作为抗癌剂的自组装的两亲性聚合物

摘要

本发明提供了两亲性的生物相容性共聚物，其具有亲水主链和悬垂的疏水基团。聚合物在水性环境中形成纳米级的分子聚集体，所述分子聚集体具有疏水的内部，抗癌药物可在其中被增溶。聚合物任选地以连接有介导携带药物的聚集体附着于所靶向的癌细胞的抗体、受体配体和其他靶向部分为特征。

权利要求

1.药物组合物，所述药物组合物包括包封在梳型聚合物内的抗癌药物，所述梳型聚合物主要由下列结构组成：其含有由交替的支化点部分B和亲水的、水溶性的聚合物嵌段A形成的主链；以及具有与所述支化点部分相连的疏水侧链C和靶向部分Z，其中：A选自式-(CH2CH2O)m-的聚(乙二醇)链，其中m在20和50之间；

B选自二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇或2，3-二氨基丁烷-1，4-二硫醇与两马来酸分子的轭合物；

每个疏水侧链C独立地选自(C8-C20)的脂肪族链、寡羟基酸、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(原酸酯)、聚(磷酸酯)、聚内酯、胆固醇、胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、甾族的物质、视黄酸、视黄醇以及肽；其中每个部分C的分子量在50和1,000之间，并且分子C-H的logP值大于约1.4，在辛醇-水中测定；

每个靶向部分Z独立地为对癌细胞的表面具有特异性结合亲和力的配体，所述配体选自由受体特异性配体、抗体、抗体片段和生长因子；

s是键或者衍生自马来酸、二乙二醇、阿康酸或巯基琥珀酸的间隔基部分；

n的值在1至100的范围内；

p的平均值在大于一至四的范围内；并且

r的平均值在0至8的范围内。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中n在2至100的范围内。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述配体选自由表皮生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、叶酸、甲氨蝶呤、蝶酸、雌二醇、雌三醇、睾酮、甘露糖-6-磷酸、以及抗NCA90、NCA95、CEA、CD15、CD20、CD22、CD33、CD52、VGEF或EGFR的抗体和抗体片段组成的组。

4.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述配体选自由表皮生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、叶酸、甲氨蝶呤、蝶酸、雌二醇、雌三醇、睾酮、甘露糖-6-磷酸、以及抗NCA90、NCA95、CEA、CD15、CD20、CD22、CD33、CD52、VGEF或EGFR的抗体和抗体片段组成的组。

5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗癌药物选自由多柔比星、喜树碱、多西紫杉醇、紫杉醇、托泊替康、伊立替康、伊马替尼、舒尼替尼、索拉非尼、阿昔替尼、帕唑帕尼、依托泊苷、甲氨蝶呤、甲基叶酸、二氯甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、星形孢菌素、阿糖胞苷、美法仑、长春罗新、放线菌素、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素D、丝裂霉素A、洋红霉素、氨喋呤、他利霉素、鬼臼毒素、顺铂、碳铂、长春碱、长春新碱、长春地辛、视黄酸和他莫昔芬组成的组。

6.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述抗癌药物选自由多柔比星、喜树碱、多西紫杉醇、紫杉醇、托泊替康、伊立替康、伊马替尼、舒尼替尼、索拉非尼、阿昔替尼、帕唑帕尼、依托泊苷、甲氨蝶呤、甲基叶酸、二氯甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、星形孢菌素、阿糖胞苷、美法仑、长春罗新、放线菌素、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素D、丝裂霉素A、洋红霉素、氨喋呤、他利霉素、鬼臼毒素、顺铂、碳铂、长春碱、长春新碱、长春地辛、视黄酸和他莫昔芬组成的组。

7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述聚合物具有结构：

其中m为20-50，并且Y和Y′独立地选自由R、OR、COOR、SR、NHR、NRR′、ONHR、NHOR、NRNH2、NHNHR、NRNHR′和NHNRR′组成的组，其中R和R′独立地选自(C8-C20)的脂肪族链、寡羟基酸、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(原酸酯)、聚(磷酸酯)、聚内酯、胆固醇、胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、甾族的物质、视黄酸、视黄醇以及肽；其中每个部分C的分子量在50和1,000之间，并且分子C-H的logP值大于约1.4，在辛醇-水中测定。

8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述聚合物具有结构：

其中m为20-50，W是O或NH，并且Y和Y′独立地选自由R、COR、COOR、CONHR、CONRR′、CONHOR、CONRNH2、CONHNHR、CONRNHR′和CONHNRR′组成的组，其中R和R′独立地选自(C8-C20)的脂肪族链、寡羟基酸、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(原酸酯)、聚(磷酸酯)、聚内酯、胆固醇、胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、甾族的物质、视黄酸、视黄醇以及肽；其中每个部分C的分子量在50和1,000之间，并且分子C-H的logP值大于约1.4，在辛醇-水中测定。

9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述聚合物具有结构：

其中部分D衍生自1，4-二氨基丁烷、1，3-二氨基-2-丙醇、六亚乙基四胺、精胺、亚精胺、五亚乙基六胺、胍基丁胺、赖氨酸、1，6-二氨基己烷、1，4-苯二胺、1，3-苯二胺和1，4-二氨基丁烷-2，3-二醇，p为0-4，并且m为20-50；并且其中R和R′独立地选自(C8-C20)的脂肪族链、寡羟基酸、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(原酸酯)、聚(磷酸酯)、聚内酯、胆固醇、胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、甾族的物质、视黄酸、视黄醇以及肽；其中每个部分C的分子量在

50和1,000之间，并且分子C-H的logP值大于约1.4，在辛醇-水中测定。

10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述聚合物具有结构：

其中m为20-50，W是O或NH，并且R和R′独立地选自(C8-C20)的脂肪族链、寡羟基酸、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(原酸酯)、聚(磷酸酯)、聚内酯、胆固醇、胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、甾族的物质、视黄酸、视黄醇以及肽；其中每个部分C的分子量在50和1,000之间，并且分子C-H的logP值大于约1.4，在辛醇-水中测定。

11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述聚合物具有结构：

其中m为20-50，L是亚苯基、C2-C6亚烃基或苯二亚甲基，W是O或NH，并且R和R′独立地选自(C8-C20)的脂肪族链、寡羟基酸、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(原酸酯)、聚(磷酸酯)、聚内酯、胆固醇、胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、甾族的物质、视黄酸、视黄醇以及肽；其中每个部分C的分子量在50和1,000之间，并且分子C-H的logP值大于约1.4，在辛醇-水中测定。

12.一种药物组合物，其含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂以及包封在梳型聚合物内的抗癌药物，所述梳型聚合物主要由以下结构组成：其含有由交替的支化点部分B和亲水的、水溶性的聚合物嵌段A形成的主链；以及具有与所述支化点部分相连的疏水侧链C和靶向部分Z，其中：A选自式-(CH2CH2O)m-的聚(乙二醇)链，其中m在20和50之间；

B选自二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇或2，3-二氨基丁烷-1，4-二硫醇与两马来酸分子的轭合物；

每个疏水侧链C独立地选自(C8-C20)的脂肪族链、寡羟基酸、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(原酸酯)、聚(磷酸酯)、聚内酯、胆固醇、胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、甾族的物质、视黄酸、视黄醇以及肽；其中每个部分C的分子量在50和1,000之间，并且分子C-H的logP值大于约1.4，在辛醇-水中测定；

每个靶向部分Z独立地为对癌细胞的表面具有特异性结合亲和力的配体，所述配体选自由受体特异性配体、抗体、抗体片段和生长因子；

s是键或者衍生自马来酸、二乙二醇、阿康酸或巯基琥珀酸的间隔基部分；

n的值在1至100的范围内；

p的平均值在大于一至四的范围内；并且

r的平均值在0至8的范围内。

13.权利要求1-12中任一项的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

说明书

作为抗癌剂的自组装的两亲性聚合物

发明领域

[0001] 本发明涉及两亲性聚合物的领域，尤其是生物相容的形成胶束的梳型聚合物的领域。本发明还涉及靶向的药物递送和抗癌剂的领域。

[0002] 背景

[0003] 近些年，含有疏水嵌段和亲水嵌段的两亲性嵌段共聚物由于当周围溶剂变化时它们的自组装为各种纳米结构的能力而被充分研究。参见Cameron等人Can.J.Chem.Rev.Can.Chim.77：1311-1326(1999)。在水性溶液中，两亲性聚合物的疏水段有为了避免与水接触并将体系的界面自由能最小化而自组装的趋势。同时，亲水嵌段在水性环境中形成水合的“晕(corona)”并且因此聚集体保持热动力学上稳定的结构。所得的是具有疏水核和亲水晕的聚合物聚集体颗粒的稳定的、乳胶状的胶体悬浮液。

[0004] 梳型两亲性共聚物与嵌段共聚物不同在于其主链主要是疏水的或亲水的，具有从主链悬垂而不是并入主链的相反极性的聚合物链。已经用疏水主链和亲水支链制备了梳型共聚物(Mayes等人，美国专利第6,399,700号)，并且也用亲水主链和疏水支链制备了梳型共聚物(Watterson等人，美国专利第6,521,736号；Uchegbu等人，美国申请公开第2006/0148982号)。前者被用于提供对细胞表面受体的配体的多价展示，而后者被用于使药物增溶并将它们递送至细胞。

[0005] 已经将两亲性聚合物聚集体作为用于增溶不溶性药物的载体，靶向的药物递送载体，和siRNA或基因递送系统进行研究。由于链缠结和/或内部疏水区域的结晶性，它们具有比常规低分子量胶束更稳定的结构。载体的聚合性质使得聚集体对一般的脂质体在被稀释至它们的临界胶束浓度 时会经受的崩解相对免疫。双层膜的缺少使得它们更容易与细胞膜融合并且将它们的有效载荷直接递送至细胞。聚集体的两亲性质还提供了类洗涤剂的活性并且适当地靶向的聚集体表现为能够与病毒外壳蛋白融合并干扰病毒外壳蛋白。

[0006] 由于聚(乙二醇)(PEG)的良好的生物相容性以及PEG包被的“隐形”颗粒避开网状内皮组织系统的显著能力，并有PEG的胶束、脂质体和聚合物作为用于药物递送系统的材料已经得到广泛认同。有许多将PEG作为PEG-脂质(形成脂质体和胶束)的亲水成分的使用的报道；参见例如Krishnadas等人，Pharm.Res.20：297-302(2003)。已将自组装为更坚固的“聚合物组装聚集体(polymersomes)”的自组装的两亲性嵌段共聚物作为用于药物增溶和递送的载体来研究。参见例如Jones和Leroux，Eur.J.Pharm.Biopharm.48：101-111(1999)；Photos 等 人，J.Controlled Release，90：323-334(2003)；Kataoka 等人，Adv.Drug Deliv.Rev.47：113-131(2001)；以及 Torchjlin，J.Controlled Rel.73：
137-172(2001)。

[0007] 还参见Gref等人，Int.Symp.Controlled Release Mater.20：131(1993)；Kwon等人，Langmuir，9：945(1993)；Kabanov等人，J.Controlled Release，22：141(1992)；Allen等 人，J.Controlled Release，63：275(2000)；Inoue等 人，J.Controlled Release，51：221(1998)；Yu和Eisenberg，Macromolecules，29：6359(1996)；Discher等 人，Science，
284：113(1999)；Kim等人，美国专利第6,322,805号；Seo等人，美国专利第6,616,941和
7,217,770号；Seo等人，欧洲专利第EP 0583955号。已经报道了具有这种能力的聚(乙烯亚胺)(PEI)的使用，重点在于寡核苷酸的递送(Nam等人，美国专利第6,569,528号；
Wagner等人，美国专利申请公开第20040248842号)。类似地，Luo等人，在Macromolecules
35：3456(2002)中描述了适用于递送多核苷酸的PEG轭合的聚酰胺型胺类(″PAMAM″)树枝状大分子。

[0008] 除了对增溶、分配和递送药物的需求，还有对于对靶细胞类型、组织、肿瘤或器官特异性定向的靶向的药物递送系统的需求。这往往通过连接对靶位点处的细胞壁具有特异性亲和力的抗体或其他配体来实现。然而除了在聚合物链的末端以外PEG缺乏官能团，并且在嵌段共聚物中，大部分的 末端基团不可避免地被与其他嵌段共聚物部分的连接键所占据。出于这一原因，靶向部分例如抗体或细胞粘附分子与PEG嵌段共聚物的连接通常被限制于非PEG嵌段，遗憾地非PEG嵌段不是共聚物通常以自组装聚集体的晕暴露的部分。

[0009] 导致嵌段共聚物自组装为聚合物聚集体的相分离现象是容易可逆的，并且已经进行了通过交联疏水核增加聚集体的稳定性的尝试(参见欧洲专利第EP 0552802号)。还尝试了药物对嵌段共聚物的疏水部分的共价连接(Park和Yoo，美国专利第6,623,729号；欧洲专利第EP 0397307号)。

[0010] 树枝状聚合物容易与靶向部分轭合并且具有体内靶向特异细胞(Singh等人(1994)Clin.Chem.40：1845)以及阻碍病毒和细菌病原体对生物学基底粘附的潜能。已经评价了与多个唾液酸轭合的梳型支链和支化接枝(dendrigraft)聚合物的抑制病毒血细胞凝集和体外阻碍哺乳动物细胞的感染的能力(Reuter等人(1999)Bioconjugate Chem.10：271)。最有效的病毒抑制剂是梳型支链和支化接枝的大分子，其显示出50,000倍增加的抗这些病毒的活性。

[0011] 近来，药物公司Starpharma宣布成功开发了通过与病毒表面上的受体结合而预TM防HIV感染的树枝状大分子基础的杀生物剂(VivaGel )(Halford(2005)Chem.& Eng.News
83(24)：30)。Chen等人(2000)(Biomacromolecules.1：473)已经报道了季铵官能化的聚(丙烯亚胺)树枝状大分子是非常强效的杀生物剂。

[0012] 杀死癌细胞而不损害患者的几乎相同的健康细胞是非常困难的有待解决的问题。即便用最成功的化学治疗剂，仅仅部分实现了对癌细胞的机制基础的选择性毒性。出于这一原因，癌疗法是尤其需要靶向递送的一类剂，并且已经对开发癌特异性细胞表面标记的配体进行了大量的努力(Delgado和Francis，Drug Targeting：Strategies，Principles and Applications(药物靶向：策略、原则和应用)，Humana Press，2000)。

[0013] 例如，在卵巢、肾、肺、乳腺、脑和子宫内膜的癌以及造血来源的骨髓细胞中叶酸的细胞表面受体常常升高。由于叶酸的受体在正常细胞中通常很少见，但却在癌细胞表面上显示，因此它已经常常被利用为受体定向 的癌疗法的靶(Lu和Low，J Control Release.91：17-29(2003))。报道的应用中叶酸与抗肿瘤药物、抗体(美国专利第5,547,668号)、脂质体(Liu和Lee，Drug Design Reviews Online，2：547-552(2005))和其他纳米粒子药物递送结构(Torchilin，Adv.Drug Delivery Rev.58：1532-1555(2006))直接轭合。由叶酸轭合的两亲性嵌段共聚物形成的胶束已经显示出将紫杉醇选择性地递送至肿瘤细胞(Park等人，J.Controlled Release 109：158-168(2005))。

[0014] 相似地，表皮生长因子受体(ErbB1，EGFR)在广谱的上皮起源的人类肿瘤中过量表达，所述肿瘤包括乳腺、头颈、胃、结肠直肠、食道、前列腺、膀胱、肾脏、胰腺和卵巢癌，以及非小细胞性肺癌。这些发现已经将EGFR确立为受体介导的递送系统的另一个重要的靶。EGF本身显示出强的促有丝分裂和血管生成活性，这使得它不适合作为靶向部分，但是已经为了这一目的开发了EGFR的多种非激动剂配体。

[0015] 已经成功地将直接抗细胞特异或肿瘤特异的表位的抗体用作靶向疗法，单独地(活化患者的补体系统)或递送放射性同位素或毒素。例如，托西莫单抗、抗CD20 B淋巴细胞抗原的鼠IgG2aλ单克隆抗体可被放射性碘标记并被用于将碘-131选择性地递送至淋巴细胞。这已经作为用于非霍奇金淋巴瘤的治疗成功地在临床上得到证实，并且已经以TM商品名Bexxar 商品化用于这一适应症。相似地，另一种抗CD20的单克隆抗体伊莫单抗TM
(Zevalin )，已经被用以递送用于非霍奇金淋巴瘤的免疫放射疗法的钇-90。

[0016] 其他临床上成功的靶向癌的抗体包括用于慢性淋巴细胞性白血病的阿伦单抗TM TM(抗CD52，Campath )，用于结肠癌和肺癌的贝伐单抗(抗VEGF，Avastin )，用于结肠、头TM TM
颈癌的西妥昔单抗(抗EGFR，Erbitux )和帕尼单抗(抗EGFR，Vectibix )，用于急性髓性TM
白血病的吉妥单抗(抗CD33，Mylotarg )，用于非霍奇金淋巴瘤的利妥昔单抗(抗-CD20，TM TM
Rituxan )和依帕珠单抗(抗CD22，Lymphocide )，以及用于乳腺癌的曲妥珠单抗(抗TM TM
HER-2，Herceptin )。具有特异的相关性的是免疫毒素Mylotarg ，其中抗CD33抗体与一种细胞毒性的抗肿瘤药物卡奇霉素轭合。

[0017] 仍然有对于稳定的、生物相容性的、易于连接各种靶向部分并且有效 地将药物的大致有效载荷递送至所期望的肿瘤细胞靶的药物递送系统的需求。还有对于类似地稳定的、高效的并且生物相容性的靶向的抗癌剂的需求。

[0018] 发明概述

[0019] 本发明提供了生物相容性的梳型聚合物分子，其含有具有支化点部分的亲水主链和在这些支化点部分处连接的疏水支链。支化点部分进一步以反应性官能团的形式提供连接点，肿瘤细胞特异性的靶向部分可与其连接。本发明提供了由这些聚合物形成的聚合物聚集体的水性悬浮液，并且提供了通过将抗肿瘤剂包封进聚合物聚集体的疏水核中来增溶这些抗肿瘤剂的方法。用于包封药物的方法基本上包括将药物物质与本发明的聚合物在水性溶剂或混合的水性溶剂中接触。所得到的药物有效载荷当在水性环境中悬浮时，在由梳型聚合物形成的大分子聚合物聚集体的疏水核内被保持在增溶(solublized)状态。在优选的实施方案中，聚合物聚集体及其包封的药物有效载荷通过靶向部分被选择性地递送至所靶向的癌细胞。

[0020] 本发明还提供了杀死癌细胞或抑制癌细胞的生长或复制，或者治疗哺乳动物中癌的方法，所述方法包括将所述癌细胞与包封在梳型聚合物内的抗癌药物接触或对所述哺乳动物施用包封在梳型聚合物内的抗癌药物，所述梳型聚合物主要由下列结构组成：

[0021]

[0022] 该结构包括由交替的支化点部分B和亲水的、水溶性的聚合物嵌段A形成的主链。疏水侧链C以及任选地靶向部分Z被连接到支化点部分。应当理解的是聚合物链具有末端基团，通常为位于末端B部分处的H或聚合物嵌段A，以及通常位于末端A聚合物嵌段处的OH，但是本发明包括所有常规的链末端。优选地，侧链C是任选地由一个或多个亲水的取代基取代的直链或支链的烃，或任选地由一个或多个亲水取代基取代的C6-C30环烃或多环烃。
侧链C还可以是疏水的氨基酸、肽或聚合物。对侧链C来说适合的亲水取代基是羟基、羧基和氨基基团，以及酰胺、磺酰胺、亚砜和砜基团。优选的亲水取代基是极性的质子惰性的基团，例如叔酰胺、亚砜和砜。

[0023] 任选的靶向部分Z是对癌细胞表面具有特异性结合亲和力的配体或抗体。在本发明的一些实施方案中，两种或更多种不同的部分Z存在于给定的支化点或聚合物分子上，以便作为增加特异性的方法而可以靶向多种细胞表面受体和抗原。“特异性结合亲和力”意指配体或抗体在待治疗的哺乳动物的体内发现的许多其他细胞的表面和大分子存在的情况下能够在体内与癌细胞表面结合。亲和力可以是单独对癌细胞特异性的，或者可以是对患者内是癌性的细胞类型特异性的。例如，在B-细胞淋巴瘤中，配体可以是所有B-细胞上存在的CD-20受体的抗体。特异性的程度不需要非常高，但是必须足以比单独的被增溶的药物有效载荷更有效地治疗癌。由“s”表示的部分是键或者间隔基部分，并且当s是间隔基时每个s可带有1至4个基团Z。n的值在1至约100的范围内；p的平均值在从1至2的范围内，并且在一些实施方案中r可是零。在r为非零的那些实施方案中，r的平均值在1至4的范围内。

[0024] 支化点部分B是具有与两个聚合物嵌段A的键、与1-2个侧链C(平均)的键、以及当r为非零时与间隔基“s”和/或配体Z的一个或多个键的多价部分。在特定的实施方案中，与B和s和/或Z的键是经由多个能够作为连接点的反应性官能团建立的。在特定的优选的实施方案中，将靶向部分与本发明的聚合物的支化点部分共价连接，并且将药物并入到聚集体的核中，以便形成靶向的药物络合物。在其他的实施方案中，如果靶向部 分是细胞表面受体的激动剂或拮抗剂，那么靶向的聚合物或聚合物聚集体可表现出类似药物的作用，甚至是在缺少所包封的抗癌药物的情况下。

[0025] 本发明进一步提供了用于制备本文所描述的梳型聚合物、聚集体、和靶向的聚合物聚集体和药物络合物的方法。本发明的聚合物自组装为聚合物聚集体，该聚合物聚集体足以体内增溶、分配和递送药物；是无毒性的、生物相容性的并且稳定的；以及能够在它们的外表面上负载多种细胞靶向部分。

[0026] 附图简述

[0027] 图1显示本发明的示例性组合物在A549肿瘤细胞的培养物中的细胞增殖测定中的活性。

[0028] 图2显示本发明的示例性组合物在H441肿瘤细胞的培养物中的细胞增殖测定中的活性。

[0029] 图3显示本发明的示例性组合物在Skbr3肿瘤细胞的培养物中的细胞增殖测定中的活性。

[0030] 图4显示本发明的示例性组合物在MDA-MB-231肿瘤细胞的培养物中的细胞增殖测定中的活性。

[0031] 图5显示本发明的示例性组合物在BT474肿瘤细胞的培养物中的细胞增殖测定中的活性。

[0032] 发明详述

[0033] p的值理想地是整数，2、3或4。实际上，侧链通常是经由不完全效率的化学反应引入的，导致对于作为整体的聚合物制剂来说p的平均值不是预期的整数。如下文所讨论的，非整数的平均值也可通过设计获得。因此本发明的聚合物中的p的平均值大于一并且可高达四(1＜p＜4)。在优选的实施方案中，p在从约2至4的范围内，并且最优选地1.5＜p≤2。应当理解的是当下文提及一个整数值时，该整数是理想化的，并不是指在所讨论的聚合物的实体实例中实际发现的平均值。

[0034] 主链聚合物嵌段A选自亲水的和/或水溶性的聚合物链，包括但不限于聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、多糖以及类似物。优选地，聚合物单元A是式-(CH2CH2O)m-的聚(乙二醇)链，其中m在1和10,000之间，优选地在3和3,000之间，更优选在4和700之间。

[0035] 不同等级的聚(乙二醇)的制造中，已知的是在工业上将二价连接体部分(例如双酚A二缩水甘油醚)偶联至两个聚(乙二醇)链，有效地将聚合物的分子量加倍同时保持相对小的分子量范围。所得的“聚(乙二醇)”分子因此在聚合物链的中点处由非二醇连接体部分打断(参见例如聚(乙二醇)-双酚A二缩水甘油醚加合物，CAS登记号第37225-26-6)。较高的低聚物，即具有由两个双酚A二缩水甘油醚部分分隔的三个PEG链的那些也是已知的，参见例如国际专利申请WO 00/24008。因此，如本文所用的，术语“聚(乙二醇)”和“聚(丙二醇)”包括并有非二醇连接体单元的聚(乙二醇)和聚(丙二醇)聚合物链，非二醇连接体单元包括但不限于双酚A二缩水甘油醚、双酚B二缩水甘油醚、双酚S二缩水甘油醚、对苯二酚二缩水甘油醚和类似物。为了这一说明目的，任何这种连接体部分不计为“单体单元”。

[0036] 聚合物嵌段A具有四和七百个单体单元之间的平均长度，最优选地具有二十和五十个单体单元之间的平均长度。聚乙二醇链可在一个或两个末端处由适于用作其他部分的连接物的官能团(包括但不限于氨基、巯基、丙烯酸酯、丙烯酰胺、马来酸酯、马来酰亚胺以及类似物)末端取代。n的值在从1至1000的范围内并且优选地在3和100之间。π-聚合物的总的分子量在从1000至100,000道尔顿或更多的范围内；优选地其在2,000道尔顿以上并且更优选地在7,000道尔顿以 上。

[0037] 疏水部分C可以是相同的或不同的，并且可从一种单体单元变化至下一种单体单元，并且可以是例如直链烃(由一个或多个亲水取代基任选地取代)，多环烃(由一个或多个亲水取代基任选地取代)，疏水的氨基酸、肽和聚合物。适合的亲水的取代基包括但不限于羟基、醚、氰基和酰胺官能团。特别预期的是含有ω-羟基、ω-氰基、ω-酰氨基或ω-烷氧基的取代基的C8至C20烷基基团。在这一背景中，术语“取代基”包括杂原子例如O、N或S对部分C的烃链或环体系中的碳原子的取代。因此，醚和酰胺键以及杂环可被并到部分C中。

[0038] 疏水部分C优选地为相对短(C8-C20)的脂肪族链，但也可以是短的低聚物。适合的低聚物包括寡羟基酸(例如聚(乙醇酸)、聚(DL-乳酸)、聚(L-乳酸)、以及聚(乙醇酸)与聚(乳酸)羟基酸的共聚物)、以及聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(原酸酯)、以及聚(磷酸酯)、聚内酯(例如聚(ε-己内酯)聚(δ-戊内酯)聚(γ-丁内酯)和聚(β-羟丁酸酯))。C部分还可选自疏水分子例如胆固醇、胆酸、脱氧胆酸、石胆酸和相关物质；类前列腺素物质；甾族的物质(例如地塞米松)；视黄酸、视黄醇以及相关的类视色素物质；疏水的肽；以及类似物。每个部分C的分子量大于40，优选地在50和1,000之间，并且最优选地在100和500之间。分子C-H的logP值(辛醇-水)大于约1.4，并且优选地大于约2.0，并且最优选地大于约2.5。通常如果分子C-H在水中是基本上不溶的，那么任何部分C都被认为在本发明中是适用的。“基本上不溶的”意指液态C-H在与水混合时将形成分离相。

[0039] 本发明的梳型聚合物的一个明显的特征是侧链C不是有规则地并且均匀地沿着聚合物链分布的，而是以簇[C]p存在。这些簇取决于聚合物单元A的单分散性的程度而或多或少有规则地沿着聚合物链被间隔。因此，连接在同一个支化部分B上的两个侧链C之间的距离与连接在由聚合物嵌段A分开的不同支化部分的两个侧链之间的距离是不同的。

[0040] 在本发明的一个尤其适用于靶向的递送系统的实施方案中，如式2中所示，支化点部分B进一步含有一个或多个反应性官能团X，其适用于连接靶向部分。

[0041]

[0042] 在式2中，单独的反应性基团X可以是彼此相同或不同的，并且在聚合物2的组装期间如果需要可以可选择地被封闭或保护。r的平均值在0(在没有X或Z基团的那些实施方案中)至约8的范围内。通常反应性基团可选自本领域已知的官能团以用于在分子物质之间形成共价键。在一些实施方案中，可以有单一的连接点X。在其他的实施方案中，可以有三个或四个不同种类的反应性基团。适合的反应性基团X包括但不限于-OH、-NH2、-SH、-CHO、-NHNH2、-COOH、-CONHNH2、卤代酰基、乙酰乙酰基、-CN、-OCN、-SCN、-NCO、-NCS以及类似物；反应性的双键例如乙烯基、丙烯酸基、烯丙基、马来酸基、苯丙烯基和类似的双键，以及具有反应性叁键的基团例如乙炔基羧基和乙炔基甲酰氨基(适于迈克尔(Michael)加成、狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应和自由基加成反应)。

[0043] 示例性的细胞靶向部分包括但不限于受体特异性配体、抗体、适体或与特异的细胞表面受体结合的肽，以及其他靶向部分，例如具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)氨基酸序列或酪氨酸-异亮氨酸-丝氨酸-精氨酸-甘氨酸(YISRG)基序的肽；包括表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子的生长因子；细胞受体配体例如叶酸、甲氨喋呤、蝶酸、雌二醇、雌三醇、睾酮(testosternone)以及其他激素；甘露糖-6-磷酸、糖、维生素、色氨酸以及类似物。受体激动剂和受体拮抗剂，无论竞争性的还是变构的，都可使用。

[0044] 可使用本领域内已知的方法挑选用于与受体结合的适体。可使用标准方法例如高通量微量滴定板筛选、噬菌体展示、引脚和平面(pin and planar)阵列以及类似方法挑选能够与受体结合的肽。抗体优选地为抗细胞特异的 表面抗原的单克隆抗体；适合的靶向部分不仅包括完整的抗体也包括含有活性抗原结合序列的抗体片段，例如Fab′2片段、Fab′片段或短链肽(例如互补决定区(CDR)肽)的抗体片段或这些抗体的活性抗原结合序列的类似物。适合的抗体包括但不限于抗肿瘤抗原诸如NCA90、NCA95、CEA、CD15、CD20、CD22、CD33、CD52、VGEF和EGFR的抗体。抗体优选为单克隆的，并且可以任选地为人源化的、嵌合的或完全人类的，并且它们可是PEG化的或其他方式改性的。但是，由于多克隆抗体的多重抗原结合能力，在一些情形下，可有利地使用多克隆抗体。

[0045] 特别适合的抗体包括但不限于托西莫单抗、伊莫单抗、阿伦单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、吉妥单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、依帕珠单抗、托西莫单抗、和曲妥珠单抗、及含有其结合结构域的抗体片段或肽。

[0046] 在替代实施方案中，生物素可经由官能团X被连接到π-聚合物并被用作用于抗生物素蛋白偶联和链霉抗生物素偶联的蛋白、肽、抗体、生长激素和其他靶向部分的非共价结合手段。

[0047] 在本发明的一些实施方案中，支化点部分B的某些部分与在聚合物链中的其他地方的其他的支化点部分连接，以便形成交联的水凝胶结构。这种交联可通过将聚合物与含有同官能或异官能基团的多官能部分(其中至少一个与位于第一个支化点部分上的X或C上的反应性基团反应，并且其中至少一个与位于同一个聚合物分子内的第二个支化点部分上的X或与C上的反应性官能团反应)反应而实现。还可经由与聚合物链A上的末端官能团的连接实现交联。正如本发明的直链梳型聚合物一样，这些交联的聚合物可以任选地带有靶向部分。

[0048] 支化点部分B通常来源于具有多个反应性基团的多官能分子，所述反应性基团中的两个是适用于与亲水聚合物单元A连接的，并且所述反应性基团中的至少两个是适用于与疏水部分C连接的。部分B可以任选地具有如上文所描述的一个或多个另外的反应性基团X。

[0049] 尤其优选的支化点部分是二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)或2，3-二氨基丁烷-1，4-二硫醇与两个马来酸分子的轭合物。这一支化点部分与作为部分A的聚乙二醇的结合产生式3和3a的聚合物主链。

[0050]

[0051] 其中Y和Y′可是相同的或不同的，并且优选地选自OH、NH2、ONH2、NHOH和NHNH2。在优选的实施方案中，二硫醇的羟基或氨基基团是反应性基团X，用作用于靶向或药物部分的连接点，而官能团Y和Y′用作用于C部分的连接点。可选择地，基团Y和Y′可用作用于靶向部分的连接点，而羟基或氨基基团被用于连接C部分。

[0052] 式3和3a意图表示每个硫原子可独立地与PEG酯的羰基基团α或β连接。本发明涵盖单一的异构体组合物以及于一个或两个C-S键处的区域异构体的混合物。此外，由于式1中的四个不对称碳，本发明涵盖所有手性的、内消旋的、和非对映的异构体及其混合物。

[0053] 乙炔二羧酸和呋喃的狄尔斯-阿尔德反应加合物也可用作适合的支化点部分。例如，来源于PEG和乙炔二羧酸的聚酯4已知为经历了与呋喃的狄尔斯-阿尔德反应(M.Delerba等人，Macromol.Rapid Commun.18(8)：723-728(1997))。

[0054]

[0055] 路线1

[0056] 因此它可经历与3，4-二取代的呋喃的狄尔斯-阿尔德反应以产生诸如5的物质(species)，并且可通过羟基化或环氧化来改性聚合物5以提供反应性基团(例如路线1中的X和X′)。

[0057] 相似地，PEG与乙二胺四乙酸二酐的反应将产生在随后的缩合反应后的式6的聚酯：

[0058]

[0059] 其他适合的支化点部分可来源于酒石酸、乙炔二羧酸、腈基三乙酸、3，4，3′，4′-二苯砜四羧酸二酐、3，4，3′，4′-二苯醚四羧酸二酐、均苯四酸二酐、链烷二硫醇例如1，2-乙二硫醇和1，4-丁二硫醇、双(2-巯乙基)醚、2-巯乙基硫化物、二巯基丙醇、二巯基嘌呤、二巯基噻二唑、二巯基琥珀酸、苯二甲硫醇、苯二硫醇、二卤代苯二甲硫醇、二卤代
4，4′-硫代双苯硫醇以及类似物。

[0060] 当Y和Y′是OH时，疏水基团C可通过羧酸基团的酰胺化或酯化被连接至聚合物。疏水基团C优选地相对小(C8-C20)并且主要为烃部分，并且可是直链或支链的或含有一个或多个环。实例包括但不限于来源于C-H分子(正辛醇、正癸醇、正十二烷胺、正十五烷胺、胆固醇、脱氧胆酸、胆酸、视黄醇、维生素A和各种顺式和反式的视黄酸异构体、各种生育酚和花生四烯酸)的共价结合的部分。尽管为了方便起见将本发明的聚合物表示为具有最多两种不同的疏水侧链，应当理解的是可通过使用两种或多种疏水化合物的混合物来改性或“调整”聚合物聚集体的内部溶剂特性，以便将不同疏水侧链引入到特定的聚合物中。除了溶剂影响之外，由于例如来自氢键和双极子-双极子相互作用，物理化学特性例如液晶相和相变温度可变化。这种作用是熟知的，例如来自膜双层的研究。

[0061] 作为一个特定的实例，通过将聚乙二醇与马来酸酐反应以形成聚酯7，之后与二硫苏糖醇反应以形成8来制备式2的聚合物，其中X＝OH并且r＝2。之后用正十八烷胺将酸7酰胺化以形成所需要的梳型聚合物9(路线2)。通过式9表示的DTT来源的酰胺梳型聚合物本文被称为“π-聚合物A”；路线2中具体的聚合物9被命名为“C18-π-聚合物A”。

[0062]

[0063] 路线2

[0064] 用2，3-双(叔丁氧基羰基氨基)丁烷-1，4-二硫醇(10a；DuPriest等人，美国专利第4,755,528号)代替二硫苏糖醇，在脱保护后产生相应的氨基官能化的π-聚合物9b(路线3)。

[0065]

[0066] 路线3

[0067] 同样地，使用丁烷二硫醇10c产生通用结构9c的聚合物，其在用于随后连接靶向部分的位置具有间隔基基团L(路线4)。间隔基基团L可是本领域已知的用于在将配体或标记连接至底物分子中使用的任何间隔基基团，包括但不限于C2至C20亚烃基和具有一至十个-CH2CH2O-单元的低聚(乙二醇)间隔基。

[0068]

[0069] 路线4

[0070] 在另一个实施方案中，具有末端氨基基团的PEG聚合物可被用于制备在A和B单元之间具有酰胺键的实例，如下文结构10-14中所示。这些聚酰胺中的每一种可经由PEG二胺H2N-(CH2CH2O)mCH2CH2-NH2与适当的环酐反应而衍生：

[0071]

[0072] 在温和的条件下，上述酰胺酸是预期的产物。加热后，酰亚胺的形成是预期的，产生具有较少反应性基团但仍然适用于连接疏水C部分的聚合物。可通过在较低的温度和/或在水性条件下进行反应来减少或避免不需要的酰亚胺的形成。可选择地，可将悬垂的侧链C加至聚合物A嵌段的末端，并且聚合时支化点部分可形成(路线5)。

[0073] 除了简单的二胺例如如路线5中所示的1，3-二氨基丙烷，还可使用具有(任选地掩蔽的)反应性官能团X的二胺，产生适用于连接靶向部分的聚合物15(路线6)。在下文式中，p可在0-4的范围内，并且每个X独立地为与可能存在的任何其他基团X相同或不同的。反应性基团X不必是悬 垂的，但是可以是例如在形成二胺的原子的链中(如在单体H2N-(CH2)3-NH-(CH2)3-NH2中)的NH基团。

[0074]

[0075] 路线6

[0076] 如上文制备的π-聚合物中的一些具有适用于进一步衍生的反应性基团X，以连接靶向部分或经由双官能或多官能交联剂以实现聚合物链的交联。在特定的实施方案中，进行聚合物链上的反应性基团的部分衍生以产生具有各种不同反应性基团的π-聚合物，这些反应性基团允许将各种靶向部分连接至单一的聚合物链。因此，亚化学计量的量的丙烯酰氯(或马来酸酐)与实施例1的π-聚合物的加成将产生均具有丙烯酰(或马来酰)基团和残留的羟基基团的聚合物。随后的亚化学计量的量的巯基-羧酸(例如HS-(CH2)3-COOH)的迈克尔加成将产生具有羟基、丙烯酰基和羧基基团的聚合物。半胱氨酸的加成除了被亚化学计量的量的试剂遗留的任何残留的反应性基团之外，还引入了氨基和羧基基团。

[0077] 另一个得到多官能的π-聚合物的方法涉及故意去除疏水链C的一部分。例如，通过在酰胺化步骤中限制悬垂形成的烷基胺的量的简单办法可制备具有未反应的羧酸基团的实施例1的π-聚合物。还有另一种方法是与胺混合物的酰胺化，所述胺中的一部分含有反应性基团X。同样，在适合的条件(步骤A中过量的马来酸酐和步骤B中过量的DTT)下，可产生具有所需要的数量的自由硫醇基基团的聚合物的制备。

[0078] 实施例1中的π-聚合物通过设计含有来源于DTT部分的羟基基团在主链中，其用作反应性基团X。这些基团与水介质中的丙烯酰氯或甲基丙烯酰氯在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液存在的条件下的酯化，产生-OH基团上的丙烯酰取代。可容易地使丙烯酸酯化(acrylated)的聚合物进行自由基聚合(具有或不具有附加的自由基单体例如丙烯酸化合物或交联剂例如双丙烯酸化合物)以获得适用于控制的药物递送(起到聚合物储存或储器的作用)和局部使用(例如皮肤贴片或软膏)的水凝胶。还可使丙烯酰基团进行迈克尔加成，尤其是与硫醇，例如蛋白、酶、肽、抗体、Fab′2片段或Fab′片段、或者其他靶向部分中的半胱氨酸残基中的硫醇(路线7)。

[0079]

[0080] 路线7

[0081] 可用马来酸酐将具有反应性羟基基团的π-聚合物在干燥后进行酯化以连接马来酸酯基团(一种迈克尔受体)，同时产生自由的羧基基团。在所得到的聚合物中，马来双键可用于迈克尔加成，尤其是与硫醇，例如蛋白、酶、肽、抗体、Fab′2片段或Fab′片段、或者其他靶向部分中的半胱氨酸残基中的硫醇(路线8)，并且羧基基团可用于与靶向部分中的氨基基团例如蛋白和肽中的赖氨酸残基偶联。

[0082] 可通过酰胺化进一步将不同的部分与新引入的(或之前可用的)羧基基团连接。因此，即使在饱和的反应条件(即待连接的部分以化学计量过量存在)下，至少两个不同的靶向部分可被连接。

[0083]

[0084] 路线8

[0085] 如路线9中所示，一种可选择的制备包括PEG二马来酸酯的酰胺化，以及之后与二硫醇反应。酰胺化可经由使用活性酯或许多已知的羧酸活化工艺中的任何一种来进行，羧酸活化工艺包括但不限于使用EDC、DIPC、DCC或类似物的方法，使用或不使用进一步的催化剂例如NHS、HOBT、DMAP、吡啶或TMED。之后将PEG二马来酸酰胺化物(dimaleamidate)与DTT或另一种二硫醇反应以产生对双键的类似迈克尔加成的加成，由此生成所需要的聚合物。这一工艺的优点是人们可以从预制的PEG二马来酰胺化物的潜在地非常广泛的选择中选择人们希望结合到聚合物中的恰当的单体(及其比率)。

[0086]

[0087] 路线9

[0088] 可用胺在通常的偶联条件下将含有悬垂的羧酸酯基团的聚合物酰胺化，并且还可将它们经由Curtius重排转化为异氰酸酯基团，并且之后与胺或醇偶联以分别形成脲和氨基甲酸酯。这种反应可被用于引入疏水基团C或连接靶向部分。

[0089] 可通过将反应性基团中的一个与二胺至少部分地反应而向聚合物引入自由胺。必须选择二胺以便胺基团之一在反应的条件下是受保护的或不反应的。后者常常可通过在pH约7.5时使用乙二胺来实现，因为两个氨基基团的pKa很不同。优选地，这一酰胺化作为引入疏水的悬垂基团之后的单独步骤来进行。之后通过在这一自由胺上的酰胺化连接具有羧酸基团的肽或另一分子。

[0090] 因此，即使在饱和条件下，可将多达三种的不同的靶向部分连接至π-聚合物：一种经由硫醇，一种经由胺或羟基，以及一种经由羧酸基团。除了靶向部分，成像剂也可被并198 32 125
入到本发明的聚合物中，使得聚合物在体内的分布可见。放射治疗剂例如 Au、P、 I、
131 90 186 188 67 211 213 224
I、Y、 Re、Re、 Cu、 At、Bi、 Ac以及类似物也可被连接至聚合物，并且细胞毒素 例如卡奇霉素、细菌内毒素、白树毒素、相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白或类似物也可被连接至聚合物。

[0091] 羟基和硫醇基团也可通过已知的方法(例如光延反应)被转化为胺，或通过与氮丙啶或卤代烷基胺(例如溴代乙胺或氯代乙胺)反应被改性为伯胺。与半胱胺的酰胺化将引入二硫化物，其可通过与肽或抗体的半胱氨酸直接反应以连接肽或抗体；或可为了与肽或抗体的进一步反应而首先被还原(例如用氨基乙硫醇或DTT)。

[0092] 通过进行部分反应，人们可将另外的反应性官能团引入本发明的聚合物，包括但不限于(1)硫醇-反应性基团例如丙烯酸或马来酸衍生物，(2)羧酸-反应性基团例如氨基或羟基，(3)胺-反应性基团例如羧基，以及(4)二硫化物-反应性基团例如巯基。取决于所用的试剂和所用的数量，每个聚合物分子的这种附加的官能团的数量可在1/r直到r的几倍的范围内。

[0093] 可选择地，可连接两种或更多特异的靶向部分以增强对癌细胞表面的结合的特异性。还可使用两种或更多特异的部分以便产生在不同目标之间的相互作用，例如一个部分可将聚合物靶向癌细胞，而另一个部分可促进补体因子的结合和补体通路的活化。

[0094] 靶向部分与本发明的聚合物的重复单元的连接导致部分在聚合物链上的和纳米微粒表面上多价展示。多价展示常常导致对靶的亲和性的大大增加。例如多价抗体在它们的靶的清除上要比正常的二价抗体有效得多。自然界中结合碳水化物的蛋白和碳水化物已知为多价的，并且如果单价时是无效的。同样的多价的肽和碳水化物靶向部分也比单独的单体有效得多。

[0095] 将靶向部分与本发明的聚合物链连接的另一个好处是分子量上的显著增加，其导致肽和其他配体的肾脏清除率的减少。此外PEG主链提供的好处类似于蛋白PEG化，例如避开免疫监视。

[0096] 本发明的梳型聚合物可用于在水性溶剂系统中包封水溶性的和微溶的抗癌药物。在水性溶剂中包封物质的方法包括将药物与本发明的梳型聚合物在水存在的条件下接触以便形成物质和聚合物的水溶性的络合物。可 选择地，可将聚合物和待包封的物质在两相的水性-有机乳液中混合并且通过蒸发除去有机溶剂。示例性的方法描述于美国专利第
6,838,089号中，该美国专利通过引用并入本文。据信在大多数实例中，聚合物自组装为类胶束的纳米微粒，其具有溶解在聚结于颗粒的核处的疏水C链中的药物，而A嵌段形成亲水的晕，其充分降低了界面自由能以使得颗粒的水性悬浮液保持稳定。

[0097] 在一些实例中，微溶的药物可以不完全溶解在核中，但是可作为在颗粒的核处由C链包围并悬浮在C链中的固态纳米颗粒或纳米晶体而存在。本发明的实施并不依赖于C链与微溶的物质混合的任何特定程度。药物在某些实例中可以分子水平溶解在C链中，而在其他的实例中，它可表现出与C链环境的任何程度的相分离。在某些实例中，由于外部条件例如pH、温度或剪切速率的作用，预期体系将从一种状态变为其他状态。例如，血流中的剪切速率可以是相当高的，而在淋巴系统中，其通常是低的。这种环境诱导的状态的改变可被利用以控制药物从颗粒核的释放。

[0098] 聚合物颗粒的疏水核的溶剂化能力可通过改性疏水C部分而改进。适合的改性包括但不限于引入一个或多个双极性的和/或亲水的取代基例如羟表、醚、酰胺、亚砜和氰基官能团，以便增加疏水核的极性和/或可极化性。

[0099] 能够被这些聚合物包封并递送的抗癌药物包括但不限于多柔比星、喜树碱、多西紫杉醇、紫杉醇、托泊替康、伊立替康、伊马替尼、舒尼替尼、索拉非尼、axitinib、帕唑帕尼、依托泊苷、甲氨蝶呤、甲基叶酸、二氯甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、克拉屈滨、克拉屈滨、星形孢菌素、阿糖胞苷、美法仑、长春罗新、放线菌素、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素D、丝裂霉素A、洋红霉素(carninomycin)、氨喋呤、他利霉素、鬼臼毒素、顺铂、碳铂、长春碱、长春新碱、长春地辛(vindesin)、视黄酸、秋水仙素、地塞米松、和他莫昔芬、以及这些药物的衍生物和类似物，以及光动力剂、核酸、核酸类似物和核酸络合物。核酸类似物包括物质例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和肽核酸。核酸络合物是低聚核酸或其类似物与基本上电中性量的阳离子或聚阳离子物质的离子络合物。

[0100] 由于本发明的聚合物的包封抗癌药物的能力，本发明还提供了药物组合物，其含有与治疗上有效量的一种或多种药理上有效的抗癌剂组合的一种或多种本发明的π-聚合物，以及药学上可接受的载体或赋形剂。适合的载体和赋形剂包括水和盐水，以及固体添加剂例如缓冲剂、盐、糖、多糖例如纤维素及其衍生物，以及本领域内已知的各种润湿剂、助流剂、防腐剂、结合剂和分散剂。本发明的聚合物可使得在现有技术中以其他方式为无效量的抗癌剂有效。因此，为了本公开内容，“治疗上有效量”是使得组合物整体有效的剂的量。

[0101] 本文所提及的所有的专利、专利申请和出版物都通过引用全文并入本文。实施例

[0102] 1.一般步骤

[0103] 本发明还提供了用于本发明的梳型聚合物的制备方法。这些聚合物的合成可由有机合成领域的技术人员通过依照下文描述的步骤容易地实现。主要的起始材料是聚乙二醇，其优选地为使用前干燥并且脱气的。这通过在真空下于高温搅拌熔化的PEG直到不再形成气泡来适宜地完成。这取决于PEG的质量，可能需要8-12小时。一旦干燥，就可将PEG在氩气下无限期保存。商业上可获得的工业和研究级别的PEG可被用于制造本发明的聚合物，例如具有1430-1570分子量分布的商品多分散“PEG 1500”。这种材料可掺入双酚A二缩水甘油醚，其在PEG链的中心处引入了仲羟基基团。为了确保本发明的聚合物具有最可重复性和一致性，PEG优选地为无双酚A并且具有低分散度。最优选的是＞95％单分散性的PEG聚合物，例如为可从Nektar Therapeutics(以前的Shearwater Polymers)、Huntsville AL以及Polypure AS，Oslo，Norway商业获得的。特别优选的PEG的一个实例是来自Polypure的“PEG-28”，其为＞95％ HO(CH2CH2O)28H，分子量1252。

[0104] 所有的反应在惰性气氛例如氮气或氩气下进行，伴随磁力的或优选地机械的搅拌。

[0105] 在步骤A中，将无水的PEG熔化，并且搅拌下加入马来酸酐(每摩尔PEG 2摩尔)。马来酸酐的量应当尽可能地与PEG末端羟基基团的数目匹配。马来酸酐不足将产生羟基-封端的聚合物链，而过量的马来酸酐将消耗下一步骤中的硫醇基团，导致过早的链终止和末端羧基基团。反应温度不是关键，该方法可在45℃和100℃之间的温度适宜地进行。反应的优选温度是在65℃和90℃之间。如果使用升高的温度，马来酸酐容易升华，而应当采取步骤以使马来酸酐保留在溶液中。将顶端空间最小化并使反应容器浸没在油浴中是有效的方法。

[0106] 取决于所选择的温度，反应可在2小时或更短的时间内完成或者可进行整夜。反应可通过硅胶板上的TLC来监测，并持续直到马来酸酐消失之后。视觉对比、UV和碘染色都可用于检查TLC板。

[0107] 在步骤B中，将步骤A中产生的粗制的PEG双马来酸酯与二硫苏糖醇(DTT)和N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)(以及添加的水，如果是流动性所必需的)混合，并且于70℃搅拌混合物。如粘度的迅速增加所指示的，反应在30分钟内完成。如果使用了比最佳量更多或更少的DTT，产物的分子量将减少。如果需要，通过用效力较差的叔胺碱例如TEA代替TEMED，也可减少产物的分子量。

[0108] 在步骤C中，向反应混合物中加入足够的水以降低粘度，并且相对于聚合物中每mol的羧酸基团加入0.1mol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1.05mol的十六烷胺。(这一量的NHS表现最佳地将副反应的程度最小化)。之后分批加入过量的N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(EDC)(每mol羧酸基团1.4mol EDC)，根据需要加入另外的水以维持搅拌。反应混合物的pH保持在7以上，并且优选地在9和11之间，以将烷基胺的反应性最优化。使用十二烷胺，这一反应可在约40～45℃进行，而用十八烷胺，温度是大约55℃-57℃。通过TLC观察反应直到观察到水平不变的剩余的烷基胺，通常在运行过夜之后。

[0109] 将反应混合物酸化至从约3.0至约4.5的pH，并且于室温搅拌长达24小时以破坏未反应的EDC，之后用1N NaOH和/或TEMED滴定至7.0的pH。以约800xg将最终的反应混合物离心1至3小时以除去固体污染物和 副产物。

[0110] 离心后，可将上清液在GPC柱(ToyopearlTM、SephadexTM、SephacrylTM、BiogelTM以及类似产品)上层析。然而π聚合物是两亲性物质，并且表现出对某些GPC柱填料的亲和力，其使污染物的去除变得复杂。可选择地，可将聚合物在大孔的疏水相互作用柱(如，TMTOYOPEARL Phenyl 650C，Toshoh Biosciences，Montgomeryville，PA，U.S.A.)上层析，用溶于水的梯度的甲醇洗脱。优选地，将反应混合物对酸性和中性水的数种变化透析以除去低分子量的起始材料和反应副产物。

[0111] 还可用丁酮、异丙醇、丁醇或其他极性有机溶剂萃取反应混合物以除去有机杂质，但显著量的两亲性聚合物损失至萃取溶剂。优选地，使用适当的膜将反应混合物进行超滤以将产物分成不同的分子量级别，例如5kDa至10kDa、10kDa至30kDa、30kDa至50kDa等，取决于所使用的滤膜的截留值。可将聚合物的水溶液进行死端式过滤以便产生无菌的或无病毒的溶液(取决于滤膜或过滤介质的选择)。

[0112] 2.π-聚合物的合成

[0113] 实施例1：PEG-二(烷基酰胺基琥珀酰)二硫醚的中等分子量聚合物(C16-π-聚合物A)

[0114] 将聚乙二醇(PEG-1500，Sigma Chemical Co.)在真空下于80℃干燥直到气泡停止形成(8-12小时，取决于PEG的质量)。干燥的PEG可在氩气下无限期的干燥保存。

[0115] 将干燥的PEG在氩气下于油浴上熔化，并搅拌下逐渐加入马来酸酐(每摩尔PEG 2摩尔，针对纯度校正)。将混合物在氩气下于90℃搅拌。由于马来酸酐容易升华，将顶端空间最小化并且将整个反应容器保持在反应温度。任何冷凝在容器壁上的马来酸酐将被刮回反应混合物。用UV可视化和碘染色，通过硅胶板上的TLC监测反应的过程，分别使用乙醇和己烷作为溶剂。在马来酸酐消失后将反应持续一小时。

[0116] 将粗制的PEG二马来酸酯用两体积的水稀释。之后搅拌下向反应混合物加入溶于水(每体积TEMED的2体积水)的二硫苏糖醇(DTT，每当 量PEG 1.01当量)和N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED，1.02当量)的溶液。在氩气下于70℃搅拌反应2.5小时，置于室温过夜，并且之后再次于70℃搅拌2小时。通过TLC监测反应并通过DTT的完全消失判定反应完成。

[0117] 向上文的反应混合物加入水以降低粘度直到混合物可被搅拌(以大约25％固体)，在氩气下于65℃搅拌混合物，并加入N-羟基琥珀酰亚胺(每mol PEG-二马来酸酯-DTT聚合物中的羧酸基团0.1mol)，之后是十六烷胺(每mol聚合物中的羧酸基团1.05mol)和N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺(EDC，每mol聚合物中的羧酸基团
0.56mol)。将混合物在氩气下搅拌1小时并加入第二份EDC(每mol聚合物中的羧酸基团
0.56mol)。另一小时后，进一步加入第三份EDC(每mol聚合物中的羧酸基团0.28mol，总共每mol羧酸基团1.4mol EDC)以补充EDC水解的损失。当所加入的固体使悬浮液难以搅拌时，如保持流动性所必需的加入另外的水，并如所需要的话，通过加入1N NaOH或1N HCl将pH保持在3.5和7.5之间(优选地在4.5和6.5之间)。在氩气下于65℃将混合物搅拌过夜，并用TLC(硅胶，以乙醇显层)监测直到烷基胺显示出已经达到稳定的浓度，并且之后是另外4小时的搅拌。(用十二烷胺，反应在约40-45℃进行，而用十八烷胺，温度优选是
55℃-57℃)。之后用1N HCl将反应混合物酸化至约4.0-4.5的pH，搅拌24h以破坏未反应的EDC，并且通过滴加1N NaOH调整至pH 7.0。

[0118] 将混合物转移至离心瓶并且在台式离心机中于约800xg离心2小时以分离残留固体。离心后，将反应混合物用异丙醇萃取以除去有机杂质。作为异丙醇萃取的替代方法，超滤是优选的。

[0119] 通过这一方法，下列氨基化合物被轭合至聚合物：

[0120] 实施例1a：十一烷胺

[0121] 实施例1b：十八烷胺

[0122] 实施例1c：4-壬基苄胺

[0123] 实施例1d：3-[(4-苯氧基)苯基]丙胺

[0124] 实施例1e：PEG-二(烷基酰胺基琥珀酰)二硫醚(C16-π-聚合物A，经由路线9替代路线)。

[0125] 在熔化的条件下，如实施例1所描述的将PEG(1.5kD，如上文所描述的脱气和干燥的)与过量的马来酸酐(每摩尔PEG多于2.2摩尔当量)反应，并且将反应产物溶于水并用1kD截留膜对水透析。将渗余物蒸发至接近干燥以产生适用于酰胺化的PEG二马来酸酯。

[0126] 在反应瓶中，将溶于最小体积的水的PEG二马来酸酯(每两份PEG二马来酸酯约1份水)在氩气下加热至70-80℃。用TEMED将pH调整至5.0-5.5。于70-80℃，向这一溶液加入每摩尔PEG二马来酸酯重复单元的2摩尔当量十六烷胺。之后缓慢流动加入溶于最小体积的水中的N-羟基琥珀酰亚胺(每摩尔PEG二马来酸酯2摩尔当量)的溶液，之后是EDC·HCl的水溶液(每摩尔PEG二马来酸酯3摩尔当量)。将混合物于70-80℃搅拌直到TLC(硅胶，用EtOH显层)显示反应的完成(十六烷胺的点不变化或不存在)。将反应混合物冷却并且通过加入乙酸破坏过量的碳二亚胺直到pH在2.5和3之间保持稳定。将产物通过透析纯化，第一次对EtOH水溶液之后对水，或者可选择地通过用异丙醇沉淀。

[0127] 将这样形成的PEG二酰胺溶解于水，用TEMED将反应混合物的pH调节至6.5和9之间，并且将温度升至60-70℃。加入DTT溶液(每摩尔PEG二酰胺1.2摩尔当量)，并且将反应混合物搅拌过夜。用化学计量当量的氯乙酰胺和TEMED消耗过量的硫醇，以产生阴性的Ellman′s测试。之后将产物通过对水的透析纯化，并且通过蒸发浓缩渗余物。

[0128] 实施例2：PEG-二(烷基酰胺基琥珀酰)二硫醚高分子量聚合物

[0129] 除了使用每mol马来酸酐0.55mol DTT和0.55mol TEMED之外，遵循实施例1中列出的步骤。由于粘度快速上升，有力的搅拌是必须的。表明大多数反应在5-10分钟内完成，之后是当温度升高至55℃至80℃时经过4小时缓慢完成。

[0130] 实施例3：PEG-二(烷基酞胺基琥珀酰)二硫醚聚合物

[0131] 除了每mol聚合物中的羧酸基团使用1.5mol十二烷胺之外，遵循实 施例1中列出的步骤。加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，每mol羧酸基团1.0mol)和1，1′-羰基二咪唑(CDI，每mol羧酸基团3.0mol)，并且将反应于80℃搅拌4小时并如上文进行后处理。

[0132] 通过这一方法，将下列氨基化合物与聚合物轭合：

[0133] 实施例3a：十一烷胺

[0134] 实施例3b：十四烷胺

[0135] 实施例3c：十八烷胺

[0136] 实施例3d：脱氢枞胺

[0137] 实施例3e：胆固醇2-氨基乙醚

[0138] 实施例3f：10-苯氧基癸烷胺

[0139] 实施例3g：癸二酸酰肼

[0140] 实施例3h：油酸酰肼

[0141] 实施例3i：脱氢枞酸酰肼

[0142] 实施例3j：胆酸酰肼

[0143] 实施例3k：棕榈酸酰肼

[0144] 实施例4：PEG-共聚-(烷基酰胺基琥珀酸酯)聚合物

[0145] 将溶于无水乙醚中的PEG(6.66mmol)和三乙胺(2.32ml，16.65mmol)的溶液在氩气下于0℃冷却并用甲磺酰氯(1.03ml，13.32mmol)滴加处理。于0℃持续搅拌1h并且之后于室温持续搅拌2h。将醚蒸发并向残留物中加入无水丙酮(15ml)以便沉淀盐酸三乙胺，将其从溶液中过滤。将滤出液用溴化锂(2.31g，26.64mmol)处理并加热至回流20h。之后TM用己烷稀释混合物并通过由Celite (0.5cm)封口的短的二氧化硅柱(3cm)过滤，并用己烷洗脱。将滤出液干燥、过滤并蒸发以剩余油状的α，ω-二溴-PEG。

[0146] 通过Godjoian等人，Tetrahedron Letters，37：433-6(1996)的方法将α，ω-二溴-PEG与一当量的2，2-二丁基-4，5-双(甲氧基羰基)-1，3，2-二氧杂锡杂环 戊烷(dioxastannolane)反应。将所得的酒石酸二甲酯-PEG聚醚用溶于甲醇的KOH皂化，并且之后用如上文实施例1和3中的十二烷胺或十六烷胺对其酰胺化，或用实施例3a-3k中的胺对其酰胺化。

[0147] 实施例5：PEG与EDTA双酐共聚

[0148] 通过实施例1中描述的方法将无水PEG与乙二胺四乙酸二酐反应，并且之后用如实施例1中的十二烷胺或用如实施例3中的十六烷胺或用实施例3a-3k中的胺对其酰胺化。

[0149] 以同样的方法，将下列双酐与PEG共聚并随后对其酰胺化：

[0150] 实施例5a：萘四羧酸双酐

[0151] 实施例5b：苝四羧酸双酐

[0152] 实施例5c：二苯甲酮四羧酸双酐

[0153] 实施例5d：4，4′-(六氟异亚丙基)二酞酸酐

[0154] 实施例5e：丁烷四甲酸双酐

[0155] 实施例5f：双环(2，2，2)辛-7-烯-2，3，5，6-四羧酸双酐

[0156] 实施例5g：二亚乙基四胺五乙酸双酐

[0157] 实施例5h：3，4，3′，4′-二苯基砜四羧酸双酐

[0158] 实施例5i：3，4，3′，4′-二苯基醚四羧酸双酐

[0159] 实施例5j：苯均四酸二酐

[0160] 实施例6A：具有悬垂的硫醚的PEG-二胺共聚物

[0161] 用与实施例1中用于DTT的同样的步骤将如实施例1中制备的PEG二马来酸酯与十二烷硫醇(每当量PEG二马来酸酯二当量)反应。没有聚合发生时，则不必稀释，并且在熔化的PEG-二马来酸酯中进行反应。加入TEMED催化剂并且之后加入硫醇。使用TLC通过起始材料的消失来观察反应。可使用直到由于蒸发损失的烷基硫醇变得显著的点的温度(直到约100℃)。使用稍微过量的烷基硫醇以充分饱和马来酸基团。在反应最后，将过量的烷基硫醇通过用氮气或氩气喷射和/或在真空中加热来去除，直到 通过气味或通过TLC检测不到烷基硫醇。

[0162] 以此方法，将下列硫醇与PEG二马来酸酯轭合：

[0163] 实施例6Aa：巯基琥珀酸二叔丁酯

[0164] 实施例6Ab：十四烷硫醇

[0165] 实施例6Ac：十六烷硫醇

[0166] 实施例6Ad：2-巯基乙磺酸

[0167] 实施例6Ae：3-巯基丙磺酸

[0168] 实施例6Af：6-巯基己酸叔丁酯

[0169] 实施例6Ag：4-巯基苯甲酸叔丁酯

[0170] 实施例6Ah：巯基乙酸叔丁酯

[0171] 实施例6Ai：4-(叔丁氧基羰基氨基)丁烷硫醇

[0172] 实施例6Aj：3-(叔丁氧基羰基氨基)苄硫醇

[0173] 实施例6Ak：4-癸基苄硫醇

[0174] 具有反应性官能团的硫醇是适用于连接C链的，和/或反应性官能团可用作靶向部分的连接点(X)。

[0175] 实施例6B：具有悬垂的硫醚的PEG-二胺共聚物

[0176]

[0177] 使用与实施例1中用于十二烷胺的同样的步骤将在实施例6A中得到的硫醇加合物用1，4-二氨基丁烷(每两COOH基团一当量的二胺)酰胺化，同时当对于维持反应混合物的流动性来说必需时用水稀释。当对于确保完成聚合来说必需时加入另外等份的EDC。通过这一方法，实施例6A和6Aa到6Ak的硫醇加合物被转化为PEG-二氨基丁烷聚酰胺。

[0178] 通过此方法，可将下列二胺转化为PEG聚酰胺(BOC＝叔丁氧基羰基)：

[0179] 实施例6Ba：2-(O-BOC)-1，3-二氨基-2-丙醇

[0180] 实施例6Bb：N′，N″-二(BOC)六亚乙基四胺

[0181] 实施例6Bc：N′，N″-二(BOC)精胺

[0182] 实施例6Bd：N′-BOC亚精胺

[0183] 实施例6Be：N′，N″，N″′-三(BOC)五亚乙基六胺

[0184] 实施例6Bf：胍基丁胺

[0185] 实施例6Bg：赖氨酸叔丁酯

[0186] 实施例6Bh：1，6-二氨基己烷

[0187] 实施例6Bi：1，4-苯二胺

[0188] 实施例6Bj：1，3-苯二胺

[0189] 实施例6Bk：1，4-二氨基丁烷-2，3-二醇丙酮化合物

[0190] 实施例7：PEG-二(烷基琥珀酸酯)二硫醚

[0191]

[0192] 通过S.Sasaki等人，Chem.Pharm.Bull.33(10)：4247-4266(1985)的步骤的变体制备DTT的2，3-双-O-十六烷基醚(内消旋-2，3-双(十六烷氧基)丁烷-1，4-二硫醇)。通过实施例1的方法将其加至PEG-二马来酸酯。

[0193] 通过这一方法，将下列醚二硫醇偶联至PEG聚合物：

[0194] 实施例7a：内消旋-2，3-双(正丁氧基)丁烷-1，4-二硫醇

[0195] 实施例7b：内消旋-2，3-双(4-壬基苯基甲氧基)丁烷-1，4-二硫醇

[0196] 实施例7c：内消旋-2，3-双(二苯基-4-甲氧基)丁烷-1，4-二硫醇

[0197] 实施例7d：4，6-双(癸氧基)苯-1，3-二甲硫醇

[0198] 实施例7e：4，5-双(癸氧基)苯-1，2-二甲硫醇

[0199] 实施例7f：3，4-双(癸氧基)噻吩-2，5-二甲硫醇

[0200] 实施例8A：取代的PEG琥珀酸酯

[0201] 除了使用2-十二碳烯-1-基琥珀酸酐替代马来酸酐外，遵照实施例1的方法。十二碳烯基取代基提供了最终的聚合物中的悬垂的C链。

[0202] 通过这一方法，将下列取代的琥珀酸酐用PEG酯化：

[0203] 实施例8Aa：异丁烯基琥珀酸酐

[0204] 实施例8Ab：2-辛烯-1-基琥珀酸酐

[0205] 实施例8Ac：十八烯基琥珀酸酐

[0206] 实施例8Ad：3-氧杂二环-己烷-2，4-二酮

[0207] 实施例8Ae：环己烷二羧酸酐

[0208] 实施例8Af：邻苯二甲酸酐

[0209] 实施例8Ag：4-癸基邻苯二甲酸酐

[0210] 实施例8Ah：六氢甲基邻苯二甲酸酐

[0211] 实施例8Ai：四氢邻苯二甲酸酐

[0212] 实施例8Aj：降冰片烯二羧酸酐

[0213] 实施例8Ak：斑蝥素

[0214] 实施例8Al：二环辛烯二羧酸酐

[0215] 实施例8Am：外-3，6-环氧-1，2，3，6-四氢邻苯二甲酸酐

[0216] 实施例8An：S-乙酰基巯基琥珀酸酐

[0217] 实施例8B：具有悬垂的烷基基团的PEG-二(烷基酰胺基琥珀酰)二硫醚

[0218] 通过实施例1的方法，将如实施例8A和8Aa至8An中的描述所得到的取代的PEG琥珀酸酯与DTT反应。

[0219] 通过这一方法，将下列二硫醇与如实施例8A和8Aa至8An中的描述所得到的取代的PEG琥珀酸酯的任何一种反应：

[0220] 实施例8Ba：乙烷-1，2-二硫醇

[0221] 实施例8Bb：丙烷-1，3-二硫醇

[0222] 实施例8Bc：丁烷-1，4-二硫醇

[0223] 实施例8Bd：戊烷-1，5-二硫醇

[0224] 实施例8Be：己烷-1，6-二硫醇

[0225] 实施例8Bf：1，4-苯二硫醇

[0226] 实施例8Bg：1，3-苯二硫醇

[0227] 实施例8Bh：1，4-苯二甲硫醇

[0228] 实施例8Bi：1，3-苯二甲硫醇

[0229] 实施例8Bj：1，2-苯二甲硫醇

[0230] 实施例8C：具有悬垂的烷基基团的PEG-二胺共聚物

[0231] 通过实施例6B的方法，将如实施例8A中的描述所得到的取代的PEG琥珀酸酯与1，4-二氨基丁烷共聚。

[0232] 通过这一方法，将下列二胺与实施例8A和8Aa至8An中的取代的PEG琥珀酸酯的任何一种共聚：

[0233] 实施例8Ca：2 O-BOC-1，3-二氨基-2-丙醇

[0234] 实施例8Cb：N′，N″-二(BOC)六亚乙基四胺

[0235] 实施例8Cc：N′，N″-二(BOC)精胺

[0236] 实施例8Cd：N′-BOC亚精胺

[0237] 实施例8Ce：N′，N″，N″′-三(BOC)六亚乙基六胺

[0238] 实施例8Cf：胍基丁胺

[0239] 实施例8Cg：赖氨酸叔丁酯

[0240] 实施例8Ch：1，6-二氨基己烷

[0241] 实施例8Ci：1，4-苯二胺

[0242] 实施例8Cj：1，3-苯二胺

[0243] 实施例8Ck：1，4-二氨基丁烷-2，3-二醇丙酮化合物

[0244] 实施例9：使用取代的酸的PEG酯交换反应

[0245] PEG二甲苯磺酸酯：在氩气下搅拌的同时向1mol的PEG(溶解于DMF或为熔化的)中加入2.1mol的甲苯磺酰氯(5％的摩尔过量)。向反应混合物中加入2.2mol的四甲基乙二胺(TEMED)。之后将反应于45℃孵育2h。用乙酸乙酯、甲苯或乙醇作为TLC溶剂通过TLC分离产物。可用甲苯从反应混合物中萃取PEG二甲苯磺酸酯。代替甲苯磺酰氯，也可使用其他的磺酰化剂例如甲磺酰氯(参见实施例4)、三氟甲磺酸酐或三氟代乙烷磺酰氯(参见美国专利申请10/397332，公开第20040006051号)。

[0246] PEG二甲苯磺酸酯的聚酯化：伴随着氩气下的搅拌，向1mol的熔化的PEG二甲苯磺酸酯中加入1mol的S，S′-二癸基-内消旋-2，3-二巯基琥珀酸和2mol的TEMED。如维持流动性所必需的加入DMF。将反应混合物加热至80℃并搅拌24h或直到通过TLC监测完成。

[0247] 实施例10：PEG-二(琥珀酰基)-二-(O-酰化)硫醚中等分子量聚合物(C16-π-聚合物B)

[0248]

[0249] 将如实施例1中所制备的PEG-二马来酸酯(10.24g，6.1mmol)置于干燥的125ml烧瓶中，并在氩气下加热至70℃以熔化PEG-二马来酸酯。在搅拌下，向熔化的材料中加入水(10mL)和溶于水(3mL)的DTT(0.961g，6.168mmol)和TEMED(0.723g，6.166mmol)的溶液。将溶液于70℃搅拌约4h。在真空中除去水以约90％的产率获得固体聚合物。

[0250] 将干燥的聚合物(5g，2.7mmol)在氩气下加热至70-90℃以使其熔化，并且加入TEMED(0.635g，5.5mmol)。伴随搅拌加入棕榈酰氯(1.689g，5.5mmol)并将混合物在氩气下搅拌过夜。(可改变聚合物与酰基氯的比例以获得从0-100％的化学计量的取代度。)向反应混合物加入水以分离“C16-π-聚合物B”。

[0251] 通过这一方法将下列酸用二(琥珀酰基)PEG-DTT共聚物的羟基基团酯化：

[0252] 实施例10a：油酸

[0253] 实施例10b：胆固醇琥珀酸酯

[0254] 实施例10c：二苯基-4-羧酸

[0255] 实施例10d：4-辛基苯乙酸

[0256] 实施例10e：十六碳-6-炔酸

[0257] 作为使用酰基卤的替代，π-聚合物的DTT来源的羟基基团也可被1，3-双(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基甲基)碳二亚胺(BDDC)活化并直接与羧酸偶联；参见Handbook of Reagents for Organic Synthesis，Reagents forGlycoside，Nucleotide，and Peptide synthesis(用于有机合成的试剂、用于糖苷、核苷酸和肽的合成的试剂的手册)，David Crich编辑，Wiley，2005第107-108页及其参考文献)。

[0258] 实施例11：C16-π-聚合物A的羧基取代的酯

[0259] 使用标准的肽键形成方法(例如通过碳二亚胺试剂)，将羧酸取代的聚合物用于连接具有反应性氨基基团的配体以将氨基基团连接至聚合物的羧酸官能度。通过以环酐酯化π-聚合物羟基基团能容易地获得这些材料。例如通过将马来酸酐与C16-π-聚合物A羟基基团如下反应来制备C16-π-聚合物A二马来酸酯：

[0260] 将C16-π-聚合物A(2g)和马来酸酐(0.85g)在干燥研钵中研磨并转移到50mL圆底烧瓶。将烧瓶于90℃在氩气下搅拌加热2-3h。之后将固体反应混合物研磨并用水调成浆，并将混合物转移至透析袋(3.5kDa截留)。将混合物对水透析以除去过量的马来酸和低分子量的副产物，并将渗余物从透析袋中取出，于60℃干燥至恒重，以获得C16-π-聚合物A二马来酸酯(1.79g)。可改变聚合物A与马来酸酐的比例以获得从0-100％的全化学计量酯化变化的取代。

[0261] 实施例11a：C16-π-聚合物A二甘醇酸酯

[0262] 将C16-π-聚合物A(2g)和二甘醇酸酐(1.0g)通过上文实施例11的方法反应以得到C16-π-聚合物A二甘醇酸酯。如同马来酸酐一样，可改变聚合物A与酸酐的比例以获得从0-100％的全化学计量酯化变化的取代。

[0263] 实施例11b：C16-π-聚合物A双(乌头酸酯)

[0264] 将C16-π-聚合物A(2g)和乌头酸酐(1.35g)通过上文实施例11的方法反应以得到C16-π-聚合物A双(乌头酸酯)。

[0265] 以相似的方式，下列酸酐与C16-π-聚合物A偶联。当使用低溶解度的酸酐时，作为对纯化的辅助，可在透析之前将pH调至4.5和6.5之间。如果需要，对0.1N HCl第二次透析提供了聚合物的酸性形式。

[0266] 实施例11c：琥珀酸酐

[0267] 实施例11d：戊二酸酐

[0268] 实施例11e：邻苯二甲酸酐

[0269] 通过与马来酸酐或顺式乌头酸酐的酯化引入的反应性双键也可被用于将含硫醇的配体加至聚合物，如下文实施例12中所描述的。

[0270] 实施例12：C16-π-聚合物A二马来酸酯的半胱氨酸加合物：

[0271] 将粉末的C16-π-聚合物A二马来酸酯(实施例11)(253mg)加至水(5mL)并且有力地搅拌混合物。向反应混合物加入半胱氨酸(24mg)和TEMED(30.5ul)，并且于室温在氩气气氛下搅拌混合物。通过TLC(硅胶板，正丁醇-乙酸-水，3∶1∶1)使用茚三酮的检测来监测反应的过程。反应混合物显示出与聚合物共迁移的阳性的茚三酮点。半胱氨酸也产生阳性的茚三酮点，然而起始聚合物与茚三酮不产生任何颜色。

[0272] 使用具有多个羧基取代基的硫醇，上文所描述的方法被用于引入用作连接点的另外的羧基基团。例如将巯基琥珀酸加至下列C16-π-聚合物A二酯：

[0273] 实施例12a：C16-π-聚合物A二马来酸酯

[0274] 实施例12b：C16-π-聚合物A二丙烯酸酯

[0275] 实施例12c：C16-π-聚合物A(双)乌头酸酯

[0276]

[0277] 实施例12c

[0278] 以相似的方式，3-巯基戊二酸被加至下列C16-π-聚合物A二酯：

[0279] 实施例12d：C16-π-聚合物A马来酸氢酯

[0280] 实施例12e：C16-π-聚合物A二丙烯酸酯

[0281] 实施例12f：C16-π-聚合物A(双)乌头酸酯

[0282] 3.靶向部分到π-聚合物的连接

[0283] 实施例1：叶酸到C16-π-聚合物A的连接

[0284] 将叶酸(2mmol)溶于无水DMSO，并与二环己基碳二亚胺(DCC)于环境温度反应以形成内酐。之后向这一反应混合物加入等摩尔量的盐酸半胱胺和TEMED，并将反应混合物在氩气下于环境温度搅拌24h，通过TLC监测反应。反应完成后，将反应混合物在真空下过滤以除去反应副产物。将滤出液用甲醇稀释以沉淀橘黄色产物。将沉淀物用甲醇调成浆并过滤，以除去残留的二环己脲和DMSO。用Ellman试剂，叶酸-半胱胺轭合物(S.Atkinson，J.Biol.Chem.，276(30)：27930-27935)产生自由巯基基团的阳性测试，并且TLC没有显示半胱胺的存在。

[0285] 之后将叶酸-半胱胺轭合物在氩气下与C16-π-聚合物A的二马来酸酯(实施例11，由具有约1500分子量的PEG制备)反应。为了保持聚合物聚集体的亲水性，将足以消耗仅50％的可用的马来酸酯基团的量的叶酸-半胱胺轭合物加至聚合物。用TEMED将反应混合物的pH调至6.5-7.5， 并且将混合物在氩气气氛下搅拌过夜。之后使用3.5kD截留膜将反应混合物对水透析以除去任何小分子量副产物和杂质。取出渗余物并将其用于下文描述的药物包封和细胞培养测定。

[0286] 实施例2：表皮生长因子(EGF)到C16-π-聚合物A的连接

[0287] 将表皮生长因子(Sigma)用溶于pH 7.4的PBS-EDTA缓冲液中的2个当量的2-亚氨基硫烷(Sigma)硫醇化，并将硫醇化的EGF通过实施例1中描述的方法连接到C16-π-聚合物A的二马来酸酯。将轭合EGF的聚合物通过超滤纯化并用PBS清洗，并且渗余物被用于制备靶向的包封聚合物。

[0288] 实施例3：抗-EGFR单克隆抗体到C16-π-聚合物A的连接

[0289] 将为腹水的鼠科的抗EGFR单克隆抗体(Sigma)根据制造商的说明书通过在TMAffinityPak 固定蛋白A(Pierce)柱上层析来纯化。在pH 7.4的PBS缓冲液中，通过实施例1中描述的方法将纯化的抗体硫醇化并轭合至C16-π-聚合物A的二马来酸酯，并通过超滤纯化。

[0290] 4.抗癌化合物的包封

[0291] 实施例1：将喜树碱包封在C16-π-聚合物A中：

[0292] 将喜树碱(10mg，Sigma)溶解于DMSO中并与溶于DMSO的C16-π-聚合物A(100mg，来源于PEG 1.5kD)的溶液混合。将凝胶状的混合物超声波约10-30分钟，用水稀释，并离心以除去任何固体。通过TLC测试澄清的上清液中包封的喜树碱的存在为阳性。

[0293] 实施例2：将多柔比星包封在C16-π-聚合物A中：

[0294] 将盐酸多柔比星(5mg，Sigma)溶解于水中并用当量的TEMED处理以将盐酸盐转化为自由胺形式。之后向所得的自由胺形式加入溶于DMSO的C16-π-聚合物A(100mg，来源于PEG 1.5kD)的溶液，并且如上文实施例1中所描述的将混合物加工并进行测试。

[0295] 实施例3：将喜树碱包封在轭合叶酸的C16-π-聚合物A中：

[0296] 上文合成的叶酸π-聚合物A轭合物溶于DMSO中，加入溶于DMSO 的喜树碱的溶液。在这一制备方法中使用了喜树碱与聚合物的1∶10的比率。将所得的混合物如上文实施例1中加工，并产生了喜树碱包封的阳性测定。

[0297] 实施例4：将喜树碱包封在轭合EGF的C16-π-聚合物A中：

[0298] 以如上文实施例1和3中所描述的同样的方式将轭合EGF的C16-π-聚合物A用于包封喜树碱。

[0299] 实施例4：将喜树碱包封在轭合抗EGFR的C16-π-聚合物A中：

[0300] 以如上文实施例1和3中所描述的同样的方式将与鼠科抗EGFR抗体轭合的C16-π-聚合物A用于包封喜树碱。

[0301] 5.细胞增殖测定

[0302] 在肿瘤细胞增殖测定中进行评估之前，将上文制备的实例稀释至具有下文列出的组合物的初始浓度：

[0303] CPT+πP

[0304] 组合物： 与π-聚合物络合的喜树碱

[0305] 重复单元mw： 2278

[0306] 配体： -

[0307] 配体mw： -

[0308] 包封的药物： 喜树碱

[0309] 药物mw： 348

[0310] 聚合物浓度： .035mg/ml

[0311] 15.4μM的重复单元

[0312] 配体浓度： -

[0313] -

[0314] 药物浓度： 3.48mg/ml

[0315] 10.0μM

[0316] CPT

[0317] 组合物： 喜树碱(对照)

[0318] 重复单元mw： -

[0319] 配体： -

[0320] 配体mw： -

[0321] 包封的药物： 喜树碱

[0322] 药物mw： 348

[0323] 聚合物浓度： -

[0324] -

[0325] 配体浓度： -

[0326] -

[0327] 药物浓度： 3.48μg/ml

[0328] 10.0μM

[0329] DOX+πP

[0330] 组合物： 与π-聚合物络合的多柔比星

[0331] 重复单元mw： 2278

[0332] 配体： -

[0333] 配体mw： -

[0334] 包封的药物： 多柔比星

[0335] 药物mw： 544

[0336] 聚合物浓度： .054mg/ml

[0337] 23.7μm的重复单元

[0338] 配体浓度： -

[0339] -

[0340] 药物浓度： 5.44μg/ml

[0341] 10.0μM

[0342] DOX

[0343] 组合物： 多柔比星(对照)

[0344] 重复单元mw： -

[0345] 配体： -

[0346] 配体mw： -

[0347] 包封的药物： 多柔比星

[0348] 药物mw： 544

[0349] 聚合物浓度： -

[0350] -

[0351] 配体浓度： -

[0352] -

[0353] 药物浓度： 5.44μg/ml

[0354] 10.0μM

[0355] πP

[0356] 组合物： π-聚合物(对照)

[0357] 重复单元mw： 2278

[0358] 配体： -

[0359] 配体mw： -

[0360] 包封的药物： -

[0361] 药物mw： -

[0362] 聚合物浓度： .035mg/ml

[0363] 15.4μM的重复单元

[0364] 配体浓度： -

[0365] -

[0366] 药物浓度： -

[0367] -

[0368] CPT+FA-πP

[0369] 组合物： 与轭合叶酸的π-聚合物络合的喜树碱

[0370] 重复单元mw： 5338

[0371] 配体： 叶酸

[0372] 配体mw： 441

[0373] 包封的药物： 喜树碱

[0374] 药物mw： 348

[0375] 聚合物浓度： .031mg/ml

[0376] 5.81μM的重复单元

[0377] 配体浓度： 2.56μg/ml

[0378] 5.81μM

[0379] 药物浓度： 3.48μg/ml

[0380] 10.0μM

[0381] FA-πP

[0382] 组合物： 轭合叶酸的π-聚合物(对照)

[0383] 重复单元mw： 5338

[0384] 配体： 叶酸

[0385] 配体mw： 441

[0386] 包封的药物： -

[0387] 药物mw： -

[0388] 聚合物浓度： .031mg/ml

[0389] 5.81μM的重复单元

[0390] 配体浓度： 2.56μg/ml

[0391] 5.81μM

[0392] 药物浓度 -

[0393] FA

[0394] 组合物： 叶酸(对照)

[0395] 重复单元mw： -

[0396] 配体： 叶酸

[0397] 配体mw： 441

[0398] 包封的药物： -

[0399] 药物mw： -

[0400] 聚合物浓度： -

[0401] -

[0402] 配体浓度： 4.41μg/ml

[0403] 10.0μM

[0404] 药物浓度 -

[0405] CPT+EGF-πP

[0406] 组合物： 与轭合EGF的π-聚合物络合的喜树碱

[0407] 重复单元mw： 5338

[0408] 配体： EGF

[0409] 配体mw： 6052

[0410] 包封的药物： 喜树碱

[0411] 药物mw： 348

[0412] 聚合物浓度： .0868mg/ml

[0413] 16.3μM的重复单元

[0414] 配体浓度： 910μg/ml

[0415] 150μM

[0416] 药物浓度 9.05μg/ml

[0417] 26.0μM

[0418] EGFR_Ab-πP

[0419] 组合物： 轭合抗EGFR抗体的π-聚合物(对照)

[0420] 重复单元mw： 5338

[0421] 配体： 抗EGFR抗体

[0422] 配体mw： 150,000

[0423] 包封的药物： -

[0424] 药物mw： -

[0425] 聚合物浓度： .106mg/ml

[0426] 19.9μm的重复单元

[0427] 配体浓度： 3,000μg/ml

[0428] 20.0μM

[0429] 药物浓度 -

[0430] -

[0431] CPT+EGFR_Ab-πP

[0432] 组合物： 与轭合抗EGFR抗体的π-聚合物络合的喜树碱

[0433] 重复单元mw： 5338

[0434] 配体： 抗EGFR抗体

[0435] 配体mw： 150,000

[0436] 包封的药物： 喜树碱

[0437] 药物mw： 348

[0438] 聚合物浓度： .106mg/ml

[0439] 19.9μm的重复单元

[0440] 配体浓度： 3,000μg/ml

[0441] 20.0μM

[0442] 药物浓度 11.0μg/ml

[0443] 31.6μM

[0444] EGF

[0445] 组合物： EGF肽(对照)

[0446] 重复单元mw： -

[0447] 配体： EGF

[0448] 配体mw： 6052

[0449] 包封的药物： -

[0450] 药物mw： -

[0451] 聚合物浓度： -

[0452] -

[0453] 配体浓度： 200μg/ml

[0454] 33.0μM

[0455] 药物浓度 -

[0456] 使用了下列细胞系，以及指定的生长培养基：A549(F12培养基)、MDAMB231(Lebovitz培养基)、H441、BT474和SKBR3(RPMI培养基)。将肿瘤细胞于含有10％胎牛血清的完全培养基中以3000细胞/孔接种在96孔板上，并于37℃孵育24小时。接种二十四小时后，以上文描述的母液的10倍稀释液开始，将测试化合物以三倍的系列稀释液加入。因此测试的母液的稀释液为10∶1、30∶1和90∶1，并且相对浓度分别为1.00、
0.33和0.11。六种测试材料量不足；将它们直接稀释至30∶1并且不以10∶1进行测试。加入测试化合物之后，将细胞在完全生长培养基中于37℃孵育72小时。在第4天，使用Promega Cell Titer Glo 测定试剂盒，将细胞溶解并向每孔加入100毫
升底物/缓冲液混合物，混合并于室温孵育15分钟。将样本在光度计上读数以测量来自每孔的细胞溶解液中存在的ATP的量，其与那一孔中存活的细胞的数目一致。

[0457] 每种细胞系的结果示于图1-5。1.00的相对浓度表示上文所描述的母液的10倍稀释。