获取细菌16SrRNA基因的V3区核苷酸序列的方法及其专用引物

摘要

本发明公开了一种获取细菌16S rRNA基因的V3区核苷酸序列的方法及其专用引物。本发明的专用引物是由序列表的序列17和序列19所示的核苷酸组成的特异引物对。本发明提供的方法，包括如下步骤：(1)以细菌的基因组DNA为模板，用通用引物进行PCR扩增；通用引物是由序列表的序列17和序列18所示的核苷酸组成的引物对；(2)以步骤(1)的PCR产物为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增；(3)将步骤(2)的PCR产物采用测序引物进行测序；测序引物的核苷酸序列如序列表的序列20所示。本发明提供的用于细菌多样性分析的针对16S rRNA基因V3区的引物对可以直接进行测序，无需借助载体，有助于降低了实验成本，缩短实验的周期，提高实验的准确性。本发明的特异引物对和方法特别适用于针对16S rRNA基因V3区用PCR-DGGE技术分析环境样品细菌多样性试验。

权利要求

1.由序列表的序列17和序列表的序列19所示的核苷酸组成的特异引物对。

2.获取细菌16S rRNA基因的V3区的核苷酸序列的试剂盒，包括特异引物对、通用引物和测序引物；所述特异引物对是由序列表的序列17和序列表的序列19所示的核苷酸组成的引物对；所述通用引物是由序列表的序列17和序列表的序列18所示的核苷酸组成的引物对；所述测序引物的核苷酸序列如序列表的序列20所示。

3.权利要求1所述特异引物对在制备获取细菌16S rRNA基因的V3区的核苷酸序列的试剂盒中的应用。

4.权利要求1所述特异引物对在获取细菌16S rRNA基因的V3区的核苷酸序列中的应用。

5.一种获取细菌16S rRNA基因的V3区的核苷酸序列的方法，包括如下步骤：(1)用通用引物PCR扩增细菌16S rRNA基因的V3区；所述通用引物是由序列表的序列17和序列表的序列18所示的核苷酸组成的引物对；

(2)以步骤(1)的PCR产物为模板，用特异引物对进行PCR扩增；所述特异引物对是由序列表的序列17和序列表的序列19所示的核苷酸组成的引物对；

(3)将步骤(2)的PCR产物采用测序引物进行测序，得到细菌16S rRNA基因的V3区的核苷酸序列；所述测序引物的核苷酸序列如序列表的序列20所示。

说明书

获取细菌16S rRNA基因的V3区核苷酸序列的方法及其专

用引物

技术领域

[0001] 本发明涉及一种获取细菌16S rRNA基因的V3区核苷酸序列的方法及其专用引物。

背景技术

[0002] 细菌的核糖体核苷酸基因通常包含9个(V1-V9)区。但是，在这9个区中，可变区的长度和可变区碱基序列的多样性也存在差异。其中V3、V6区的碱基序列多样性最高。V6区比较短，因此16S rRNA基因中V3区(约200bp)成为最为常用的分子标记之一。PCR-DGGE技术以及由此延伸的PCR-TGGE被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域。因信息量大，能够区分细菌的几乎所有的属且序列长度在DGGE胶的最佳分离效果之内，16S rRNA基因中V3区被大量科研工作者应用于对环境多样性的研究。

[0003] PCR扩增16S rRNA基因中高可变区V3的通用引物为338F和543R组成的引物对。当用上述技术研究环境样品多样性时，研究人员一般会直接从胶中回收DGGE/TGGE胶中单一条带的DNA，然后用DNA溶解Buffer溶解回收的DNA，用PCR二次扩增回收DNA以提高回收样品的丰度，再通过连接载体，转化感受态细胞，挑选单克隆细胞，验证阳性克隆，提取质粒，进行测序，最后分析数据。但是，通过转化克隆载体测序的方法试验步骤繁琐、试验周期长、工作量大、花费大、最为严重的缺点是获得序列信息有可能出错。造成出错原因大概有两方面：第一方面DNA模板二次扩增时发生低丰度污染，因挑选阳性克隆不当，错把污染序列作为目的序列；另一方面以DNA为模板的DNA聚合酶本身在催化半保留复制时也会发生错误合成，当挑选阳性单克隆测序时，序列的准确性有可能降低。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种获取细菌16S rRNA基因的V3区核苷酸序列的方法及其专用引物。

[0005] 本发明提供了专用引物，是由序列表的序列17和序列表的序列19所示的核苷酸组成的特异引物对。该专用引物可用于获取细菌16S rRNA基因的V3区核苷酸序列。

[0006] 本发明还保护一种获取细菌16S rRNA基因的V3区的核苷酸序列的试剂盒，包括特异引物对、通用引物和测序引物；所述特异引物对是由序列表的序列17和序列表的序列19所示的核苷酸组成的引物对；所述通用引物是由序列表的序列17和序列表的序列18所示的核苷酸组成的引物对；所述测序引物的核苷酸序列如序列表的序列20所示。

[0007] 所述特异引物对在制备获取细菌16S rRNA基因的V3区的核苷酸序列的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。

[0008] 所述特异引物对在获取细菌16S rRNA基因的V3区的核苷酸序列中的应用也属于本发明的保护范围。

[0009] 本发明提供的获取细菌16S rRNA基因的V3区的核苷酸序列的方法，包括如下步骤：

[0010] (1)用通用引物PCR扩增细菌16S rRNA基因的V3区；所述通用引物是由序列表的序列17和序列表的序列18所示的核苷酸组成的引物对；

[0011] (2)以步骤(1)的PCR产物为模板，用特异引物对进行PCR扩增；所述特异引物对是由序列表的序列17和序列表的序列19所示的核苷酸组成的引物对；

[0012] (3)将步骤(2)的PCR产物采用测序引物进行测序，得到细菌16S rRNA基因的V3区的核苷酸序列；所述测序引物的核苷酸序列如序列表的序列20所示。

[0013] 采用通用引物扩增16S rRNA基因的V3区，产物约200bp，因扩增产物较短不能直接用于测序而必须通过传统的连接载体克隆后进行测序，工作量繁重，实验周期漫长。本发明提供的用于细菌多样性分析的针对16S rRNA基因的V3区的特异引物对可以直接进行测序，无需借助载体，有助于降低了实验成本，缩短实验的周期，提高实验的准确性。本发明的特异引物对和方法特别适用于针对16S rRNA基因的V3区用PCR-DGGE技术分析环境样品细菌多样性试验。

附图说明

[0014] 图1为用Tinoco Plot软件对M543R引物的二级结构进行评估的结果。

[0015] 图2为用Dotplot软件对338F-M543R引物对进行全局比对评估的结果。

[0016] 图3为用通用引物和特异引物对进行PCR的PCR产物电泳图。

[0017] 图4为DNA片段甲的测序结果。

[0018] 图5为序列1至序列4的比对结果。

[0019] 图6为DNA片段乙的测序结果。

[0020] 图7为序列5至序列8的比对结果。

[0021] 图8为DNA片段丙的测序结果。

[0022] 图9为序列9至序列12的比对结果。

[0023] 图10为DNA片段丁的测序结果。

[0024] 图11为序列13至序列16的比对结果。

具体实施方式

[0025] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

[0026] 实施例中引物的核苷酸序列如下：

[0027] 338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAgCAG-3(序列表的序列17)；

[0028] 543R：5’-TGTATTACCGCGGCTGCTGG-3’(序列表的序列18)；

[0029] M543R：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACATTCACGACTCACTATAGGGTGTATTACCGCGGCTGCTGG-3’(序列表的序列19)；

[0030] QSS：5’-GCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCTG-3’(序列表的序列20)。

[0031] 实施例中的PCR参数：

[0032] PCR的反应体系(50ul)：10×buffer5ul，2mM dNTP4ul，10mM primer(338F)2ul，10mM primer(M543R或543R)2ul，Taq酶(2U/ul)1ul，DNA1ul，ddH2O35ul。

[0033] PCR反应条件；起始变性(10分钟，95℃)；30个循环(变性30秒，95℃；退火30秒，55℃；延伸30秒，72℃)；延伸2分钟，72℃。

[0034] 实施例1、特异引物对的发现和分析

[0035] 一、特异引物对的发现

[0036] 合成序列表的序列1所示的DNA片段甲(Clostridium bifermentans strain MKA2的16S rRNA基因)。序列1所示DNA与GENBANK ACCESSION NUMBER GU358061.1所示DNA互补。Clostridium bifermentans strain MKA2的16S rRNA基因的V3区为自5’末端第125至299位核苷酸。

[0037] 用通用引物(338F-543R)对DNA片段甲进行PCR扩增。PCR产物进行1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，然后用天根DNA胶纯化试剂盒进行切胶纯化。纯化后的产物洗脱体积为50ul。将纯化后的DNA用543R作测序引物，直接测序。测序图谱见图4A，测序结果见序列表的序列2。分析发现：当用引物直接测序时，测序引物下游40个碱基后的序列峰图完全可信。

[0038] 设计一条长达44bp的特异序列连接到原来的543R引物5’端，原引物从20碱基加长到64个碱基，得到新的下游引物M543R。

[0039] 二、特异引物对的分析

[0040] 用 Tinoco Plot(http：//www.biophys.uni-duesseldorf.de/local/TINOCO/tinoco.html)软件对M543R的二级结构进行评估，见图1，M543R自身没有形成超过4碱基的螺旋结构。用Dot-Plot(http：//www.biophys.uni-duesseldorf.de/local/DOTPLOT/dotplot.html)对338F-M543R引物对进行完全比对评估加长的序列是否会与338F形成螺旋结构，如图2所示，该增加的特异性序列没有和338F引物形成超过4碱基的强螺旋结构。

[0041] 三、特异引物对的应用效果

[0042] 用特异引物对(338F-M543R)对步骤一中纯化后的PCR产物进行PCR扩增。PCR 产物进行1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，然后用天根DNA胶纯化试剂盒进行切胶纯化。纯化后的产物洗脱体积为50ul。将纯化后的DNA用QSS作测序引物，直接测序。测序图谱见图4B，测序结果见序列表的序列3。从测序峰图分析，可以很清晰的分辨出M543R中与543R引物相同的碱基序列以及在其后的碱基序列，无论碱基的可信度还是峰间距，噪音值都达到的试验要求的准确度。特别需要补充的是，根据测序的原理，测序不准确的序列一般会出现在前端，后端序列只要测序反应可靠长度区间(700bp)内，就不会出现不准确。

[0043] 将步骤一中纯化后的PCR产物与pGEM-T载体(Promega公司产品pGEM-T easy Vector system)连接，转化大肠杆菌DH5α(北京天为时代公司)感受态，挑选阳性克隆.使用载体引物M1320进行测序，测序图谱见图4C，测序结果见序列表的序列4。

[0044] 将序列1至序列4用clustalw2(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)比对分析，结果见图5。用特异引物对(338F-M543R)和QSS引物测序的结果和连接载体后所得结果不存在差别，都能高效准确的扩增DNA片段甲，从而得到DNA片段甲的准确核苷酸序列(Clostridium bifermentans的V3区)：直接用543R测序由于前端约40多碱基不能测出，影响了序列准确性。

[0045] 分别用特异引物对(338F；M543R)和通用引物(338F；543R)对7株菌的16S rRNA基因中V3区的进行PCR扩增。PCR扩增产物进行1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳。PCR产物点样为5ul，所用DNA分子量标记(marker)为北京天根公司的1kb Plus。结果见图3，M为marker；1-14为7株菌，每株菌两个泳道。可见，引物改造后对引物的退火温度，扩增效率无影响。

[0046] 实施例2、细菌16S rRNA基因的V3区核苷酸序列的获得

[0047] 合成序列表的序列5所示的DNA片段乙(Shewanella sp.enrichment culture clone LY4的16S rRNA基因)。序列5所示DNA与GENBANK ACCESSION NUMBER GQ465946.1所示DNA互补。Shewanella sp.enrichment culture clone LY4的16S rRNA基因的V3区为自5’末端第195至395位核苷酸。

[0048] 1、用通用引物(338F-543R)对DNA片段乙进行PCR扩增。PCR产物进行1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，然后用天根DNA胶纯化试剂盒进行切胶纯化。纯化后的产物洗脱体积为50ul。将纯化后的DNA用543R作测序引物，直接测序。测序图谱见图6A，测序结果见序列表的序列6。

[0049] 2、用特异引物对(338F-M543R)对步骤1中纯化后的PCR产物进行PCR扩增。PCR产物进行1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，然后用天根DNA胶纯化试剂盒进行切胶纯化。纯化后的产物洗脱体积为50ul。将纯化后的DNA用QSS作测序引物，直接 测序。测序图谱见图6B，测序结果见序列表的序列7。

[0050] 3、将步骤1的PCR产物与pGEM-T载体(Promega公司产品pGEM-T easy Vector system)连接，转化大肠杆菌DH5α(北京天为时代公司)感受态，挑选阳性克隆.使用载体引物M1320进行测序，测序图谱见图6C，测序结果见序列表的序列8。

[0051] 将序列5至序列8用clustalw2(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)比对分析，结果见图7。结果表明，采用本发明的方法，可以直接对DNA片段乙(Shewanella sp.的V3区)进行准确测序。

[0052] 实施例3、细菌16S rRNA基因的V3区核苷酸序列的获得

[0053] 合成序列表的序列9所示的DNA片段丙(Marine bacterium SIMO-4432的16S rRNA基因)。序列9所示DNA与GENBANK ACCESSION NUMBER DQ469762.1所示DNA互补。Marine bacterium SIMO-4432的16S rRNA基因的V3区为自5’末端第129至327位核苷酸。

[0054] 1、用通用引物(338F-543R)对DNA片段丙进行PCR扩增。PCR产物进行1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，然后用天根DNA胶纯化试剂盒进行切胶纯化。纯化后的产物洗脱体积为50ul。将纯化后的DNA用543R作测序引物，直接测序。测序图谱见图8A，测序结果见序列表的序列10。

[0055] 2、用特异引物对(338F-M543R)对步骤1中纯化后的PCR产物进行PCR扩增。PCR产物进行1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，然后用天根DNA胶纯化试剂盒进行切胶纯化。纯化后的产物洗脱体积为50ul。将纯化后的DNA用QSS作测序引物，直接测序。测序图谱见图8B，测序结果见序列表的序列11。

[0056] 3、将步骤1的PCR产物与pGEM-T载体(Promega公司产品pGEM-T easy Vector system)连接，转化大肠杆菌DH5α(北京天为时代公司)感受态，挑选阳性克隆.使用载体引物M1320进行测序，测序图谱见图8C，测序结果见序列表的序列12。

[0057] 将序列9至序列12用clustalw2(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)比对分析，结果见图9。结果表明，采用本发明的方法，可以直接对DNA片段丙(Marine bacterium SIMO-4432的V3区)进行准确测序。

[0058] 实施例4、细菌16S rRNA基因的V3区核苷酸序列的获得

[0059] 合成序列表的序列13所示的DNA片段丁(Providencia alcalifaciens strain3T1-2的16S rRNA基因)。序列13所示DNA与GENBANK ACCESSION NUMBER GU195126.1所示DNA互补。Marine bacterium SIMO-4432的16S rRNA基因的V3区为自5’末端第252至451位核苷酸。

[0060] 1、用通用引物(338F-543R)对DNA片段丁进行PCR扩增。PCR产物进行1.5％(质 量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，然后用天根DNA胶纯化试剂盒进行切胶纯化。纯化后的产物洗脱体积为50ul。将纯化后的DNA用543R作测序引物，直接测序。测序图谱见图i0A，测序结果见序列表的序列14。

[0061] 2、用特异引物对(338F-M543R)对步骤1中纯化后的PCR产物进行PCR扩增。PCR产物进行1.5％(质量百分含量)琼脂糖凝胶电泳，然后用天根DNA胶纯化试剂盒进行切胶纯化。纯化后的产物洗脱体积为50ul。将纯化后的DNA用QSS作测序引物，直接测序。测序图谱见图10B，测序结果见序列表的序列15。

[0062] 3、将步骤1的PCR产物与pGEM-T载体(Promega公司产品pGEM-T easy Vector system)连接，转化大肠杆菌DH5α(北京天为时代公司)感受态，挑选阳性克隆.使用载体引物M1320进行测序，测序图谱见图10C，测序结果见序列表的序列16。

[0063] 将序列13至序列16用clustalw2(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)比对分析，结果见图11。结果表明，采用本发明的方法，可以直接对DNA片段丁(Marine bacterium SIMO-4432的V3区)进行准确测序。