一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法及其测定方法

摘要

一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，将双孢蘑菇真空冷冻干燥24h；热水浸提粗多糖：加入蒸馏水，大火煮沸，文火维持，离心取上清液，沉淀放回加热设备中加水继续加热致沸腾，文火维持，再离心取上清液；重复三次，将获得的上清液用蒸馏水定容备用；双水相萃取操作：精确称取聚乙二醇(PEG)60002.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入样品稀释液20mL混匀；同时称取PEG6000 2.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入蒸馏水20mL混匀，得到的双孢蘑菇多糖被分配在PEG相中。利用双水相体系萃取双孢蘑菇多糖最大收率为80.1％，得率可以达到17.45mg/g。

权利要求

1.一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，其特征在于：使用材料：鲜双孢蘑菇；

使用试剂：苯酚、浓硫酸、葡萄糖、硫酸铵(NH4)2SO4、聚乙二醇(PEG)6000、蒸馏水；

使用仪器设备：10mL离心管、50mL离心管、真空冷冻干燥器、离心机；

分离方法及步骤

(1)材料预处理：将新鲜的双孢蘑菇真空冷冻干燥24h；

(2)热水浸提粗多糖：将干燥后的双孢菇粉碎后称取两克，置于不锈钢或玻璃容设备中，加入200mL蒸馏水，大火煮沸，文火维持1小时，离心取上清液，沉淀放回加热设备中加水100mL继续加热致沸腾，文火维持30min，再离心取上清液；重复三次，将获得的上清液装入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL备用；

(3)双水相萃取操作：精确称取聚乙二醇(PEG)6000 2.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入样品稀释液20mL混匀；同时称取PEG6000 2.66g，硫酸铵4.28g，加入到

50mL离心管中，加入蒸馏水20mL混匀，作为对照，在离心机中以3000r/min离心5min，读取样品管上下相体积，上相体积为9.5mL，下相体积为14.5mL；

得到的双孢蘑菇多糖大部分被分配在PEG相(上相)中。

2.根据权利要求1所述的一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，其特征在于：最佳的条件为：PEG6000的质量百分数为13.3％，(NH4)2SO4的质量百分数为21.4％，pH值为7，温度为25℃，在一个大气压条件下操作。

说明书

一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法及其测定方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物多糖的提取，特别涉及一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法及其测定方法。

背景技术

[0002] 目前，提取食用菌多糖常用的方法有：热水浸提法、微波辅助法、超声波辅助法和酸碱浸提法，这些方法均有一定的不足之处。其中，热水浸提法需要温度在80-100℃，处理时间在60-180min，处理温度比较高、时间比较长，容易使多糖发生变性失活；微波辅助法是利用微波的吸收性、穿透性和反射性使极性物质，如水等选择性吸收，从而被加热，增加物料的通透性，使得多糖等活性物质从组织中释放出来，其实质也是利用加热提取多糖，所以容易使多糖发生变性失活；超声波辅助法是利用其在溶剂中产生的空化作用，导致溶液内空穴的形成、增长和爆破压缩，从而是固体样品破碎，增大样品与萃取剂之间的接触面积，提高目标产物从固相转移到液相的传质速率，其实质是破碎细胞壁，溶出目标产物，但是在实际操作的过程中，利用超声波破碎食用菌细胞壁，效率非常低，致使多糖的提取率也比较低；酸碱浸提法虽然可以缩短提取时间，但由于酸、碱在浓度因子难以控制的情况下，容易使部分多糖发生水解，从而破坏多糖的活性结构，降低多糖得率。经查阅文献，以上提取方法的多糖提取率在9-15mg/g。

发明内容

[0003] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法。

[0004] 本发明的技术方案是：

[0005] 一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，其特征在于：

[0006] 使用原料：鲜双孢蘑菇；

[0007] 使用试剂：苯酚、浓硫酸、葡萄糖、硫酸铵(NH4)2SO4、聚乙二醇(PEG)6000、蒸馏水；

[0008] 使用仪器设备：10mL离心管、50mL离心管、真空冷冻干燥器、离心机；

[0009] 分离方法及步骤

[0010] (1)材料预处理：将新鲜的双孢蘑菇真空冷冻干燥24h；

[0011] (2)热水浸提粗多糖：将干燥后的双孢菇粉碎后称取两克，置于不锈钢或玻璃容设备中，加入200mL蒸馏水，大火煮沸，文火维持1小时，离心取上清液，沉淀放回加热设备中加水100mL继续加热致沸腾，文火维持30min，再离心取上清液；重复三次，将获得的上清液装入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL备用；

[0012] (3)双水相萃取操作：精确称取聚乙二醇(PEG)6000 2.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入样品稀释液20mL混匀；同时称取PEG60002.66g，硫酸铵4.28g，加入到
50mL离心管中，加入蒸馏水20mL混匀，作为对照，在离心机中以3000r/min离心5min，读取样品管上下相体积，上相体积为9.5mL，下相体积为14.5mL；

[0013] 得到的双孢蘑菇多糖大部分被分配在PEG相(上相)中。

[0014] 本从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法，最佳的条件为：PEG6000的质量百分数为13.3％，(NH4)2SO4的质量百分数为21.4％，pH值为7，温度为25℃，在一个大气压条件下操作。

[0015] 本从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的测定方法，其特征在于：

[0016] 使用仪器：UV-722型紫外可见光分光光度计、分析天平；

[0017] (1)苯酚-硫酸法测定多糖含量：分相后上下相各取1mL加9mL水稀释10倍，再取1mL稀释液加0.5mL 6％苯酚和2.5mL浓硫酸，混匀后静置30min，用UV-722紫外-可见分光光度计在490nm下测定吸光度值；上相吸光度为0.369，下相吸光度0.06；

[0018] (2)标准曲线的制作：准确称取葡萄糖0.0210g用蒸馏水溶解，定容至500mL。取10支刻度试管，分别编号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9.取定容好的葡萄糖溶液0.1mL放入1号试管，取0.2mL到2号管，以此类推，取0.9mL放入9号管，0号管里不加葡萄糖溶液，盖上试管，摇匀，再在每只试管中加入事先配制好的6％苯酚0.5mL，然后立即加入2.5mL浓硫酸，摇匀；静置30min，后在紫外-可见分光光度计上490nm测其吸光度值，记录数值并作图；

[0019] 数据如表1

[0020] 表1标准曲线吸光度值

[0021]

[0022] (3)数据计算

[0023] 计算得上相中多糖浓度为5.9mg/mL，下相中多糖浓度为2.0mg/mL。

[0024] 相关的计算公式

[0025] R＝Vt/Vb

[0026] K＝Ct/Cb

[0027] Y＝1/(1+1/(R×K))

[0028] R＝0.655

[0029] K＝6.15

[0030] Y＝0.801

[0031] R双水相体系上下相的体积比

[0032] Vt双水相体系上相体积，mL

[0033] Vb双水相体系下相体积，mL

[0034] K双孢菇多糖双水相体系分配系数

[0035] Ct双水相系统上相双孢菇多糖的质量浓度，mg/mL

[0036] Cb双水相系统下相双孢菇多糖的质量浓度，mg/mL

[0037] Y双孢菇多糖在上相中的收率。

[0038] 本发明效果是：

[0039] 双水相萃取(Aqueous two-phase extraction，ATPE)技术始于20世纪60年代，由于其条件温和，容易放大，可连续操作，目前已成功的应用于蛋白、核酸等生物产品的分离和纯化。其主要优势有以下几点：

[0040] (1)易于放大，各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低，现已证明双水相萃取的分配系数仅与分离体积有关，这是其他过程无法比拟的，这一点对于工业应用尤为有利；

[0041] (2)由于双水相系统之间的传质过程和平衡过程快速，因此相对于某些分离过程来说，能耗较小，而且可以实现快速分离；

[0042] (3)由于双水相的相间张力大大低于有机溶剂与水相之间的相间张力，相分离过程温和，使生化分子如酶不易受到破坏，而且可以直接在双水相系统中进行生化转化以消除产物抑制；

[0043] (4)整个操作过程可以在室温下进行操作条件温和。

[0044] 基于以上双水相萃取的优势，我们可以在温和的条件下，利用两种水溶液的萃取操作提取双孢蘑菇多糖，不仅可以提高产品的提取率和得率，而且可以将实验室操作的结果直接放大到生产规模，省去了中试过程，为生物产品的研发和生产找到了一条捷径。

[0045] 利用PEG/(NH4)2SO4双水相体系萃取双孢蘑菇多糖最大收率为80.1％，得率可以达到17.45mg/g；

附图说明

[0046] 图1葡萄糖标准曲线图

具体实施方式

[0047] 一种从双孢蘑菇中分离双孢蘑菇多糖的方法本发明创造的具体方案

[0048] 1实验材料、试剂和仪器设备

[0049] 鲜双孢蘑菇、苯酚、浓硫酸、葡萄糖、(NH4)2SO4、聚乙二醇(PEG)6000、蒸馏水。

[0050] 10mL离心管、50mL离心管、真空冷冻干燥器、离心机、UV-722型紫外可见光分光光度计、分析天平。

[0051] 2实验方法及步骤

[0052] (1)实验材料预处理：将新鲜的双孢蘑菇真空冷冻干燥24h。

[0053] (2)热水浸提粗多糖：将干燥后的双孢菇粉碎后称取两克，置于不锈钢或玻璃容设备中，加入200mL蒸馏水，大火煮沸，文火维持1小时，离心取上清液，沉淀放回加热设备中加水100mL继续加热致沸腾，文火维持30min，再离心取上清液。重复三次，将获得的上清液装入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL备用。

[0054] (3)双水相萃取操作：精确称取PEG6000 2.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入样品稀释液20mL混匀；同时称取PEG6000 2.66g，硫酸铵4.28g，加入到50mL离心管中，加入蒸馏水20mL混匀，作为对照，在离心机中以3000r/min离心5min，读取样品管上下相体积，上相体积为9.5mL，下相体积为14.5mL。

[0055] (4)苯酚-硫酸法测定多糖含量：分相后上下相各取1mL加9mL水稀释10倍，再取1mL稀释液加0.5mL 6％苯酚和2.5mL浓硫酸，混匀后静置30min，用UV-722紫外-可见分光光度计在490nm下测定吸光度值。上相吸光度为0.369，下相吸光度0.06。

[0056] (5)标准曲线的制作：准确称取葡萄糖0.0210g用蒸馏水溶解，定容至500mL。取10支刻度试管，分别编号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9.取定容好的葡萄糖溶液0.1mL放入1号试管，取0.2mL到2号管，以此类推，取0.9mL放入9号管，0号管里不加葡萄糖溶液，盖上试管，摇匀，再在每只试管中加入事先配制好的6％苯酚0.5mL，然后立即加入2.5mL浓硫酸，摇匀。静置30min，后在紫外-可见分光光度计上490nm测其吸光度值，记录数值并作图。
数据如表1，图如图1。

[0057] 表1标准曲线吸光度值

[0058]

[0059] 图1为葡萄糖标准曲线

[0060] (6)数据计算

[0061] 计算得上相中多糖浓度为5.9mg/mL，下相中多糖浓度为2.0mg/mL。

[0062] 相关的计算公式

[0063] R＝Vt/Vb

[0064] K＝Ct/Cb

[0065] Y＝1/(1+1/(R×K))

[0066] R＝0.655

[0067] K＝6.15

[0068] Y＝0.801

[0069] R双水相体系上下相的体积比

[0070] Vt双水相体系上相体积，mL

[0071] Vb双水相体系下相体积，mL

[0072] K双孢菇多糖双水相体系分配系数

[0073] Ct双水相系统上相双孢菇多糖的质量浓度，mg/mL

[0074] Cb双水相系统下相双孢菇多糖的质量浓度，mg/mL

[0075] Y双孢菇多糖在上相中的收率

[0076] 利用PEG/(NH4)2SO4双水相体系萃取双孢蘑菇多糖最大收率为80.1％，得率可以达到17.45mg/g。双孢蘑菇多糖大部分被分配在PEG相(上相)中。最佳的条件为：PEG6000的质量百分数为13.3％，(NH4)2SO4的质量百分数为21.4％，pH值为7，温度为25℃，在一个大气压条件下操作。