与植物抗逆性相关的热激因子蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种与植物抗逆相关的蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆相关的由1)衍生的蛋白质。将与植物抗逆相关蛋白的编码基因导入烟草和拟南芥的转基因实验证明，转入BhHsf1基因的植株抗逆性明显提高，说明BhHsf1是与植物抗逆相关的蛋白。本发明的培育抗逆性提高的转基因植物的方法具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

权利要求

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的cDNA基因为如下1)-2)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第15-1166位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在pBin19的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入植物中，得到抗逆转基因植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入植物中。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述植物为水稻、小麦、大豆、烟草、拟南芥、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、三叶草、冰草、草莓或西红柿。

11.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述抗逆转基因植物为抗热和/或抗旱转基因植物。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述抗逆转基因植物为抗热和/或抗旱转基因植物。

说明书

与植物抗逆性相关的热激因子蛋白及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种与植物抗逆相关的蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种与植物抗逆相关的热激因子蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 随着全球气温的上升和极端气候事件的增长，热、旱等逆境对作物的产量和品质的影响日趋显著。因此，通过分子操作技术提高作物的抗逆性日显重要。

[0003] 生物体受到胁迫后，会产生一系列的应急反应，其中热激蛋白(heatshockprotein，HSP)会在体内迅速积累，并帮助相关蛋白折叠、细胞内分配及降解。进一步研究发现，HSPs的含量与生物体耐热性呈正相关，且能够提高生物体的应激能力和在逆境中的存活率(Harf & Hayer-Hartl，Protein folding：molecular chaperones inthe cytosol：from nascent chain to folded protein.Science.295；1852 ～ 1858.2002；
Young，Barral，Hard，More than folding：localized functions of cytosolic cham pemnes.Trends.Biochem.Sci.28：541～547，2003)。

[0004] 热激蛋白基因的表达是受一类专门的转录因子--热激转录因子(heatstresstranscription factor，Hsf)调控的，它们在HSP基因转录时可与其启动子区热激元件(heat shock element，HSE)这一保守基序特异性结合，从而调控热激蛋白基因的开启与关闭，完成其相应的生物学功能(Pelham.A regulatory upstream promoter element inthe Drosophila hsp70 heat-shock gene.Cel1.30：517-528，1982；Pefisic，Xiao，Lis.Stable binding of Drosophila heat shock factor to head-tohead and tail-to-tail repeats of aconserved 5 bp recognition unit.Cel1.59：797 ～806，1989)。 已 有研究表明热激蛋白对提高植物抗逆胁迫能力有明显的作用(Prieto-Dapena，
Almoguera，Jordano，The ectopic overexpression of a seed-specific transcription factor，HaHSFA9，conferstolerance to severe dehydration in vegetative organs.Plant J.54：1004-1014，2008；晁旭，巩振辉，逯明辉，马超，李大伟，赵军，孟长军，拟南芥热激转录因子AtHsfA6a的克隆与细胞定位分析，西北农林科技大学学报(自然科学版)2008年4期：94-98)。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因。

[0006] 本发明所提供的与植物抗逆性相关的蛋白，名称为BhHsf1，来源于苦苣苔科的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)，是如下1)或2)的蛋白质：

[0007] 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0008] 2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由1)衍生的蛋白质。

[0009] 为了使1)中的BhHsf1便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

[0010] 表1.标签的序列

[0011]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0012] 上述2)中的BhHsf1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的BhHsf1的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第15-1116位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

[0013] 上述与植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因也属于本发明的保护范围。

[0014] 与植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

[0015] 1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第15-1166位脱氧核糖核苷酸；

[0016] 2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

[0017] 3)在严格条件下与序列表中序列1的自5′末端第15-1166位脱氧核糖核苷酸杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

[0018] 4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

[0019] 序列表中的序列1由1453个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第15-1166位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的BhHsf1蛋白。

[0020] 上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

[0021] 扩增上述BhHsf1基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

[0022] 含有上述与植物抗逆性相关蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

[0023] 可用现有的植物表达载体构建含有BhHsf1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。

[0024] 使用BhHsf1基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

[0025] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

[0026] 所述重组表达载体具体可为在植物表达载体pBin19的多克隆位点间插入上述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体，如pBin19-35S-BhHsf1。

[0027] 本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。

[0028] 本发明所提供的培育抗逆性提高的转基因植物的方法，是将上述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因BhHsf1导入植物中，得到抗逆性提高的转基因植物。

[0029] 所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因BhHsf1是通过所述重组表达载体导入植物中的。

[0030] 上述抗逆性具体可为抗热性(耐热性)和抗旱性(耐旱性)。

[0031] 携带有本发明的与植物抗逆性相关蛋白编码基因BhHsf1的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、大豆、烟草、玉米、油菜、高粱、棉花等农作物，也可以是苜蓿、三叶草、冰草等牧草以及草莓、西红柿等果蔬花卉植物。

[0032] 本发明从旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)中筛选到一个受干旱诱导表达的BhHsf1基因，将该基因导入烟草和拟南芥的转基因植物热胁迫实验证明，转入BhHsf1的T2代转基因烟草株系的存活率皆为100％，未转基因的野生型烟草的存活率为0％；转入BhHsf1的T2代转基因拟南芥纯合体株系的存活率分别为100％(株系7)，100％(株系15)和78％(株系21)，未转基因的野生型拟南芥的存活率为0％。将该基因导入拟南芥的转基因植物干旱胁迫实验证明，转入BhHsf1的T2代转基因拟南芥纯合体株系的存活率分别为50％(株系15)和38％(株系21)，未转基因的野生型拟南芥的存活率为0％。说明BhHsf1是与植物抗逆性相关的蛋白。与植物抗逆相关蛋白BhHsf1及其编码基因对于培育抗逆性提高的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

[0033] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

[0034] 图1为Northern检测BhHsf1的诱导表达结果

[0035] 图2为BhHsf1基因过表达载体的物理图谱

[0036] 图3为转入pBin19-35S-BhHsf1的T2代阳性转基因烟草及拟南芥的RT-PCR检测结果

[0037] 图4为BhHsf1基因过表达的转基因烟草及拟南芥的抗热能力鉴定

[0038] 图5为BhHsf1基因过表达的拟南芥的抗旱能力鉴定

具体实施方式

[0039] 下述实施例中所述方法如无特别说明均为常规方法，所用引物及探针均由上海生工合成。

[0040] 实施例1、BhHsf1基因的克隆

[0041] 提取经干旱胁迫处理(25℃，光照，置于滤纸上风干，下同)8小时的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)叶片的总RNA，利用ZAP- 文库构建试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)构建cDNA文库。从中随机挑选4800个基因，用BioGridrobot(BioRobotics +Ltd，Cambridge，UK)自动化点样在Hybond-N 尼龙膜(AmershamBiosciences，Freiburg，Germany)上，制成cDNA微阵列(cDNA芯片)。将该cDNA芯片分别与未经干旱处理正常生
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长的旋蒴苣苔叶片和经干旱胁迫处理8小时的旋蒴苣苔叶片的polyA-RNA所制备的 P标记的探针进行杂交，分析它们在正常条件及干旱诱导后基因表达的动态变化。结果发现其中1个经干旱诱导上调的基因具有序列1的自5′端第667-1453位脱氧核糖核苷酸的DNA片段。

[0042] 设计引物，利用5’-RACE法得到了该基因的全长序列，命名为BhHsf1。5’-RACE具体方法如下：

[0043] 1)合成第一链cDNA

[0044] 提取经干旱胁迫处理8小时的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)叶片的总RNA并以其为模板，用基因特异性引物GSP-Race1：5’-tatccgacggctgctt-3’进行反转录。反应体系为：总RNA(2μg/μl)1.0μl，GSP-Race1(1μM)2μl，dNTP(2mM)5μl，DEPC-H2O 6.0μl，5×M-MLV buffer 4μl，RNase抑制剂(5u/μl，购自Takara公司)1μl，M-MLV(购自Promega公司)1μl。37℃反应1h后再65℃10min，纯化回收(三博PCR产物回收试剂盒)后加C尾。

[0045] 2)cDNA的加尾

[0046] 反 应 体 系 为：cDNA 5μl，DEPC-H2O 13.5μl，5×buffer 5μl，dCTP(10mm)0.5μl。75℃反应5min后加入1μl TdT末端转移酶(购自takara公司)，再
37℃反应1h，得到加C尾的cDNA序列。

[0047] 3)加尾cDNA的PCR

[0048] 以上述获得的加C尾的cDNA序列为模板，PCR扩增。反应体系为：cDNA 1μl，10×PCR buffer 1μl，dNTP(2mm)1μl，含有BamHI内切酶识别位点的引物GSP-Race2：
5’-gggatcctttggagggatttgat-3’(10μm)0.5μl，含有SalI内切酶识别位点的多聚G锚定引物5’-ggccacgcgtcgactagtacg14-3’(10μm)0.5μl，Taq酶(购自takara公司)0.1μl。
反应条件为：先95℃预变性4min，然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，再72延伸2分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。

[0049] 4)巢式PCR扩增

[0050] 将上述PCR产物稀释100倍作为模板，PCR扩增。PCR反应体系为：模板1μl，10×PCR buffer 1μl，dNTP(2mm)1μl，含有BamHI内切酶识别位点的引物GSP-Race3：
5’-ctggat cctccttttgatgtgtttc-3’0.5μl，含有SalI内切酶识别位点的锚定引物5’-ggccacgcgtcgactagtac-3’(10μm)0.5μl，Taq酶(购自takara公司)0.1μl。反应条件为：
先95℃预变性4min，然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，再72延伸2分钟，共35个循环；
最后72℃延伸10分钟。

[0051] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到500bp左右的条带；回收该500bp左右的条带，与载体pGEM-T(购自Promega公司)连接后进行测序。根据测序结果拼接得到BhHsf1基因全序列，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，分析发现该序列包含完整的BhHsf1基因的开放阅读框(ORF)、5’-UTR(5’-非翻译区)和3’-UTR，其ORF为自5′末端第15-1166位的脱氧核糖核苷酸，编码的氨基酸残基序列如序列表中序列2所示。该氨基酸残基序列属于Hsf蛋白家族。

[0052] 实施例2、BhHsf1基因的诱导表达分析

[0053] Northern blot参照Amersham Phamacia Biotech产品说明书进行。

[0054] 分别提取未受干旱胁迫、干旱胁迫处理2、8、24、72小时的旋蒴苣苔(Boeahygrometrica)叶片的总RNA，以如下DNA片段为探针进行Northern blot：提取经干旱胁迫处理8小时的旋蒴苣苔(Boea hygrometrfca)叶片的总RNA，以hsf1-f5’-cgagatctatggtttctgtggtag-3’和

[0055] GSP-Race3：5’-ctggatcctccttttgatgtgtttc-3’为引物进行RT-PCR，得到具有序列1的自5′末端第15-1166位脱氧核糖核苷酸的DNA片段作为探针。

[0056] Northern blot(图1)中从左到右依次为未受干旱胁迫、干旱胁迫2h、8h、24h和72h。具体检测结果如图1所示。其中，

[0057] LC为未受干旱胁迫的旋蒴苣苔叶片；Ld2为干旱胁迫2h后旋蒴苣苔叶片；

[0058] Ld8为干旱胁迫8h后旋蒴苣苔叶片；Ld24为干旱胁迫24h后旋蒴苣苔叶片；

[0059] Ld72为干旱胁迫72h后旋蒴苣苔叶片。

[0060] 上图为BhHsf1 mRNA的Northern blot检测结果；下图为以上样品所对应的转膜前总RNA甲醛凝胶电泳图像，二个条带为18S rRNA和28S rRNA。

[0061] Northern blot检测实验显示在未受干旱胁迫的旋蒴苣苔叶片中未检测到BhHsf1表达，在干旱胁迫2h叶片中BhHsf1就有较高的表达，且一直保持到干旱胁迫72h，说明BhHsf1确实是受脱水诱导表达的基因。

[0062] 实施例3、转BhHsf1基因烟草的抗逆性检测分析

[0063] 1)转BhHsf1基因烟草及拟南芥的获得

[0064] A.制备含有BhHsf1基因的重组表达载体

[0065] 提取经干旱胁迫处理8小时的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)叶片的总RNA，以hsf1-f 5’-cgagatctatggtttctgtggtag-3’和hsf1-r 5’-agtcgacagtaggcgaatcccat-3’为引物进行RT-PCR，得到具有序列1的自5′末端第15-1166位脱氧核糖核苷酸的DNA片段，将该DNA片段连接到pEasy-blunt载体(北京全式金公司)上，将获得的重组载体命名为pBhHsf1。将重组载体pBhHsf1用BamHI和SalI(购自大连宝生物公司)双酶切后，回收1152bp的片段(BhHsf1)，与CaMV35S启动子和poly-A序列(Odell，JT；Nagy，F；Chua，NH.Identification of DNA sequences required for activity of thecauliflower mosaic virus 35S promoter.Nature.313(2005)：810-812) 一 同 连接 到 载 体 pBin19(D.A.Frisch，L.W.Harris-Haller，N.T.Yokubaitis，T.L.Thomas，S.H.Hardin，T.C.Hall，Complete sequence of the binary vector Bin 19，Plant Mol.Biol.27(1995)405-409.)，得到重组质粒pBin19-35S-BhHsf1(物理图谱如图2所示)。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有10μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基筛选出所需重组子并进行测序分析，经过测序鉴定，证明重组质粒的序列及结构正确。

[0066] B.含有BhHsf1基因的重组细胞和重组植物的制备

[0067] 利用电击法将pBin19-35S-BhHsf1转化到农杆菌LAB4404(北京拜尔迪公司)细胞中，用含有50μg/ml硫酸卡那霉素、30μg/ml链霉素和50μg/ml利福平的YEB培养基进行筛选，获得携带35S启动子和BhHsf1基因的重组农杆菌菌株LAB-pBin19-35S-BhHsf1。

[0068] 将LAB-pBin19-35S-BhHsf1采用叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum cv.SR-1)，花器官浸泡法转化拟南芥(Col-0)，将上述转基因烟草和拟南芥移至温室培养，自交、收集转基因烟草的种子。同时，以野生型烟草和拟南芥作为对照。

[0069] 将上述转基因烟草和拟南芥的种子播种于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的MS培养基上，将在上述含有100μg/ml硫酸卡那霉素的MS培养基上抗性分离比为3∶1的T1代转基因植物的成活幼苗移至温室培养，收集T1代转基因植物的种子。取100粒T1代转基因植物种子播种于含100μg/ml硫酸卡那霉素的MS培养基中，结果共获得三个T2代转pBin19-35S-BhHsf1烟草株系：2-9、4-10、8-2。三个T2代转pBin19-35S-BhHsf1拟南芥株系7，15，21。

[0070] C.转基因植物的BhHsf1基因表达分析

[0071] 提取一个月苗龄的上述各个株系的T2代转基因植物的总RNA，以hsf1-f5’-cgagatctatggtttctgtggtag-3’和hsf1-r 5’-agtcgacagtaggcgaatcccat-3’为引物进行RT-PCR，同时以未转基因的野生型烟草和拟南芥作为对照。PCR扩增程序为：95℃预变性4min，94℃变性45秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共27个循环；最后再72℃延伸10分钟；同时以18s rRNA基因做为内参，PCR扩增程序为：95℃预变性4min，94℃变性45秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共18个循环；最后再72℃延伸10分钟。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，每组样品进行2次重复。结果表明，未转基因的野生型烟草(WT)中没有扩增出条带，转pBin19-35S-BhHsf1烟草株系2-9、4-10和8-2中，皆有BhHsf1表达。未转基因的野生型拟南芥(WT)中没有扩增出条带，转pBin19-35S-BhHsf1拟南芥株系7，15和21中皆有BhHsf1表达(图3)。

[0072] 图3中，以引物hsf1-f及hsf1-r所扩增得到的BhHsf1基因片段的条带大小为1164bp，18S rRNA基因做为内参所扩增得到的DNA片段的条带大小为195bp。

[0073] 左侧WT指未转BhHsf1基因的拟南芥野生型，图中显示以PCR方法基因特异性扩增BhHsf1基因(上)和18s rRNA在琼脂糖凝胶中所显示的核苷酸条带图像。

[0074] 右侧WT指未转BhHsf1基因的烟草野生型，图中显示以PCR进行基因特异性扩增BhHsf1基因(上)和18s rRNA在琼脂糖凝胶中所显示的核苷酸条带图像。

[0075] 2)检测转BhHsf1基因的转基因烟草和转基因拟南芥的抗逆性

[0076] 将实施例3步骤1)A中获得的转入质粒pBin19-35S-BhHsf1的3个株系的T2代转基因拟南芥播于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的MS培养基上，未转基因的野生型拟南芥播于MS培养基上，培养在22℃、50％湿度、光照16h和黑暗8h的条件下，6天后将所有的小苗均转移至MS培养基上，3天后进行热激处理：37℃热激1小时，正常培养条件(22℃)3小时，然后49℃热激1小时。然后放于正常培养条件(22℃)。3天后照相并统计存活率。实验共设三次重复，每次重复各个株系均50株。结果如图4A和B所示。未经热激处理组，野生型和转基因拟南芥均正常生长(图4A)；而热激处理组，未转基因的野生型拟南芥的存活率为0％；转入质粒pBin19-35S-BhHsf1的T2代转基因拟南芥株系的存活率分别为100％(7)，100％(15)和78％(21)(图4B)。表明转BhHsf1基因拟南芥的抗热性明显提高。

[0077] 将实施例3步骤1)A中获得的转入质粒pBin19-35S-BhHsf1的3个株系的T2代转基因烟草和未转基因的野生型烟草播于MS培养基上，培养在22℃、50％湿度、光照16h和黑暗8h的条件下，2周后进行热激处理：49℃热激2小时后放于正常培养条件，7天后照相并统计存活率。实验共设三次重复，每次重复各个株系均100株。结果见图4，图4C热激前的烟草照片，图4D为热激处理后又生长7天的烟草照片，表明正常生长的野生型烟草在热激后存活率为0％；转入质粒pBin19-35S-BhHsf1的T2代转基因纯合体烟草株系在热激后存活率皆为100％。说明转BhHsf1基因烟草的抗热性明显提高。

[0078] 将实施例3步骤1)A中获得的转入质粒pBin19-35S-BhHsf1的3个株系的T2代转基因拟南芥播于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的MS培养基上，未转基因的野生型拟南芥播于MS培养基上，培养在22℃、50％湿度、光周期16/8h的条件下(下同)，5天后将所有的小苗均转移至土壤中，培养条件同上，3周后停止浇水，进行干旱胁迫处理：干旱2周后照相，恢复浇水，3天后照相并统计存活率。实验共设三次重复，每次重复各个株系均48株。结果如图5所示。未经干旱处理时，野生型和转基因拟南芥均正常生长(图5A)；而干旱处理后，野生型和转基因拟南芥均萎蔫干枯，但转基因植物明显好于野生型(图5B)；复水后，未转基因的野生型拟南芥的存活率为0％；转入质粒pBin19-35S-BhHsf1的T2代转基因拟南芥株系的存活率分别为50％(15)和38％(21)(图 C)。表明转BhHsf1基因拟南芥的抗旱性明显提高。

[0079] 该实施例的实验结果表明，转入BhHsf1基因的植株的抗逆性明显优于未转BhHsf1基因的植株，说明BhHsf1是与植物抗逆性相关的蛋白之一。

[0080] 序列表

[0081] <110>中国科学院植物研究所

[0082] <120>与植物抗逆性相关的热激因子蛋白及其编码基因与应用

[0083] <160>2

[0084] <210>1

[0085] <211>1453

[0086] <212>DNA

[0087] <213>旋蒴苣苔属旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)

[0088] <221>CDS

[0089] <222>(15)..(1166)

[0090] <400>1

[0091] aaacatactt gtac atg gtt tct gtg gta gct gca ggg agt aaa caa gaa 50[0092] Met Val Ser Val Val Ala Ala Gly Ser Lys Gln Glu[0093] 1 5 10

[0094] atg gtg gcg agt gaa gct ctg att ggt gtg aag gag gag ccc ttg gtg 98[0095] Met Val Ala Ser Glu Ala Leu Ile Gly Val Lys Glu Glu Pro Leu Val[0096] 15 20 25

[0097] ttt ctt gat gag gct gag tat ctt gga ggt ggg ttc agt ggc tgc agg 146[0098] Phe Leu Asp Glu Ala Glu Tyr Leu Gly Gly Gly Phe Ser Gly Cys Arg[0099] 30 35 40

[0100] agt gga ggt gag gag gag gag tgg ggg gat gcg gcg gag gag cat ctt 194[0101] Ser Gly Gly Glu Glu Glu Glu Trp Gly Asp Ala Ala Glu Glu His Leu[0102] 45 50 55 60[0103] ccg aaa ccg ttg gag ggg ctg agg gat atc ggg cct ccc ccg ttt ctg 242[0104] Pro Lys Pro Leu Glu Gly Leu Arg Asp Ile Gly Pro Pro Pro Phe Leu[0105] 65 70 75

[0106] aag aag acg ttt gag atg gtg gat gat cct cgt acg gac tcg ata ctg 290[0107] Lys Lys Thr Phe Glu Met Val Asp Asp Pro Arg Thr Asp Ser Ile Leu[0108] 80 85 90

[0109] tcg tgg agt ggc gcc ggc aat agc ttc gtt gtg tgg gat ccc cac acc 338[0110] Ser Trp Ser Gly Ala Gly Asn Ser Phe Val Val Trp Asp Pro His Thr[0111] 95 100 105

[0112] ttt gcc acc gat ctg ctc ccc aag cat ttc aag cac aac aac ttc tcc 386[0113] Phe Ala Thr Asp Leu Leu Pro Lys His Phe Lys His Asn Asn Phe Ser[0114] 110 115 120

[0115] agc ttc gtc cgc caa cta aac acc tat aga ttc agg aag att gat tcg 434[0116] Ser Phe Val Arg Gln Leu Asn Thr Tyr Arg Phe Arg Lys Ile Asp Ser[0117] 125 130 135 140[0118] gac aga tgg gag ttt gcc aac gaa ggg ttc cgg agg aac aag aag cat 482[0119] Asp Arg Trp Glu Phe Ala Asn Glu Gly Phe Arg Arg Asn Lys Lys His[0120] 145 150 155

[0121] ttg ctg aaa cac atc aaa agg agg aag cag agc ccc caa atg atg cgg 530[0122] Leu Leu Lys His Ile Lys Arg Arg Lys Gln Ser Pro Gln Met Met Arg[0123] 160 165 170

[0124] cca cac gag gca gca gca gca gca cag ccg tgg cag tat ccc acc aat 578[0125] Pro His Glu Ala Ala Ala Ala Ala Gln Pro Trp Gln Tyr Pro Thr Asn[0126] 175 180 185

[0127] cat ggt gtg gat tcc gag att tat aag ctc gga gcc gac cag agc ctt 626[0128] His Gly Val Asp Ser Glu Ile Tyr Lys Leu Gly Ala Asp Gln Ser Leu[0129] 190 195 200

[0130] ctg agg caa gaa atc gtg aag cta agg cag caa caa gag tgc tcg cag 674[0131] Leu Arg Gln Glu Ile Val Lys Leu Arg Gln Gln Gln Glu Cys Ser Gln[0132] 205 210 215 220[0133] cgc tac atc gcc gcc atg gaa gag cgt ctc cac gcc tcc gag atg cag 722[0134] Arg Tyr Ile Ala Ala Met Glu Glu Arg Leu His Ala Ser Glu Met Gln[0135] 225 230 235

[0136] caa aaa cac atg atc gtt ttc atg atc aaa tcc ctc aag gat ccc atg 770[0137] Gln Lys His Met Ile Val Phe Met Ile Lys Ser Leu Lys Asp Pro Met[0138] 240 245 250

[0139] ttt tta ctg gac tgt gtg gac agg atc aac agg aaa agg gca ctg agc 818[0140] Phe Leu Leu Asp Cys Val Asp Arg Ile Asn Arg Lys Arg Ala Leu Ser[0141] 255 260 265

[0142] agc gaa gaa gtc gcc ttc aaa aga agg cgg ttg tct gaa aac atg gaa 866[0143] Ser Glu Glu Val Ala Phe Lys Arg Arg Arg Leu Ser Glu Asn Met Glu[0144] 270 275 280

[0145] tcc aat att ggt att gat cag gac agg agg ttc caa gcc cag gag gag 914[0146] Ser Asn Ile Gly Ile Asp Gln Asp Arg Arg Phe Gln Ala Gln Glu Glu[0147] 285 290 295 300[0148] ttg agt acc ata cca tcc gaa ata cag aca cta ttc tct ccc gat tca 962[0149] Leu Ser Thr Ile Pro Ser Glu Ile Gln Thr Leu Phe Ser Pro Asp Ser[0150] 305 310 315

[0151] tcc ggg agc cct gta cag gac cac aag gcc gaa aca gaa ttg cac agc 1010[0152] Ser Gly Ser Pro Val Gln Asp His Lys Ala Glu Thr Glu Leu His Ser[0153] 320 325 330

[0154] tct gat gtc tgc tcc gac aac ttc ata ttg tgg gag aaa ctc atg gaa 1058[0155] Ser Asp Val Cys Ser Asp Asn Phe Ile Leu Trp Glu Lys Leu Met Glu[0156] 335 340 345

[0157] gat gac atg atc tac gat gaa gaa caa ggg ccg gaa aag cag ccg tcg 1106[0158] Asp Asp Met Ile Tyr Asp Glu Glu Gln Gly Pro Glu Lys Gln Pro Ser[0159] 350 355 360

[0160] gat acc cgt agg ata gga gaa ttc gat ccc aaa acc gtc gca atg gga 1154[0161] Asp Thr Arg Arg Ile Gly Glu Phe Asp Pro Lys Thr Val Ala Met Gly[0162] 365 370 375 380[0163] ttc gcc tac tag agaccggccg gaaggaggtc gtttccgaca tataaaatcc 1206[0164] Phe Ala Tyr

[0165] agatcgaggt acaaatggaa agtgttacat atatatgatc atattttata taatttcctt 1266[0166] gtcattgttg tatgctaaat tattagttta ttagatagga attaggattt tagttgaaag 1326[0167] tggcattttt gcagagaacg ggagtctgcc gataatgtca tcatgtataa tatccatatt 1386[0168] tttctcactt tgtaagtttg gtctatagac ttcatcatat atcatgtgaa tgtatcttga 1446[0169] actctga 1453[0170] <210>2

[0171] <211>383

[0172] <212>PRT

[0173] <213>旋蒴苣苔属旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)

[0174] <400>2

[0175] Met Val Ser Val Val Ala Ala Gly Ser Lys Gln Glu Met Val Ala Ser[0176] 1 5 10 15

[0177] Glu Ala Leu Ile Gly Val Lys Glu Glu Pro Leu Val Phe Leu Asp Glu[0178] 20 25 30

[0179] Ala Glu Tyr Leu Gly Gly Gly Phe Ser Gly Cys Arg Ser Gly Gly Glu[0180] 35 40 45

[0181] Glu Glu Glu Trp Gly Asp Ala Ala Glu Glu His Leu Pro Lys Pro Leu[0182] 50 55 60

[0183] Glu Gly Leu Arg Asp Ile Gly Pro Pro Pro Phe Leu Lys Lys Thr Phe[0184] 65 70 75 80[0185] Glu Met Val Asp Asp Pro Arg Thr Asp Ser Ile Leu Ser Trp Ser Gly[0186] 85 90 95

[0187] Ala Gly Asn Ser Phe Val Val Trp Asp Pro His Thr Phe Ala Thr Asp[0188] 100 105 110

[0189] Leu Leu Pro Lys His Phe Lys His Asn Asn Phe Ser Ser Phe Val Arg[0190] 115 120 125

[0191] Gln Leu Asn Thr Tyr Arg Phe Arg Lys Ile Asp Ser Asp Arg Trp Glu[0192] 130 135 140

[0193] Phe Ala Asn Glu Gly Phe Arg Arg Asn Lys Lys His Leu Leu Lys His[0194] 145 150 155 160[0195] Ile Lys Arg Arg Lys Gln Ser Pro Gln Met Met Arg Pro His Glu Ala[0196] 165 170 175

[0197] Ala Ala Ala Ala Gln Pro Trp Gln Tyr Pro Thr Asn His Gly Val Asp[0198] 180 185 190

[0199] Ser Glu Ile Tyr Lys Leu Gly Ala Asp Gln Ser Leu Leu Arg Gln Glu[0200] 195 200 205

[0201] Ile Val Lys Leu Arg Gln Gln Gln Glu Cys Ser Gln Arg TyrIle Ala[0202] 210 215 220

[0203] Ala Met Glu Glu Arg Leu His Ala Ser Glu Met Gln Gln Lys His Met[0204] 225 230 235 240[0205] Ile Val Phe Met Ile Lys Ser Leu Lys Asp Pro Met Phe Leu Leu Asp[0206] 245 250 255

[0207] Cys Val Asp Arg Ile Asn Arg Lys Arg Ala Leu Ser Ser Glu Glu Val[0208] 260 265 270

[0209] Ala Phe Lys Arg Arg Arg Leu Ser Glu Asn Met Glu Ser Asn Ile Gly[0210] 275 280 285

[0211] Ile Asp Gln Asp Arg Arg Phe Gln Ala Gln Glu Glu Leu Ser Thr Ile[0212] 290 295 300

[0213] Pro Ser Glu Ile Gln Thr Leu Phe Ser Pro Asp Ser Ser Gly Ser Pro[0214] 305 310 315 320[0215] Val Gln Asp His Lys Ala Glu Thr Glu Leu His Ser Ser Asp Val Cys[0216] 325 330 335

[0217] Ser Asp Asn Phe Ile Leu Trp Glu Lys Leu Met Glu Asp Asp Met Ile[0218] 340 345 350

[0219] Tyr Asp Glu Glu Gln Gly Pro Glu Lys Gln Pro Ser Asp Thr Arg Arg[0220] 355 360 365

[0221] Ile Gly Glu Phe Asp Pro Lys Thr Val Ala Met Gly Phe Ala Tyr

[0222] 370 375 380