一种在革兰氏阳性菌中合成的CDP-2-甘油及其制备方法

摘要

本发明涉及一种在革兰氏阳性菌细菌中利用氧化还原酶合成的甘油化合物(Glycerol)，以及采用甘油和磷酸化酶合成甘油-2-磷酸(glycerol-2-phosphat)中间体，进而进一步合成CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)，本发明还公开了上述单糖合成中所采用的三种酶以及CDP-2-甘油在治疗肺炎链球菌23F引起的细菌感染药物方面的应用。

权利要求

1.一种在肺炎链球菌23F中采用还原酶合成CDP-2-甘油的方法，其特征在于它的制备方法如下：

10mM的1，3-二羟基丙酮，1mM的NADH，pH7.4的50mM磷酸盐缓冲液，2.97μM还原酶Gtp1的纯化酶制剂，37℃恒温水浴锅中反应0.5小时，1，3-二羟基丙酮即被还原成甘油，然后5mM甘油，5mM ATP，5mM CTP，pH7.4的50MM磷酸盐缓冲液，0.05U/ml IP，0.071mM重组磷酸化酶Gtp3的纯化酶制剂和0.026mM的重组CDP转移酶Gtp2的纯化酶制剂，37℃水浴反应0.5小时，加入等体积的氯仿抽提，水相经Beckman Coulter P/ACE MDQ毛细管电泳分析，有CDP-2-甘油的生成；

其中所述的还原酶Gtp1编码的基因选自SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；

所述的编码CDP转移酶Gtp2的基因选自SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，具有SEQID NO：6所示的氨基酸序列。

所述的编码磷酸化酶Gtp3的基因选自SEQID NO：2所示的核苷酸序列，具有SEQ IDNO：

5所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的方法，其中还原酶Gtp1的重组质粒载体为pET-28a(+)，重组菌是导入了还原酶。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于在磷酸化酶Gtp3作用下，将甘油转化为甘油

2-磷酸。

4.权利要求1所述的方法，其中磷酸化酶Gtp3的重组质粒载体为pET-28a(+)，重组菌是通过导入到磷酸化酶Gtp3。

5.权利要求1所述的方法，其特征在于在CDP转移酶Gtp2的作用下，将甘油2-磷酸转化为CDP-2-甘油。

6.权利要求1所述的方法，其中CDP转移酶Gtp2的重组质粒载体为pET-28a(+)，重组菌是导入到CDP转移酶Gtp2中。

说明书

一种在革兰氏阳性菌中合成的CDP-2-甘油及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物化学技术领域，涉及革兰氏阳性球菌细菌表面单糖的合成，尤其涉及肺炎链球菌23F中单糖的合成，更具体的说，是一种在革兰氏阳性菌中利用还原酶、磷酸化酶和CDP转移酶合成CDP-2-甘油的制备方法及其用途。

背景技术

[0002] 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是革兰氏阳性球菌，广泛分布于自然界。肺炎链球菌能否致病与其荚膜有密切关系，因为其荚膜能抵抗人体内吞噬细胞的吞噬作用而大量繁殖，引起疾病。构成荚膜的多糖即荚膜多糖，由寡糖重复单元组成，构成这些寡糖重复单元的单糖包括多种单糖，糖衍生物和糖类似物等，分为常见糖和罕见单糖。常见糖(如葡萄糖，半乳糖)由于在细菌的其他基本代谢中同样需要，因此编码其合成的基因不特别存在与荚膜多糖抗原基因簇中。罕见糖(如鼠李糖，阿拉伯糖和甘露糖)仅存在于荚膜多糖中，编码其合成的基因位于荚膜多糖抗原基因簇中。

[0003] 肺炎链球菌23F血清型的荚膜多糖由包含五个单糖(两个鼠李糖，1个半乳糖和1个葡萄糖及1个甘油-2-磷酸)的寡糖重复单元组成。在这四种单糖中，半乳糖和葡萄糖为两种最常见的单糖，在其它细菌表面抗原的组成中也有存在。鼠李糖虽为罕见单糖，但是鼠李糖在革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌中的生物合成途径已经被研究。然而甘油-2-磷酸的单糖合成路径未曾有过鉴定。因此，该合成途径的鉴定将为生物合成该罕见糖奠定基础。

[0004] 近年来，由于基因组学的迅速发展，已有200余种不同的细菌多糖基因簇被破译，常见糖及一些罕见糖的合成基因的功能及其合成途径也已得到确认(http://www.microbio.usyd.edu.au/BPGD/default.htm)。糖具有高度的复杂性和多样性。化学的方法只能合成部分单糖，而且成本高昂，化学合成罕见单糖有许多困难。与生命有关的罕见单糖非常难分离。大量生产罕见单糖，多年来一直是糖科学研究的最重要的目标。用生物技术大量生产罕见单糖是最有前景的途径。运用已确定功能的单糖合成酶的组合，产生自然界中不存在或非常重要的罕见单糖，这对医疗和生物制药领域有非常重要的意义。

[0005] 目前，有关在肺炎链球菌23F中合成CDP-2-甘油(甘油-2-磷酸的前体)的酶学和分子生物学特性还未见报道。

发明内容

[0006] 本发明的一个目的是提供一种在革兰氏阳性菌细菌表面中利用还原酶合成甘油(glycerol)，利用磷酸化酶合成甘油-2-磷酸(glycerol-2-phosphate)，进而合成CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)。

[0007] 本发明的另一目的是提供上述罕见单糖CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)的制备方法。

[0008] 本发明的发明人经过大量的研究及创造性的劳动设计出了在肺炎链球菌23F中合成甘油(glycerol)，甘油-2-磷酸(glycerol-2-phosphate)，进而合成CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)的合成途径：

[0009] Gtp1 Gtp3 Gtp2

[0010] 1，3-dihydroxyacetone——>glyceol——>glycerol-2-phosphate——>CDP-2-glycerol

[0011] 在此合成路径中，这三种单糖及其所需要的还原酶，磷酸化酶和CDP转移酶是本发明的发明人经过大量的研究及创造性的劳动设计出来的。为了实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

[0012] 一种在革兰氏阳性菌细菌中还原酶合成的甘油(Glycerol)。所述的革兰氏阳性菌为肺炎链球菌23F，所述的还原酶为还原酶Gtp1；所述的编码还原酶Gtp1的基因具有选自于下列a)、b)或c)的核苷酸序列：

[0013] a)SEQID NO：1所示的核苷酸序列；

[0014] b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQID NO：1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；

[0015] c)在严格杂交条件下与上述a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的还原酶的核苷酸序列。

[0016] 所述的还原酶Gtp1具有选自于下列j)、k)或l)的氨基酸序列：

[0017] j)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；

[0018] k)SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；

[0019] l)上述k)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有还原酶的活性。

[0020] 本发明公开了还原酶Gtp1的重组质粒，所述的质粒的载体为pET-28a(+)。

[0021] 本发明公开了还原酶Gtp1的重组菌，所述的重组菌导入了还原酶。

[0022] 本发明所述的甘油(Glycerol)经磷酸化酶Gtp3作用转化为甘油2-磷酸(glycerol-2-phosphate)。

[0023] 所述的编码磷酸化酶Gtp3的基因具有选自于下列d)、e)或f)的核苷酸序列：

[0024] d)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

[0025] e)由于遗传密码的简并性，不同于SEQID NO：2但编码的氨基酸序列与SEQID NO：2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；

[0026] f)在严格杂交条件下与上述d)或e)中的序列杂交，并且编码具有活性的磷酸化酶的核苷酸序列。

[0027] 所述的磷酸化酶Gtp3具有选自于下列p)、q)或r)的氨基酸序列：

[0028] p)上述g)、h)或i)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；

[0029] q)SEQID NO：5所示的氨基酸序列；

[0030] r)上述q)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有磷酸化酶的活性。

[0031] 本发明所述的磷酸化酶Gtp3的重组质粒，所述的质粒的载体为pET-28a(+)。

[0032] 本发明所述的磷酸化酶Gtp3的重组菌，所述的重组菌导入了磷酸化酶Gtp3。

[0033] 本发明所述的甘油2-磷酸(glycerol-2-phosphate)经CDP转移酶Gtp2的作用转化为CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)。

[0034] 本发明所述编码CDP转移酶Gtp2的基因具有选自于下列g)、h)或i)的核苷酸序列：

[0035] g)SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；

[0036] h)由于遗传密码的简并性，不同于SEQID NO：5但编码的氨基酸序列与SEQID NO：3所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；

[0037] i)在严格杂交条件下与上述g)或h)中的序列杂交，并且编码具有活性的磷酸化酶的核苷酸序列。

[0038] 本发明所述的CDP转移酶Gtp2具有选自于下列该m)、n)或o)的氨基酸序列：

[0039] m)上述g)、h)或i)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；

[0040] n)SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；

[0041] o)上述n)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有磷酸化酶的活性。

[0042] 本发明所述的CDP转移酶Gtp2的重组质粒，所述的质粒的载体为pET-28a(+)。

[0043] 本发明所述的CDP转移酶Gtp2的重组菌，所述的重组菌导入了CDP转移酶Gtp2。

[0044] 应当指出的是，上述提到的术语“严格杂交条件”在本说明书中的含义是指在该条件下形成了所谓特异杂交而没有形成非特异的杂交。例如，该严格杂交条件可以是，相互之间的同源性不小于70％的DNA之间可以杂交而低于上述数值的DNA之间不能杂交，优选的是同源性不少于90％的DNA之间可以杂交。相对于Southern杂交中普通洗涤条件而言，可以例如为如下的杂交条件：将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0，7％SDS)中，50℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，50℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(2×SSC和
0.1％SDS)，50℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(0.5×SSC和0.1％SDS)，50℃洗膜
30min。

[0045] 所属技术领域的技术人员应该知道，本发明的编码罕见单糖合成的还原酶、磷酸化酶和CDP转移酶的DNA序列，还包括编码对SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示核苷酸序列所表达的酶分子的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失并仍具有该酶活性的蛋白质的核苷酸序列。

[0046] 另外，对本发明的罕见单糖合成的还原酶、磷酸化酶和CDP转移酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的蛋白质也能达到本发明的目的。

[0047] 因而本发明还包括与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有还原酶、磷酸化酶和CDP转移酶酶活性的蛋白质。上面使用的术语“多个”可以是小于100的数目，优选为小于10的数目。

[0048] 此外，本发明的发明人对合成成CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)这种新的单糖的酶进行了研究，以抑制上述单糖的合成或生产上述这种单糖，详述如下：

[0049] (1)调节还原酶的方法

[0050] 本发明涉及到调节还原酶Gtp1的功能的方法。在肺炎链球菌23F中这个还原酶将1，3-二羟基丙酮转化为甘油。因为它拥有这个功能，所以它可以在商业上用来将1，3-二羟基丙酮转化为甘油。

[0051] 另一方面，本发明提供一种检验还原酶Gtp1活性的方法。向待测样品中加入足量的NADH，在适宜的条件和足够的时间下反应，检测终产物NAD的生成，进而检测甘油的生成。

[0052] (2)调节磷酸化酶的方法

[0053] 本发明涉及到调节磷酸化酶Gtp3的功能的方法。在肺炎链球菌23F中这个磷酸化酶将甘油转化为甘油-2-磷酸。

[0054] 另一方面，本发明提供一种检验磷酸化酶Gtp3活性的方法。向待测样品中加入足量的甘油，在适宜的条件和足够的时间下反应，Gtp3与Gtp2偶联，检测终产物CDP-2-甘油的生成。

[0055] (3)调节CDP转移酶的方法

[0056] 本发明涉及到调节CDP转移酶Gtp2功能的方法。在肺炎链球菌23F中这个CDP转移酶将甘油-2-磷酸转化为CDP-2-甘油。因为Gtp2拥有这个功能，所以它可以在商业上用来将甘油-2-磷酸转化为CDP-2-甘油。

[0057] 另一方面，本发明提供一种检验CDP转移酶Gtp2活性的方法。向待测样品中加入足量的甘油-2-磷酸，在适宜的条件和足够的时间下反应，检测CDP-2-甘油的生成。

[0058] 本发明还提供一种检测有活性的物质的抑制因子的方法。这种筛选CDP转移酶Gtp2活性抑制因子的方法包括①将包含以下物质的待测样品在一定条件下培养(a)有CDP转移酶活性的物质(b)一个可能的抑制因子(c)甘油-2-磷酸；②终止反应；③比较样品与对照(不含可能的抑制因子)中CDP-2-甘油的浓度，如果与样品比较，对照中的CDP-2-甘油的浓度降低就说明找到了CDP转移酶Gtp2的活性抑制因子。

[0059] 本发明进一步公开了CDP-2-甘油在制备治疗肺炎链球菌23F引起的细菌感染药物方面的应用。

[0060] (1)利用本发明提供的序列制成反义寡核苷酸，然后利用反义寡核苷酸抑制对应基因的表达或者制成药物，使对应罕见单糖的合成受阻，最终阻止细菌的繁殖。

[0061] 本发明中的核酸序列相对于其正常转录状态可以转化为反义的核酸分子。更合适的情况是，转化一个在起始密码子之前的区域或一个未被观察的区域，以得到反义序列。特别地，本发明中的核酸分子包含的核酸序列或其中的片段，特别是SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示的核酸序列相对于其正常转录状态可以转化为反义的核酸分子。

[0062] 本发明的反义核酸分子或其中一个片段可以通过使用天然存在的核苷酸或者各种用来增加分子的生物稳定性或增加与mRNA或天然的基因结合的物理稳定性的修饰的核苷酸(比如硫代磷酸化衍生物和吖啶替代核苷酸)进行化学合成。还可以用生物方法合成反义序列：将表达载体以重组质粒、噬菌体质粒或减活病毒的形式转入细胞中。这样，反义序列可以在高效调节区的控制下合成。合成效率取决于载体转入的细胞种类。

[0063] (2)利用本发明中的酶可制备单克隆抗体、多克隆抗血清或嵌和抗体衍生物等，这样来抑制对应酶的活性，使对应罕见单糖的合成受阻。

[0064] 本发明中蛋白的活性可以被针对本发明中蛋白的抗体抑制。可以用传统方法制备抗体。比如，利用本发明中的蛋白或多肽，使用标准方法来制备多克隆抗血清或单克隆抗体。用具有免疫原性形式的多肽来免疫哺乳动物(比如小鼠、大鼠或兔子)使之产生抗体反应。使多肽具有免疫原性的技术包括将其连接到载体上或其它本领域公知的方法，比如加入佐剂。免疫过程可以通过检测抗体在血浆或血清中的滴度方法控制。利用抗原这样的免疫原和标准的ELISA实验或其它免疫检测方法来评估抗体的水平。免疫过程之后可以获得抗血清，如果需要可以血清中分离多克隆抗体。

[0065] 为生产单克隆抗体，可以从被免疫的动物中涉及抗体产生细胞(淋巴细胞)。这些细胞可以通过标准的体细胞融合方法和骨髓瘤细胞融合，使之稳定并产生杂交瘤细胞。这些技术在本领域是公知的，比如杂交瘤技术是由Kohler和Milstein(Nature 256，495-497(1975))发明的，人体B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，Immunol.Today 4，72(1983))，通过EBV-杂交瘤技术产生人体单克隆抗体(Cole等，《肿瘤治疗中的单克隆抗体》(1985))Allen R.Bliss，Inc，77-96页)，和组合抗体库的筛选(Huse等，Science246，1275(1989))。
利用免疫化学方法筛选杂交瘤细胞，然后产生与多肽特异反应的抗体，并且可分离出单克隆抗体。

[0066] 嵌合抗体衍生物，比如由非人类动物的可变区合人类的恒定区组成的抗体也在本发明的范围之内。例如嵌合抗体分子由来自鼠、小鼠或其它物种抗体的抗原结合位点和人类的恒定区组成。可以用传统方法制备含有识别本发明中某一蛋白的免疫球蛋白可变区的嵌合抗体(比如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，6851(1985)；Takeda等，Nature 314，452(1985)；Cabilly 等，U.S.Pat.No.4,816,567；Boss 等，U.S.Pat.No.4,816,397；Tanaguchi等，European Patent Publication EP171496；EuropeanPatent Publication 0173494，United Kingdom patent GB 2177096B)。

[0067] 与本发明中某个蛋白特异反应的单克隆或嵌合抗体可以通过产生人类恒定区嵌合体来进一步类人化。人类恒定区嵌合体中的可变区，特别是抗原结合位点的保守骨架区是人源的，只有高变区是非人源的。这种免疫球蛋白分子可以通过本领域公知的技术制备(比如Teng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80，7308-7312(1983)；Kozbor等，Immunology Today，4，7279(1983)；Olsson 等，Meth.Enzymol.，92，3-16(1982) 和 PCT Publication WO92/06193或EP 0239400)。类人化的抗体也可进行商业生产(Scotgen Limited，2Holly Road，Twickenham，Middlesex，Great Britain)。

[0068] (3)还可利用本发明中的核酸分子或蛋白分子制成疫苗来抑制细菌感染

[0069] 本发明也涉及一种通过服用疫苗使机体对本发明中的蛋白产生免疫应答来抑制或处理由肺炎链球菌23F引起的细菌胞感染的方法。

[0070] 在美国针对肺炎链球菌的有效多价多糖疫苗，一种是适用于婴幼儿的，是2002年2月通过许可的存在于蛋白载体上的7价多糖疫苗(4，6B，9V，14，18C，19F和23F)，另一种是适用于成人的23价多糖疫苗。

[0071] 本发明还提出一种生产可作为商品或其它反应底物的CDP-2-甘油的方法，该方法包括在生产CDP-2-甘油过程中使用上述酶的步骤。

[0072] 为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。

附图说明

[0073] 图1Gtp1，gtp2和gtp3反应的毛细管电泳图；

[0074] 图2Gtp2反应产物的一级质谱；

[0075] 图3Gtp2反应产物的二级质谱；

[0076] 图4Gtp2反应产物的核磁共振图。

具体实施方式

[0077] 为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。以下各实施例仅仅是用于说明不是限制本发明。

[0078] 实施例一合成酶基因的克隆

[0079] 1.肺炎链球菌23F的总DNA提取

[0080] (1)取其过夜培养的新鲜培养物3ml，离心收集菌体，菌体悬于500μl 50mM Tris缓冲液中(pH8.0)，离心去上清，菌体重悬于500μl 50mM Tris缓冲液中(pH8.0)加入20μl 0.5M EDTA(pH8.0)，混匀后37℃保温20分钟，之后加入20μl 20mg/ml溶菌酶，混匀后37℃保温15分钟，再加入25μl 20mg/ml蛋白酶K，温柔混匀后再加入30μl 10％SDS，
50℃保温至澄清，再加入10μl 25mg/ml RNA酶，65℃保温30分钟，分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提2次，氯仿∶异戊醇抽提1次，最后一次的上清溶液加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇，回收DNA，用70％乙醇洗，沉淀溶于100μl TE缓冲液(pH8.0，10mM Tris，1mM EDTA)。将分离到的待测肺炎链球菌单菌落用血平板，37℃，5％CO2培养箱过夜培养。

[0081] (2)将过夜培养的血琼脂培养基上的菌体刮至1.5ml的eppendorf管中，加入500μL50mM的Tris(pH 8.0)重悬，10000rpm离心3分钟，弃上清。

[0082] (3)加入500μL 50mM Tris(pH 8.0)重悬，20μL 0.5M EDTA(pH8.0)，吹匀，37℃保温20分钟。

[0083] (4)加20μL 20mg/mL溶菌酶，混匀，37℃保温20分钟。

[0084] (5)加25μL 20mg/mL蛋白酶K，轻柔混匀。

[0085] (6)加30μL 10％SDS，50℃水浴2小时至溶液澄清。

[0086] (7)加10μL 25mg/mL RNase，65℃水浴30分钟。

[0087] (8)加等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻柔颠倒数分钟，12000rpm离心10分钟，上清转移至另一eppendorf管中，重复抽提一次。

[0088] (9)上清液转移至一新的eppendorf管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，12000rpm离心10分钟，上清液转移至另一eppendorf管中。

[0089] (10)加2.5倍体积的预冷的无水乙醇，轻摇，沉淀DNA。

[0090] (11)用毛细管绕起DNA，并用70％冰乙醇洗涤。

[0091] (12)开盖37℃保温30分钟，挥发乙醇。

[0092] (13)将DNA溶于100μL TE中，DNA置-20℃冰箱保存。

[0093] 2.还原酶Gtp1基因的克隆和筛选

[0094] 取前面所述的肺炎链球菌23F总DNA溶液作为模板，以下列寡核苷酸序列为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行30个循环PCR。

[0095] 设定的PCR循环参数如下：

[0096] 95℃，3min；95℃，30s；50.9℃，30s；72℃，1min；72℃，7min；4℃，2h。

[0097] 引物序列见SEQ ID NO：7

[0098] SEQ ID NO：7

[0099] 上游引物5’-GGGAATTCCATATGTTGAAAAATAATGATTTAAAGATA-3’

[0100] 下游引物5’-CCGCTCGAGCTACAACTCGCTTATGAGTTC-3’

[0101] 将上述PCR产物用NdeI和XhoI双酶切，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收1kb酶切产物片段，与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5α后，涂于50μg/ml Kan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37℃培养12小时后，挑取单克隆菌落提取质粒鉴定，插入有SEQID No：1所示的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW1282，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为H1550。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果表明，该基因DNA片段全长1029bp。由TTG起始密码开始，到TAG终止密码子结尾，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。3磷酸化酶Gtp3基因的克隆和筛选

[0102] 取前面所述的肺炎链球菌23F总DNA溶液作为模板，以下列寡核苷酸序列为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行30个循环PCR。

[0103] 设定的PCR循环参数如下：

[0104] 95℃，3min；95℃，30s；50℃，30s；72℃，1min；72℃，7min；4℃，2h。

[0105] 引物序列见SEQ ID NO：8

[0106] SEQ ID NO：8

[0107] 上游引物5’-CATGCCATGGGCATGAAATTGACAAATAGAGTTGA-3’

[0108] 下游引物5’-CCGCTCGAGGACAATTCCTTTCCACATT-3’

[0109] 将上述PCR产物用NcoI和XhoI双酶切，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收0.8kb酶切产物片段，与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5α后，涂于50μg/ml Kan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37℃培养12小时后，挑取单克隆菌落提取质粒鉴定，插入有SEQ ID No：2所示的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW1207，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为H1445。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果表明，该基因DNA片段全长834bp。由ATG起始密码开始，到TAT终止密码子结尾，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

[0110] 4.CDP转移酶Gtp2基因的克隆和筛选

[0111] 取前面所述的肺炎链球菌23F的总DNA溶液作为模板，以下列寡核苷酸序列为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行30个循环PCR。

[0112] 设定的PCR循环参数如下：

[0113] 95℃，3min；95℃，30s；50℃，30s；72℃，1min；72℃，7min；4℃，2h。

[0114] 引物序列见SEQ ID NO：9

[0115] SEQ ID NO：9

[0116] 上游引物5’-CATGCCATGGGCATGAAAGCACTTATTTTAGCA-3’

[0117] 下游引物5’-CCGCTCGAGAGCAAATAGTTTTTCTGCAG-3

[0118] 将上述PCR产物用NcoI和XhoI双酶切，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收0.7kb酶切产物片段，与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5α后，涂于50μg/ml Kan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37℃培养12小时后，挑取单克隆菌落提取质粒鉴定，插入有SEQ ID No：3所示的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW1263，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为H1520。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果显示，该基因DNA片段全长705bp。由ATG起始密码开始，到ATT终止密码子结尾，其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。

[0119] 实施例二合成酶的纯化

[0120] 1.重组还原酶Gtp1的纯化和特性

[0121] 将上述重组菌E.coliDH5αH1550中的质粒pLW1282提出，转入到E.coliBL21中，并筛选得到阳性转化子。将转化子单克隆接入20ml含50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃，200rpm培养12小时，然后将培养物按1％(V/V)接种量接入200ml含50μg/mlKan的LB培养基(共2个摇瓶)，37℃，200rpm培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，25℃，
200rpm诱导4小时。离心收集菌体，悬于一定量的Bindingbuffer(50mM NaH2PO4，pH 8.0，
300mM NaCl，10mM咪唑)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组还原酶Gtp1的粗提液。此上清经螯合琼脂糖凝胶(ChelatingSepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组该磷酸化酶的分子量为39.1KD，与理论推算的分子量(38.3KD)相似。

[0122] 2.重组磷酸化酶Gtp3的纯化和特性

[0123] 将上述重组菌E.coliDH5αH1445中的质粒pLW1207提出，转入到E.coliBL21中，并筛选得到阳性转化子。将转化子单克隆接入20ml含50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃，200rpm培养12小时，然后将培养物按1％(V/V)接种量接入200ml含50μg/mlKan的LB培养基(共2个摇瓶)，37℃，200rpm培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，37℃，
200rpm诱导4小时。离心收集菌体，悬于一定量的Bindingbuffer(50mM NaH2PO4，pH 8.0，
300mM NaCl，10mM咪唑)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组磷酸化酶Gtp3的粗提液。此上清经螯合琼脂糖凝胶(ChelatingSepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组该磷酸化酶的分子量为31.7KD，与理论推算的分子量(33.7KD)相似。

[0124] 3.重组CDP转移酶Gtp2的纯化和特性

[0125] E.coli DH5αH1520中的质粒pLW1263提出，转入到E.coli BL21中，并筛选得到阳性转化子。将转化子单克隆接入20ml含50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃，200rpm培养12小时，然后将培养物按1％(V/V)接种量接入250ml含50μg/ml Kan的LB培养基(共2个摇瓶)，37℃，200rpm培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mM，37℃，200rpm诱导4小时。离心收集菌体，悬于一定量的Binding buffer(50mM NaH2PO4pH 8.0，
300mM NaCl，10mM咪唑)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组CDP转移酶Gtp2的粗提液。此上清经螯合琼脂糖凝胶(Chelating Sepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组CDP转移酶的分子量为27.5KD，与理论推算的分子量(28.3KD)相似。

[0126] 实施例三肺炎链球菌23F中CDP-2-甘油产物的鉴定

[0127] 1.重组还原酶Gtp1的作用

[0128] 在0.5ml离心管中装入20μl下列反应体系：10mM 1，3-二羟基丙酮，1mM的NADH，50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，2.97μM实施例二中制得的重组氧化还原酶Gtp1的纯化酶制剂。37℃反应0.5小时。加入等体积的氯仿抽提，水相经Beckman Coulter P/ACE MDQ毛细管电泳分析，结果如图1所示，结果显示NADH完全消失，有新产物NAD生成。初步证明1，
3-二羟基丙酮被还原为甘油。

[0129] 2.重组CDP转移酶Gtp2的作用

[0130] 在0.5ml离心管中装入20μl下列反应体系：20mM甘油-2-磷酸，50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，5MM的CTP，0.013mM实施例二中制得的重组CDP转移酶Gtp2的纯化酶制剂。37℃反应0.5小时。加入等体积的氯仿抽提，水相经Beckman Coulter P/ACE MDQ毛细管电泳分析，结果如图1所示，结果显示CTP完全消失，有新产物生成。重复此反应，积累500μl体系后，经Finnigan LCQ Advantage MAX质谱仪检测，初步证明产物为CDP-2-甘油，如图2所示。

[0131] 3.重组磷酸化酶Gtp3的作用

[0132] 在0.5ml离心管中装入20μl下列反应体系：5mM甘油，50mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)，0.071mM实施例二中制得的重组磷酸化酶Gtp3的纯化酶制剂。37℃反应0.5小时。
加入等体积的氯仿抽提，取水相，再加入相应比例的CTP和0.026mM实施例二中制得的重组CDP转移酶Gtp2的纯化酶制剂37℃反应0.5小时。结果如图1所示，结果显示CTP完全消失，有ATP和新产物生成。

[0133] 实施例四终产物CDP-2-甘油的分离纯化及质谱检测方法

[0134] 将反应体系注入岛津LC-20AT高效液相色谱中分离，使用Venusil MP-C18柱(4.6×250mm)，流动相为70％乙腈和30％水，流速为0.6ml/min。

[0135] 将收集到的产物注入Finnigan LCQ Advantage MAX质谱仪检测。使用电喷雾源，负相，4.5kV，220℃。以氮气作为碰撞气体，氦气为辅助气体。在做二级质谱时碰撞能量为20-30eV。

[0136] 实施例五肺炎链球菌合成途径的确定

[0137] 肺炎链球菌中CDP-2-甘油合成途径中的三个酶Gtp1，Gtp3和Gtp2的功能均未在其它菌株中被鉴定过。通过实施例三中的实验证明了肺炎链球菌23F中的还原酶Gtp1将1，3-二羟基丙酮转化为甘油，磷酸化酶Gtp3将甘油转化为甘油-2-磷酸，CDP转移酶Gtp2将甘油2-磷酸转化为CDP-2-甘油。至此证明了肺炎链球菌23F中CDP-2-甘油的合成途径可以表述如下：

[0138] 1，3二羟基丙酮→甘油→甘油-2-磷酸→CDP-2-甘油

[0139] 实际制备方法如下：10mM的1，3-二羟基丙酮，1mM的NADH，50mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)，2.97μM还原酶Gtp1的纯化酶制剂，37℃恒温水浴锅中反应0.5小时，1，3-二羟基丙酮即被还原成甘油。然后5mM甘油，5mM ATP，5mM CTP，50mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)，0.05U/ml IP，0.071mM重组磷酸化酶Gtp3的纯化酶制剂和0.026mM的重组CDP转移酶Gtp2的纯化酶制剂，37℃水浴反应0.5小时。加入等体积的氯仿抽提，水相经Beckman Coulter P/ACE MDQ毛细管电泳分析，有CDP-2-甘油的生成。如果以甘油-2-磷酸为底物，在下列条件下，同样可以实现CDP-2-甘油的制备。20mM的甘油-2-磷酸，5mM CTP，50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.07.4)，10mM MgCl2，0.05U/ml IP，0.013mM的重组CDP转移酶Gtp2的纯化酶制剂。
37℃反应0.5小时。

[0140] 实施例六合成酶的活性鉴定

[0141] 1.重组还原酶的活性鉴定

[0142] 在0.5ml离心管中装入20μl下列反应体系：10mM的1，3-二羟基丙酮，1mM的NADH，50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，2.97μM实施例二中制得的重组还原酶Gtp1的纯化酶制剂。37℃反应0.5小时。加入等体积的氯仿抽提，水相经Beckman Coulter P/ACE MDQ毛细管电泳分析。

[0143] (1)最适酶活温度

[0144] 上述反应条件下，在4-75℃范围内测定上述重组还原酶Gtp1的活性，结果表明该酶的最适温度为37℃。

[0145]温度(℃) 4 15 25 37 50 55 60 65
转化率 8.8 10.8 24.8 37.4 49.3 66.5 76.5 86.6
(％)

[0146] (2)最佳反应pH

[0147] 上述反应条件下，在pH 5.5-9.5范围内测定上述重组还原酶Gtp1的活性，结果表明该酶的最适pH范围为6.5-7.0。

[0148]pH 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5
转化率(％)
58.2 91.4 94.8 94.7 88.3 83.2 69.2 70.3 46.4

[0149] (3)金属离子影响

[0150] 上述反应条件下，金属离子为NH4+，Mg2+，Ca2+，Ni2+，Zn2+，Cu2+，Fe2+，Fe3+条件下，测2+
定上述重组还原酶Gtp1的活性，结果表明该还原酶对金属离子没有依赖，但是其中Fe 对其转化率有促进作用。

[0151]离子 无 NH4+ Cu2+ Ni2+ Zn2+ Mn2+ Ca2+ Fe3+ Co2+ Fe2+ Mg2+转化率
(％) 62.3 76.8 38.9 23.8 45.0 46.2 56.3 56.6 55.3 91.2 66.4

[0152] (4)Km、kcat值测定

[0153] 上述反应条件下(60℃)，50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，0.496μM酶，5min)，改变+一种底物的浓度，测定NAD 的生成浓度，根据米氏方程得出上述重组CDP转移酶Gtp2的Km值和kcat。

[0154]底物 Km(mM) Kcat(min-1) Vmax(mM min-1)
1，3-二羟基丙酮 0.12±0.01 50.40±11.23 0.025±0.006
甘油醛 0.19±0.03 21.47±4.96 0.021±0.005
NADH 1.74±0.21 247.98±34.39 0.123±0.02

[0155] 2.重组CDP转移酶的活性测定

[0156] 在0.5ml离心管中装入20μl下列反应体系：5mM甘油-2-磷酸，50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，10mM MgCl2，0.013mM实施例二中制得的重组CDP转移酶Gtp2的纯化酶制剂。37℃反应0.5小时。加入等体积的氯仿抽提，水相经Beckman Coulter P/ACEMDQ毛细管电泳分析。

[0157] (1)最适酶活温度

[0158] 上述反应条件下，在4-75℃范围内测定上述重组CDP转移酶Gtp2的活性，结果表明该酶的最适温度为37℃。

[0159]温度(℃) 4 15 25 37 50 65 75
转化率(％) 13.3 24.9 33.6 60.9 29.9 8.7 5.7

[0160] (2)最佳反应pH

[0161] 上述反应条件下，在pH 6.0-9.5范围内测定上述重组CDP转移酶Gtp2的活性，结果表明该酶的最适pH为8.0。

[0162]pH 6 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5
转化率(％) 45.6 48.5 57.1 59.5 65.1 49.2 46.8 33.1

[0163] (3)金属离子的影响

[0164] 上述反应条件下，金属离子为NH4+，Mg2+，Ca2+，Ni2+，Zn2+，Cu2+，Fe3+条件下，测定上述重组CDP转移酶Gtp2的活性，结果表明该CDP转移酶对Mg2+有依赖，其中Fe3+对其转化率有促进作用。Ni2+和Cu2+对其酶活的抑制作用最大。

[0165]离子 无 Fe2+ NH4+ Cu2+ Ni2+ Ca2+ Zn2+ Co2+ Mn2+ Fe3+ Mg2+
转化率(％) 0 84.4 51.5 0 0 35.4 47.7 17.1 23.3 55.4 55.7[0166] (4)Km、kcat值测定

[0167] 上述反应条件下(37℃，50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)，0.028μM酶，5min)，改变一种底物的浓度，测定CDP-2-甘油的生成浓度，根据米氏方程得出上述重组CDP转移酶Gtp2的Km值和kcat。

[0168]底物 Km(mM) Kcat(min-1) Vmax(mMmin-1)
甘油2-磷酸 3.03±0.32 875.6±54.99 0.024±0.002
甘油-1-磷酸 13.49±0.18 623.73±149.84 0.017±0.004
CTP 0.15±0.02 755.63±251.89 0.021±0.007
dCTP 1.37±0.06 188.7±88.53 0.051±0.024

[0169] 3.重组磷酸化酶的活性鉴定

[0170] 在0.5ml离心管中装入20μl下列反应体系：5mM甘油，50mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)，0.071mM实施例二中制得的重组磷酸化酶Gtp3的纯化酶制剂。37℃反应0.5小时。加入等体积的氯仿抽提，取水相，再加入相应比例的CTP和0.026mM实施例二中制得的重组CDP转移酶Gtp2的纯化酶制剂37℃反应0.5小时。加入等体积的氯仿抽提，水相经Beckman Coulter P/ACE MDQ毛细管电泳分析。

[0171] 虽然本发明已较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。