拟穴青蟹功能基因来源微卫星标记的快速检测方法

摘要

本发明涉及一种拟穴青蟹功能基因来源微卫星标记的快速检测方法，包括：(1)拟穴青蟹基因组DNA的提取；(2)根据GeneBank数据库中拟穴青蟹的功能基因序列，获得含有微卫星重复的基因序列；(3)微卫星标记引物的设计；(4)拟穴青蟹不同地理群体或群体不同个体的基因组DNA的PCR扩增；(5)PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。本发明的检测方法具有快速、准确、灵敏等优点，能够直观地检测出拟穴青蟹不同个体的基因型，从而快速获得拟穴青蟹在功能基因微卫星位点遗传变异的多态性图谱，该微卫星标记可应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源保护与管理及遗传连锁图谱构建等领域。

权利要求

1.一种拟穴青蟹功能基因来源微卫星标记的快速检测方法，包括：(1)拟穴青蟹基因组DNA的提取；

(2)根据GeneBank数据库中拟穴青蟹的功能基因序列，获得含有微卫星重复的基因序列；

(3)微卫星特异引物的设计，应符合以下参数：a.引物长度在18-25bp之间；b.GC含量在40-60％之间；c.退火温度在48-60℃之间；d.PCR产物的预期长度在130-300bp之间；

Scpa-AMP-SSR：F：CTTTACCAACGGCTTCTTCAR：CAGTAGCTTCCATGCAATTCTT

退火温度为55℃，核心重复序列为(ATT)9N6(ATT)4；

Scpa-CB-SSR：F：CAGTGCAAGGCAAGTCAGGATACR：AGTTCTGGAAGCATGCAATACTGAC

退火温度为57℃，核心重复序列为(TG)17；

Scpa-ALF-SSR：F：TGGGCGTCCATTTCTCATTAR：TCGGAACTGAATTTAAAAATTAGAG

退火温度为53℃，核心重复序列为(AC)20；

Scpa-SP-SSR：F：TTCAAGCAAGGACTCCAATTR：GTTGCCTGAATCACAAATACC

退火温度为52℃，核心重复序列为(CT)54；

Scpa-PDI-SSR：F：AAATAGGAGAACGAATAGCCCR：GAAAACATTCATTCATAACCCT

退火温度为51℃，核心重复序列为(GAGT)4G(AGCA)4；

(4)拟穴青蟹不同地理群体或群体不同个体的基因组DNA的PCR扩增；

(5)PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而获得拟穴青蟹遗传变异的多态性图谱。

2.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹功能基因来源微卫星标记的快速检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中的拟穴青蟹基因组DNA提取具体操作如下：剪取拟穴青蟹少量肌肉组织100-150mg，置于500μl组织提取液的中剪碎，加入终浓度为20mg/ml的蛋白酶K和终浓度为100μg/ml的RNase A，55℃消化2-3个小时；用酚、氯仿、异戊醇按体积比25∶24∶1配成的混合液抽提两次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于TE缓冲液中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μl，并保存在-20℃备用。

3.根据权利要求2所述的一种拟穴青蟹功能基因来源微卫星标记的快速检测方法，其特征在于：所述的组织提取液具体组分为10mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；100mmol/L EDTA，pH8.0；100mmol/L NaCl；0.5％SDS。

4.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹功能基因来源微卫星标记的快速检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中的PCR扩增反应体系为25μl，包括基因组DNA模板1μl、终浓度均为0.4μmol/L的上下游引物、终浓度为1.5mmol/L Mg2+、终浓度为0.2mmol/LdNTP、0.75U Tag DNA聚合酶、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、特异性的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟。

说明书

技术领域

本发明属于拟穴青蟹DNA分子遗传标记检测领域，特别是涉及一种拟穴青蟹功能基因来源微卫星标记的快速检测方法。

背景技术

微卫星DNA(Microsatellite DNA)几乎存在于所有真核生物基因组中，由1-6个核苷酸组成的简单序列重复(Simple Sequence Repeats，SSR)，是近十几年发展起来的一种新型分子标记技术。微卫星具有数量多、随机分布、多态性高、重复性强、呈共显性遗传及操作简单等优点，被广泛地应用于群体遗传多样性分析、种质资源保护与管理、遗传连锁图谱构建及QTL定位等领域中。
国内外学者已在大多数的重要水产养殖动物中开发了微卫星标记。如：GUO等开发了大黄鱼的6个多态微卫星标记；李绍戊等开发了团头鲂的19个微卫星标记；马洪雨等报道了圆斑星鲽的40个多态微卫星标记和条斑星鲽的31个多态微卫星标记；Wang等开发了太平洋牡蛎的17个EST来源的多态微卫星标记；ELFSTROM等开发了扇贝的16个微卫星标记；Yap等筛选到梭子蟹的8个多态微卫星标记；An等筛选了中华绒螯蟹的9个微卫星标记。这些多态微卫星标记已经被广泛地应用到群体遗传结构分析、亲缘关系鉴定、遗传连锁图谱构建等研究中。功能基因来源的微卫星标记属于I型标记，很有可能与一些经济性状相关联，对于遗传连锁图谱构建及分子辅助育种具有重要的意义。
拟穴青蟹(Scylla paramamosain)属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹属(Scylla)，主要分布于太平洋、印度洋的热带、亚热带和温带沿岸，在我国主要分布于东南沿海各省，以福建、广东和海南最多，是我国重要的养殖蟹类之一。为了鉴定和保护在我国广泛分布的青蟹资源，马凌波等对我国东南沿海的青蟹的线粒体进行了研究，结果证实在我国广泛分布的青蟹为拟穴青蟹，而不是先前认为的锯缘青蟹。目前，可利用的拟穴青蟹微卫星标记数量非常少，且无I型(与功能基因相关的标记)微卫星标记的报道，严重限制了相关遗传学研究的发展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种拟穴青蟹功能基因来源微卫星标记的快速检测方法，该方法具有快速、准确、灵敏、安全、扩增条带清晰等优点，能够直观地检测出拟穴青蟹不同个体的基因型，从而快速获得拟穴青蟹在功能基因微卫星位点遗传变异的多态性图谱，且提供的5个功能基因的微卫星标记可应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源保护与管理及遗传连锁图谱构建等领域。
本发明的一种拟穴青蟹功能基因来源微卫星标记的快速检测方法，包括：
(1)拟穴青蟹基因组DNA的提取
剪取拟穴青蟹少量肌肉组织100-150mg，置于500μl组织提取液的中剪碎，加入终浓度为20mg/ml的蛋白酶K和终浓度为100μg/ml的RNaseA，55℃消化2-3个小时；用酚∶氯仿∶异戊醇按体积比25∶24∶1配成的混合液抽提两次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于TE缓冲液中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μl，并保存在-20℃备用；
(2)从GeneBank数据库中下载拟穴青蟹的功能基因序列，利用生物学软件SSRHUNTER1.3查找微卫星核心重复序列，查找标准为：2-5个碱基重复单元、重复次数≥4次，从而获得含有微卫星重复的基因序列；
(3)利用生物学软件Primer Premier 5.0在核心重复序列的两侧设计特异性引物，应符合以下参数：a.引物长度在18-25bp之间；b.GC含量在40-60％之间；c.退火温度在48-60℃之间；d.PCR产物的预期长度在130-300bp之间；

(4)拟穴青蟹不同地理群体或群体不同个体的基因组DNA的PCR扩增
PCR扩增反应体系为25μl，包括基因组DNA模板1μl、终浓度均为0.4μmol/L的上下游引物、终浓度为1.5mmol/L M2+、终浓度为0.2mmol/LdNTP、0.75U TagDNA聚合酶、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μl；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、特异性的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟；
(5)PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据扩增产物的不同迁移距离确定每个个体的基因型，从而获得拟穴青蟹遗传变异的多态性图谱。
所述步骤(1)中的组织提取液具体组分为10mmol/L Tris-CI，pH 8.0；100mmol/L EDTA，pH8.0；100mmol/L NaCl；0.5％SDS。
本发明设计的拟穴青蟹5个功能基因的多态性微卫星标记应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源保护与管理及遗传连锁图谱的构建。
有益效果
本发明的检测方法具有快速、准确、灵敏、安全、扩增条带清晰等优点，能够直观地检测出拟穴青蟹不同个体的基因型，从而快速获得拟穴青蟹在功能基因微卫星位点遗传变异的多态性图谱，且提供的5个功能基因的微卫星标记可应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源保护与管理及遗传连锁图谱构建等领域。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
1、拟穴青蟹基因组DNA的提取
剪取拟穴青蟹少量肌肉组织(约100-150mg)，置于500μl组织提取液(10mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；100mmol/LEDTA，pH8.0；100mmol/L NaCl；0.5％SDS)的中剪碎，加入蛋白酶K(终浓度为20mg/ml)和RNase A(终浓度为100μg/ml)，充分混匀，55℃消化2-3个小时至澄清；用酚∶氯仿∶异戊醇混合液(体积比为25∶24∶1)抽提两次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于50μl TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl，pH8.0；10mmol/L EDTA，pH 8.0)中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μl，并保存在-20℃备用；2、拟穴青蟹功能基因序列查找及微卫星引物设计
从GenBank数据库中搜索并下载拟穴青蟹功能基因序列，利用生物学软件SSRHUNTER 1.3对每个基因序列查找微卫星核心重复，查找标准为：2-5个碱基重复单元、重复次数≥4次。利用生物学软件Primer Premier 5.0在核心重复序列的两侧设计特异性引物，引物应符合以下参数：(1)引物长度在18-25bp之间；(2)GC含量在40-60％之间；(3)退火温度在48-60℃之间；(4)PCR产物的预期长度在130-300bp之间；引物信息详见表1。
3、PCR扩增
利用上述微卫星引物对拟穴青蟹群体进行PCR扩增，其反应体系为25μl，包括基因组DNA模板1μl、终浓度均为0.4μmol/L上下游引物、终浓度为1.5mmol/L Mg2+、终浓度为0.2mmol/LdNTP、Tag DNA聚合酶0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μl。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、引物特异的退火温度(表1)退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟，4℃保存备用。
4、PCR产物的电泳检测
向PCR产物中加入约1/2体积的变性剂(98.0％甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯氰)，于95℃变性5分钟，快速冷却；然后上样约3μl于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。分子量标准为pBR322/MspI，电泳液为1×TBE，恒压35-40V/cm，电泳约1-1.5小时。
电泳完成后进行染色和显色，其操作过程为：首先用70％乙醇固定10分钟，之后用蒸馏水洗5分钟；然后用1.5‰硝酸银染色10分钟，之后再用蒸馏水洗8秒钟；最后用显色液(2％NaOH∶4‰甲醛＝v/v)显色至带型清晰，再用蒸馏水将凝胶冲洗干净，便获得了拟穴青蟹在遗传变异的多态性图谱。最终，检测到5个扩增条带清晰、杂合度高的多态性微卫星位点(表1)。
表1