一种化合物及其在制备治疗呼吸道病毒感染药物中的应用

摘要

本发明属于制药领域，公开了一种化合物及其在制备治疗呼吸道病毒感染药物中的应用。该化合物的结构式如式(I)所示，其中：R是-CH2-CH2-，R’是C4～C14的直链或多链烷基；x为1-50，y为0～50。该化合物具有抗呼吸系统病毒感染的作用，可用于制备治疗呼吸系统病毒感染的药物。

权利要求

1.一种烷芳基聚醚醇类化合物，其结构式如式(I)所示：其中：

R是-CH2-CH2-，R’是C4～C14的直链或多链烷基；

x为1-50，y为0～50。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于x为1-20，y为0-30。

3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于该化合物为泰洛沙泊或杯芳烃。

4.一种抗呼吸道病毒药物，该药物含有治疗有效量的权利要求1、2或3所述的化合物。

5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于治疗有效剂量为0.001毫克～10克/Kg体重。

6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于该药物的剂型为片剂、注射剂、气雾剂、颗粒剂、胶囊剂、滴鼻剂。

7.权利要求1、2或3所述的化合物在制备治疗呼吸系统病毒感染药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于呼吸系统病毒为鼻病毒、流感病毒、付流感病毒、冠状病毒、呼吸道系统合胞病毒、肠病毒或腺病毒中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于呼吸系统病毒是流感病毒。

说明书

一种化合物及其在制备治疗呼吸道病毒感染药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于制药领域，涉及一种化合物及其在制备治疗呼吸道病毒感染药物中的应用。

背景技术

[0002] 呼吸系统病毒感染常见于各种年龄的人，是一种成人和儿童均常见的疾病，目前尚无有效的治疗方法，多数感染是相对轻微自限性的并局限于上呼吸道，这类病毒感染可以是很重，就象流行性感冒，也可以是轻微的在几天就好转的自限性感染。常见的造成呼吸道感染的病毒有鼻病毒(Rhinovirus)、付流感病毒(Para-lnfluenza)、冠状病毒(coronavirus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、流感病毒(Influenza Virus)、肠病毒和某些腺病毒株等，这些病毒可以引起不同的呼吸道感染及并发症：如普通感冒、鼻窦炎、支气管炎、肺炎及中耳炎，许多病毒感染也常诱发细菌感染，这种继发感染可导致更严重的支气管炎、肺炎和中耳炎。

[0003] 通常呼吸道病毒感染通过手接触患者的鼻分泌物而进入人体造成新的感染，较少的情况是通过呼吸空气中的来自于患者咳嗽或打喷嚏带病毒的微粒而传播感染，由于多种原因所致，来自于儿童患者的鼻腔或呼吸道的分泌物常比成年患者带有更多的病毒。对于儿童来讲，鼻病毒、流感病毒、付流感病毒、呼吸道合胞病毒、肠道病毒和某些腺病毒株是呼吸道病毒感染的主要致病病毒。

[0004] 呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肠道病毒、流感病毒、付流感病毒、冠状病毒和腺病毒常可加重哮喘，病毒加重哮喘的程度随患者的年龄而异。

[0005] 流行性感冒病毒所致的流行感冒是一种常见的高死亡率的严重疾病，由于流感病毒的高变异性，新的病毒株常会不断的产生，由于人类对新的病毒株常缺乏免疫力，新的病毒株常导致暴发性的流行性感冒。这种爆发性的流感极易在人与人之间传播，并在极短时间内造成世界范围内的大流行。在亚洲和世界其他地方的H5N1禽流感病毒株很可能会造成爆发性的流行性感冒。目前对于H5N1尚未有效的疫苗和治疗方法。Tamiflu和Amantadine是目前治疗流行性感冒的常用药物，但是这些药物须在病毒感染24小时内使用，否则无任何疗效，并且这两种药物特别是Amantadine极易导致抗药性。

[0006] 流行性感冒是目前唯一可以用疫苗预防的呼吸道感染，某些疾病如心脏和肺的疾病，如囊性纤维化病(cystic fibrosis)和哮喘，还有其他疾病如糖尿病引起的肾功能障碍、镰刀状红细胞贫血极易引发病毒感染，并且病毒感染常可加重原有疾病。另外，免疫力低下的患者如爱滋病(HIV)病毒感染者和化疗癌症病人，在感染流感病毒后常会有严重的不良预后。

[0007] 第一个被证明能够抑制流感病毒复制的化合物是adamantane(金刚烷)衍生物Amantadine(金刚烷胺)。Amantadine在内质网内能够阻止氢离子进入病毒从而阻止病毒壳体脱壳，Amantadine的一个大问题是重复用药极易诱发抗药性。Neuraminidase(神经氨酸酶)抑制剂如：Oseltamivir和zanamivir通过抑制病毒Neuraminidase而阻止病毒从感染的细胞释放从而阻止病毒进步感染其它的细胞。但是，如果病毒已进入细胞，这种药物则并不能抑制病毒的复制。如果在病毒感染24小时后给Oseltamivir和Zanamivir则无效，因为在感染24小时后病毒已进入其它的细胞。Ribavirin长期以来被认为是一种广谱的抗病毒药并用于流感病毒，麻疹、呼吸道合胞病毒感染的治疗，但是此药唯一被正式批准的是用于呼吸道合胞病毒感染治疗，并且常引起贫血等副作用。

[0008] 最近的实验显示以往知道的alkylanyl polyether alcohol polymers(烷芳基聚醚醇)类药物是一种强的抗氧化剂，并且可用于疾病的治疗(美国专利号5,474,760和U.S Ser.No 08/039/732)，烷芳基聚醚醇在商业上用作表面活性剂(surfactant)和湿化剂(wettingagent)(美国专利号2,454,541)，这类药物最著名的化合物是Tyloxapol。然而这类化合物中的其它化合物由于与Tyloxapol具有共同的特性也广为人们了解(见J.W.Cornforth等，某些具有表面活性的Polyoxyethylene ethers在小鼠体内的抗结核作用Nature(1951)168：150-153)。

[0009] Tyloxapol或Triton WR-1339作为一种烷芳基聚醚醇，以前被用于一种雾化药物配方(见M.L.Tainer等，Alevaire作为一种粘液-溶化剂，New England Journal of Medicine(1955)764-767)。Winthrop Laboratories销售一种商品名称叫ALEVAIRE的药品物，其配方组成是0.125％superinone(四丁酚醛)(商标名是Typloxapol，泰洛沙泊)，2％碳酸氢钠和5％甘油.这种药物已有30多年的使用历史并用于治疗慢性支气管炎，严重哮喘、百日咳等。

[0010] 现在含有Tyloxapol的气雾药物配方的商品名是 Neonatal，这个药物在1990年FDA被批准用于通过气管给药而治疗新生儿呼吸窘迫综合症。Glyxo-Welcome公司现销售此药。 药物的配方是108mg Dipalmitoyl Phosphatidylcholine(DPPC，二棕榈酰磷脂酰胆碱)，12mg Cetyl alcohol(十六(烷)醇，鲸蜡醇)，8mg water(水)。DPPC被认为是其药效的主要成份，Tyloxapol作为一个分散剂(dispersing agent)使DPPC在配成的药物中保持乳液状态。当药物配成时， 药物溶液含有13.5mg/ml DPPC、
1.5mg/ml cetyl alcohcl、1mg/ml tyloxapol(泰洛沙泊，四丁酚醛)、0.1M氯化钠，这个药物用于新生儿呼吸窘迫综合症预防和治疗。

[0011] 以往的研究显示洗涤剂(detergents)是一种对细胞膜有很强调节作用的调节剂(见Attwood D和Flornce A，表面活性系统，1983)人们都知道洗涤剂及相关的药物在适当的浓度能够稳定细胞膜，例如可以减轻红细胞的溶解。

[0012] 烷基芳基聚醚醇被证明是一种很强的抗氧化剂，这种抗氧化作用可以阻止NF-kB的激活，并且抑制慢性细胞因子(cytokines)的释放(美国专利号6,165,445)。

[0013] 美国的Discovery Laboratories的SuperVentTM是另一种主要成份为tyloxapol的药物配方，主要用于治疗呼吸道的炎症及强氧化造成的多痰。在20个健康志愿者体上的临床一期试验证明烷芳基聚醚醇气雾溶液在浓度高达1.25％仍安全，实验也显示Tyloxapol对呼吸道IL-8有很强的直接抑制作用，从而可以阻断由呼吸道感染所致的恶性循环。

[0014] 目前尚未有烷芳基聚醚醇类化合物用于制备抗呼吸道病毒药物方面的报道。

发明内容

[0015] 本发明的目的是提供一种抗呼吸道病毒感染的化合物。

[0016] 本发明的另一个目的是提供上述化合物在制备治疗呼吸道病毒感染药物中的应用。

[0017] 本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

[0018] 一种烷芳基聚醚醇类化合物，其结构式如式(I)所示：

[0019]

[0020] 其中：

[0021] R是-CH2-CH2-，R’是C4～C14的直链或多链烷基；

[0022] 其中x为1-50，y为0～50。可进一步优选为x：1-20，y：0-30。

[0023] 更进一步，该类烷基芳基聚醚醇化合物优选为Tyloxapol(化合物A，泰洛沙泊)或Calixarenes(杯芳烃)。

[0024] 一种抗呼吸道病毒药物，该药物含有治疗有效量的式(I)所示的化合物。

[0025] 治疗有效剂量为0.001毫克～10克/Kg体重。

[0026] 所述药物的剂型为片剂、注射剂、气雾剂、颗粒剂、胶囊剂、滴鼻剂等。

[0027] 式(I)所示的化合物在制备治疗呼吸道病毒药物中的应用。

[0028] 呼吸系统病毒为鼻病毒、流感病毒、付流感病毒、冠状病毒、呼吸道系统合胞病毒、肠病毒或腺病毒中的一种或多种。优选是流感病毒。

[0029] 本发明中溶解药物的溶液包括等张盐水或生理盐水或者是两者结合；或葡萄糖注射液、氯化钠注射液、乳酸盐缓冲液等缓冲溶液一种或多种混合液。

[0030] 本发明的有益效果：

[0031] 本发明提供了一种烷芳基聚醚醇类化合物，这类化合物具有抗呼吸道病毒作用，可用于制备抗呼吸道病毒药物，为药物治疗呼吸道病毒感染提供了更多的选择。

附图说明

[0032] 图1：Tyloxapol(化合物A)抑制PR8流感病毒在呼吸道上皮细胞内的复制。

[0033] 将Tyloxapol(化合物A)溶解在0.9％NaCl溶液中使浓度为5mg/ml，待完全溶解后用NaOH或HCl调节pH至7。该溶液将用于本专利所有试验。人的呼吸道上皮细胞在感染流感病毒PR84小时后，按如图所示的浓度及给药方式给药，未经药物处理的病毒感染组作为对照，48小时后，取材，分离RNA并用RT-PCR方法相对定量病毒的数目，实验结果来自三次不同的实验，每次实验均有3个不同的标本，图中所示的实验数据是平均值±标准差。

[0034] 图2：Tyloxapol(化合物A)能抑制病毒复制而对照化合物则不能。

[0035] 配制吐温80溶液作为阴性对照物(化合物C)。人的呼吸道上皮组织在感染PR8流感病毒4小时后，加入如图所示的不同浓度的化合物A和C，48小时后，取材，分离RNA，并用定量RT-PCR方法定量病毒。实验结果本自三次不同的实验，每次实验均有3个不同的标本，图中所示的实验数据是平均值±标准差。

[0036] 图3：Tyloxapol(化合物A)加入组织培养液中或直接在组织表面给药均能彻底抑制流感病毒复制。

[0037] 人的呼吸道上皮组织在感染流感病毒4小时后，加入如图所示不同浓度的Tyloxapol(化合物A)。未经药物处理的病毒感染组作为对照组。48小时后，取材，分离RNA并用定量RT-PCR定量病毒。实验结果来自于三个不同的实验，每次实验均有3个不同的标本，图中所示的实验数据是平均值±标准差，如图所示：Tyloxapol而不是对照化合物能抑制病毒复制，LX浓度的Tyloxapol是5mg/ml。

[0038] 图4：Tyloxapol(化合物A)与Tamiflu在抑制病毒复制上的比较。

[0039] 人的呼吸道上皮组织在感染流感病毒4小时后，加入不同的浓度的Tyloxapol和Tamiflu。未经药物处理的病毒感染组作为对照组。48小时后，取材，分离RNA并用定量RT-PCR定量病毒，实验结果来自于3个不同的实验，每次实验均有3个不同的标本，图中所示的实验数据是平均值±标准差。如图所示，Tyloxapol比Tamiflu有更强的抑制病毒复制的作用，Tyloxapol加入组织培养液中或直接在组织表面给药均有效，而Tamiflu经组织表面给药则无效，图中的0.04X浓度的Tyloxapo l是0.2mg/mL。

[0040] 图5：Tyloxapol(化合物A)和Tamiflu抑制流感病毒复制的时效研究。

[0041] 人呼吸道上皮组织在感染流感病毒4小时后，在如图所示的时间加入药物，48小时的取材，分离RNA并用定量RT-PCR定量病毒，实验结果来自于3次不同的实验，每次实验有3个不同的标本，图中所示的实验数据是平均值±标准差，如图所示Tyloxapol(在病毒感染4小时、10小时或24小时后给药均能有效抑制病毒的复制，而Tamiflu仅在感染4小时后给药能有效抑制病毒的复制，在感染24小时后给药则无效。图中0.04X浓度的是Tyloxapol是0.2mg/ml，Tamiflu浓度是500nM。

[0042] 图6：Tyloxapol的毒性Lactated dehydrogenase(LDH)释放的研究。

[0043] 人呼吸道上皮组织在感染流感病毒4小时后，在不同时间点加入Tyloxapol并保持不同的时间，在感染48小时后收取组织培养液，并分LDH释放量，0.5％Triton X-100处理的标本作为LDH释放的最高量。实验结果来自于三次不同的实验，每次实验均有3个不同的标本，图中所示的实验数据是平均值±标准差，Tyloxapol在抑制病毒复制的效浓度时毒性极低。

[0044] 图7：在人呼吸道上皮组织表面直接给Tyloxapol的毒性研究。

[0045] 人呼吸道表面上皮组织在感染流感病毒4小时后，在组织表面给不同浓度的Tyloxapol并维持44小时，然后收取组织培养液并分析LDH的释放，0.5％Triton X-100处理的标本作为LDH释放的最高量，实验结果来自于三次不同实验，每次实验均有3个不同的标本，图中所示的实验数据是平均值±标准差。实验显示在组织表面直接给药时，在其抑制病毒复制的有效浓度时，没有LDH释放。

[0046] 图8：Tyloxapol抑制流感病毒在小鼠体内的复制并能保护小鼠。

[0047] 在小鼠感染流感病毒24小时后，每天两次给Tyloxapol(化合物A)和Tamiflu在感染96小时后取小鼠肺，分离RNA并用定量RT-PCR定量病毒。Tyloxapol的浓度与目前临床使用的浓度一样，Tamiflu剂量是10mg/kg，每一组均有10只小鼠，图中的实验数据是平均值±标准差，如图所示，Tyloxapol能抑制病毒在小鼠体内复制。

[0048] 图9：Calixarenes(杯芳烃)抑制流感病毒在小鼠体内的复制并能保护小鼠。

[0049] 在小鼠感染流感病毒24小时后，每天两次给Calixarenes(杯芳烃)和Tamiflu。在感染96小时后取小鼠肺，分离RNA并用定量RT-PCR定量病毒。Calixarenes(杯芳烃)的浓度与目前临床使用的浓度一样，Tamiflu剂量是10mg/kg，每一组均有10只小鼠，图中的实验数据是平均值±标准差，如图所示，Calixarenes(杯芳烃)能抑制病毒在小鼠体内复制。

[0050] 以上图中“相对疗效”是各组标本测定病毒残余量的比较相对值。

具体实施方式

[0051] 以下是本发明的详细说明：

[0052] 就象Bock和Rainey的专利(美国专利号2,454,541(1948)所描述的那样，alkylarylpolyether alcohol polymers常能通过聚合烷基芳基醇(alkylaryl alcohol)和甲醛(formaldehyde)而成，几个特殊的alcohol polyether alcohol polymers能很容易的用以前描述的方法(J.W.Cornforth等Nature(1951)168：150-153)合成，这类化合物的原型化合物能很方便的直接购买到作为药物所需的纯度。

[0053] 本发明提供一种能抑制呼吸病毒感染特别是流感病毒感染的药剂，这种药剂能有效的抑制病毒在离体和在体的呼吸道上皮细胞的复制，这种药剂是一种含有有效浓度的烷芳基聚醚醇类化合物的配方。这类烷芳基聚醚醇化合物其结构如下：

[0054]

[0055] 其中：

[0056] R是-CH2-CH2-，R’是C4～C14的直链或多链烷基；

[0057] 其中x为1-50，y是0～50。可进一步优选为x：1-20，y：0-30.

[0058] 该种抗呼吸道病毒药物含有治疗有效量的式(I)所示的化合物，其治疗有效剂量为0.001毫克～10克/Kg体重。所述药物的剂型为片剂、注射剂、气雾剂、颗粒剂、胶囊剂、滴鼻剂等。

[0059] 式(I)所示的化合物在制备治疗呼吸道病毒药物中的应用，该类烷基芳基聚醚醇化合物可进一步优选为Tyloxapol(化合物A，泰洛沙泊)和Calixarenes(杯芳烃).Tyloxapol相对无毒性，并且在高于几千倍其它洗涤剂引起溶血现象的浓度时均不会发生溶血现象(Glasman HN.Sciences(1950)111：688-689)。

[0060] 本专利试验所用的病毒是一种小鼠流感病毒适应株(PR8)，并广泛用于抗病毒药物的筛选和流感动物模型，感染的严重程度能直接通过观察动物的活动，皮毛的状态和摄食量的变化而判断，病毒的复制情况能通过病毒浓度检测或定量RT-PCR定量病毒的RNA而得，本发明用烷芳基聚醚醇治疗呼吸道病毒特别芳基醇是流感病毒感染，其试验配方为将Tyloxapol(化合物A)溶于0.9％氯化钠溶液中，用NaOH或HCl将pH调至7.0左右，也可以加入烷基聚合物(nonpolymer alky)(1-25％重量比)或arylalcohol(1-20％重量比)如乙酰基醇(acetyl alcohol)以增强混合物的治疗作用，本发明可以通过滴入混合物的方式治疗小鼠流感病毒感染。

[0061] 通过用临床使用的雾化器产生可吸入的雾化粒而经呼吸道给药，例如用Tyloxapol双蒸水和0.9％NaCl配制成与呼吸道分泌物一样渗透压的等张5mg/ml Tyloxapol溶液，将PH调至7.0左右；以避免由于适度酸性或碱性面造成气管痉挛，作为一种选择，也可以加入5％的甘油(Glycerol)到混合物中从而在雾化时起到稳定雾化粒大小作用。小鼠实验是在感染前或后(视实验设计而定)直接经鼻滴入50μl到100μl Tyloxapol溶液到呼吸道。另外，Tyloxapol溶液也可每天几次通过气溶喷剂吸入或通过呼吸机雾化吸入气管扩张药和交感神经激动剂(如Albuterol)与Tyloxapol溶液混用，合用时雾化给药而预防Tyloxapol溶液可能引起的气管痉挛。

[0062] 为了进一步增加对本发明的理解，下面的例子主要用来说明这些特定的细节例子。

[0063] 实施例1

[0064] 人呼吸道上皮组织细胞植于尼龙制成的支持网上，并让其在液气界面生长。其培养为改良的Ex-Cell Vero无血清培养液(从Invitrogen公司购买)。PR8流感病毒经呼吸道上皮组织表面感染4小时，然后经组织表面直接给药(喷雾给药)或在组织培养液中加入Tyloxapol(化合物A)或中性对照(化合物C)及阳性对照物(Tamiflu)(液体给药)。按图1-7所示时间治疗后，取材，分离RNA并用定量RT-PCR方法定量病毒，同时收取培养液检测LDH作毒性分析。结果见图1-7。

[0065] 实施例2

[0066] 小鼠轻度麻醉后，用于将小鼠竖立并使其鼻向上，然后用微量吸管将PR8病毒[0067] (2000pfu/300μl in PBS)滴入小鼠外鼻孔让其吸入，并继续使小鼠保持竖立5秒钟而保证小鼠将所有溶液吸入气管。然后用加温灯给小鼠保温约20分钟或直至小鼠恢复活动，在小鼠感染流感病毒24小时后，用上述方法经鼻道给小鼠滴入50μl 4mg/mL Tyloxapol溶液，Tamiflu剂量是10mg/kg，感染未治疗组及PBS营养液组为对照(除未治疗组外各组每天2次给予等体积相应溶液)，在感染96小时后取小鼠肺，分离RNA并用定量RT-PCR方法定量病毒。结果见图8。

[0068] 实施例3

[0069] 将Calixarenes(杯芳烃)溶于0.9％氯化钠溶液中，用NaOH或HCl将pH调至7.0左右，用0.9％氯化钠溶液定容使最终浓度为4mg/ml。待小鼠轻度麻醉后，将小鼠竖立并使其鼻向上，然后用微量吸管将PR8病毒(2000pfu/300μl in PBS)滴入小鼠外鼻孔让其吸入，并继续使小鼠保持竖立5秒钟而保证小鼠将所有溶液吸入气管。然后用加温灯给小鼠保温约20分钟或直至小鼠恢复活动，在小鼠感染流感病毒24小时后，用上述方法经鼻道给小鼠滴入50μl 4mg/ml Calixarenes(杯芳烃)溶液，Tamiflu剂量是10mg/kg体重，感染未治疗组及PBS营养液组为对照(除未治疗组外各组每天2次给予等体积相应溶液)，在感染96小时后取小鼠肺，分离RNA并用定量RT-PCR方法定量病毒。结果见图9。

[0070] 本发明中分离RNA的方法为：

[0071] 试剂盒购自Sigma公司，其商品名为spy4，具体实验步骤如下：倒掉培养液用100μlPBS将细胞洗一次，然后加入细胞裂解液(spy4，Sigma)将60μl细胞裂解液转入96孔的RNA分离板，将在室内静放1-2小时，然后除去裂解液，用洗液(spy4，Sigma)将RNA分离板洗3次，每孔每一次用80μl洗液，最后在每一孔加入60μl提取液，并在65℃保持5分钟，将提取液(含mRNA)转移至新的96孔板。

[0072] 本发明中采用定量RT-PCR方法定量病毒的方法为：

[0073] RT-PCR试剂盒购自Bioline公司，其商品名为sensimx One-step SYBR green。其实验步骤如下：1μl上述分离后的mRNA，加入7μl 2X的混合液(RT-PCR试剂盒)和
4.7μl水；作定量，RT-PCR其方法是42℃，30分钟；95℃，10分钟，然后40个循环，95℃，15秒；60℃，30秒；72℃，20秒。