用于使化合物靶向多种选定器官、组织或肿瘤细胞的分子

摘要

本发明提供了包含与部分连接的器官、组织或肿瘤细胞归巢分子的偶联物。这样的部分例如能够是寡核苷酸、小干扰RNA、基因、病毒、蛋白、药物或可检测剂。此外，本发明提供了通过给予患有或疑似患有病变的个体分子或偶联物以诊断或治疗神经元或神经肌肉疾病、或脑病变、或者神经元或神经外胚层来源的肿瘤的方法，所述分子或偶联物归巢于、结合于脑细胞或神经元细胞或者神经元或神经外胚层来源的肿瘤细胞并被其摄取。本发明还提供了识别和测量神经元细胞中轴突生长的方法。

权利要求

1.与选自生物活性部分和诊断部分的部分连接的肽或模拟肽的偶联物，所述肽或模拟肽包含选自LPWKPLG(SEQ ID NO：2)和THRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：1)的序列或由选自LPWKPLG(SEQID NO：2)和THRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：1)的序列组成。

2.如权利要求1所述的偶联物，其中所述生物活性部分选自DNA、RNA或其类似物，诸如包含2’-O-烷基特别是2’-O-甲氧基乙基-和2’-O-甲基、或2’-O-烯基(烯丙基)或2’-O-炔基核苷酸的化合物，锁核酸(LNA)，肽核酸(PNA)，乙烯桥联核酸(ENA)，硫代磷酸修饰的核苷酸，基于吗啉代的核苷酸及其组合。

3.如权利要求1所述的偶联物，所述偶联物是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：1的肽与治疗活性蛋白和/或诊断蛋白的融合蛋白。

4.如权利要求3所述的偶联物，其还包含核定位信号。

5.权利要求1-4中任一项所述的偶联物用于制备使生物活性部分或诊断部分穿过血脑屏障靶向脑细胞、神经元细胞或者神经元或神经外胚层来源的肿瘤细胞的药物的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其中所述药物用于治疗脑病症。

7.如权利要求5所述的用途，其中所述药物用于治疗神经元或神经肌肉疾病。

8.如权利要求5所述的用途，其中所述药物用于治疗神经元或神经外胚层来源的肿瘤。

9.分子，其包含肽或模拟肽以及用于将所述分子与生物活性部分或诊断部分连接的连接部分，所述肽或模拟肽包含选自LPWKPLG和THRPPMWSPVWP的序列或由选自LPWKPLG和THRPPMWSPVWP的序列组成，所述连接部分不是肽。

10.包含肽或模拟肽的偶联物用于制备监测神经元细胞中轴突生长的组合物的用途，所述肽或模拟肽包含序列THRPPMWSPVWP或由序列THRPPMWSPVWP组成。

说明书

用于使化合物靶向多种选定器官、组织或肿瘤细胞的分子

发明领域

[0001] 本发明涉及体内靶向领域，并提供了归巢于、结合于多种器官或组织或肿瘤细胞并被多种器官或组织或肿瘤细胞摄取的分子。

[0002] 发明背景

[0003] 大多数治疗性化合物通过循环递送至靶器官或组织。然而，在大多数情况下，药物或其它治疗不仅靶向患病器官或组织，而且会被体内的其它器官和组织吸收。这由于例如遍及患者身体的普遍毒性效应而导致不期望的副作用。因此，选择性靶向特定器官或组织或特定类型的肿瘤细胞是理想的。另外，将治疗性化合物与靶向分子偶联能够改善被靶向的组织或细胞对化合物的摄取性质，这产生更有效的分子。因此，与靶向分子偶联获得相比于母体化合物更有效且毒性更低的化合物，参见Curnis et al.，2000，Nature Biotechnol.18，1185-1190。这能够应用于多种化合物，例如肽、蛋白质、细胞抑制剂、抗菌素和抗病毒剂。

[0004] 在诸如强直性肌营养不良(MD)或脊髓性肌萎缩(SMA)的神经肌肉疾病的情况下，转运穿过血脑屏障并摄入神经元细胞对于有效治疗是必须的。神经元特异性肽能够与例如反义寡核苷酸(AON)和小干扰RNA(siRNA)结合。AON和siRNA通过阻断不期望基因的转录而具有用作治疗特定疾病的新型药品的高效能。在SMA治疗领域中，反义诱导的外显子增加(antisense-induced exon inclusion)作为用于校正SMN2(运动神经存活2)转录的翻译读码框的新颖且有前景的工具而备受关注。其目的是以增加被靶向的外显子(通过将AON与前体mRNA结合)的方式操纵剪接。这允许校正翻译读码框，并诱导合成全长SMN蛋白。

[0005] 已有若干报道显示出外显子增加策略用于恢复全长SMN蛋白生成的治疗作用(Hua et al.，2007，PLoS Biol.5，e73；Baughan et al.，2006，Mol.Ther.14，54-62)。然而，要克服的最大障碍是这些AON体内神经元摄取差和穿过血脑屏障的转运障碍。对于其它神经元疾病或脑疾病(例如阿尔茨海默病、帕金森病等)，问题非常相似，即治疗性或诊断化合物体内摄取差。

[0006] 在神经元或神经外胚层肿瘤(例如神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤等)的情况下，靶向作用对于产生无副作用的有效治疗也是很重要的。化学治疗药物能够作用于正常组织和癌组织，这导致对这种靶向作用的需求。对于基于反义寡核苷酸(AON-)或小干扰(si)RNA的药品，已知药代动力学性质不利于游离药物在肿瘤部位达到足够的水平，因为大多数被肝脏和肾脏吸收。递送化学治疗剂的载体必须显示出足够的半衰期以有效递送治疗剂至期望细胞，还越过血脑屏障。

[0007] 鉴于以上所述，进一步改善递送系统是实现诸如AON的药剂的体内特异性摄取明显所需的。

[0008] 发明概述

[0009] 本发明的目的是提供化合物，优选肽或模拟肽(peptidomimetic)，其归巢于感兴趣的器官或组织或细胞型，特别是脑细胞或神经元细胞，或者神经元或神经外胚层来源的肿瘤细胞。通过将诊断部分或具有生物活性的部分与这样的归巢化合物(homing compound)偶联，使所述部分靶向特定器官或组织或细胞。

[0010] 在广泛研究后，本发明人已经鉴定出两种与脑细胞、神经元细胞以及神经元或神经外胚层来源的肿瘤细胞选择性结合并被其摄取的肽。因此本发明通过将这样的寡核苷酸与这些特异性肽结合而满足了改善例如(反义)寡核苷酸体内摄取的需要。分子有利地用于治疗神经肌肉疾病、脑疾病或神经元或神经外胚层来源的肿瘤的反义治疗方法、以及将多种诊断或药物穿过血脑屏障递送至脑细胞或神经元细胞或者神经元或神经外胚层来源的肿瘤细胞。

[0011] 因此，本发明涉及包含选自THRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：1)和LPWKPLG(SEQ ID NO：2)的序列或由选自THRPPMWSPVWP(SEQID NO：1)和LPWKPLG(SEQ ID NO：2)的序列组成的肽或模拟肽。

[0012] 而且，本发明涉及肽或模拟肽与选自与其连接的生物活性部分和诊断部分的部分的偶联物，所述肽或模拟肽包含选自THRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：1)和LPWKPLG(SEQ ID NO：2)的序列或由选自THRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：1)和LPWKPLG(SEQ IDNO：2)的序列组成。

[0013] 上述偶联物用作药物是本发明的一方面。

[0014] 发明详述

[0015] 本发明提供了用于使诊断部分或生物活性部分靶向感兴趣的器官或组织或细胞型的肽或模拟肽，特别是穿过血脑屏障靶向脑细胞或神经元细胞或者神经元或神经外胚层来源的肿瘤细胞。

[0016] 本发明范围内的肽至少包含上文确定的SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2。在一个实施方案中，本发明范围内的肽包含部分SEQ ID NO：1，所述部分SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：1中的11、10、9、8或7个氨基酸等同。在一个实施方案中，本发明范围内的肽包含SEQ ID NO：3-12或由SEQ ID NO：3-12组成。在一个实施方案中，本发明范围内的肽包含SEQ ID NO：1的变异体，所述变异体包含SEQ ID NO：1中的任何氨基酸被其他任何氨基酸或其衍生物取代的一个取代。在一个实施方案中，本发明范围内的肽包含SEQ ID NO：13-23或由SEQ IDNO：13-23组成。肽能够完全由天然存在的L-氨基酸构建，或能够包含一种或多种对主链和/或侧链的修饰。可以通过掺入氨基酸模拟物来引入这些修饰，所述氨基酸模拟物显示出与天然氨基酸的类似性。。上述包含一种或多种氨基酸模拟物的肽序列被称为模拟肽。在本发明范围内，氨基酸模拟物包括但不限于β2-和β3-氨基酸、β2，2-β2，3和β3，3-二取代氨基酸、α，α-二取代氨基酸、氨基酸的抑制素(statine)衍生物、D-氨基酸、α-羟基酸、α-氨基腈、N-烷基氨基酸等。此外，肽的C-末端可以是羧酸或羧胺，或由掺入一种上述氨基酸模拟物生成的其它物质。此外，上述肽可以包含一个或多个天然肽键由下述基团取代的取代，所述基团包括但不限于：磺酰胺、逆酰胺(retroamide)、含氨氧基的键、酯、烷基酮、α，α-二氟酮、α-氟酮、类肽(peptoid)键(N-烷基化甘氨酰酰胺键)。
此外，上述肽可以包含氨基酸侧链(是指相应天然氨基酸的侧链)的取代，例如4-氟苯丙氨酸、4-羟赖氨酸、3-氨基脯氨酸、2-硝基酪氨酸、N-烷基组氨酸、或者在β-侧链碳原子处具有与天然手性相反的手性的β-支链氨基酸或β-支链氨基酸模拟物(例如别苏氨酸、别异亮氨酸及其衍生物)。在一个其它实施方案中，以上提及的肽序列可以包含氨基酸相似结构类似物或氨基酸模拟物，例如取代赖氨酸的鸟氨酸、取代苯丙氨酸的高苯丙氨酸或苯基甘氨酸、取代甘氨酸的β-丙氨酸、取代谷氨酸的焦谷氨酸、取代亮氨酸的正亮氨酸或者甲硫氨酸和/或半胱氨酸的硫氧化形式。本专利包括上述肽的线性或环状形式，以及它们的逆向、反向和/或逆反类似物。本领域技术人员已知更多的类似变异体，但是本文并未提及这些，这并不限制本发明的范围。在一个实施方案中，本发明的肽或模拟肽长度至多为30个氨基酸，或者长度至少为25个氨基酸或20个氨基酸或19、18、17、16、15、14、13、12、
11、10、9、8或7个氨基酸。

[0017] 生物活性部分是发挥(直接或间接)生物学功能优选治疗功能的化合物，因此优选治疗活性化合物。治疗活性化合物能够是本领域已知的任何化合物，并优选为通过调节细胞间过程而具有治疗作用的化合物。具有(直接)调节作用或(直接)生物学功能的治疗活性化合物能够为例如任何蛋白、酶抑制剂、寡核苷酸、siRNA、基因、或药物。能够使用任何生物活性化合物或治疗活性化合物，只要它能够与本发明的肽或模拟肽连接或能够使其适于与本发明的肽或模拟肽连接。生物活性化合物或治疗活性化合物因此成为本发明化合物中的部分。本领域技术人员能够鉴定适当的生物活性或治疗活性化合物。在一个实施方案中，生物活性化合物是细胞抑制药，例如抗癌化合物，例如蒽环类(包括柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌)、烷化剂(包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺)、抗代谢物(包括咪唑硫嘌呤、巯嘌呤)、植物碱和/或萜类(包括长春碱类和紫杉醇类，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛鬼臼毒素、依托泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇)、替尼泊苷)、拓朴异构酶抑制剂(包括喜树碱、依立替康、拓扑特肯、安吖啶)、更生霉素、达卡巴嗪、吉西他滨、替莫唑胺、mAbs(包括曲妥珠单抗、西妥昔单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗)。

[0018] 在一个实施方案中，生物活性化合物或治疗活性化合物是包含核酸或其类似物或由核酸或其类似物组成的化合物。这样的化合物可以被认为通过特别是在蛋白生成水平调节细胞内遗传机构来发挥(间接)生物学功能，优选治疗功能。核酸可以是DNA、RNA或其类似物，诸如包含例如2’-O-甲基-、2’-O-甲氧基乙基-(MOE)和2’-O-烯丙基核苷酸的2’-O-烷基或2’-O-烯基(烯丙基)或2’-O-炔基核苷酸的化合物，锁定核酸(LNA)，肽核酸(PNA)，乙烯桥联核酸(ENA)，硫代磷酸修饰的核苷酸例如2’-O-甲氧基乙基硫代磷酸RNA核苷酸或2’-O-甲基硫代磷酸RNA核苷酸，基于吗啉代的核苷酸及其组合等。包含核酸或其类似物或由核酸或其类似物组成的化合物也可以包含多种核酸或其类似物的混合物。该化合物例如可以是2’O-甲基RNA和RNA混合物的嵌合体、DNA和LNA混合物的嵌合体，等等。该化合物也可以是例如具有末端2’O-甲基RNA核苷酸和内部DNA核苷酸的gapmer。
所述化合物可以是基因、质粒、多核苷酸或寡核苷酸、小干扰RNA等等。所述化合物可以是单链或双链。

[0019] 在一个实施方案中，诊断部分与本发明的肽或模拟肽连接。诊断部分可以用于体内或体外诊断目的。常用的成像标记、放射标记或荧光标记例如Cy3、Cy5、Cy5.5等等，或者绿色荧光蛋白(GFP)或可能经由重组表达的其它诊断蛋白可以用作诊断部分。

[0020] 为了制备本发明的偶联物，通过将化合物与氨基酸或肽偶联的已知方法，将生物活性部分或诊断部分与本发明的肽或模拟肽进行偶联。常规方法是将部分与肽或模拟肽中的自由氨基或自由羟基或自由羧酸基团或自由硫醇基连接。常用的结合方法包括硫醇/马来酰亚胺偶联、酰胺或酯键形成，或混合二硫化物形成。本领域技术人员熟知能够用于产生所需偶联的标准化学方法。生物活性部分或诊断部分可以与肽或模拟肽直接偶联或经由间隔子或连接子肽分子偶联。生物活性或诊断部分并不必然与本发明的肽或模拟肽共价连接。它还可以通过静电相互作用轭合。在一个实施方案中，本发明还涉及包含本发明的肽或模拟肽以及连接部分的分子，所述连接部分不是肽，用于将分子与生物活性部分或诊断部分连接。连接部分例如可以是与生物活性多-或寡核苷酸配合的(聚)阳离子基团。这样的(聚)阳离子基团可以是精胺或聚乙烯亚胺、聚乙二醇、聚-L-赖氨酸等等。

[0021] 如在一个实施方案中提及的，本发明的肽或模拟肽与生物活性部分连接。例如，肽或模拟肽能够与生物活性或治疗性肽连接，并且在一个实施方案中，肽或模拟肽甚至能够是肽或模拟肽基础结构的一部分。例如，治疗性肽的氨基-或羧基-末端能够用包含上述肽或由上述肽构成的序列延伸。应当理解，这种用本发明的肽或模拟肽延伸的肽包含在本发明的偶联物中。制备这样的肽能够通过标准氨基酸或肽偶联步骤实现。

[0022] 在一个实施方案中，本发明的肽或模拟肽与核定位信号(NLS)结合。在一个实施方案中，本发明的偶联物与NLS结合。在本发明范围内，NLS作用为引导本发明的偶联物例如生物活性部分或诊断部分进入细胞核，大概是通过它被胞质核转运受体识别发挥作用的。NLS可以是本发明的肽或模拟肽的一部分，例如NLS的氨基或羧基末端能够用包含上述肽或由上述肽组成的序列延伸。NLS还可以在不同于本发明的肽或模拟肽的位置与生物活性部分或诊断部分偶联。NLS序列在本领域是已知的。通常NLS信号由带正电荷的赖氨酸和/或精氨酸的(几个)短序列组成或包含带正电荷的赖氨酸和/或精氨酸的(几个)短序列，例如NLS由(K)KKR(K)、(K)KRS(K)、(K)(S)RK(R)(K)组成或包含(K)KKR(K)、(K)KRS(K)、(K)(S)RK(R)(K)。已知的NLS是PKKKRKV、GKKRSKV、KSRKRKL。在一个实施方案中，本发明的肽或模拟肽与选自SEQ ID NO：24-39的NLS结合。

[0023] 在一个实施方案中，通过肽或模拟肽与生物活性蛋白的重组表达来制备本发明的偶联物，在所述偶联物中，生物活性部分是蛋白或多肽且肽或模拟肽包含在所述蛋白或多肽骨架中。优选制备DNA构建体使得本发明的肽或模拟肽在生物活性肽的末端表达，优选在生物活性肽的C-末端表达。通过重组DNA方法制备这样的DNA构建体并在适当宿主中表达是本领域技术人员的常规实践。

[0024] 因此，在一个实施方案中，本发明的偶联物是本发明的肽与治疗活性蛋白(例如抗体)或诊断(例如荧光)蛋白或两者的融合蛋白，任选地还包含NLS，所述本发明的肽为例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的肽。这样的融合蛋白能够通过适当DNA构建体的表达来制备。

[0025] 在一个实施方案中，本发明涉及本发明的偶联物用于制备使生物活性部分或诊断部分穿过血脑屏障靶向脑细胞、神经元细胞或者神经元或神经外胚层来源的肿瘤细胞的药物的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗脑病症。在一个实施方案中，所述药物用于治疗神经元或神经肌肉疾病。在一个实施方案中，药物用于治疗神经元或神经外胚层来源的肿瘤。

[0026] 脑病症的实例是涉及神经变性和/或神经炎症事件的那些病症，例如中风、阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化。本发明中还包括受益于神经营养因子，包括GDNF、BDNF、EPO(红细胞生成素)和抗炎抗体(例如， 和 )的(CNS-)的病症的治TM
疗。本发明中还包括受益于用于治疗遗传性溶酶体贮积症( Aldurazyme 、
)和庞贝氏症( )的酶替代疗法的病症的治疗。本发明中还包
括转移至脑的肿瘤的治疗，例如能够用治疗性抗癌抗体(例如
TM TM TM
和Erbitux )和抗癌化合物(例如Gleevec 和Iressa )治疗的那些肿瘤。

[0027] 神经元或神经肌肉疾病的实例是强直性肌营养不良(MD)或脊髓性肌萎缩(SMA)、DNA重复疾病，例如但不限于：具有聚谷氨酰胺(CAG)重复的编码区重复疾病：亨廷顿病、HRS综合征(Haw River syndrome)、肯尼迪病/脊髓延髓肌萎缩、脊髓小脑共济失调，或具有聚丙氨酸(GCG)重复的疾病例如：婴儿期痉挛综合征、锁骨颅骨发育不全、睑裂狭小/上睑下垂/内眦赘皮综合征、手-足-生殖器综合征、并指多指、眼咽型肌营养不良、前脑发育畸形症。本发明治疗的基因非编码区重复的疾病包括三核苷酸重复病症(主要是CTG和/或CAG重复)：强直性肌营养不良1型、强直性肌营养不良2型、弗里德赖希共济失调、脊髓小脑共济失调、孤独症。此外，本发明偶联物能够用于治疗与脆性位点相关的重复病症，包括多种脆性X-综合征、Jacobsen综合征，以及其它不稳定重复性元件病症，例如肌阵挛性癫痫、面肩肱型肌营养不良和2型糖尿病的某些形式。

[0028] 神经元或神经外胚层来源的肿瘤的实例包括CNS和PNS的所有瘤，例如但不限于神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突神经胶质瘤、少突星形细胞瘤、星形细胞瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、MPNST(恶性外周神经鞘膜瘤)、神经节瘤或神经鞘瘤。神经外胚层来源的肿瘤例如横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌、肾上腺嗜铬细胞瘤、原始PNET(外周神经外胚层瘤)、尤文肉瘤和黑色素瘤。在一个实施方案中，药物用于治疗神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突神经胶质瘤、少突星形细胞瘤、星形细胞瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、MPNST(恶性外周神经鞘膜瘤)、神经节瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌、肾上腺嗜铬细胞瘤、原始PNET(外周神经外胚层瘤)、尤文肉瘤和黑色素瘤。

[0029] 在一个实施方案中，生物活性部分是与重复伸展序列(repetitivestretch)互补和/或能够与其杂交的寡核苷酸，所述重复伸展序列选自(CAG)n、(GCG)n、(CUG)n、(CGG)n和(CCUG)n，其中n选自1-50，优选2-20。选择的整数n使得在优选实施方案中寡核苷酸包含至少10个至约50个与重复元件互补的连续核苷酸，更优选包含12-45个核苷酸，还更优选包含12-30个核苷酸，最优选包含12-25个与重复伸展序列互补的核苷酸。

[0030] 与转录子中的聚谷氨酰胺(CAG)n序列互补的寡核苷酸的用途特别用于诊断、治疗和/或预防由HD、HDL2/JPH3、SBMA/AR、SCA1/ATX1、SCA2/ATX2、SCA3/ATX3、SCA6/CACNAIA、SCA7、SCA17或DRPLA人类基因的重复扩增导致的人类病症亨廷顿病、若干形式的脊髓小脑共济失调或HRS综合征。

[0031] 与转录子中的聚丙氨酸(GCG)n序列互补的寡核苷酸的用途特别用于诊断、治疗和/或预防由ARX、CBFA1、FOXL2、HOXA13、HOXD13、OPDM/PABP2、TCFBR1或ZIC2人类基因的重复扩增导致的人类病症：婴儿期痉挛综合征、锁骨颅骨发育不全、睑裂狭小、手-足-生殖器疾病、并指多指、眼咽型肌营养不良和/或前脑发育畸形症。

[0032] 与转录子中的(CUG)n重复序列互补的寡核苷酸的用途特别用于诊断、治疗和/或预防分别由DM1/DMPK或SCA8人类基因的重复扩增导致的人类遗传性病症：强直性肌营养不良1型、脊髓小脑共济失调。

[0033] 与转录子中(CCUG)n重复序列互补的寡核苷酸的用途特别用于诊断、治疗和/或预防由DM2/ZNF9基因的重复扩增导致的人类遗传性病症强直性肌营养不良2型。

[0034] 与转录子中(CGG)n重复序列互补的寡核苷酸的用途特别用于诊断、治疗和/或预防由FRAXA/FMR1、FRAXE/FMR2和FRAXF/FAM11A基因的重复扩增导致的人类脆性X综合征。

[0035] 与转录子中(CCG)n重复序列互补的寡核苷酸的用途特别用于诊断、治疗和/或预防由FRA11B/CBL2基因的重复扩增导致的人类遗传性病症Jacobsen综合征。

[0036] 在一个实施方案中，本发明的肽或模拟肽中的生物活性部分是包含来自下表中的序列的反义寡核苷酸或siRNA。在一个实施方案中，本发明的肽或模拟肽偶联物用于调控选自下表1的靶基因和/或蛋白(的表达)和/或用于治疗，特别是治疗选自下表的疾病。

[0037]反义寡核苷酸序列 靶基因/蛋白 疾病
5’-GCTGGGCAGGCCATTCACAC DCL 神经外胚层肿瘤
5’-GCTCGGCAGGCCGTTCACCC DCL 神经外胚层肿瘤
5’-CTTCTCGGAGCTGAGTGTCT DCL 神经外胚层肿瘤
5’-CTTCTCGGAGCTGAGCGTCT DCL 神经外胚层肿瘤
5’-GCUGGGCAGGCCAUUCACAC DCL 神经外胚层肿瘤
5’-GCUCGGCAGGCCGUUCACCC DCL 神经外胚层肿瘤
5’-CUUCUCGGAGCUGAGUGUCU DCL 神经外胚层肿瘤
5’-CUUCUCGGAGCUGAGCGUCU DCL 神经外胚层肿瘤
5’-CAAGAAGACGGCUCACUCCTT DCL 神经外胚层肿瘤
3’-TTGUUCUUCUGCCGAGUGAGG
5’-CAAGAAAACGGCUCAUUCCTT DCL 神经外胚层肿瘤
3’-TTGUUCUUUUGCCGAGUAAGG
5’-GAAAGCCAAGAAGGUUCGATT DCL 神经外胚层肿瘤
3’-TTCUUUCGGUUCUUCCAAGCT
5’-GAAGGCCAAGAAAGUUCGUTT DCL 神经外胚层肿瘤
3’-TTCUUCCGGUUCUUUCAAGCA
5’-(CAG)n(n＝2-12) DMPK 强直性肌营养不良
反义寡核苷酸序列 靶基因/蛋白 疾病
5’-(CAG)n(n＝2-12) SCA8 脊髓小脑共济失调8
5’-(CCG)n(n＝2-12) FMR1 脆性X综合征
5’-(CGG)n(n＝2-12) FMR2 脆性XE
5’-(UUC)n(n＝2-12) X25 弗里德赖希共济失调
5’-(CUG)n(n＝2-12) AR 脊髓性肌萎缩
5’-(CUG)n(n＝2-12) IT15 亨廷顿病
5’-(CUG)n(n＝2-12) DRPL4 齿状核红核苍白球路
易体萎缩
5’-(CUG)n(n＝2-12) SCA1，2，3，7 脊髓小脑共济失调1、
2、3、7型
5’-(CUG)n(n＝2-12) CACNA1A 脊髓小脑共济失调6型
5’-(CGCG4CG4)n(n＝2-12) CSTB 进行性肌阵挛
5′-AUUCACUUUCAUAAUGCUGG SMN2 脊髓性肌萎缩
5’-TTTTTGATTTTGTCT SMN2 脊髓性肌萎缩
5’-ATTTAAGGAATGTGA SMN2 脊髓性肌萎缩
5′-CCGTCGCCCTTCAGCACGCA-3′ SOD 肌萎缩侧索硬化症
(ALS)
5′-GTCGCCCTTCAGCACGCACA-3’ SOD 肌萎缩侧索硬化症
(ALS)
5′-CTACAGTTTAGCAGGACAG-3’ SOD 肌萎缩侧索硬化症
(ALS)
5’-TCTCTATTGCACATTCCAAG Huntington 亨廷顿病
(IT15)
反义寡核苷酸序列 靶基因/蛋白 疾病
5’-TGATCAGATCTTGAATGTGA Huntington 亨廷顿病
(IT15)
5’-GTAATCAGGCCTGCACCATG Huntington 亨廷顿病
(IT15)
5’-AAGCAATCCATGGACTGAAG Huntington 亨廷顿病
(IT15)
5’-CTGCTGCTGTTGCTGCTGCT Huntington 亨廷顿病
(IT15)
5’-CGCCTGCACCATGTTCCTCA Huntington 亨廷顿病
(IT15)

[0038]

[0039]

[0040] 本领域技术人员容易认识到，可以对上表中的序列作出变化，同时保留与靶序列的互补性。尿嘧啶核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸可互换，同时保留与靶序列的互补性。关键是寡核苷酸应该能够充分有效地与预定靶序列结合。类似地，肌苷(即包含能形成摆动碱基对的碱基的核苷酸)能够置换核苷酸，同时保留互补性。在其它包含(三联体)核苷酸重复序列的实施方案中，容易认识到，对于有效地结合互补性，寡核苷酸能够以重复序列的任何核苷酸开始并以重复序列的任何核苷酸结束，并且寡核苷酸不需要是重复序列的精确倍数。例如，上表中的(CUG)n也能够由(UGC)n或(CTG)n或(CIG)n或(CUG)nCU或(CUG)n(CTG)m(CUG)p(n、m、p是整数)等表示。

[0041] 本发明的一个实施方案是将病毒或病毒颗粒靶向细胞。在本发明的偶联物中，病毒或病毒颗粒是生物活性部分。在一个实施方案中，本发明的肽或模拟肽与病毒生物活性部分如下连接：在病毒基因组中包括肽或模拟肽的DNA/RNA序列使得肽或模拟肽在病毒或病毒颗粒的外表面处表达。产生这样的表达的重组方法学是本领域技术人员熟知的。因此，肽或模拟肽使病毒或病毒颗粒靶向特定细胞/组织。这对于靶向接种、基因治疗、基因替代或病毒外显子增加构建体(AAVvectors expressing antisense sequences fused to either U 1or U7smallnuclear RNA(表达与U1或U7小核RNA融合的反义序列的AAV载体)；Baughan et al.，2006，Mol.Ther.14，54-62)特别有用。

[0042] 在一个实施方案中，本发明的肽或模拟肽是THRPPMWSPVWP。在另一实施方案中，本发明的肽或模拟肽是LPWKPLG。

[0043] 本发明还包括DNA和其互补DNA序列，以及DNA序列的RNA转录子及其互补RNA序列，所述DNA由编码本发明的肽的序列组成或包含编码本发明的肽的序列，所述DNA序列由编码本发明的肽的序列组成或包含编码本发明的肽的序列。

[0044] 本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的偶联物和药物可接受的载体。

[0045] 此外，还发现肽THRPPMWSPVWP能够用于监测特别是用于识别并测量神经元或神经分化细胞的轴突生长。

[0046] 此外，发现肽THRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：1)及其某些截短变异体特别是HRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：3)、THRPPMWS(SEQ IDNO：10)和HRPPMWSPVW(SEQ ID NO：11)被肌细胞选择性摄取，很可能还被神经母细胞瘤细胞选择性摄取。因此，这些可以用于使诊断部分或生物活性部分靶向感兴趣的器官或组织或细胞型，特别是肌细胞或者穿过血脑屏障至脑细胞、神经元细胞或者神经元或神经外胚层来源的肿瘤细胞。

[0047] 因此，本发明另一方面还涉及连接到选自生物活性部分和诊断部分的部分的肽或模拟肽的偶联物，所述肽或模拟肽包含选自下述的序列或由选自下述的序列组成：HRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：3)、THRPPMWS(SEQ ID NO：10)和HRPPMWSPVW(SEQ ID NO：11)。

[0048] 在一个实施方案中，生物活性部分选自DNA、RNA或其类似物，例如包含2’-O-烷基特别是2’-O-甲氧基乙基-和2’-O-甲基或2’-O-烯基(烯丙基)或2’-O-炔基核苷酸的化合物、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、乙烯桥联核酸(ENA)、硫代磷酸修饰的核苷酸、基于吗啉代的核苷酸及其组合等。偶联物可以是SEQ ID NO：1、3、10或11的肽与治疗活性蛋白和/或诊断蛋白的融合蛋白。偶联物还可以包含核定位信号。

[0049] 这样的偶联物可以有利地用于制备使生物活性部分或诊断部分靶向肌细胞的药物。因此，药物可以有利地用于治疗与肌细胞相关的病症，包括心脏病。药物可以例如用于治疗肌病、肌营养不良或肌萎缩症或可以用于治疗II型糖尿病或肥胖。

[0050] 预期本文涉及的SEQ ID NO：3、10和11的肽也可以被神经母细胞瘤细胞选择性摄取。由于它们被肌细胞和神经母细胞瘤细胞特异性摄取，它们可以有利地用于使生物活性部分或诊断部分靶向神经肌肉细胞以治疗神经肌肉疾病。上文已经描述了与SEQ ID NO：1和2的肽相关的神经元或神经肌肉疾病的实例。实施例

[0051] 实施例1：神经母细胞瘤和神经分化细胞的体外摄取

[0052] 合成选择的肽并提供以荧光标记(FAM)，基于体外神经母细胞瘤细胞的摄取进行筛选。

[0053] N1E-115小鼠神经母细胞瘤细胞用FAM-标记的肽孵育并在不预先固定的情况下用倒置荧光显微镜拍照。如照片中所示，仅有肽LPWKPLG和THRPPMWSPVWP被神经母细胞瘤细胞有效摄取。结果表明摄取使细胞质以及细胞核均匀染色。

[0054] 将通过添加神经生长因子(NGF)分化为神经元细胞型的大鼠神经元嗜铬细胞瘤PC12细胞用FAM-标记的肽THRPPMWSPVWP孵育，并在不预先固定的情况下用倒置荧光显微镜拍照。照片显示了大鼠神经元细胞中摄取的肽。有趣的是，在该实验中观察到肽不仅使细胞质和细胞核染色，而且使这些神经元分化PC12细胞中的NGF-诱导的轴突生长有效地染色。

[0055] 实施例2：体内靶向脑细胞

[0056] 肽THRPPMWSPVWP用Cy5荧光标记来标记，并将7nmol通过静脉注射入至裸鼠的尾静脉。使用用于Cy5检测的滤光器用Maestro成像系统采集图像。

[0057] 图1显示20分钟后(图1A)和24小时后(图1B)肽的摄取。在图1A和1B的右侧，小鼠的亮光图象与显示为浅蓝染色的检测到的Cy5标记结合。在图1A和1B的左侧，检测到的Cy5图案分别以红色显示用于定量。左侧的数表明检测到的Cy5标记的量。将小鼠面朝下平卧并在注射20分钟后能够在脑中检测到清楚的信号。这表明肽THRPPMWSPVWP能够穿过血脑屏障并随后被脑细胞摄取。

[0058] 实施例3：在N115神经母细胞瘤细胞中通过肽-AON偶联物下调DCL将肽THRPPMWSPVWP和LPWKPLG与siRNA分子或DNA硫代磷酸反义寡核苷酸(AON)偶联。该siRNA和AON已经显示出能够在N115神经母细胞瘤细胞中下调DCL(双皮质素样)基因(未公布的观察结果)。N115神经母细胞瘤细胞用500nM偶联物孵育。48小时后收获细胞，并通过描述的蛋白质印迹分析(Vreugdenhil et al.，2007，Eur.J.Neurosci.25，635-648)检测基因沉默。表1中示出了不同浓度的各偶联物的DCL下调百分比。所有偶联物均能够在N115细胞中诱导DCL下调。

[0059] 表1：通过不同浓度肽-AON偶联物下调N115细胞中的DCL

[0060]AON-(偶联物) 浓度(nM) 下调％
LPWKPLG-AON 500 62％
LPWKPLG-siRNA 500 99％
THRPPMWSPVWP-AON 500 11％
THRPPMWSPVWP-siRNA 500 68％

[0061] 实施例4：THRPPMWSPVWP变异体的摄取

[0062] 选择肽THRPPMWSPVWP(见表2)的几种变异体，与荧光标记合成并测试KM109细胞的摄取。测试肽3、7、8、9、10和11。肽HRPPMWSPVWP(SEQ ID NO：3)被细胞非常有效地摄取。肽THRPPMWS(SEQ ID NO：10)和HRPPMWSPVW(SEQ ID NO：11)也被摄取，尽管水平较低。还要测试下表中所示的其他肽被KM109细胞的摄取。此外，以类似方式测试所有肽被神经母细胞瘤细胞的摄取。

[0063] 表2：用于筛选的所选THRPPMWSPVWP的变异体(SEQ ID NO：3-23)

[0064]HRPPMWSPVWP(3) THRPPMWSPVFP(13)
RPPMWSPVWP(4) THRPPMWSPVYP(14)
PPMWSPVWP(5) THRPPMWSPAWP(15)
PMWSPVWP(6) THRPPMWSPLWP(16)
HRPPMWSPVWP(3) THRPPMWSPVFP(13)
THRPPMWSPVW(7) THRPPMWSPIWP(17)
THRPPMWSPV(8) THRPPMWTPVWP(18)
THRPPMWSP(9) THRPPMFSPVWP(19)
THRPPMWS(10) THRPPMYSPVWP(20)
1
HRPPMWSPVW(11) THRPPnleWSPVWP(21)
RPPMWSPV(12) THKPPMWSPVWP(22)
SHRPPMWSPVWP(23)

[0065]

[0066] 1：nle＝正亮氨酸

[0067] 实施例5：全身递送后THRPPMWSPVWP-AON偶联物的体内摄取

[0068] 将肽THRPPMWSPVWP与20-mer 2’O-甲基硫代磷酸反义寡核苷酸(AON)M23偶联。将单独的AON M23和THRPPMWSPVWP-AONM23偶联物静脉内注射入mdx小鼠。小鼠接受50mg/kg单独的AON或偶联物3次注射，间隔为48小时，并在10天后处死。然后，用AONM23特异性杂交-连接ELISA测量AON M23在四头肌和在心脏中的水平。

[0069] 在表3中，四头肌和心肌中AON M23-肽偶联物的摄取显示为单独的AON M23的摄取的百分比(将单独的AON M23摄取设为100％)。结果表明，四头肌和心肌中摄入的偶联物比单独的M23AON高40％-50％。

[0070] 表3：全身递送后四头肌和心肌中THRPPMWSPVWP-AON偶联物的摄取，相对于裸AON的摄取(设为100％)

[0071]