多孔复合材料，其制备方法以及在获得组织工程装置中的应用

摘要

本发明涉及多孔复合材料，其中存在至少一种相互分散的生物聚合物，其具有包含从50w/％至95w/％的α-磷酸三钙(α-TCP，α-Ca3(PO4)2)和从5w/％至50w％的磷酸八钙(OCP，Ca8H2(PO4)6·5H2O)的磷酸钙矿物组分，相对于所述矿物组分的总重量。这种α-TCP和OCP的组合物使得体内吸收速度更快并由此使得具有低结晶度矿物组分含纳米晶体结构的新骨组织更快地形成，所述性质与生物磷灰石的性质非常相似。这种多孔复合材料可以作为骨和/或软骨替代物(支架)应用以及在制备组织工程装置中应用。

权利要求

1.制备多孔复合材料的方法，包含下列步骤：将至少一种生物聚合物与基本上由α-磷酸三钙组成的矿物组分在水介质中混合从而获得一种泡沫；

将所获得的泡沫放置足够的时间以实现生物聚合物凝胶化；

将所述泡沫在低于-20℃的温度下冷却；

将冷却的泡沫冷冻干燥；

所述多孔复合材料包含30wt％至99wt％的至少一种相互分散的生物聚合物和1wt％至70wt％的矿物组分，其中所述矿物组分包含从60wt％至85wt％的α-磷酸三钙和从

15wt％至40wt％的磷酸八钙，相对于所述矿物组分的总重量。

2.权利要求1的方法，其中进一步将至少一种交联剂添加到所述水介质中。

3.权利要求2的方法，其中所述至少一种交联剂选自：酰胺、醛和二酮。

4.权利要求2的方法，其中所述交联剂为京尼平。

5.权利要求1的方法，其中将所述泡沫在低于-90℃的温度下冷却。

6.权利要求2的方法，其中以相对于聚合物重量从0.5wt％至5wt％的量添加所述交联剂。

7.权利要求6的方法，其中以相对于聚合物重量从1.5wt％至3wt％的量添加所述交联剂。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中在不高于-20℃的温度下，在低于10毫巴的减压下，将所述冷冻干燥步骤进行不短于18小时。

9.权利要求8的方法，其中所述冷冻干燥步骤在从-40℃至-60℃的温度下进行。

10.权利要求8的方法，其中所述冷冻干燥步骤在24小时与3天之间的一段时间进行。

11.权利要求8的方法，其中所述冷冻干燥步骤在从0.1至1.0毫巴的减压下进行。

12.根据权利要求1-11任一项的方法制备得到的多孔复合材料。

13.权利要求12的多孔复合材料，其中所述矿物组分包含从70wt％至80wt％的α-磷酸三钙和从20wt％至30wt％的磷酸八钙。

14.权利要求12的多孔复合材料，其中所述矿物组分是通过α-磷酸三钙的原位部分水解而获得的。

15.权利要求12的多孔复合材料，其中所述至少一种生物聚合物是蛋白质或多糖。

16.权利要求15的多孔复合材料，其中所述至少一种生物聚合物是水溶性蛋白质。

17.权利要求16的多孔复合材料，其中所述至少一种生物聚合物是动物明胶。

18.权利要求12-17中任一项的多孔复合材料，包含从55wt％至95wt％的所述至少一种生物聚合物，和从5wt％至45wt％的所述矿物组分。

19.权利要求12-17中任一项的多孔复合材料，其中所述至少一种生物聚合物是交联的。

20.权利要求19的多孔复合材料，其中所述至少一种生物聚合物是用交联剂交联的，所述交联剂选自酰胺、醛和二酮。

21.权利要求19的多孔复合材料，其中所述至少一种生物聚合物是用京尼平交联的。

22.权利要求12-17中任一项的多孔复合材料，具有平均粒度从1至500μm的多孔结构。

23.权利要求12-17中任一项的多孔复合材料，进一步包含分化的和/或未分化的细胞，生长因子或其它蛋白质和/或生物刺激物。

24.权利要求23中的多孔复合材料，其中所述细胞、生长因子或其它蛋白质和/或生物刺激物是自体的或同源的。

说明书

多孔复合材料，其制备方法以及在获得组织工程装置中的

应用

[0001] 说明

[0002] 本发明涉及多孔复合材料，其制备方法及其在骨质骨和/或骨-软骨再生和获得组织工程装置中的应用。

[0003] 正如人们理解的那样，骨组织是一种非常复杂的生物矿化复合材料，主要由无机组分(70-80％)和有机组分(20-30％)构成，所述无机组分例如是羟基磷灰石(HA)和水，所述有机组分例如是I型胶原、蛋白聚糖和其它非胶原蛋白质。在骨形成过程中，低结晶度羟基磷灰石纳米晶体聚集并以其纤维形式紧密附着于有机组分之上，由此它们形成具有完美机械和弹性性能的纳米结构的复合材料。

[0004] 骨缺损及其缺失体积再生的相应需求或现有体积增长的需求构成了整形外科、上颔面和神经外科领域的主要挑战。已经研究了各种生物材料并将其作为骨替代物，其已经显示出高生物相容性，同时这样的仿生性使得受体骨组织及其细胞成分的生物学机制激活，促进新的形成以及骨整合过程。当该功能完成，这些材料通常被完全再吸收，为新生骨留出专门的空间。这种再生过程通常定义作“引导骨再生”。

[0005] 例如，在国际专利申请WO 03/071991中公开了一种多孔基质，其可以用作骨再生材料，由不溶于水的纤维状聚合物，尤其是不溶性胶原，胶原衍生物或用磷酸钙矿化改性的明胶衍生物构成。生物聚合物可以和水溶性配体混合使用，例如可溶性胶原、明胶、聚乳酸、聚乙醇酸和其它。矿化可以通过用碱性pH的钙离子和磷酸离子水溶液处理聚合物纤维获得。然后添加水溶性配体并与矿化的生物聚合物水溶液混合；然后将得到的混合物冷却并冷冻干燥。多孔基质可以通过添加如戊二醛来交联。

[0006] 国际专利申请WO 06/031196公开了一种由生物材料和矿物质构成的多孔复合物。生物材料可以选自大范围的产品，包含蛋白质(例如，胶原、弹性蛋白、明胶以及其它)、肽、多糖。矿物质可以是磷酸钙，例如磷灰石或取代磷灰石、或透钙磷石、磷酸三钙、磷酸八钙。生物矿物可以用各种交联剂交联，例如丙烯酰胺，聚酯，戊二醛，乙醛，甲醛或核糖。复合物可以这样制备：将生物材料与矿物质在水中根据各种方法混合，以获得悬浮液，随后将其冷冻干燥。

[0007] Chun-Hsu Yao等，“Calvarial bone response to tricalciumphosphate-genipin crosslinked gelatin composite”，Biomaterials 26(2005)，p.3065-3074，报道了对通过将明胶与京尼平(genipin)和磷酸三钙陶瓷颗粒交联获得的多孔可生物降解复合物在体内生物响应性的研究。将0.5w/％京尼平水溶液加入到18％明胶水溶液中以制备明胶交联物。随后，将磷酸三钙以尺寸为200-300μm的颗粒的形式(从Merck得到)加入。在固化之后，将复合物在-80℃下冷冻并冷冻干燥。

[0008] Yoshitake Takahashi等，“Osteogenic differentiation of mesenchymalstem cells in biodegradable sponges composed of gelatin and β-tricalcium phosphate”，Biomaterials 26(2005)p.3587-3596，公开了由明胶和β-磷酸三钙构成的可生物降解多孔材料的制备方法以及它们在间质干细胞在体外成骨分化中的应用。这些材料已经通过将胶原用戊二醛在β-磷酸三钙的存在下交联并随后冷冻干燥而制备。

[0009] Hae-Won Kim 等，“Stimulation of osteoblast responses to biomimeticnanocomposites of gelatin-hydroxyapatite for tissueengineeringscaffolds”，Biomaterials 26(2005)，p.5221-5230，最终涉及对成骨细胞在基于胶原/羟基磷灰石的纳米复合物存在下在体外响应的研究。纳米复合物通过羟基磷灰石和明胶溶液共沉淀以及随后冷冻干燥来制备。羟基磷灰石可以通过将钙离子和磷酸根离子加入到明胶溶液中获得，或通过直接将粉末形式的羟基磷灰石与明胶溶液混合获得。

[0010] 本申请人旨在获得这样一种多孔复合材料，它可用于加速骨和/或骨-软骨再生，显示出与快速的新组织形成相称的合适的体内吸收速度，因此所述复合材料尤其适合于实施骨和/或骨-软骨再生技术以及获得组织工程装置。

[0011] 本申请人已经惊奇地发现，这个问题可以通过后附的权利要求书请求保护的多孔复合材料来解决，其中存在至少一种相互分散的生物聚合物，其具有包含相对于矿物组分的总重量从50w/％至95w/％的α-磷酸三钙(α-TCP，α-Ca3(PO4)2)和从5w/％至50w％的磷酸八钙(OCP，Ca8H2(PO4)6·5H2O)的磷酸钙矿物组分。所述α-TCP和OCP的组合物使得体内吸收速度增加并由此使得具有低结晶度矿物组分含纳米结晶结构的新骨组织更快地形成，所述性质与生物磷灰石的性质非常相似。

[0012] 因此，根据第一个方面，本发明涉及多孔复合材料，该多孔复合材料包含至少一种相互分散的生物聚合物和矿物组分，所述矿物组分包含相对于矿物组分的总重量从50w/％至95w/％的α-磷酸三钙(α-TCP)和从5w/％至50w％的磷酸八钙(OCP)的矿物组分。

[0013] 优选地，所述矿物组分包含从60w/％至85w/％的α-TCP和从15w/％至40w％的OCP。更优选地，所述矿物组分包含从70w/％至80w/％的α-TCP和从20w/％至30w％的OCP。

[0014] 优选地，所述生物聚合物是蛋白质或多糖。更优选地，所述生物聚合物为水溶性蛋白质，尤其是例如通过从生物组织中提取获得的动物明胶，所述生物组织例如肌肉，结缔组织，比如骨，腱，韧带或软骨，或皮肤或真皮。

[0015] 所述多孔复合材料优选地包含从30w/％至99w/％、更优选从55w/％至95w/％的所述至少一种生物聚合物以及从1w/％至70w/％、更优选从5w/％至45w/％的如上所定义的矿物组分，这里的百分比是相对于所述多孔复合材料的总重量来表述的。

[0016] 根据另一个方面，本发明涉及用于制备如上公开的多孔复合材料的方法，该方法包含：

[0017] 将至少一种生物聚合物与基本上由α-磷酸三钙(α-TCP)构成的矿物组分在水介质中混合以获得泡沫；

[0018] 让所获得的泡沫静置足够的时间以实现生物聚合物的凝胶化；

[0019] 将所述泡沫在低于-20℃、优选低于-90℃的温度下冷却；

[0020] 将冷却的泡沫冷冻干燥。

[0021] 根据另一个方面，本发明涉及如上公开的多孔复合材料作为用于骨和/或骨-软骨再生的材料的应用。

[0022] 根据另一个方面，本发明涉及如上公开的多孔复合材料作为用于生产组织工程装置的材料的应用。

[0023] 根据另一个方面，本发明涉及如上公开的多孔复合材料作为骨和/或骨-软骨替代物(支架)的应用。

[0024] 按照本发明的方法，从α-TCP获得如上定义的α-TCP和OCP组合物，由于α-TCP在水环境中部分水解成OCP。关于这一点，参见A.Bigi等，“α-Tricalcium phosphate hydrolysis to octacalcium phosphate：effect ofsodium polyacrylate”，Biomaterials，23(2002)，p.1849-1854。

[0025] 要注意的是，正如申请人进行的并在下文中报道的实验中所示，该结果不能由其它磷酸钙(例如由β-TCP)获得，所述β-TCP是完全不同于α-TCP的结晶形TCP；也不能由羟基磷灰石获得，所述羟基磷灰石是通常作为TCP销售的商品的主要成分。

[0026] 根据一个优选的实施方案，所述至少一种存在于本发明多孔复合材料中的生物聚合物是交联的。因此，可能根据应用需要调节高机械压力抗性和更大降解抗性的特性。

[0027] 所述生物聚合物的交联可以通过在制备过程中添加至少一种交联剂来获得。交联剂可以选自，例如：酰胺，例如丙烯酰胺；醛，例如戊二醛；聚酯。

[0028] 特别优选的交联剂为京尼平，它是一种细胞素性非常低的可生物降解天然产物。京尼平为京尼平苷的水解产物，通常从栀子(Gardenia jasminoidesEllis)的果实获得。

[0029] 将交联剂添加到生物聚合物和α-TCP分散于其中的水介质中，同时搅拌足够的时间以实现生物聚合物的交联。交联剂的添加量通常为从0.5w/％至5w/％，优选从1.5w/％至3.0w/％，相对于生物聚合物的重量。

[0030] 在冷却和冷冻干燥之前，让所得泡沫静置足够的时间以实现生物聚合物的凝胶化。

[0031] 为了调节最终材料的形状和尺寸以使它适合于所需应用，凝胶化步骤可以在合适的成形模具中实施。于是，浪费得以最小化。作为选择，为了获得所需形状和尺寸，可以在冷冻干燥之后将所述材料剪切。

[0032] 冷冻干燥步骤可以通过已知技术实施，温度通常不高于-20℃，优选在-40℃与-60℃之间，经过通常不短于18小时、优选从24小时至3天的时间，在减压下，通常低于10毫巴，优选从0,1和1,0毫巴。

[0033] 本发明的复合材料显示平均粒度从1至500μm的多孔结构。通过SEM分析，所述多孔结构既显示出大孔性又显示出微孔性，具有平均粒度从100至200μm的相互连通的大孔。大孔壁是微孔的，微孔平均粒度为几个μm。

[0034] 本发明的多孔复合材料可以包含用于原位和/或体外组织工程的细胞。这些细胞，分化的(例如成骨细胞、骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞)和/或不分化的(例如间充质干细胞)，自体的或同源的，可以在外科植入步骤中与多孔复合材料联合或它们可以在其上培养以获得将要体内植入的体外工程结构。生长因子或其它蛋白质和/或生物刺激物(合成的和生物学的，自体的或同源的)，可以在其中的制备步骤过程中，同时随着有或没有细胞的外科植入，以及在植入前的体外构建工程步骤中与多孔复合材料联合。

[0035] 现在将通过一些实施例说明本发明，这些实施例并不被视为以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

[0036] 图1不含矿物组分的明胶多孔材料的各种SEM图像放大图；

[0037] 图2、3、4和5：根据本发明的多孔复合材料的各种SEM图像放大图，所述材料含有含量分别为9w/％(图2)、23w/％(图3)、33w/％(图4)、42w/％(图5)的矿物组分，相对于多孔复合材料的总量；

[0038] 图6：用于制备本发明多孔复合材料的α-TCP粉末的X-射线衍射图；

[0039] 图7、8、9：从本发明多孔复合材料中分离的矿物组分的粉末的X-射线衍射图，所述多孔复合材料含有含量分别为23w/％(图7)、33w/％(图8)、42w/％(图9)的矿物组分，相对于多孔复合材料的总量；

[0040] 图10：用于制备已知技术的多孔复合材料的β-TCP粉末的X-射线衍射图；

[0041] 图11：从根据已知技术由β-TCP获得的多孔复合材料中分离的矿物组分的粉末的X-射线衍射图，所述矿物组分以33w/％的含量存在，相对于多孔复合材料的总含量；

[0042] 图12：用于制备已知技术的多孔复合材料的商品TCP(Merck)的粉末的X-射线衍射图；

[0043] 图13：从根据已知技术由商品TCP(Merck)获得的多孔复合材料中分离的矿物组分的粉末的X-射线衍射图，所述矿物组分以42w/％的含量存在，相对于多孔复合材料的总重量。

[0044] 实施例1-5

[0045] 所用材料

[0046] 采用通过酸提取获得的猪皮明胶。

[0047] 通过摩尔比为1∶2的CaCO3与CaHPO4·2H2O的混合物在1300℃下5小时的固态反应制备了α-TCP。固体产物在使用前被细研磨。

[0048] 制备多孔复合材料

[0049] 根据下列步骤进行各种样品的制备。

[0050] a)将明胶在下列浓度下溶于含α-TCP的水中，为了获得在最终复合材料中矿物组分的含量为9w/％(实施例2)、23w/％(实施例3)、33w/％(实施例4)和42w/％(实施例5)。溶解通过在40℃下在1000rpm下机械搅拌50分钟获得。在搅拌结束时获得泡沫。

[0051] b)使泡沫凝胶化，同时将其在环境温度下在培养皿中保持从10至40分钟范围内的时间。

[0052] c)通过在液氮(-195℃)中浸10分钟对获得的凝胶进行冷冻。

[0053] d)将冷冻的凝胶在-50℃下在1毫巴压力下冷冻干燥24小时。

[0054] 作为对照，也可以采用不添加α-TCP的明胶根据如前所述相同的方法制备了一种多孔材料。(实施例1)

[0055] 如果要得到交联复合材料的样品，就可以在(a)步骤之后，添加京尼平水溶液以使京尼平含量相对于明胶重量为1,5w/％。随后，将如此获得的组合物在搅拌下保持10分钟。

[0056] 复合材料表征

[0057] 图2-5图像是含有如下含量的矿物组分的本发明多孔复合材料的SEM显微照片：9w/％(实施例2，图2)、23w/％(实施例3，图3)、33w/％(实施例4，图4)、42w/％(实施例5，图5)。作为对照，图1举例说明了实施例1的明胶多孔材料的SEM图像，不含矿物组分，在各种放大倍数下。

[0058] 可以注意到，多孔结构显示出大孔性和微孔性。大孔，其看起来相互连通，平均粒度为100-200μm。图像没有显示出属于无机相的细节，这显示了复合材料组分的优异均质化。矿物组分结晶结构的表征采用PANalytical X’Pert PRO衍射仪通过对粉末的X-射线衍射分析进行。

[0059] 图6显示了从用于制备多孔复合材料样品的α-TCP获得的粉末的x-射线衍射图。所有衍射峰与α-TCP的特征峰相符合(在图中α-TCP参考数据ICDD通过对应于特征峰的片段报道)。

[0060] 图7显示了从含有23w/％矿物组分(实施例3)直接冷冻干燥后的复合材料(通过明胶增溶作用)中分离的矿物组分中获得的粉末的x-射线衍射图。该图除了显示出典型的α-TCP峰之外，还显示出代表OCP的其它衍射峰的存在(在图中OCP的ICDD参考数据通过对应于特征峰片段报道)。

[0061] 对于含不同矿物组分含量的样品已经得到了相似结果，如图8(33w/％，实施例4)和图9(42w/％，实施例5)所示。α-TCP和OCP两相的相对量可以通过整个衍射图的结构精化来计算，采用QUANTO程序实现。对于测试的所有样品所得数据都非常相似；在制备后至多一个月的各时刻下测试，含不同矿物组分含量的复合材料的间接值为26±5％OCP和74±5％α-TCP。

[0062] 通过配有1KN承载单元具有1mm/min杆速的INSTRON 4465测力计，使复合材料样品经受压力。结果显示了矿物组分含量如何在压力下影响机械性能。事实上，机械性能作为矿物组分含量的函数增加：在压力下的应力值从平均值0.08±2MPa，对于无矿物组分的样品，增加到0.21±3MPa，对于含70w/％矿物组分含量的样品。并存地(同时地)，杨氏模量值从0.9±1MPa增加到4±1MPa。

[0063] 通过ThermoFinnigan Pascal 140和Pascal 240装置，使用最大压力240MPa以及汞样品接触角140°，对于上述复合材料样品进行了侵入孔隙率分析。也通过SEM图像测量了孔隙大小。结果表明了由微孔和大孔导致的相互连通的多孔性，尺寸在从1至500μm的范围内。

[0064] 实施例6-7(根据已知技术)

[0065] 多孔复合材料的一些制备测试通过与上述提及的实施例1-5相同的方法进行，但是使用β-TCP作为无机组分替代α-TCP(实施例6)或标明为TCP的Merck商品(实施例7)。

[0066] 通过摩尔比为1∶2的CaCO3与CaHPO4·2H2O的混合物在1000℃下进行15小时的固态反应已经制备了β-TCP。目标产物的X-射线衍射图在图10中说明。所有衍射峰与β-TCP的特征峰相符合(在图中β-TCP的ICDD参考数据通过对应于特征峰的片段报道)。图11显示了从含33w/％矿物组分直接冷冻干燥后的复合材料(通过明胶增溶作用)分离的矿物组分中获得的粉末的X-射线衍射图。所有衍射峰都与β-TCP的特征峰相符合(β-TCP的ICDD参考数据也通过对应于特征峰的片段报道)。没有检测到显著量的OCP和α-TCP。

[0067] TCP商品(Merck)的X-射线衍射图在图12中显示。所有衍射峰实际上与HA的特征峰符合而不是与TCP的特征峰符合(HA的ICDD参考数据通过对应于特征峰的片段报道)。图13显示了从含42w/％矿物组分直接冷冻干燥后的复合材料(通过明胶增溶作用)分离的矿物组分中获得的粉末的X-射线衍射图。所有衍射峰都与HA特征峰符合(在这种情况下，HA的ICDD参考数据也通过对应于特征峰的片段在衍射图中报道)。没有检测到显著量的OCP和α-TCP。