单分枝酰基甘油(MMG)作为佐剂的应用

摘要

在此我们将MMG及其α-和酮分枝菌酸衍生物鉴定为衍生自牛分枝杆菌BCG(哥本哈根)，能以极低剂量刺激和活化人类DC的高生物活性的脂质。除了其作为人类DC的免疫刺激剂的直接作用之外，我们证明了其在开发适合于人类施用的新一代佐剂中的应用。此外，我们鉴定了在癌症治疗中具有巨大潜力并用于针对传染性疾病和比如阿尔茨海默病的病症的疫苗佐剂的许多高度活性的合成的MMG类似物。

权利要求

1.单分枝酰基甘油(MMG)或其合成的同系物、类似物和修饰形式用于制备佐剂或免疫调谐剂的应用。

2.如权利要求1所述的合成的MMG同系物、类似物或修饰形式的应用，所述合成的MMG同系物、类似物或修饰形式基于具有8-36个碳的烃基链，最优选地具有8-16个碳的烃基链，该烃基链任选地具有脂质尾，每个脂质尾上含0-3个双键。

3.如权利要求2所述的合成的MMG同系物、类似物或修饰形式的应用，所述合成的MMG同系物、类似物或修饰形式基于如图9所示的具有8至36个碳的烃基链。

4.一种佐剂或免疫调谐剂，其根据权利要求1-3制备。

5.如权利要求4所述的佐剂或免疫调谐剂，其还包括表面活性剂。

6.如权利要求5所述的佐剂或免疫调谐剂，其中所述表面活性剂为DDA-B、DDA-C、DDA-X、DODA-B、DODA-C、DODA-X、DOTAP、DODAP、DOTMA、DXPC、DXPE、DXPG或其组合。

7.如权利要求4-6所述的佐剂或免疫调谐剂，其包括其他免疫调谐剂，其中所述免疫调谐剂是例如TDB和MDP的非TLR配体或例如Poly I:C的TLR配体和/或其任何类似物。

8.一种合成的MMG同系物、类似物或修饰形式，其基于具有8-36个碳的烃基链，该烃基链任选地具有脂质尾，每个脂质尾上含0-3个双键。

9.如权利要求8所述的合成的MMG类似物，其具有8-16个碳或如图9所示多达36个碳。

10.一种疫苗，其包括如权利要求4-7所述的佐剂或免疫调谐剂，其用于肠胃外、口服、黏膜施用、舌下、透皮、体表、吸入、鼻内、气溶胶、眼内、气管内、直肠内、阴道、通过基因枪、皮肤贴片或以滴眼剂或漱口剂的形式。

11.如权利要求10所述的疫苗，其中抗原组分包括来自胞内病原体的抗原表位。

12.如权利要求11所述的疫苗，其中所述抗原组分包括来自例如结核分枝杆菌

(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)或非洲分枝杆菌(M.africanum)的毒性分枝杆菌的抗原表位。

13.如权利要求12所述的疫苗，其中所述抗原组分在融合产物Ag85b_TB10.4、Ag85b_ESAT-6_Rv2660、Ag85b_TB10.4_Rv2660和Ag85a_TB10.4_Rv2660中选择。

14.如权利要求11所述的疫苗，其中所述抗原组分包括来自恶性疟原虫(例如Msp1、Msp2、Msp3、Ama1、GLURP、LSA1、LSA3或CSP)、沙眼衣原体(例如CT184、CT521、CT443、CT520、CT521、CT375、CT583、CT603、CT610或CT681)、HIV、流感或者乙型肝炎或丙型肝炎的抗原表位。

15.如权利要求10所述的疫苗，其用于治疗癌症、自身免疫病症、例如阿尔茨海默病的神经病症、气道炎症、炎性病症、传染性疾病、皮肤病症、过敏、哮喘或由病原体引起的疾病。

16.一种递送系统，其包括如权利要求4-7所述的佐剂或免疫调谐剂，其用于治疗癌症、自身免疫病症、例如阿尔茨海默病的神经病症、气道炎症、炎性病症、传染性疾病、皮肤病症、过敏、哮喘或由病原体引起的疾病。

17.如权利要求14所述的递送系统，其中所述MMG或其合成的同系物、类似物和修饰形式与一种或多种疫苗、抗原、抗体、细胞毒性剂、过敏原、抗生素、反义寡核苷酸、TLR和非TLR激动剂、TLR和非TLR拮抗剂、肽、蛋白、基因治疗载体、DNA疫苗、免疫调谐剂或共刺激分子组合施用。

说明书

单分枝酰基甘油(MMG)作为佐剂的应用

发明领域

[0001] 本发明公开了单分枝酰基甘油(monomycolyl glycerol，MMG)、其合成同系物、类似物或修饰形式用于制备免疫调谐剂、佐剂、该佐剂和包含该佐剂的疫苗或递送系统的应用。

[0002] 一般背景

[0003] 第一疫苗由活体、减毒的病原体组成。该减毒形式是自然存在的密切相关的有机体或通过培养物中的连续传代而获得。例如，许多年来一直在用牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的减毒株接种疫苗(80多年前开发的牛分枝杆菌BCG疫苗)与人类的结核病(TB)斗争。然而，尽管已施用了超过30亿剂量的BCG(超过任何其他疫苗)，其不总是在每个群体中提供令人满意的对人类TB的抗性。

[0004] 现在，更新的方法是使用高度纯化的物质，例如纯化的重组蛋白或肽。这些疫苗是定义明确的，并且副反应被最小化。遗憾地，许多高度纯化的物质不是非常免疫原性的，并且不诱导足以赋予保护的免疫应答。为了达到这一目的，该抗原需要来自称为佐剂的免疫应答增强剂的一些帮助。取决于病原体，保护可能需要体液或细胞介导的应答占优势。可由免疫血清转移的免疫反应称为体液免疫，并且指的是由结合与传染剂相关的抗原物质并且因此触发针对它的免疫应答的抗体介导的抗性。细胞介导的免疫(CMI)依赖于装载免疫应答的免疫系统的细胞。CMI或T辅助细胞(Th)1免疫应答一般与胞内病原体(包括利什曼原虫和结核菌)的斗争相关，但还在与其他类型的感染(例如酵母感染念珠菌)的斗争中发挥作用。针对胞外病原体(例如蠕虫感染)的防御需要体液或Th2免疫应答。

[0005] 在取决于感染阶段的许多病例中，例如流感病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、衣原体和疟疾，可能需要混合的Th1/Th2应答(Mosmann和Sad 1996)。这些需要Th1和Th2二者，因为其生命周期的一部分在胞内，但是它们也经过胞外时期，例如细胞间的传输。

[0006] 特定种类免疫应答(体液或细胞介导的)的发展可通过佐剂的选择来确定。例如，针对比如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的胞内病原体的保护性免疫需要细胞介导的免疫应答，并且针对TB的亚基疫苗的适合的佐剂应增强Th1应答(Lindblad等1997)。

[0007] 存在许多佐剂，但这些的大多数经受阻止其在人类中使用的多种问题。只有少数佐剂被接受用于人类使用，例如基于铝的佐剂(AlOH-盐)和MF-59，但是它们二者都诱导偏向Th2的应答，这使其不适合用于TB疫苗和需要Th1应答的其他疫苗(Lindblad等1997)。

[0008] 在过去20-30年间，鉴定了许多新的佐剂系统，并且其中一些目前处于开发阶段。尽管如此，仍旧公认对新的佐剂系统的需要(Moingeon等2001)，并且在可用于临床应用的少数选择中该需要是明显的。

[0009] 佐剂(来自拉丁文adjuvare，意为帮助)可定义为当在疫苗中施用时用来指引、加速、延长和/或增强特定免疫应答的任何物质。佐剂被分为两个主要的类别即递送系统或免疫调谐剂/免疫刺激剂。递送系统可以是例如乳剂、聚苯乙烯颗粒、囊泡(niosome)、ISCOMS、病毒体、微球体或为由脂双层组成的小泡的表面活性剂样脂质体。脂质体作为抗原的载体(在小泡内或附着到表面上)起作用，并可在接种位点形成贮库，以允许抗原缓慢、连续的释放。注射和吞噬后一段时间，脂质体呈递确保特定量的抗原可用于单个抗原呈递细胞(Gluck 1995)。免疫调谐剂靶向特定的细胞或受体，例如APC表面上的toll样受体。递送系统和免疫调谐剂可一起使用，例如在Glaxo系列佐剂中。因此，除了递送疫苗外，抗原递送系统还可用于递送免疫调谐剂。

[0010] 除了是疫苗中的组分外，免疫调谐剂可不与抗原一起施用。通过这种方法，可能局部激活免疫系统，例如可见于抗原呈递细胞的成熟、对抗肿瘤和抗病毒活性重要的细胞因子的产生。因此，免疫调谐剂的施用可支持例如癌症和皮肤疾病的根除。可局部施用的免疫调谐剂的实例为紫杉烷(例如紫杉醇)、toll样受体7/8配体雷西莫特、咪喹莫特、Gardiquimod。

[0011] 二甲基双十八烷基铵-溴化物、-氯化物、-磷酸盐、-乙酸盐或其他有机或无机盐(DDA)是亲脂的季铵化合物，在高于40℃的温度下其在水溶液中形成阳离子脂质体。DDA是增强APC对疫苗抗原吸收的非常有效的递送系统。已描述了DDA和免疫调谐剂的组合。在人类中施用包含DDA的Arquad 2HT是有希望的，并且不诱导明显的副作用(Stanfield，
1973)。DDA和TDB或DDA和MPL的组合显示递送介质(DDA)和免疫调谐剂(TDB或MPL)之间非常明显的协同，与任一单独组分获得的应答相比具有高度升高水平的CMI应答。因此DDA是有希望的疫苗抗原和免疫调谐剂的递送介质，例如在用于针对TB和其他胞内病原体的疫苗的佐剂系统的开发中。

[0012] 已经报道，来自分枝杆菌的各种化合物是免疫调谐的。当使用从牛分枝杆菌BCG提取的脂质作为佐剂时，在豚鼠中获得对卵清蛋白的皮肤测试应答(Hiu 1975)。在升高温度下从牛分枝杆菌BCG的总极性脂质形成的脂质体能够产生对卵清蛋白的体液应答，并且从这些极性脂质制备的疫苗在用肿瘤细胞攻击的小鼠中产生保护(WO 03/011336)。(Dascher等2003)研究了在豚鼠的实验TB疫苗中来自结核分枝杆菌H37Rv的总脂质作为抗原的影响。此研究中，基于胆固醇和1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)的脂质体与结核分枝杆菌H37Rv总脂质提取物混合。去除溶剂之后，用二甲基双十八烷基铵(DDA)作为于PBS缓冲液中的佐剂重构脂质。用该疫苗免疫接种的豚鼠未显示细菌的明显减少，表明与DDA混合的脂质体的该制剂缺少强抗原，或者分枝杆菌脂质与胆固醇∶DSPC的制剂阻止了DDA的佐剂效应。可选地，当施用各种脂质的混合物时，有效的脂质可构成总脂质中非常有限的比例。

[0013] 还研究了从分枝杆菌纯化的各种组分的佐剂活性。纯化的蛋白衍生物(PPD)本身不诱导延迟类型的超敏反应，但是当加入Wax D(分枝杆菌细胞壁肽聚糖片段-阿拉伯半乳聚糖-分枝菌酸复合体)作为佐剂时，观察到强反应(Yamazaki S 1969)。免疫调谐剂SSM或Z-100，即一种从结核分枝杆菌提取的脂质阿拉伯甘露聚糖，具有抗肿瘤活性(Suzuki F1986)。另一种分枝杆菌细胞衍生的化合物是海藻糖6，6′-二分枝菌酸酯(TDM)(索状因子；含有分枝菌酸的糖脂)(Saito等，1976)。TDM(或合成类似物)还具有免疫刺激效应，并且已被包括于各种佐剂制剂中(McBride等1998)(Koike等1998)。

[0014] 在Silva等(1985)的论文中，从牛分枝杆菌BCG纯化的5个组分作为脂质包被的炭颗粒被静脉内注射，并在小鼠的肺中产生炎性反应。这5个组分包括TDM、海藻糖单分枝菌酸酯(MMT)、葡萄糖单分枝菌酸酯(MMGlc)、阿拉伯糖单分枝菌酸酯(MMAr)和甘油单分枝菌酸酯(MMGlyc)。文章描述了单分枝酰基甘油头基，而分枝菌酸组合物定义不明确，并且没有提供结构数据。另外，仅将施用脂质之后的反应描述为肺中的炎性活性，而没有描述增强已知作为佐剂效应的特定免疫应答的能力。

[0015] 尽管通过几十年来不断扩展的有关能刺激动物(鼠)模型中的免疫应答的脂质的文献已发现分枝杆菌衍生的脂质的免疫刺激和炎性活性，但迄今未鉴定到具有刺激人类树突细胞(DC)的能力的单个脂质。例如，尽管已显示TDM在促炎性应答方面是最有活性的分枝杆菌脂质，但没有观察到用TDM刺激后树突细胞的激活(Uehori等，2003)。因此，尽管在几篇文章中TDM已经显示出炎性活性，该脂质明显缺乏激活对起动免疫应答关键的树突细胞的能力。鉴定具有激活人类树突细胞能力的这类脂质将表明其可被用作将适合于在人类中使用的新的佐剂系统的一部分。此外，缺少适合于人类使用的诱导Th1的佐剂使鉴定单个的、分枝杆菌衍生的具有促进Th1能力的脂质成为重要的发现。

[0016] DC是专业的抗原呈递细胞(APC)，其在用诸如结核分枝杆菌的病原体感染后指导免疫应答中发挥重要作用。因此，通过活化的DC产生IL-12代表了控制结核分枝杆菌感染的重要步骤，因为正是该细胞因子在驱使促进巨噬细胞激活的Th-1细胞产生IFN-γ中至关重要(Nathan等1983)。此外，近年来发现了表明分枝杆菌还靶向DC以试图调谐免疫应答的证据，并已经确立了分枝杆菌脂质在这一过程中的关键作用。

[0017] 分枝杆菌胞外被膜多达40％的干重是由脂质组成(Minnikin 1982)。这些脂质长期与该家族有机体的特定致病性相关，并且已知在对分枝杆菌感染的宿主响应中发挥实际作用(Brennan和Goren 1979)。这些脂质中突出的是结核菌醇双结核蜡酸酯(phthiocerol dimycocerosate，PDIM)蜡(Minnikin等2002)，其存在被显示与致病性相关；PDIM缺陷的结核分枝杆菌突变体在小鼠中显示减缓的生长(Sirakova等2003)。与PDIM密切相关的是所谓的“酚糖脂”(PGL)，一个很好的实例是发现于牛分枝杆菌的2-甲基鼠李糖基酚-结核菌醇双结核蜡酸(“分枝杆菌糖脂B”)。近来已经证明该单糖基PGL与结核分枝杆菌的某些分离株的超毒性的联系(Reed等2004)。

[0018] 特别感兴趣的另一种脂质类别是海藻糖-6，6-二分枝菌酸酯(TDM)，即所谓的“索状因子”。通过刺激促炎性细胞因子诸如TNF-α、IL-6和IL-12以及促进Th-1的细胞因子IFN-γ的释放，TDM促进肉芽肿病变的维持(Lima等2001)，并且通过抑制吞噬体-溶酶体的融合在延长巨噬细胞内结核分枝杆菌的存活中发挥作用(Indrigo等2002)。TDM的分枝菌酸酯组分的精细结构对早期感染期间巨噬细胞的促炎激活是重要的(Rao等，2005)。

[0019] 尽管其在增强分枝杆菌存活中的作用，还可利用分枝杆菌脂质的免疫调谐能力来产生新一代的诱导Th1的佐剂。在鉴定具有有效免疫刺激活性的单个脂质时，可能能够避免与使用与油-弗氏完全佐剂(CFA)混合的结核分枝杆菌的热灭活全细胞相关的毒性问题-尽管其仍然保持有效的佐剂活性。实际上最近已经显示，从牛分枝杆菌卡介苗(BCG)的极性脂质形成的脂质体激活鼠骨髓衍生的树突细胞(BM-DC)。发现该活性的大部分归因于脂质糖磷脂磷脂酰肌醇二甘露糖苷(Sprott等2004)。

[0020] 近来我们实验室的研究已经鉴定了来自牛分枝杆菌BCG和二甲基双十八烷基铵溴化物(DDA)的分枝杆菌脂质的提取物的新的佐剂组合，其能促进复杂和持续的免疫应答，具有强的体液和细胞介导的组分二者(Rosenkrands等2005)。发现总BCG脂质的大部分佐剂活性归因于无极性脂质。

[0021] 尽管这些研究进一步证实了分枝杆菌脂质作为佐剂的潜力，优化的溶液将鉴定单独具有有效活性的单个最具免疫刺激性的脂质。这将代表甚至更简单、更便宜的佐剂，并且还将提高制备脂质的合成类似物的可能性，其允许在世界范围施用的疫苗中使用的佐剂所需要的可大量产生的更清洁的系统。

[0022] 发明概述

[0023] 本发明公开了能激活人类DC的免疫刺激脂质、单分枝酰基甘油(monomycolyl glycerol，MMG)及其合成的同系物、类似物和修饰形式。MMG衍生自总BCG脂质的无极性馏分，并且负责诱导与这些脂质相关的佐剂和保护作用。具有更小碳骨架的合成MMG能在体外增强天然MMG对人类DC的刺激特性，并且还在体内诱导强Th1应答，其解释为针对小鼠模型中TB的长效的保护性免疫应答。

[0024] 发明的详细公开内容

[0025] 本发明公开了单分枝酰基甘油(MMG)或其合成的同系物、类似物和修饰形式用于制备免疫调谐剂、佐剂和包含此佐剂的疫苗或递送系统的应用，所述佐剂具有刺激人类树突细胞的特殊能力。

[0026] 作为免疫调谐剂，MMG或其合成的同系物、类似物和修饰形式将不与抗原一起施用。通过此方法，可能局部地激活免疫系统，例如可见于抗原呈递细胞的成熟、对抗肿瘤和抗病毒活性重要的细胞因子的产生。

[0027] 佐剂(来自拉丁文adjuvare，意为帮助)可定义为当在疫苗中施用时用来指引、加速、延长和/或增强特定免疫应答的任何物质。取决于佐剂的性质，其可促进细胞介导的免疫应答、体液免疫应答或两者的混合。当用作疫苗佐剂时，向佐剂中加入抗原组分。由于佐剂介导的免疫应答的增强是非特异的，本领域中很好地理解，相同的佐剂可与不同的抗原一起使用来促进针对不同靶的应答，例如使用来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的抗原来促进针对结核分枝杆菌的免疫，或使用衍生自肿瘤的抗原来促进针对该特定种类肿瘤的免疫。

[0028] 本发明公开的优选佐剂是包含MMG或其合成的同系物、类似物或修饰形式的佐剂，其还包含递送介质，例如乳剂、聚苯乙烯颗粒、囊泡(niosome)、ISCOMS、病毒体、微球体、或表面活性剂样脂质体。优选的表面活性剂最优选地是基于二甲基双十八烷基铵溴化物或氯化物(DDA-B或DDA-C)或其硫酸盐、磷酸盐或乙酸盐(DDA-X)或者二甲基双十八碳烯铵溴化物或氯化物(DODA-B或DODA-C)或其硫酸盐、磷酸盐或乙酸盐化合物(DODA-X)的阳离子脂质。本发明中使用的其他类型的优选阳离子脂质包括但不限于1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1，2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵-丙烷、1，2-二棕榈酰-3-三甲基铵-丙烷、1，2-二硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷和二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)和N-[1-(2，3-二油基氧代)丙基]-N，N，N-三甲基铵(DOTMA)。其他表面活性剂在DXPC、DXPE、DXPG或其组合中选择，其中X是链长描述的替代，例如P＝棕榈酰(16C)、S＝硬脂酰(18C)、A＝花生酰(20C)。

[0029] 递送介质还可用于其他免疫调谐剂，诸如TLR和非TLR配体，比如MPL(单磷酰脂A)、聚肌胞苷酸(poly-IC)、胞壁酰二肽(MDP)、酵母聚糖、双链RNA(dsRNA)、DC-Chol、CpG寡聚脱氧核苷酸、阳离子肽、TDM、TDB、他莫昔芬或任何这些分子的任何类似物。因此，优选的佐剂包含MMG或其同系物、类似物或修饰形式，并且在递送介质中还包含TLR-或非TLR配体。

[0030] 包含MMG或其合成的同系物、类似物和修饰形式的递送系统可用于治疗癌症、自身免疫病症、例如阿尔茨海默病的神经病症、气道炎症、炎性病症、传染性疾病、皮肤病症、过敏、哮喘或由病原体引起的疾病。MMG或其合成的同系物、类似物和修饰形式与一种或多种疫苗、抗原、抗体、细胞毒性剂、过敏原、抗生素、反义寡核苷酸、TLR-和非TLR激动剂、TLR-和非TLR拮抗剂、肽、蛋白、基因治疗载体、DNA疫苗或共刺激分子组合施用。

[0031] 抗原组分或物质是与T和B细胞上预先形成的抗体和/或特定受体相互作用的分子。在接种疫苗的情况下，能刺激特定T或B细胞发育的分子导致免疫细胞记忆群体的形成，如果免疫细胞第二次遇到抗原，该免疫细胞记忆群体将促进更快的“记忆”应答。由于记忆群体很少是克隆的，实践中这意味着抗原是任何分子或分子的集合，当其与来自先前暴露其中的个体的免疫细胞再次相遇时可刺激免疫应答的增加。

[0032] 本发明进一步公开了用于肠胃外、口服或黏膜施用的疫苗或包含该佐剂的递送系统。优选的疫苗包含来自胞内病原体的抗原表位，所述胞内病原体例如毒性分枝杆菌(例如融合产物Ag85b_TB 10.4、Ag85b_ESAT-6_Rv2660、Ag85b_TB10.4_Rv2660和Ag85a_TB10.4_Rv2660)、恶性疟原虫(Msp1、Msp2、Msp3、Ama1、GLURP、LSA1、LSA3或CSP)、沙眼衣原体(例如CT184、CT521、CT443、CT520、CT521、CT375、CT583、CT603、CT610或CT681)、HIV、流感或乙型肝炎或丙型肝炎。佐剂或递送系统还可用在用于治疗癌症、过敏或自身免疫疾病的疫苗中。

[0033] 总分枝杆菌脂质提取物是通过化学或物理过程从例如BCG、田鼠分枝杆菌(M.microti)、结核分枝杆菌和母牛分枝杆菌(M.vaccae)的分枝杆菌获得的脂质混合物。本文中，用于提取的方法是有机溶剂的作用(如下文所述)，但如本领域技术人员所知，其他可能性是可能的。

[0034] 无极性脂质馏分定义为非极性脂质。无极性脂质馏分是通过用甲醇/盐水(saline)和石油醚的双相混合物处理分枝杆菌而获得的。石油醚提取物包含无极性(非极性)脂质。此后，通过向分枝杆菌和剩余的水相加入氯仿而获得极性脂质馏分。氯仿提取物含有剩余的极性脂质。无极性脂质馏分中的主要组分是结核菌醇双结核蜡酸酯(phthiocerol dimycocerosate)、三酰基甘油、海藻糖结核烯酸酯(trehalose mycolipenates)和甲基萘醌。极性脂质馏分的主要组分是磷脂，诸如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇。中等极性的脂质是硫脂、海藻糖分枝菌酸酯、糖基化酚结核菌醇(包括酚糖脂，PGL的)和酰基化海藻糖(Dobson等，1985)。

[0035] MMG指获自无极性脂质馏分的脂质单分枝酰基甘油和衍生物，例如α-MMG和酮MMG及其天然和合成类似物。MMG可通过以甲苯/丙酮(95∶5)运行的TLC分离。通过该方法PGL和MMG一起被提取，但可以氯仿∶甲醇∶0.880氨(97∶3∶0.5)在1-D TLC上分离。MMG的衍生物，α-MMG和酮-MMG可通过于100℃下在16×100mm管内与5％的TBAH水溶液(2.5ml)一起加热过夜而获得(Minnikin 1988)。

[0036] MMG的合成的同系物、类似物或修饰形式可通过任何传统的化学合成方法产生。类似物指结构相似但元素组成不同的一组化合物之一，而同系物指同系物系列化合物的任何成员。这些化合物可以具有不同的碳链长度；特别地，减小的尺寸与减弱的毒性相关，并且因此可用来减弱类似物的任何明显的毒性。因此，合成形式可基于具有例如8-36个碳和在每个脂质尾上具有0-3个双键的烃基链。可选地，简化形式可通过去除一个脂质尾来获得。合成的MMG的碳骨架尺寸优选地为C8-C36，例如3-羟基-2-乙基-己酸-2，3-二羟基丙酯(C8)、3-羟基-2-丁基-辛酸-2，3-二羟基丙酯(C12)、3-羟基-2-己基-癸酸-2，3-二羟基丙酯(C16)、3-羟基-2-庚基-十一酸-2，3-二羟基丙酯(C18)、3-羟基-2-十四烷基-十八烷酸-2，3-二羟基丙酯(C32)或3-羟基-2-十六烷基-二十酸-2，3-二羟基丙酯(C36)和最优选地C8或C16。修饰形式可通过用其他多元醇头基例如聚丙二醇和聚乙烯甘油来替换甘油部分来制备。合成单分枝菌酸酯以及甘油中C2和C3周围的立体化学可被改变。在下文单独写的MMG还指如上文所述的MMG的合成的同系物、类似物或修饰形式。

[0037] 抗原组分或物质可以是多肽或多肽的一部分，其在动物或人类和/或在通过本文所述的任何生物测定确定的生物样品中引发免疫应答。多肽的免疫原性部分可以是T细胞表位或B细胞表位。为了鉴定在免疫应答期间识别的相关T细胞表位，可能使用“蛮力”方法：由于T细胞表位是线性的，如果系统地被构建，多肽的缺失突变体将揭示多肽的哪些区域在免疫识别中是必需的，例如通过使这些缺失突变体经受例如本文描述的IFN-γ测定。另一种方法利用衍生自多肽的重叠寡肽(优选地合成的具有例如20个氨基酸残基的长度)。这些肽可在生物测定中测试(例如，如本文所述的IFN-γ测定)，并且这些肽中的一些将产生阳性应答(并且因此是免疫原性的)，如肽中T细胞表位的存在所证明。线性B细胞表位可通过分析B细胞识别以覆盖感兴趣多肽的重叠肽来确定，如例如Harboe等，1998中所述。

[0038] 尽管已显示T细胞表位的最小长度为至少6个氨基酸，正常的是此类表位由更长的氨基酸延伸构成。因此，优选的是本发明的多肽片段具有至少7个氨基酸残基的长度，诸如至少8个、至少9个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个和至少30个氨基酸残基。因此，在本发明方法的重要实施方案中，优选的是多肽片段具有至多50个氨基酸残基的长度，诸如至多40、35、30、25和20个氨基酸残基。预期长度介于10至20个氨基酸残基的肽将证明为最有效的诊断工具，并且因此在本发明方法中使用的多肽片段的特别优选的长度为18个，诸如15、14、13、12和甚至11个氨基酸。

[0039] 特别地，抗原物质可衍生自代谢的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和其他环境分枝杆菌例如鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)的培养物。特别地，来自此类分枝杆菌滤出液的感兴趣的物质是ESAT-6基因家族蛋白(诸如ESAT6和TB10.4)以及其他早期抗原(诸如Ag85A、Ag85B、ORF2c、Rv1036和Rv0285)，其为TB患者和不同动物模型中结核病早期的细胞介导免疫的主导靶。作为TB感染晚期主导靶的诸如Rv2653、Rv2655、Rv2656、Rv2657、Rv2658、Rv2659、Rv2660的其他抗原也是相关的。其本身的免疫原性是低的，但与本发明的佐剂组合相组合后，其变为激起高和持续的针对结核病的免疫的有力候选物，如本说明书下文详述部分中所证明。

[0040] 现在ESAT-6基因家族蛋白以及适用于与本发明的佐剂组合相组合的许多其他抗原可人工地产生，例如合成地或通过遗传重组技术。

[0041] 已证明融合蛋白特别适合作为疫苗中的抗原物质，例如已证明融合产物Ag85b_TB10.4、Ag85b_ESAT-6_Rv2660、Ag85b_TB10.4_Rv2660和Ag85a_TB10.4_Rv2660对TB非常有效。

[0042] 疫苗被定义为死的、减毒的或者以别的方式修饰的微生物(细菌、病毒或立克次体)或其一部分的悬浮液，其用于接种以便产生对疾病的免疫。疫苗可被预防性地施用来预防疾病或作为治疗性疫苗来与现存的疾病诸如癌症或潜在的传染性疾病斗争，但还与过敏和自身免疫疾病相关。疫苗可于合适的佐剂中乳化以加强免疫应答。

[0043] 疫苗以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的和免疫原性的量施用。待施用的量取决于待治疗的受治疗者，包括例如个体免疫系统装载免疫应答的能力和期望的保护程度。合适的剂量范围是每次接种几百微克级别的活性成分，优选范围从约0.1μg至1000μg，诸如在从约1μg至300μg的范围内，以及特别在从约1μg至50μg的范围内。
用于最初施用和加强注射的合适方案也是可变的，但其代表为最初施用然后随后接种或进行其他施用。

[0044] 应用方式可广泛地变化。用于疫苗施用的任何传统方法都适用。据信这些方法包括通过注射或类似方法肠胃外地在固体的生理可接受的基质上或在生理可接受的分散物中的口服或黏膜应用。疫苗的剂量将取决于施用途径，并且将根据待接种的人的年龄而变化，较少程度地将根据待接种的人的尺寸而变化。

[0045] 传统地将疫苗通过例如皮下或肌内注射而肠胃外施用。适合于其他施用模式的另外的制剂包括栓剂，在一些示例中，包括口服或黏膜制剂。对于栓剂，可包括常规的粘合剂和载体，例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯；此类栓剂可从含有范围为0.5％至10％，优选地为1-2％的活性成分的混合物形成。口服制剂包括此类正常使用的赋形剂，例如，制药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁和类似物质。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉剂的形式，并且有利地含有10-95％的活性成分，优选地为25-70％。

[0046] 可选择的疫苗可以是例如：

[0047] 蛋白疫苗：包含多肽(或其至少一个免疫原性部分)、肽混合物或融合多肽的疫苗组合物。

[0048] 活重组疫苗：非病原微生物或病毒中疫苗的相关抗原的表达。此类微生物的著名实例是牛分枝杆菌BCG、沙门氏菌和假单胞菌，而且病毒的实例是牛痘病毒和腺病毒。

[0049] 对于所有这些疫苗构建体，加入合适的佐剂导致增强的疫苗功效(Brandt等，2000)，(van Rooij等，2002)，(Ben-nekov等，2006)。

[0050] 脂质体(或脂小泡)是由脂双层包围的水相区室。脂质组分通常为磷脂或如表面活性剂的其他两亲分子，通常补充有胆固醇和其他带电荷的脂质。脂质体能包裹水和脂溶性化合物，因此允许脂质体作为载体起作用。在药理学和医学中，脂质体已用作递送系统，诸如免疫佐剂，其用于治疗传染性疾病和炎症、癌症治疗和基因治疗(Gregoriadis等1995)。可影响脂质体的佐剂作用的因素是脂质体的大小、脂质构成和表面电荷。此外，抗原的位置(例如其是否吸附或共价偶联于脂质体表面或封装于脂质体水相区室内)也可能是重要的。树突细胞可用作抗原递送介质。已显示将抗原加载至抗原呈递细胞诸如树突细胞是用于产生在抗肿瘤免疫中有作用的活性T细胞的有效方法。

[0051] 例如二甲基双十八烷基铵溴化物、氯化物或其他有机或无机盐类(DDA-B、DDA-C或DDA-X)、二甲基双十八碳烯铵氯化物、溴化物或其他有机或无机盐类(DODA-C、DODA-B或DODA-X)或者1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1，2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵-丙烷、1，2-二棕榈酰-3-三甲基铵-丙烷、1，2-二硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷和二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DO-DAP)和N-[1-(2，3-二油基氧代)丙基]-N，N，N-三甲基铵(DOTMA)的季铵化合物当分散于水相介质时能形成脂质聚集体，诸如脂双层、各种类型单层和多层脂质体、胶团和类似物。这些结构的脂膜为了包括显示为稳定小泡分散体的其他两亲性化合物(诸如糖脂，例如MMG或α，α′-海藻糖6，6′-二山嵛酸酯(TDB))提供了极好的基质(Davidsen等，PCT/DK2005/000467)。

[0052] MMG和递送系统的组合可以以协同的方式起作用来增强免疫应答，例如当单独施用DDA时。因此，DDA促进低水平IFN-γ的产生，然而在与MMG组合时，IFN-γ的生产被显著地提高。

[0053] 本发明的脂质体可通过本领域熟知的多种方法来制备(Davidsen等，PCT/DK2005/000467)。将MMG并入脂质体/递送系统可通过本领域熟知的多种方法来实现，其包括脂质体和MMG的简单混合。特别地，将MMG并入脂质体可如Davidsen等，PCT/DK2005/000467中所述来实现。

[0054] 除了提供对疾病的免疫外，本发明的佐剂组合还可用于产生针对本身为弱免疫原性物质的化合物的抗体，而且此类抗体可用于检测和定量例如在医学和分析化学中所研究的化合物。

[0055] 图注

[0056] 图1.牛分枝杆菌BCG的无极性和极性脂质的分离和免疫刺激活性的评估。从牛分枝杆菌BCG哥本哈根提取的极性和无极性脂质通过2-D TLC分析。在极性脂质馏分中，1-4是磷脂酰肌醇甘露糖苷，PI是磷脂酰肌醇，PE是磷脂酰乙醇胺，DPG是二磷脂酰甘油(心肌磷脂)。PG是L-α-磷脂酰-DL-甘油，而5和6是未知的磷脂。在无极性馏分中，TAG是三酰基甘油，PDIM是结核菌醇双结核蜡酸A、B和C，MMG是单分枝酰基甘油，PGL是酚糖脂，而FFA是游离脂肪酸(图A)。在单独的培养基、LPS(0.1μg/ml)、MPL(100μg/ml)、索状因子(CF)(100μg/ml)、无极性脂质(0.1-100μg/ml)或极性脂质(0.1-100μg/ml)存在时将iDC孵育24小时。显示了处理后DC的表面标志物水平的几何平均荧光强度(MFI)。数据获自使用三种不同供体的三次实验的一次代表实验(图B)。将用100μg/ml无极性或极性脂质处理后获得的培养物上清液通过ELISA分析细胞因子IL-6、TNF-α和IL-12的存在。显示了使用三种不同供体，从一式三份进行的三次实验的一次代表实验获得的数据(±s.e.m)(图C)。MLR测定中在与用100μg/ml无极性或极性脂质处理24小时的DC孵育后，来自PPD阴性供体的T细胞的增殖(图D)和IFN-γ释放(图E)。显示了使用三种不同供
体，从一式三份进行的三次实验的一次代表实验获得的数据(±s.e.m)。

[0057] 图2.MMG、TAG、PDIM和PGL的结构。单个脂质PDIM、TAG、PGL和MMG的2-D TLC分析(图A)和MMG、PGL、PDIM和TAG的代表结构(图B)。

[0058] 图3.MMG激活人类树突细胞。在单独的培养基(虚线)或MMG、PDIM、PGL或TAG(10μg/ml)存在时将iDC孵育24小时。发现脂质制剂不含内毒素污染(＜0.001ng LPS/μg脂质)。显示了处理后6个供体中的一个代表供体的DC的表面标志物水平的MFI(图A)。用MMG、PDIM A、PGL或TAG(10μg/ml)处理后获得的培养物上清液通过ELISA来分析细胞因子IL-6、TNF-α和IL-12的存在(图B)。显示了使用不同供体，从一式三份进行的3或4次实验获得的数据的平均值(±s.e.m.)。使用Tukey检验分析数据。

[0059] 图4.MMG的α-和酮分枝菌酸酯是免疫刺激的。在单独的培养基和MMG的α-或酮分枝菌酸酯(10μg/ml)存在时将iDC孵育24小时。显示了处理后DC的表面标志物的MFI。

[0060] 图5.由分离自牛分枝杆菌BCG哥本哈根的MMG所诱导的IFN-γ释放。将C57BL/6小鼠用Ag85B-ESAT-6与基于脂质的佐剂的组合进行免疫接种，所述脂质是分离自并入DDA脂质体的BCG哥本哈根。测量了接种疫苗几天之后分离自引流淋巴结的PBMC的IFN-γ释放。

[0061] 图6.MMG佐剂对有毒TB感染的保护。用Ag85B-ESAT-6与基于DDA的佐剂和10或50μg MMG的组合对C57BL/6小鼠免疫接种3次。最后接种疫苗的6周后，小鼠接受用结核分枝杆菌的气溶胶攻击。6周后测量肺和脾中细菌的数目。包括了接受标准BCG接种的小鼠作为阳性对照，而且用不含抗原的DDA/MMG(10μg)免疫接种的小鼠作为阴性对照。实验疫苗的保护功效被表示为与未免疫接种的小鼠相比肺中细菌载量的Log 10减少。结果是每组6只小鼠的平均值±SEM。显著不同于未免疫接种对照的值被标记为*P＜0.05。

[0062] 图7.通过组合MMG和DDA增强IFN-γ释放。在2次实验中，用DDA或DDA/MMG(图A)或者MMG或DDA/MMG(图B)中的Ag85B-ESAT-6对C57BL/6小鼠免疫接种。测量了最后一次接种疫苗3周之后分离自血液(图A)或脾中(图B)的PBMC的IFN-γ释放。

[0063] 图8.向MMG/DDA组合中加入TDB增强IFN-γ的释放。将C57BL/6小鼠用在MMG中施用的Ag85B-ESAT-6免疫接种，其中所述MMG被并入DDA脂质体或含有TDB的DDA脂质体。测量接种疫苗5个月之后分离自血液的PBMC的IFN-γ释放。

[0064] 图9.合成的MMG类似物的结构的实例。

[0065] 图10.免疫应答与天然和合成的MMG类似物是可比较的。用DDA、DDA/MMG(10μg)、DDA/MMG C36(10μg)或DDA/MMG C16(10μg)中的Ag85B-ESAT-6对C57BL/6小鼠免疫接种。测量最后一次免疫接种1周之后分离自血液的PBMC的IFN-γ释放。

[0066] 图11.具有更短的链长度的更高的免疫应答。用DDA或具有范围从8至36链长的各种MMG类似物(1μg/剂量)的DDA中的Ag85B-ESAT-6对C57BL/6小鼠免疫接种。测量最后一次免疫接种3周之后分离自血液的PBMC的IFN-γ释放。实施例

[0067] 材料和方法

[0068] 从牛分枝杆菌BCG提取无极性和极性脂质

[0069] 牛分枝杆菌BCG(哥本哈根)在改良的Sauton培养基中培养。2-3周后收集分枝杆菌，悬浮于PBS中，并通过于60℃下孵育1.5小时将其杀死。根据标准方案提取无极性和极性脂质(Dobson等，1985)，(Rosenkrands等，2005)。

[0070] 对于无极性脂质的提取，将甲醇∶0.3％NaCl(440ml)和440ml石油醚加入到20g分枝杆菌中(湿重)，并将混合物搅拌2小时。离心后，去除上层，并用440ml石油醚重新提取下层。来自两次提取的上清液相被集中并蒸发以产生无极性脂质。

[0071] 对于极性脂质的提取，含有生物质的甲醇盐水溶液在沸水浴中于100℃下加热10分钟，然后于37℃下冷却10分钟。加入体积为520ml的氯仿∶甲醇∶0-3％NaCl(9∶10∶3)，并将混合物搅拌过夜。总混合物通过烧结的玻璃漏斗；收集滤饼并用
170ml氯仿∶甲醇∶0-3％NaCl(5∶10∶4)重新提取2次。集中所有三种水性甲醇氯仿相，并加入580ml氯仿∶0.3％NaCl水溶液(1∶1)，搅拌10分钟。在允许所述相分离之后，去除上层水层并弃掉。下层有机层被蒸发至干燥以提供极性脂质。

[0072] 单个无极性脂质的纯化

[0073] 使用以石油醚/丙酮(98∶2)运行的TLC来分离PDIM和TAG；仅回收基于结核菌醇A的PDIM的主要组分。通过以甲苯/丙酮(95∶5)运行的TLC来一同分离PGL和MMG。以氯仿∶甲醇∶0.880氨(97∶3∶0.5)在1-D TLC上分离PGL和MMG。使PDIM、
1 13
TAG、PGL和MMG经过500MHz的 H和 C核磁共振(NMR)(Bruker drx500)和MALDI-TOF质谱(MS)(BrukerBiflex IV)。通过SDS-PAGE来分析重新水合的脂质提取物(1mg/ml)的样品(10μl)(Laemmli等，1970)并进行银染(Blum等，1987)以分析残留的蛋白含量。发现脂质制品不含内毒素污染(＜0.001ng LPS/μg脂质)。

[0074] 单分枝酰基甘油的水解

[0075] 单分枝酰基甘油于100℃下与5％TBAH水溶液(2.5ml)在16×100mm管内加热过夜(Minnikin等，1988)。冷却后，用水(2ml)稀释混合物，并加入二氯甲烷中的碘甲烷的10％溶液(3ml)，并将管置于旋转器上1小时。弃掉上层水层，用等体积的1M HCl和水洗涤下层并蒸发至干燥以产生残留物，该残留物通过TLC(石油醚∶丙酮95∶5)显示含有α-和酮分枝菌酸酯甲酯。制备的TLC(如上文)产生α-甲基分枝菌酸酯和酮甲基分枝菌酸酯。

[0076] 使用三甲基甲硅烷基衍生化来分离α-MMG和酮-MMG。将MMG混合物和600ml TRI-SIL试剂(Pierce)于75℃下加热20分钟。然后在氮气流中将冷却的溶液干燥，并加载至制备的TLC平板，并在石油醚∶甲苯(50∶50)中展开，并使用0.01％罗丹明将α-MMG和酮-MMG条带显影，并在长波荧光下检查。从TLC平板上刮下对应的条带，并使用二乙醚从硅胶提取α-MMG和酮-MMG 3次(3×5mL)。将集中的提取物干燥，并通过加入庚烷∶甲醇(1∶1)和对甲苯磺酸的一些晶体来去除三甲基甲硅烷基基团并混合1小时。回收庚烷层并蒸发至干燥以获得纯化的α-MMG和酮-MMG。

[0077] 显示C36产生的MMG的合成

[0078] 3-羟基-2-十四烷基-十八烷酸(合成的C32白喉菌酸，根据Datta等，1991合成)(100mg，0.20mmol，1当量)和4-吡咯烷基吡啶(100mg，3当量)置于50ml圆底烧瓶中，并加入二氯甲烷(500μl)中的50μl 2，2-二甲基-4-羟甲基-1，3-二氧戊烷(sn-异亚丙基甘油)溶液以及 的分子筛。混合物在室温高真空下进行完全干燥，并加入N′，N-二环己基羰基二咪唑(DCC)(15ml，于DCM中的0.1M DCC，5当量)，使反应留在室温下搅拌过夜。通过过滤去除分子筛，在真空中将反应混合物减少至干燥，并使用快速柱层析(Fluka 60741硅胶60)来纯化残留物，用己烷至己烷∶乙酸乙酯(8∶2)以5％的增量来洗脱以便以56％的产率(68mg)产生纯的异亚丙基保护的化合物(3-羟基-2-十四烷1
基-十八烷酸-2，2-二甲基-[1，3]-二氧戊烷-4-基甲酯)。H NMR(CDCl3，300MHz)δH
0.90(t，6H，CH3)、1.20(s，54H，CH2)、1.40(s，3H，CH3)、1.45(s，3H，CH3)、2.50(m，1H，CH)、
13
4.05-4.40(m，5H，CH2，CH)；C NMR(CDCl3，75MHz)δc15.0(CH3)、22.1、28.8、28.9、29.0、
31.4(CH2)、29.1(CH3)、52.1(CH(CH2)13CH3)、63.2(CH2OCO)、69.3(CH2O)、73.4(CH(CH2)14CH3)、+ +
174.3(C＝O)；m/z(EI)633.55[M+Na](100％)；HRMS计算为C38H74O5Na[M+Na]633.5536实测为633.5527。

[0079] 3-羟基-2-十四烷基-十八烷酸-2，2-二甲基-[1，3]-二氧戊烷-4-基甲酯(68mg，1当量)溶解于6ml的三氟乙酸∶四氢呋喃∶水(8∶17∶3，根据体积)溶液中，并于室温搅拌过夜。溶液用饱和的碳酸氢钠水溶液中和，并将混合物用氯仿提取2次。将有机提取物用水和盐水(brine)洗涤、干燥并置于真空中以减少至产生白色固体的粗产物，其通过10g硅胶Varian Bond Elut12256026柱体上的快速柱层析来纯化，用己烷至己烷∶乙酸乙酯(7∶3)以5％的增量来洗脱以便以49％的产率(32mg)产生作为白色固1
体的标题化合物。熔点为72-74℃。H NMR(CDCl3，300MHz)δH 0.90(t，6H，CH3)、1.25(s，
13
54H，CH2)、2.50(m，1H，CH)、3.45-3.85(m，3H，CH，CH2)、4.25(m，2H，CH2)；C NMR(CDCl3，
75MHz)δc15.0(CH3)、26.3、30.9、313、33.5(CH2)、47.5(CH(CH2)13CH3)、68.4(CH2)、+
69.5(CH(CH2)14CH3)、72.5(CH2O)、76.4(CH)、175.4(C-1)；m/z(EI)593.50[M+Na](100 ％ )；
+
HRMS计算为C35H70O5Na[M+Na]593.5121实测为593.5143。

[0080] 树突细胞测定

[0081] 根据从Romani等，1994改进的方法来获得人类PBMC衍生的DC。从血沉棕黄层获得外周血。简言之，通过Ficoll-Hypaque离心分离单核细胞(Lymphoprep 1077中密度，Nycomed，Oslo，挪威)，然后使用抗CD14标记的磁珠(MACS；Miltenyi Biotech，Bergesh Gladbach，德国)分离CD14阳性细胞。将单核细胞在补充有10％FCS、50μM 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺(都是Gibco)(CM)的完全RPMI1640中以及100ng/ml人类重组GM-CSF(Prepotech，Rocky Hill，NJ，USA)和50ng/ml人类重组IL-4(Becton Dickinson(BD))的存在下于37℃、5％CO2中培养7天。

[0082] 在第7天，iDC(1×105个细胞/ml)与脂多糖(LPS)(大肠杆菌O127：B8)(Sigma-Aldrich，Brondby，丹麦)或牛分枝杆菌BCG衍生的脂质一起再培养24小时。通过用氯仿∶甲醇(2∶1)重新溶解干燥的牛分枝杆菌脂质物质然后蒸发溶剂并将超声深入CM来制备脂质提取物。将脂质以0.1至100μg/ml加入到不成熟的DC中。

[0083] 流式细胞计量分析

[0084] 通过首先与相关mAb(BD Pharmingen)孵育(30分钟，4℃)然后与1/20稀释的FITC-轭合的山羊抗小鼠Ig(Jackson ImmunoResearchLaboratories，West Grove，PA)孵育(30分钟，4℃)来对DC染色以用于表面标志物。在加入相关的人类一抗mAb之前，用10％胎牛血清溶液阻断非特异性Ab结合(15分钟，4℃)。使用FACScan流式细胞计量仪(BD)立即通过流式细胞计量术检查染色的细胞，并用CellQuest软件来分析。

[0085] 细胞因子的测量

[0086] 收集DC培养物的上清液并储存于-20℃。根据制造商的说明书通过ELISA(BD)测量分泌的IL-12p70、IL-6和TNF-α。

[0087] 混合的白细胞反应(MLR)测定

[0088] 用于混合的淋巴细胞反应(MLR)测定的iDC从如上文所列的单核细胞所产生。得到的细胞在相同培养基(iDC)中或在含有脂质(10或100μg/ml)的培养基中培养24小5 5
时。从0.125×10 至2×10 的DC滴定物(titrations)与来自PPD阴性供体的异源T细
5
胞(10 个细胞/孔)在37℃/5％CO2下于平底96-孔微量滴定板中一起孵育。根据制造商的说明书使用Pan-T细胞分离试剂盒(Miltenyi)来分离T细胞。将DC异源T细胞共培养物孵育6天。收集上清液并储存于-20℃下直至根据制造商的说明书通过ELISA(BD)来
3
测量分泌的IFN-γ。然后用含有1μCi/孔[H]胸苷的培养基在培养的最后18小时对两个测定物(assays)进行脉冲。收集细胞并通过液体闪烁计数(Microbeta Systems)来测量T细胞增殖。使用至少三种不同的供体一式三份地进行所有测定。

[0089] 抗原

[0090] 如前所述，Ag85B和ESAT-6(下文命名为Ag85B-ESAT-6)的融合蛋白作为重组蛋白产生(Olsen等，2001)。

[0091] 动物

[0092] 8至12周大的雌性BALB/c或C57BL/6小鼠获自Bom-holtgaard(Ry，丹麦)或Harlan Scandinavia(丹麦)。感染的小鼠被保持在BL-3层流安全罩内的笼中。

[0093] 免疫接种

[0094] 在尾巴根部经皮下(s.c.)免疫接种小鼠多至3次，每次免疫接种之间间隔两周。疫苗(0.2ml/小鼠)是由在250μg DDA中乳化的2μg融合蛋白Ag85B-ESAT-6和10μg重新水合的脂质提取物所组成的，除非另外指明。在一些实例中，将11mol％TDB并入DDA脂质体(Davidsen等，PCT/DK2005/000467)。作为涉及结核分枝杆菌感染的实验中的阳性对照，单组小鼠在尾巴根部接受一剂BCG Danish 1331的皮下注射。通过用MilliQ水以1或5mg/ml将干燥的牛分枝杆菌脂质物质重新水合然后将超声深入来制备总的或单个的脂质提取物。通过混合抗原与盐水、然后加入重新水合的脂质提取物和DDA并涡旋混合来制备标准的脂质疫苗。保持疫苗过夜以允许抗原吸附。

[0095] 淋巴细胞培养物

[0096] 在最后一次免疫接种7-150天之后从小鼠中提取血液样品或腹股沟淋巴结，并如5
前文所述制备(Rosenkrands等，2005)。细胞培养物在含有2×10 个细胞、体积为200μl的补充有2-巯基乙醇、谷氨酰胺、青霉素-链霉素、hepes和10％胎牛血清的RPMI的圆底微量滴定孔中一式三份地进行。使用浓度为5μg/ml的抗原用于重新刺激。仅含有培养基或
5μg/ml ConA的孔被包括在所有实验中，其分别作为阴性和阳性对照。在抗原存在时孵育
72小时之后从平行培养物中收集培养物上清液，并通过酶联免疫吸附测定来确定IFN-γ的量(Brandt等，2000)。

[0097] 实验感染

[0098] 为了评估疫苗的功效，在第一次免疫接种2.5个月之后通过气溶胶途径在Glas-Col吸入暴露系统中攻击小鼠，其中所述Glas-Col吸入暴露系统被校准为在肺中沉积大约25CFU的毒性结核分枝杆菌Erdman。6周后通过将系列稀释物铺板于补充有用来选择性抑制BCG生长的每毫升2μl 2-噻吩-羧酸酰肼的Middlebrook 7H11琼脂上来确定脾和肺中的细菌载量。在37℃下孵育2-3周后对菌落计数。

[0099] 统计分析

[0100] 通过方差分析来测试受感染小鼠和对照小鼠之间菌落数目的差异。当指示显著作用时，通过Dunnett检验来评估平均值之间的差异。对于人类DC测定，通过方差分析来测试对不同脂质响应的细胞因子的释放的差异，并且当指示显著作用时，通过Tukey检验来评估平均值之间的差异。

[0101] 实施例1

[0102] 来自牛分枝杆菌BCG的无极性脂质的分离和免疫刺激活性

[0103] 牛分枝杆菌BCG的总脂质被分为极性和无极性馏分。在极性馏分中，可被鉴定的脂质是磷脂酰肌醇甘露糖苷(1-4)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二磷脂酰甘油(DPG)和L-α-磷脂酰-DL-甘油(PG)。还鉴定了许多未知的磷脂(7和8)(图1A)。在无极性馏分中，鉴定的主要脂质是结核菌醇双结核蜡酸(PDIM)、三酰基甘油(TAG)、酚糖脂(PGL)和单分枝酰基甘油(MMG)(图1)。FFA是游离脂肪酸。

[0104] 使用人类外周血单核细胞衍生的不成熟DC(iDC)来检查无极性和极性脂质的免疫刺激活性的比较(图1)。与未处理的对照相比，无极性脂质的处理导致活化标志物CD86、CD40和HLA-DR水平的剂量依赖性升高(图2B)。100μg/ml无极性脂质的剂量导致可与用有效免疫刺激分子LPS(0.1μg/ml)观察到的活化相比较的以及与分枝杆菌索状因子(TDM)和MPL相比更强的DC活化。这些分子的向上调节伴随着促炎调谐剂肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-6和IL-12的分泌(图2C)。用极性脂质处理的iDC的上清液中这些促炎细胞因子的水平低于使用该测定的检测极限。最后，我们使用来自PPD阴性供体的异源T细胞的混合白细胞反应(MLR)(图2D&E)作为DC活化的另一个读数。进一步支持用无极性脂质处理的DC的高活化状态，我们发现了高水平的增殖和IFN-γ释放，而极性馏分没有诱导MLR。

[0105] 实施例2

[0106] 从牛分枝杆菌BCG的无极性脂质提取物分离单个脂质以及MMG的表征

[0107] 使用制备的TLC来分离来自免疫刺激性无极性馏分的脂质以产生纯的结核菌醇双结核蜡酸A(PDIM A)、TAG、PGL和MMG的样品；还检测了少量结核菌醇B和结核菌酮A，但1
没有由所采用的制备方法来对其回收(图2A)。通过 H核磁共振(NMR)和质谱(MS)来确
1
认脂质的结构和身份(图2B以及数据未显示)。MMG组分显示出1-单酰基甘油特征的 H
13
和 C NMR谱(Gunstone等，1991)。MALDI-TOF MS与总MMG馏分的NMR数据的结合(表1)揭示了顺式和反式形式α-分枝菌酸酯和酮分枝菌酸酯的存在。主要组分的大概比例分别为1.00∶0.29∶0.24。

[0108] 表1：纯化MMG的MALDI-TOF质谱。信号是M+Na+离子的m/z。系列的主要组分显示为黑体，其中主要组分加了下划线。

[0109]MMG
碳数目
c-酮 t-酮 α
1206 79
1234 81
1262 83
MMG
碳数目
1306 84
1335 86
1349 87
1363 88
1377 89
1391 90
1405 91

[0110] 实施例3

[0111] MMG对人类树突细胞的活化

[0112] 评估纯化的MMG、PDIM A、PGL和TAG的活化人类iDC的能力。在这些测定中，一致地发现MMG是DC活化最有效的诱导剂，其导致CD86、CD40和HLA-DR的显著向上调节(图3A)。MMG在活化DC方面甚至超过PDIMA，即一种长期与分枝杆菌致病性相关的脂质(Cox等，1999)，其作为第二个最有活性的脂质出现，而PGL和TAG诱导更低的活化。在6个单独的供体中，观察到的活化顺序为MMG＞PDIM A＞PGL＞TAG，而且与未处理的iDC相关的水平之上的CD86水平的平均增加倍数分别为1.91±0.29、1.82±0.43、1.52±0.26和
1.32±0.14。细胞因子的诱导遵循与突出作为最有效的免疫刺激脂质的MMG相同的整体趋势(图3B)。暴露于MMG的DC释放的IL-6水平显著高于PGL或TAG诱导的IL-6的水平
(P＜0.05)。没有记录到其他脂质诱导的细胞因子之间的显著差异。因此MMG可被归类为牛分枝杆菌BCG的无极性脂质馏分中最有效的免疫刺激脂质。

[0113] 实施例4

[0114] α-和酮-MMG的免疫刺激活性

[0115] 本实施例中，我们希望进一步剖析MMG的刺激特性并鉴定负责其有效免疫刺激能力的活性组分。在制备了MMG的三甲基甲硅烷醚、制备的TLC和随后的三甲基甲硅烷醚保护基团的水解之后，分离α-MMG和酮-MMG以得到α-MMG和酮-MMG。α-和酮-分枝菌酸酯的结构被记录于图2B。当评估其活化人类iDC的能力时，α-和酮-MMG以活化标志物的水平2-3倍增加的顺序刺激(图4)。因此，MMG的两个亚组分还表现出显著的刺激人类DC的能力。

[0116] 实施例5

[0117] 从牛分枝杆菌BCG分离的MMG对Th1免疫应答的诱导

[0118] 为了研究MMG的佐剂活性，测试了分离的脂质在小鼠中诱导IFN-γ产生的能力。C57BL/6小鼠被施用10μg总的或单个脂质。在体内，DDA作为介质来递送脂质。因此，将
2μg融合蛋白Ag85B-ESAT-6和于250μgDDA中乳化的10μg重新水合的脂质提取物通过皮下途径施用。被并入DDA脂质体的10μg剂量的MMG在分离自引流淋巴结的PBMC重新刺激后导致10ng/ml的IFN-γ水平；该水平可与在同等剂量的DDA中记录的总脂质水平相比较(图5)。PDIM-A还诱导IFN-γ的产生，尽管是较低的水平，而具有并入的TAG或PGL的DDA脂质体促进很少的IFN-γ释放(图5和数据未显示)。应注意，这些单个脂质似乎作为佐剂发挥作用，因为用总脂质提取物或单个脂质重新刺激后没有观察到回忆应答(数据未显示)。因此MMG还被鉴定为体内最有活性的无极性脂质，其可单独作为BCG衍生的总脂质的大部分佐剂活性的原因。

[0119] 实施例6

[0120] 基于MMG的佐剂的保护功效

[0121] 为了评估基于MMG的佐剂提供针对TB感染的保护的能力，使用在MMG(2种不同的剂量)和DDA中递送的Ag85B-ESAT-6对C57BL/6小鼠免疫接种。包括接受BCG疫苗接种和单独的佐剂的小鼠组以分别作为阳性和阴性对照。在最后一次接种疫苗6周之后，通过气溶胶途径用活的结核分枝杆菌攻击小鼠。6周后在肺和脾中测量疫苗降低细菌载量的能力。这些数据显示了使用MMG/DDA作为佐剂的显著的保护水平，并且保护水平可与BCG的保护水平相比较(图6)。如预期，该效应是特异的，因为用不含抗原的佐剂接种的小鼠不能抑制细菌生长。

[0122] 实施例7

[0123] 组合MMG和DDA的更好效应

[0124] 为了评估组合免疫调谐剂(MMG)和递送系统(DDA)的作用，用单独的DDA或DDA/MMG的组合(实施例1，图7A)或实施例2中(图7B)用单独的MMG或DDA/MMG的组合接种C57BL/6小鼠。根据这些实验，清楚的是通过组合DDA和MMG显著增强了免疫应答。

[0125] 实施例8

[0126] 将TDB/THIRD组分并入MMG和DDA脂质体对免疫应答的增强

[0127] 为了研究当与其他免疫刺激组分组合时对MMG佐剂活性的作用，在用Ag85B-ESAT-6和被并入DDA脂质体或含有并入的免疫调谐剂TDB的DDA脂质体的10μg MMG进行皮下免疫接种之后(Davidsen等，PCT/DK2005/000467)，在第一次疫苗接种5个月之后评估C57BL/6小鼠中的免疫应答。尽管并入DDA脂质体的MMG的组合在对分离自血液的PBMC重新刺激后导致～25ng/ml的IFN-γ水平，当采用具有并入的TDB的DDA脂质体时，IFN-γ的释放显著升高(图8)。因此，MMG、DDA和TDB之间观察到协同效应，表明向MMG和DDA组合中加入第三个组分可进一步增强佐剂活性。

[0128] 实施例9

[0129] MMG类似物的佐剂活性可与天然MMG的佐剂活性相比较

[0130] 为了评估合成的MMG类似物的免疫效应，用于具有天然MMG、含16个碳的合成的MMG类似物(如图9所示)和含36个碳的合成的MMG类似物(如图9所示)(都是10μg/DDA/MMG)的DDA中的Ag85B-ESAT-6对C57BL/6小鼠免疫接种。最后一次疫苗接种1周后测量血中的免疫应答，并显示使用3种基于MMG的佐剂的可比较水平的应答，而DDA本身再次显示较低的作用。

[0131] 实施例10

[0132] 较短的链长度的较强免疫应答

[0133] 为了评估具有较短链长度的合成的MMG类似物的免疫效应，使用在单独的DDA、具有天然MMG的DDA、具有范围从C8至C36的不同合成类似物的DDA(都是1μg/剂量)中的Ag85B-ESAT-6对C57BL/6小鼠免疫接种。最后一次疫苗接种3周之后测量血中的免疫应答，并证明即使在1μg的剂量水平下，合成的MMG类似物是活化的。此外，这些结果还证明与天然MMG相比具有较短(从16C或更少)的合成的MMG类似物更有效。***P＜0.001(图11)。

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