增强免疫反应的人半乳凝素-9缺失体的制备及应用

摘要

本发明公开了增强免疫反应的人半乳凝素-9缺失体的制备方法，含有蛋白DNA序列的表达载体以及用该表达载体转化的宿主细胞。本发明还提供了人半乳凝素-9缺失体在提高细胞免疫方面的应用。所述蛋白具备促进DC细胞及巨噬细胞活化功能，表现为增强细胞免疫反应，而缺失了人半乳凝素-9全蛋白的免疫抑制作用。

权利要求

1.一种增强免疫反应的人半乳凝素-9缺失体，所述缺失体由人半乳凝素-9蛋白的C端氨基酸序列构成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

2.编码权利要求1所述的人半乳凝素-9缺失体的基因，其序列如SEQ IDNO：5所示。

3.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的基因序列。

4.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求3所述的表达载体所转化。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是大肠杆菌或酵母细胞。

6.权利要求1所述的人半乳凝素-9缺失体在制备增强免疫功能药物中的应用。

说明书

增强免疫反应的人半乳凝素-9缺失体的制备及应用

技术领域：

[0001] 本发明涉及一种蛋白制备方法以及应用。具体而言，该蛋白是一种人半乳凝素-9的缺失体，由人半乳凝素-9的C端的129个氨基酸序列所组成，通过钓取人半乳凝素-9的C端基因，构建其原核表达系统，分离纯化而制备。所述蛋白具备促进DC细胞及巨噬细胞活化功能，表现为增强细胞免疫反应，而缺失了人半乳凝素-9全蛋白的免疫抑制作用。所述蛋白可以应用于抗病毒、抗感染药品的生产中。背景技术：

[0002] 半乳凝素(galectin)存在于各种生物体内，不仅分布于细胞核，也分布于细胞质乃至细胞外基质。人半乳凝素-9(Gal-9)作为家族成员之一，除了能诱导嗜酸粒细胞聚集和活化外，还介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控和肿瘤转移等。编码Gal-9的基因于人类染色体定位在17ql 1.1，包含11个外显子，转录本长度约为1.7kb。其编码蛋白大约为36kDa，包含两个同源的糖识别结构域(cabohydraterecognition domain，CRD)，两者由一条肽链将其相连[Lipkowitz MS，Leal-Pinto E，Cohen BE，et al.galectin9 is the sugar-regulatedurate transporter/channel UAT[J].Glycoconj J，2004，
19(7-9)：491-498.]。Gal-9在组织中分布广泛，已在人的肝脏、小肠、胸腺、肾脏、脾脏、肺脏、心肌和骨骼肌等组织内发现。

[0003] 通过结合表达于不同细胞表面的Tim-3分子，Gal-9蛋白分别发挥促进非特异性免疫反应及下调特异性免疫应答的双向调节作用。具体的作用机制包括Gal-9分子一方面在免疫反应初始阶段通过促进DC等炎症细胞的活化增强免疫反应、而另一方面在免疫反应效应阶段通过抑制Th1细胞活性而双向调节体内的免疫反应[Nobumoto A，Galectin-9expandsunique macrophages exhibiting plasmacytoid dendritic cell-likephenotypes that activate NK cells in tumor-bearing mice.ClinImmunol.；130(3)：322-30.Anderson AC，Promotion of tissueinflammation by the immune receptor Tim-3 expressed on innateimmune cells.Science.2007；318(5853)：
1141-3.]。Gal-9通过表达于DC、巨噬细胞等炎症细胞以及活化的T细胞表面的Tim-3分子发挥作用。在自身免疫病中，Gal-9/Tim-3分子可以通过抑制T细胞的活性而缓解疾病的进程[Chou FC.Attenuation of Th1 response through galectin-9and T-cell Ig mucin 3 interaction inhibits autoimmune diabetes inNOD mice.Eur J Immunol.2009.]，但在用外源Gal-9干预的过程中也存在激活体内炎症细胞的潜在危害；另一方面，Gal-9/Tim-3相互作用可以通过增强DC细胞活性促进抗病毒及抗肿瘤免疫，但Gal-9/Tim-3对T细胞的抑制则可能促进肿瘤或病毒的免疫逃避[Sharvan Sehrawat.Role of Tim-3/Galectin-9 Inhibitory Interaction in Viral-InducedImmunopathology：Shifting the Balance toward Regulators.TheJournal of Immunology，2009，182：3191.Jihe ne Klibi.Blooddiffusion and Th1-suppressive effects of galectin-9-containingexosomes released by Epstein-Barr virus-infected nasopharyngealcarcinoma cells.Blood.2009；113：1957.Keiko Nagahara，Galectin-9Increases Tim-3+Dendritic Cells and CD8+T Cells and EnhancesAntitumor Immunity via Galectin-9-Tim-3 Interactions.The Journalof Immunology，2008，181：7660.]。Gal-9分子的双向调节作用为该分子的应用带来不便。

[0004] 我们通过对Gal-9的结构进行分析，分别表达了人Gal-9蛋白(Gal-9蛋白)及由人Gal-9的C端序列构成的缺失体(Gal-9C蛋白)，并对其功能进行了对比研究，我们首次发现了Gal-9C蛋白不再具有介导T细胞凋亡而表现的抑制免疫反应的作用，而仅仅保留了其促进DC及巨噬细胞活化，增强免疫反应的功能。这表明在特定的环境下，用Gal-9C蛋白进行免疫干预只会特异性激活体内的炎症细胞促进免疫反应，而不在具有下调免疫应答的副作用。基于我们的研究，我们表达并纯化了大量的Gal-9C蛋白，为抗病毒免疫等需要增强免疫反应的免疫干预治疗提供了新的产品。附图说明：

[0005] 图1为Gal-9C蛋白与Gal-9蛋白对DC细胞激活作用图；

[0006] 图2为Gal-9C蛋白与Gal-9蛋白对巨噬细胞激活作用图；

[0007] 图3为Gal-9C蛋白与Gal-9蛋白诱导CD4T细胞凋亡图；发明内容：

[0008] 为了更好的开发Gal-9的生物学效能，本发明一方面提供了一种提高免疫调节能力的人Gal-9C蛋白，它是人半乳凝素-9的C端序列，长度为129氨基酸。在一个较佳的实例中，所述的蛋白具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述的DNA序列具有SEQ ID NO：5所示的DNA序列。

[0009] 本发明提供了含有本发明所述的DNA序列的表达载体。本发明也提供了含有本发明所述表达载体所转化的宿主细胞。在一个较佳的实例中，所述的主细胞是大肠杆菌或者酵母细胞。

[0010] 本发明提供了所述蛋白的新用途。该用途与人Gal-9全蛋白的功能发生了改变，具体而言，人Gal-9全蛋白既有免疫增强作用，又有免疫抑制作用；而人Gal-9C蛋白只具备增强免疫作用，而缺失了人半乳凝素-9全蛋白的免疫抑制作用。。

[0011] 本发明的优点在于：所述的Gal-9C蛋白具备促进DC细胞及巨噬细胞活化作用而不再介导T细胞凋亡，Gal-9C蛋白的制备过程中，将人Gal-9全蛋白进行了改造，得到了可以用做提高免疫力的潜在蛋白药物。具体实施方案：

[0012] 下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。下面实施例中未表明具体条件的试验方法，通常按照常规的条件。

[0013] 实施例1目的基因的获得与原核表达系统的构建

[0014] 1)基因调取

[0015] 根据基因序列以及PET-32a载体的酶切位点，采用Sac I、Xho I双酶切位点，钓取PCR Gal-9C与Gal-9，设计基因引物如下：

[0016] Gal-9C Ps：5’-ccggaattcttcatcaccacc-3’(SEQ ID NO：1)

[0017] Gal-9C Pa：5’-ccgctcgagctatgtctgcacatggg-3’(SEQ ID NO：2)[0018] Gal-9 Ps：5’-ccggaattcgccttcagcggttcccagg-3’(SEQ ID NO：3)[0019] Gal-9 Pa：5’-tccagctgacccatgtgcagacataggg-3’(SEQ ID NO：4)[0020] 引物合成后，以人外周血单核细胞中提取的总RNA反转录生成的cDNA为模板，钓取上述两段基因(SEQ ID NO：5以及SEQ ID NO：6)。PCR循环条件设置为94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃50s，循环35次；72℃7min，4℃hold。

[0021] 2)基因克隆

[0022] 小量提取PET-32a质粒，用Sac I、Xho I限制性内切酶将PET-32a质粒与调取的目的基因Gal-9C与Gal-9各自双酶切，酶切条件：37℃过夜(约12h)，将双酶切后回收的载体与目的基因连接，将连接后含有目的基因的质粒载体转化入Top 10感受态细菌，用含氨苄抗性的LB平板培养基涂板，37℃过夜培养，挑取单克隆测序；将测序完全正确的单克隆菌提取质粒，转化入BL-21感受态大肠杆菌。

[0023] 实施例2蛋白质的表达纯化

[0024] 1)菌体的培养

[0025] 挑取单克隆，活化后接种入大量LB液体培养基，置于37℃摇床中3、4小时，直至培养基OD值约为0.6时进行目的蛋白的诱导表达。诱导条件为Gal-9：室温(25℃)、0.05mM IPTG、1L LB液体培养基；Gal-9C：室温(25℃)、0.1mM IPTG。

[0026] 2)蛋白分离纯化

[0027] 诱导十二个小时左右，收集菌体(7000rpm、5mins)，将表达两种蛋白的菌体分别用PBS重悬后，放入液氮冻融两、三次，再加入少量溶菌酶(4℃、1小时)尽量使菌体裂解，最后超声破碎(每次10分钟，共两次)。离心(10000rpm、10mins)取上清过滤后上镍柱纯化。将过滤后上清用不含杂蛋白的镍柱上柱，之后用平衡液(20mM PBS+500mM NaClpH：7.8)洗掉杂蛋白，然后依次用20mM进一步洗掉杂蛋白，200mM咪唑进行洗脱，收集目的蛋白。

[0028] 实施例3蛋白质功能验证

[0029] 1)Gal-9与Gal-9C促炎检测

[0030] 分别用人DC细胞以及巨噬细胞分别与不同浓度的含有Gal-9蛋白的样本与含有Gal-9C蛋白的样本，在37℃共孵育12-24h，收集细胞培养上清，ELISA法检测TNF-a分泌情况。ELISA结果如图1与图2：Gal-9与Gal-9C均能促进炎性因子分泌。

[0031] 2)Gal-9与Gal-9C诱导T细胞凋亡检测

[0032] 将人的淋巴细胞用Gal-9与Gal-9C两种蛋白分别共孵育4小时后将细胞用+Annexin V-PE以及CD4-FITC染色，检测CD4T细胞的凋亡情况。流式检测结果如图3：Gal-9+
有明显的诱导CD4T细胞凋亡作用。

[0033] 上述两个结果表明，Gal-9既有提高免疫力，又具有抑制免疫力的作用；而Gal-9C仅仅保留了提高免疫力的作用。

[0034] 上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也应属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由各权利要求限定。

[0035] <110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所

[0036] <120>增强免疫反应的人半乳凝素-9缺失体的制备及应用

[0037] <160>8

[0038] <210>1

[0039] <211>21

[0040] <212>DNA

[0041] <213>人工序列

[0042] <220>

[0043] <223>引物

[0044] <400>1

[0045] ccggaattct tcatcaccac c

[0046] <210>2

[0047] <211>26

[0048] <212>DNA

[0049] <213>人工序列

[0050] <220>

[0051] <223>引物

[0052] <400>2

[0053] ccgctcgagc tatgtctgca catggg

[0054] <210>3

[0055] <211>28

[0056] <212>DNA

[0057] <213>人工序列

[0058] <220>

[0059] <223>引物

[0060] <400>3

[0061] ccggaattcg ccttcagcgg ttcccagg

[0062] <210>4

[0063] <211>28

[0064] <212>DNA

[0065] <213>人工序列

[0066] <220>

[0067] <223>引物

[0068] <400>4

[0069] tccagctgac ccatgtgcag acataggg

[0070] <210>5

[0071] <211>390

[0072] <212>DNA

[0073] <213>人工序列

[0074] <220>

[0075] <223>

[0076] <400>5

[0077] ttcatcacca ccattctggg agggctgtac ccatccaagt ccatcctcct gtcaggcact 60[0078] gtcctgccca gtgctcagag gttccacatc aacctgtgct ctgggaacca catcgccttc 120[0079] cacctgaacc cccgttttga tgagaatgct gtggtccgca acacccagat cgacaactcc 180[0080] tgggggtctg aggagcgaag tctgccccga aaaatgccct tcgtccgtgg ccagagcttc 240[0081] tcagtgtgga tcttgtgtga agctcactgc ctcaaggtgg ccgtggatgg tcagcacctg 300[0082] tttgaatact accatcgcct gaggaacctg cccaccatca acagactgga agtggggggc 360[0083] gacatccagc tgacccatgt gcagacatag 390[0084] <210>6

[0085] <211>1068

[0086] <212>DNA

[0087] <213>人工序列

[0088] <220>

[0089] <223>

[0090] <400>6

[0091] atggccttca gcggttccca ggctccctac ctgagtccag ctgtcccctt ttctgggact 60[0092] attcaaggag gtctccagga cggacttcag atcactgtca atgggaccgt tctcagctcc 120[0093] agtggaacca ggtttgctgt gaactttcag actggcttca gtggaaatga cattgccttc 180[0094] cacttcaacc ctcggtttga agatggaggg tacgtggtgt gcaacacgag gcagaacgga 240[0095] agctgggggc ccgaggagag gaagacacac atgcctttcc agaaggggat gccctttgac 300[0096] ctctgcttcc tggtgcagag ctcagatttc aaggtgatgg tgaacgggat cctcttcgtg 360[0097] cagtacttcc accgcgtgcc cttccaccgt gtggacacca tctccgtcaa tggctctgtg 420[0098] cagctgtcct acatcagctt ccagaacccc cgcacagtcc ctgttcagcc tgccttctcc 480[0099] acggtgccgt tctcccagcc tgtctgtttc ccacccaggc ccagggggcg cagacaaaaa 540[0100] cctcccggcg tgtggcctgc caacccggct cccattaccc agacagtcat ccacacagtg 600[0101] cagagcgccc ctggacagat gttctctact cccgccatcc cacctatgat gtacccccac 660[0102] cccgcctatc cgatgccttt catcaccacc attctgggag ggctgtaccc atccaagtcc 720[0103] atcctcctgt caggcactgt cctgcccagt gctcagaggt tccacatcaa cctgtgctct 780[0104] gggaaccaca tcgccttcca cctgaacccc cgttttgatg agaatgctgt ggtccgcaac 840[0105] acccagatcg acaactcctg ggggtctgag gagcgaagtc tgccccgaaa aatgcccttc 900[0106] gtccgtggcc agagcttctc agtgtggatc ttgtgtgaag ctcactgcct caaggtggcc 960[0107] gtggatggtc agcacctgtt tgaatactac catcgcctga ggaacctgcc caccatcaac 1020[0108] agactggaag tggggggcga catccagctg acccatgtgc agacatag 1068[0109] <210>7

[0110] <211>129

[0111] <212>PRT

[0112] <213>人工序列

[0113] <220>

[0114] <223>

[0115] <400>7

[0116] Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu Tyr Pro Ser Lys Ser Ile Leu[0117] 5 10 15[0118] Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala Gln Arg Phe His Ile Asn Leu[0119] 20 25 30

[0120] Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His Leu Asn Pro Arg Phe Asp Glu[0121] 35 40 45

[0122] Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile Asp Asn Ser Trp Gly Ser Glu[0123] 50 55 60

[0124] Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro Phe Val Arg Gly Gln Ser Phe[0125] 65 70 75 80[0126] Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His Cys Leu Lys Val Ala Val Asp[0127] 85 90 95[0128] Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His Arg Leu Arg Asn Leu Pro Thr[0129] 100 105 110

[0130] Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp Ile Gln Leu Thr His Val Gln[0131] 115 120 125

[0132] Thr

[0133] <210>8

[0134] <211>355

[0135] <212>PRT

[0136] <213>人工序列

[0137] <220>

[0138] <223>

[0139] <400>8

[0140] Met Ala Phe Ser Gly Ser Gln Ala Pro Tyr Leu Ser Pro Ala Val Pro[0141] 5 10 15[0142] Phe Ser Gly Thr Ile Gln Gly Gly Leu Gln Asp Gly Leu Gln Ile Thr[0143] 20 25 30

[0144] Val Asn Gly Thr Val Leu Ser Ser Ser Gly Thr Arg Phe Ala Val Asn[0145] 35 40 45

[0146] Phe Gln Thr Gly Phe Ser Gly Asn Asp Ile Ala Phe His Phe Asn Pro[0147] 50 55 60

[0148] Arg Phe Glu Asp Gly Gly Tyr Val Val Cys Asn Thr Arg Gln Asn Gly[0149] 65 70 75 80[0150] Ser Trp Gly Pro Glu Glu Arg Lys Thr His Met Pro Phe Gln Lys Gly[0151] 85 90 95[0152] Met Pro Phe Asp Leu Cys Phe Leu ValGln Ser Ser Asp Phe Lys Val[0153] 100 105 110

[0154] Met Val Asn Gly Ile Leu Phe Val Gln Tyr Phe His Arg Val Pro Phe[0155] 115 120 125

[0156] His Arg Val Asp Thr Ile Ser Val Asn Gly Ser Val Gln Leu Ser Tyr[0157] 130 135 140

[0158] Ile Ser Phe Gln Asn Pro Arg Thr Val Pro Val Gln Pro Ala Phe Ser[0159] 145 150 155 160[0160] Thr Val Pro Phe Ser Gln Pro Val Cys Phe Pro Pro Arg Pro Arg Gly[0161] 165 170 175[0162] Arg Arg Gln Lys Pro Pro Gly Val Trp Pro Ala Asn Pro Ala Pro Ile[0163] 180 185 190

[0164] Thr Gln Thr Val Ile His Thr Val Gln Ser Ala Pro Gly Gln Met Phe[0165] 195 200 205

[0166] Ser Thr Pro Ala Ile Pro Pro Met Met Tyr Pro His Pro Ala Tyr Pro[0167] 210 215 220

[0168] Met Pro Phe Ile Thr Thr Ile Leu Gly Gly Leu Tyr Pro Ser Lys Ser[0169] 225 230 235 240[0170] Ile Leu Leu Ser Gly Thr Val Leu Pro Ser Ala Gln Arg Phe His Ile[0171] 245 250 255[0172] Asn Leu Cys Ser Gly Asn His Ile Ala Phe His Leu Asn Pro Arg Phe[0173] 260 265 270

[0174] Asp Glu Asn Ala Val Val Arg Asn Thr Gln Ile Asp Asn Ser Trp Gly[0175] 275 280 285

[0176] Ser Glu Glu Arg Ser Leu Pro Arg Lys Met Pro Phe Val Arg Gly Gln[0177] 290 295 300

[0178] Ser Phe Ser Val Trp Ile Leu Cys Glu Ala His Cys Leu Lys Val Ala[0179] 305 310 315 320[0180] Val Asp Gly Gln His Leu Phe Glu Tyr Tyr His Arg Leu Arg Asn Leu[0181] 325 330 335[0182] Pro Thr Ile Asn Arg Leu Glu Val Gly Gly Asp Ile Gln Leu Thr His[0183] 340 345 350

[0184] Val Gln Thr

[0185] 355