截短的分泌型天冬氨酸蛋白酶2

摘要

本发明涉及截短形式的分泌型天冬氨酸蛋白酶2(Sap2)，以及编码该截短形式的分泌型天冬氨酸蛋白酶2的核酸分子。这个截短的Sap2多肽(tSap2)出奇地稳定并缺乏酶活性，但是在阴道内给药时保留全部的免疫原性并提供抵抗念珠菌引起的阴道内感染的全部保护。本发明进一步涉及包括tSap2的组合物和tSap2在制备这种组合物中的应用。

权利要求

1.由序列号NO:1所示的氨基酸序列表示的多肽。

2.由编码序列号NO:1所示的氨基酸序列的核酸序列表示的多核苷酸。

3.根据权利要求2的多核苷酸，由序列号NO:2所示的核酸序列表示。

4.由与序列号NO:2所示的核酸序列互补的核酸序列表示的多核苷酸。

5.包括权利要求2-4任何一项的多核苷酸的载体。

6.包括权利要求5的载体的宿主细胞。

7.包括权利要求1的多肽的组合物。

8.包括权利要求2-4任何一项的多核苷酸的组合物。

9.权利要求7或8任何一项的组合物是疫苗。

10.权利要求7-8任何一项的组合物包括一种或多种选自赋形剂、稀释剂、佐剂、病毒体的额外成分。

11.权利要求1的多肽和/或权利要求2-4任何一项的多核苷酸用于制备治疗或预防白色念珠菌感染的药物组合物的应用。

12.根据权利要求11的应用，其特征在于，使用一种或多种选自赋形剂、稀释剂、佐剂、传递载体的额外成分。

13.根据权利要求12的应用，其特征在于，所述的传递载体是病毒体。

14.根据权利要求13的应用，其特征在于，所述的多肽和/或多核苷酸连接至所述病毒体的表面。

15.根据权利要求13的应用，其特征在于，所述的多肽和/或多核苷酸包含在所述病毒体的腔内。

16.根据权利要求13的应用，其特征在于，所述的多肽和/或多核苷酸既连接至所述病毒体的表面又包含在所述病毒体腔内。

17.根据权利要求11-16任何一项的应用，其特征在于，所述的感染是黏膜感染。

18.根据权利要求17的应用，其特征在于，所述感染引起外阴道或食道的念珠菌病。

19.包括权利要求1的多肽和/或权利要求2-4任何一项的多核苷酸的试剂盒。

20.根据权利要求19的试剂盒，进一步包括用于检测包括多肽的复合体的试剂。

说明书

截短的分泌型天冬氨酸蛋白酶2

技术领域

[0001] 本发明涉及截短形式的分泌型天冬氨酸蛋白酶2(Sap2)，以及编码该截短形式的分泌型天冬氨酸蛋白酶2的核酸分子。这个截短的Sap2多肽(tSap2)出奇地稳定，在阴道内给药时具有全部的免疫原性并提供抵抗念珠菌引起的阴道内感染的全部保护。本发明进一步涉及包括tSap2的组合物和tSap2在制备这种组合物中的应用。

背景技术

[0002] 由白色念珠菌和其它相关的真菌引起的感染在全世界范围内依然流行(Nyirijesy美国家庭医生(2001)63：697-702)。念珠菌病的广谱性和其公认的临床价值已经激起对理解包含在这些疾病的发病机理中不同的真菌和宿主成分的兴趣。白色念珠菌是人类的共生菌，它与宿主免疫系统的交互作用在共生和控制感染中起重要角色。已经研究了几个潜在的抗白色念珠菌宿主反应的抗原靶，最终目的是产生抵抗念珠菌病的免疫学手段。研究最多的抗原靶包括甘露糖蛋白(MP)，一些具有粘附或受体样功能，热休克蛋白，烯醇酶和分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)(Schaller等，J.of Invet.Dermatology(2000)114：712-717)。加上抗念珠菌免疫反应机制的新发展，这些研究已经打下进一步研究上面的一些靶作为潜在的治疗剂或预防性疫苗或制备被动接种的抗体的选择应用的基础。

[0003] 之前已经发现白色念珠菌的Sap家族成员Sap2的表达，对于感染是严格必需的，用全长的野生型Sap2在阴道或甚至鼻内免疫赋予提高的抵抗念珠菌感染的保护度(de Bernardis，Infect and Imm.(2002)70，2725-2729)。但是，野生型Sap2蛋白显示出酶活性，非常不稳定，并赋有毒性的可能性(Schaller等，Infect and Imm(2003)，71，3227-3234)，使其甚少选作疫苗。

[0004] 因此，本领域需要一种Sap2抗原，其能够引发有效的抗体和细胞内免疫反应抵抗白色念珠菌而没有与其相关联的全长野生型Sap2的缺点。

发明内容

[0005] 本发明通过提供截短的Sap2多肽(tSap2)满足这个需要。根据本发明的tSap2出奇地稳定，在阴道内给药时具有强烈的免疫原性，并提供抵抗念珠菌引起的阴道内感染的完全保护。

[0006] 在第一个方面，本发明涉及包括以下氨基酸序列中的任何一项的多肽：

[0007] (a)序列号NO：1所示的氨基酸序列；

[0008] (b)具有在序列号NO：1的全部长度上与序列号NO：1所示的氨基酸序列有至少80％序列同源性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列编码与具有序列号NO：1所示的氨基酸序列的多肽功能上相同的多肽；

[0009] (c)由在高度严格条件下与序列号NO：2的互补序列杂交的多核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列长度至少为15个氨基酸，以及其中所述的氨基酸序列编码与具有序列号NO：1所示的氨基酸序列的多肽功能上相同的多肽；

[0010] (d)是序列号NO：1所示氨基酸序列的片段的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列长度至少是15个氨基酸，并且其中所述的氨基酸序列编码与具有序列号NO：1所示的氨基酸序列的多肽功能上相同的多肽；

[0011] 其中所述的包括(a)-(d)的氨基酸序列中的任何一项的多肽不具有序列号NO：3或序列号NO：7所示的氨基酸序列。

[0012] 在优选实施方式中，根据本发明的多肽具有序列号NO：1所示的氨基酸序列。

[0013] 在另一方面，本发明涉及包括选自以下一种核酸序列的多核苷酸：

[0014] (a)序列号NO：2所示的核酸序列；

[0015] (b)与(a)的序列互补的核酸序列；

[0016] (c)编码序列号NO：1所示的氨基酸序列的核酸序列；

[0017] (d)具有在序列号NO：2整个长度上与序列号NO：2所示序列有至少80％序列同源性的核酸序列；其中所述核酸序列编码与具有序列号NO：1所示的氨基酸序列的多肽功能上相同的多肽；

[0018] (e)在高度严格条件下与(b)序列杂交的核酸序列，其中所述核酸序列的长度是至少45个核苷酸，并且其中所述核酸序列编码与由序列号NO：1所示氨基酸序列组成的多肽功能上相同的多肽；

[0019] (f)是序列号NO：2所示核酸序列的片段的核酸序列，其中所述核酸序列的长度至少45个核苷酸，并且其中所述核酸序列编码与具有序列号NO：1所示氨基酸序列的多肽功能上相同的多肽；

[0020] 其中所述多核苷酸不具有序列号NO：4或序列号NO：8所示的序列。

[0021] 在优选实施方式中，根据本发明的多核苷酸具有序列号NO：2所示的核酸序列。

[0022] 在进一方面，本发明涉及包括根据本发明的多核苷酸的载体。此外，本发明涉及包括所述载体的宿主细胞。

[0023] 在另一方面，本发明涉及包括至少一种根据本发明的多肽和/或至少一种根据本发明的多核苷酸的组合物。在优选实施方式中，该组合物是疫苗组合物。进一步地，根据本发明的组合物可以包括选自赋形剂、稀释剂、佐剂或病毒体等等的一种或多种额外成分。

[0024] 在另一方面，本发明涉及根据本发明的多肽作为免疫原和/或抗原的应用。在优选实施方式中，根据本发明的多肽在疫苗组合物中使用。此外，本发明涉及至少一种根据本发明的多肽和/或至少一种根据本发明的多核苷酸用于制备治疗或预防念珠菌感染的药物组合物的应用。优选地，所述念珠菌感染是白色念珠菌感染。

[0025] 根据本发明的应用可以涉及选自赋形剂、稀释剂、佐剂或传递载体等等的一种或多种额外成分的使用。在优选实施方式中，该传递载体是病毒体。如果病毒体用作传递载体，根据本发明的多肽和/或多核苷酸可以连接在病毒体表面。可选地或额外地，所述多肽和/或多核苷酸可以包含在病毒体的腔内。进一步的选择是根据本发明的多肽和/或多核苷酸与病毒体一起使用，其中所述病毒体用作单独成分。

[0026] 在优选实施方式中，所述念珠菌感染是黏膜感染和/或系统感染。在另一个优选实施方式中，所述念珠菌感染黏膜感染并且由所述感染引起的疾病选自外阴道或食道念珠菌病。

[0027] 在进一步的方面，本发明涉及包括至少一种根据本发明的多肽和/或至少一种根据本发明的多核苷酸的试剂盒。在优选实施方式中，所述试剂盒用于念珠菌感染的体外诊断。优选地，念珠菌感染是白色念珠菌感染。根据本发明的试剂盒可以进一步包括用于检测包括所述多肽的复合体的试剂。优选地，该检测通过选自由免疫组织化学实验、ELISA、RIA、Western印迹分析、FACS分析、免疫荧光实验以及发光免疫分析组成的组的试验达到目的。

附图说明

[0028] 图1证明截短的Sap2(tSap2)制品比酶活性的野生型Sap2更稳定。3μg(对于SDS-PAGE)或0.3μg(对于Western印迹)的重组表达的Sap2和tSap2在PBS中孵育不同时间长度(30分钟至24小时或48小时)，室温或37℃。孵育后，两个制品都用于SDS-PAGE分析并用考马斯亮蓝染色。图1A：室温(左)和37℃(右)下用考马斯亮蓝染色的tSap2的SDS-PAGE。图1B：室温(左)和37℃(右)下用考马斯亮蓝染色的Sap2的SDS-PAGE。图1C：用多克隆抗Sap2抗体的tSap2的Western印迹。

[0029] 图2证明了在免疫的大白鼠的阴道液体中，截短的Sap2(tSap2)比酶活性的野生型Sap2(Sap2)诱导了更高的抗体水平。在抗体制品中观察到的增加的最多的是IgA，IgA是在黏膜免疫性中涉及的主要免疫球蛋白。抗体水平通过ELISA在阴道液体汇集物中测定，该阴道液体来自用野生型Sap2制品免疫的大白鼠和用截短的重组Sap2(tSap2)免疫的大白鼠。在阴道液体中的抗体的存在根据λ＝405nm读出的吸光率表示。

[0030] 图3显示了在动物感染模型中，用截短的蛋白(tSap2)对大白鼠的免疫减轻白色念珠菌引起的阴道感染比用野生型蛋白(Sap2)处理更快。两组每组5只雌性切除卵巢的大白鼠通过阴道内方案免疫三次，每周一次：一组接受100μg/剂量的野生型Sap2(-■-)，第二组接受50μg/剂量的截短的Sap2(-▲-)。最后一次免疫的一周后，所有的大白鼠用阴道原发性(vaginopathic)剂量的白色念珠菌株SA-40感染。通过计算阴道内白色念珠菌克隆形成单位(CFU)评估感染后21天内真菌细胞从处理的大白鼠上的清除。具体地，计算28℃时在含有氯霉素的Sabouraud琼脂上培养1μl阴道液体样品72小时的酵母细胞。

[0031] 图4显示在免疫的大白鼠阴道中，包含截短的Sap2蛋白的基于病毒体的制剂比单独的截短的蛋白诱导更高的抗Sap2的IgG和IgA水平。通过对用不同制品处理的大白鼠的阴道液体汇集物实行ELISA来评估抗体水平。阴道液体中的抗体的存在根据λ＝405nm读出的吸光率表示。

[0032] 图5证明在感染的大白鼠阴道中，与单独的截短的蛋白相比，绑定在病毒体的截短的蛋白提供更高的感染清除速率。通过监控顺次被免疫和被感染的大白鼠的阴道感染的状态测定清除速率。计算感染后1、2、7、13、21和28天的克隆形成单位(CFU)。

[0033] 图6显示结合至病毒体的截短的蛋白比单独的所述蛋白提供更高的感染清除速率。向基于病毒体的制剂添加黏膜佐剂HLT(来自大肠杆菌的热不稳定性毒素)在保护方面没有提供任何优势。监控阴道感染的过程28天。

[0034] 图7显示抗tSap2的单克隆抗体(mAbs)(NL2/2A8和NL2/9b9)阴道内给药的效果。同型匹配的不相关的抗体(抗烯醇酶单克隆抗体；NL2/7C9)以及白色念珠菌株SA40用作对照。每种单克隆抗体的特异性用Western印迹检测，在感染30分钟前，在单次阴道内给药中所有的单克隆抗体使用相同的蛋白浓度。相比于对照，即，仅接受白色念珠菌细胞或抗烯醇酶单克隆抗体的大白鼠，通过诱导真菌细胞从阴道非常快速的清除，两个抗tSap2单克隆抗体(NL2/2A8和NL2/9B9)均对大白鼠提供保护。在检测条件下，抗Sap2单克隆抗体的效果与从普及的抗真菌药氟康唑的处理中、或从众所周知的Sap抑制剂抑肽素的处理中获得的效果基本可比。

具体实施方式

[0035] 定义

[0036] 本文所描述的氨基酸和氨基酸残基可以指依照公认的本领域技术人员熟知的教科书中参考的一个或三个字母密码，如Stryer，生物化学，第4版，Freeman和Co.，纽约，1995和Creighton，蛋白质，第二版，Freeman和Co.，纽约，1993。本文所用的术语“多肽”和“多核苷酸”可以同义地和在它们最广的含义范围内使用以指代两个或多个氨基酸残基的分子或氨基酸相似物。氨基酸残基可以由肽键连接，或可选地通过其它键，如酯键、醚键等。本文所用的术语“氨基酸”或“氨基酸残基”指天然和/或非天然的或合成的氨基酸，包括D或L对映体形式，以及氨基酸相似物。

[0037] 术语“tSap2”、“tSap2多肽”以及“tSap2蛋白”互换使用，意思是截短形式的野生型Sap2蛋白，其中N-末端76个氨基酸被删除。术语“Sap2”、“Sap2多肽/蛋白质”、“野生型(wt)Sap2”以及“野生型Sap2多肽/蛋白质”互换使用，是指如在序列号NO：3中所示的全长的、天然Sap2。野生型Sap2由398个氨基酸组成，其中最前面的56个氨基酸(1-56)编码前原序列，剩下的氨基酸(57-398)编码成熟形式的Sap2。

[0038] 相关多肽和多核苷酸的“序列同源性”可以依靠已知程序的方式测定。作为规则，使用具有考虑特定需求的计算法则的特定的计算机程序。对于本发明的目的，用于测定两个序列之间的同源性的计算机程序是BLASTP(用于氨基酸序列比较)和BLASTN(用于核苷酸序列比较)，如Altschul S等，核酸研究25：3389-3402(1997)所描述的。BLAST程序可以从美国国立生物技术信息中心(NCBI)中获得，以及从其它来源(如：BLAST手册，Altschul S等，NCB NLM NIH Bethesda MD 20894；Altschul等，J.Mol.215：403-410(1990))获得。对于本发明的目的，使用具有以下默认设置的BLASTN和BLASTP运算法则。

[0039] BLASTN

[0040] 分值参数：匹配/错配分值1，-2

[0041] (Scoring Parameters：Match/Mismatch Scores 1，-2)

[0042] 中断耗值：内在：5，外延：2

[0043] (Gap costs：Existence：5，Extension：2)

[0044] 筛选和遮蔽：选择低复杂度区域

[0045] (Filters and Masking：Low complexity regions selected)

[0046] 物种特异性重复：选择(人)

[0047] (Species-specific repeats for：selected(human))

[0048] 查找表格遮蔽仅选择

[0049] (Mask for lookup table only selected)

[0050] 遮蔽小写字体不选择

[0051] (Mask lower case letters not selected)

[0052] BLASTP

[0053] 分值参数：

[0054] (Scoring Parameters：)

[0055] 矩阵：BLOSUM62

[0056] (Matrix：BLOSUM62)

[0057] 中断耗值：内在：11，外延：1

[0058] (Gap costs：Existence：11，Extension：1)

[0059] 组合物校正：基于组合物的统计

[0060] (Compositional adjustements：Composition-based statistics)

[0061] 筛选和遮蔽：不选择

[0062] (Filtersand Masking：None selected)

[0063] 程序高级选项

[0064] (Program Advanced Options)

[0065] -G打开中断耗值[整数]

[0066] (-G Cost to open gap[Integer])

[0067] 默认值＝核苷酸5蛋白质11

[0068] (default＝5 for nucleotides 11 proteins)

[0069] -E扩展中断耗值[整数]

[0070] (-E Cost to extend gap[Integer])

[0071] 默认值＝核苷酸2蛋白质1

[0072] (default＝2 nucleotides 1 proteins)

[0073] -q核苷酸错配处罚[整数]

[0074] (-q Penalty for nucleotide mismatch[Integer])

[0075] 默认值＝-3

[0076] (default＝-3)

[0077] -r核苷酸匹配得分[整数]

[0078] (-r reward for nucleotide match[Integer])

[0079] 默认值＝1

[0080] (default＝1)

[0081] -e期望数值[真实]

[0082] (-e expect value[Real])

[0083] 默认值＝10

[0084] (default＝10)

[0085] -W字长[整数]

[0086] (-W wordsize[Integer])

[0087] 默认值＝核苷酸11蛋白质3

[0088] (default＝11 nucleotides 3 proteins)

[0089] -y BLAST外延在比特上的下降(X)(如果是0，默认值)

[0090] (-y Dropoff(X)for BLAST extensions in bits(default if zero))[0091] 默认值＝对于BLASTN 20对于其它程序7

[0092] (default＝20 for BLASTN 7 for other programs)

[0093] -X对于中断比对的X下降值(以比特)

[0094] (-X X dropoff value for gapped alignment(in bits))

[0095] 默认值＝15对于所有程序除了BLASTN，因为它不适用

[0096] (default ＝ 15 for al programs except for BLASTN for which it does notapply)

[0097] -Z对于中断比对的最终X下降值(以比特)

[0098] (-Z final X dropoff value for gapped alignment(in bits))

[0099] 对于BLASTN 50对于其它程序25

[0100] (50 for BALSTN 25 for other programs)

[0101] 对于序列比对，完整的tSap2序列(序列号分别为1和2)被用作与相关序列比对的序列。具体地，为测定未知同源性的多肽与根据本发明的tSap2多肽的同源性，所述的第一个多肽的氨基酸序列与序列号NO：1所示的tSap2多肽的氨基酸序列在序列号NO：1的整个长度上进行比对。类似地，为测定未知同源性的多核苷酸与根据本发明的tSap2多核苷酸的同源性，所述的第一个多核苷酸的核苷酸序列与序列号NO：2所示的核酸序列在序列号NO：2的整个长度上进行比对。

[0102] 标准的杂交的“高度严格条件”在Ausubel等(Eds.)，分子生物学现有方案，John Wiley和Sons(2000)中公开。典型的高度严格杂交条件包括68℃时用0.1×SSC/0.1％SDS清洗15分钟。

[0103] 如果多肽与序列号NO：1所示的tSap2多肽具有本质上一样的特征，则该多肽被认为是与具有序列号NO：1所示的氨基酸序列的多肽“功能上相同”。“本质上一样的特征”指至少一种属于tSap2的性质(如与野生型Sap2相比，改进的稳定性或增加的抗原性)也通过功能上相同的多肽显示。多肽的稳定性可以通过将多肽孵育不同时间然后用考马斯亮蓝为多肽染色来测定(实施例1，图1)。如果与野生型Sap2相比，功能上相同的多肽在更长时间内保持可测或者在相同的时间内存在更大的量，则与野生型Sap2的稳定性相比，功能上相同的多肽的稳定性“改进了”。多肽的抗原性可以通过测量由动物免疫引发的抗体的滴度来测定，如在阴道念珠菌感染的大白鼠模型中(实施例4和5)。如果功能上相同的多肽比野生型Sap2引发更高的IgA或IgG滴度，则与野生型Sap2的抗原性相比，功能上相同的多肽的抗原性是“改进了”(图2)。

[0104] tSap2多肽的个别氨基酸可以适当地用相同大小、电荷和/或极性的氨基酸取代。另外，合适的连接物或标签(如组氨酸标签)可以加至tSap2多肽的任意末端以方便它们与传递载体的合并和/或它们与靶抗原的融合和/或方便它们的纯化和/或检测。

[0105] 本文所用的术语“抗原决定簇”分子中指能够被T细胞和/或B细胞受体识别的部分。术语“抗原”用在本文以描述结合至T细胞受体或抗体的分子并且其免疫原性可以通过本文公开的佐剂得以提高或加强。

[0106] 术语“佐剂”指一种不同于靶抗原的物质，能够提高或加强免疫效应细胞的活化作用。术语“佐剂系统”在本文使用以表示多种免疫刺激蛋白如本发明的tSap2多肽与佐剂如CT或HLT的联合以提高该系统中每一个成分如果单独使用时可能发出的免疫刺激效果，以及它们与合适的传递系统如病毒体的联合，可以进一步提高组合物的免疫刺激效果。

[0107] “给药”或“给药于”意思是给有需要的个体提供本发明的一种或多种tSap2多肽或包含蛋白的组合物作为药物、前药、药物代谢物或疫苗。疫苗是用于建立抵抗疾病的免疫性的抗原制品。疫苗制品通常包括由引起疾病的全部有机体(杀死的或变弱的)或这些有机体的部分(如抗原蛋白或DNA)组成的抗原，用于赋予抵抗所述有机体引起的疾病的免疫性。疫苗制品可以是天然的、合成的或来自重组DNA技术。疫苗可以是预防性的(如预防或改善通过任何天然或“野生”病原的将来的感染的影响)，或治疗性的。

[0108] “有效量”是药物制品单独、或与更多剂量一起刺激期望的反应的量。

[0109] 本文所用的术语“病毒体”指通过体外过程制备的囊泡，由脂质和至少一种病毒包膜蛋白组成。脂质源于生物学起源(如卵、植物、动物、细胞培养、细菌、病毒)或合成制备(化学合成)。病毒体可以是源于多种病毒并且缺少源病毒的感染性核壳体和遗传材料的重组病毒包膜，如有免疫潜力的重组流行性感冒病毒体(IRIV)。因此，病毒体是特定类型的脂质囊泡，在它的脂质膜内，包括至少一种病毒包膜蛋白。本文所用的术语“病毒包膜蛋白”指由有包膜的病毒编码的任何蛋白，其存在于病毒体脂质膜中，其中本发明的病毒体部分或全部来源于该有包膜的病毒。当病毒包膜蛋白参与在病毒或病毒体与目标细胞膜的融合时，它们有时以“病毒融合蛋白”起作用。如果蛋白的生化性质允许其物理结合于脂质膜时，包膜蛋白可以是重组蛋白。这些包膜蛋白是病毒体功能性的原因。本发明使用的病毒体还可以是融合病毒体，意思是其包括来自至少两种不同病毒株的病毒包膜蛋白。与病毒系统相反，病毒体是安全的，因为病毒的感染性核壳体已经移除。

[0110] 多肽

[0111] 本发明提供截短的Sap2多肽(tSap2)，包括以下氨基酸序列中的任何一项：

[0112] (a)序列号NO：1所示的氨基酸序列；

[0113] (b)具有在序列号NO：1全部长度上与序列号NO：1所示的氨基酸序列有至少80％序列同源性的氨基酸序列；其中所述的氨基酸序列编码与具有序列号NO：1所示的氨基酸序列的多肽功能上相同的多肽；

[0114] (c)由在高度严格条件下与序列号NO：2的互补序列杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列长度是至少为15个氨基酸，并且其中所述的氨基酸序列编码与具有序列号NO：1所示的氨基酸序列的多肽功能上相同的多肽；

[0115] (d)是序列号NO：1所示氨基酸序列的片段的氨基酸序列，其中所述的氨基酸序列长度至少是15个氨基酸，并且其中所述的氨基酸序列编码与具有序列号NO：1所示的氨基酸序列的多肽功能上相同的多肽；

[0116] 其中包括(a)-(d)的氨基酸序列中的任何一项的多肽不具有序列号NO：3或序列号NO：7所示的氨基酸序列。

[0117] 在优选实施方式中，根据本发明的多肽具有序列号NO：1所示的氨基酸序列。

[0118] 在进一步优选实施方式中，(b)的多肽包括具有与序列号NO：1所示的氨基酸序列有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列。同样优选的是由(具有)具有与序列号NO：1所示的氨基酸序列有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列组成的多肽。

[0119] 在优选实施方式中，(c)和(d)的氨基酸序列的最小长度是20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、或300个氨基酸。

[0120] 多核苷酸

[0121] 本发明进一步提供编码截短的Sap2多肽(tSap2)的多核苷酸，包括选自以下的核酸序列：

[0122] (a)序列号NO：2所示的核酸序列；

[0123] (b)与(a)的序列互补的核酸序列；

[0124] (c)编码序列号NO：1所示的氨基酸序列的核酸序列；

[0125] (d)具有在序列号NO：2整个长度上与序列号NO：2所示序列有至少80％序列同源性的核酸序列；其中所述核酸序列编码与具有序列号NO：1所示的氨基酸序列的多肽功能上相同的多肽；

[0126] (e)在高度严格条件下与(b)序列杂交的核酸序列，其中所述核酸序列的长度是至少45个核苷酸，并且所述核酸序列编码与由序列号NO：1所示氨基酸序列组成的多肽功能上相同的多肽；

[0127] (f)是序列号NO：2所示核酸序列的片段的核酸序列，其中所述核酸序列的长度是至少45个核苷酸，并且其中核酸序列编码与具有序列号NO：1所示氨基酸序列的多肽功能上相同的多肽；

[0128] 其中多核苷酸不具有序列号NO：4或序列号NO：8所示的序列。

[0129] 在优选实施方式中，根据本发明的多核苷酸具有序列号NO：2所示的核酸序列。

[0130] 在进一步优选实施方式中，多核苷酸包括具有与序列号NO：2所示核酸序列有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的核酸序列。同样优选的是由(具有)具有与序列号NO：1所示核酸序列有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的核酸序列组成的多核苷酸。

[0131] 在优选实施方式中，(e)和(f)的核酸序列的最小长度是60、75、90、105、120、135、150、300、450、600、750、或900个核苷酸。

[0132] 在进一方面，本发明涉及包括根据本发明的多核苷酸的载体。此外，本发明涉及包括所述载体的宿主细胞。

[0133] 组合物和应用

[0134] 此外，本发明涉及包括至少一种根据本发明的多肽和/或至少一种根据本发明的多核苷酸的组合物。在优选实施方式中，这个组合物是疫苗组合物。进一步地，根据本发明的组合物可以包括选自赋形剂、稀释剂、佐剂、病毒体等等的一种或多种额外成分。

[0135] 在另一方面，本发明涉及根据本发明的多肽作为免疫原和/或抗原的应用。在优选实施方式中，根据本发明的多肽在疫苗组合物中使用。此外，本发明涉及至少一种根据本发明的多肽和/或至少一种根据本发明的多核苷酸用作制备治疗或预防念珠菌感染的药物组合物的应用。优选地，所述念珠菌感染是白色念珠菌感染。

[0136] 根据本发明的应用可以涉及选自赋形剂、稀释剂、佐剂、传递载体等等的一种或多种额外成分的使用。在优选实施方式中，传递载体是病毒体。如果使用病毒体，根据本发明的多肽和/或多核苷酸可以连接在病毒体表面。可选地或额外地，多肽和/或多核苷酸可以包含在病毒体腔内。进一步的选择是根据本发明的多肽和/或多核苷酸与病毒体一起使用，其中病毒体用作单独成分。

[0137] 在优选实施方式中，念珠菌感染是黏膜感染和/或系统感染。在另一个优选实施方式中，念珠菌感染是黏膜感染并且由所述感染引起的疾病选自外阴道或食道念珠菌病。

[0138] 本发明提供一种新的抵抗念珠菌病的肽疫苗，该疫苗没有使用野生型Sap2带来的毒性副作用的风险并且显示出相对于野生型Sap2的提高的稳定性，同时提供抵抗白色念珠菌感染的免疫反应的有力的刺激。可以重组制备提供截短的和稳定形式的Sap2，并且克服了在获得、提纯和标准化天然抗原中的已知的困难(de Bernardis，感染和免疫(Infect andImm.)2002 70，2725-2729)。便利地，缺少野生型的N-末端最前面的76个氨基酸的新的Sap2多肽可以作为重组产物在原核或真核细胞中制备，任选地，作为便于纯化的6组氨酸(HIS)标签的蛋白。本发明的截短的Sap2多肽(tSap2)非常稳定。该重组的tSap2在western印迹中与抗天然Sap2产生的单克隆抗体以及感染的患者的血清中存在的抗Sap2抗体具有高度反应性。此外，产生的抗tSap2单克隆抗体识别野生型酶。

[0139] 在大白鼠阴道炎实验模型中，用tSap2的免疫赋予了抵抗白色念珠菌感染的抗体介导的保护。本发明显示了抗tSap2多肽的单克隆抗体提供了抵抗真菌引起的阴道感染的被动防御(图7)。因此，本发明提供了用于抵抗在女性中非常常见、通常是慢性的以及有时难以控制的抗真菌感染的主动和被动防御的新手段。

[0140] 为进一步加强本发明的tSap2多肽的免疫刺激效果，组合物可以包括tSap2多肽和一种或多种佐剂。

[0141] 可选地，tSap2多肽可以通过本文公开的方法连接至传递载体如病毒体的表面。可选地，tSap2多肽可以通过本文公开的方法封装在传递载体中。可选地，tSap2多肽可以既由传递载体封装又连接在传递载体的表面。此外，包括tSap2多肽的组合物可以额外地包括一种或多种佐剂，其中tSap2多肽连接在传递载体的表面或封装在传递载体中或由传递载体封装并连接在传递载体的表面。

[0142] 佐剂可以选自费式佐剂(完全和不完全)，分支杆菌如BCG、母牛分支杆菌或短棒状杆菌，霍乱毒素或破伤风毒素，大肠杆菌热不稳定毒素，quil-皂苷混合物如QS-21(SmithKline Beecham)，MF59(Chiron)和多种油/水乳状液(如IDEC-AF)，MALP-2，ISCOMs。其它可以使用的佐剂包括但不限于：矿物盐或矿物凝胶如氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙，表面活性物质如溶血卵磷脂、聚合多元醇、聚阴离子、肽、钥孔戚血蓝素和二硝基酚，免疫刺激分子如皂角苷、胞壁酰二肽和三肽衍生物，短核酸stretches如CpG二核苷酸、CpG寡核苷酸、单磷酰基脂质A和聚磷腈，微粒和微粒佐剂如乳状液、脂质体、病毒体、cochleates或免疫刺激复合体佐剂。细胞因子由于它们的淋巴细胞刺激性质同样有作用。许多对于这样的目的有用的细胞因子是本领域普通技术人员所知的，包括白细胞介素2(IL-2)、IL-12、GM-CSF和许多其它的。此外，来自趋化因子家族的配体是合适的，如RANTES、脂蛋白、脂肽、酵母细胞壁成分、双链RNA、细菌细胞表面脂多糖(LPS)、鞭毛蛋白、富含U的单链病毒RNA、细胞因子信号小干扰RNA的抑制剂(SOCS siRNA)、Pan DR抗原决定簇(PADRE)以及它们的混合物。

[0143] 本发明的tSap2多肽可以通过化学合成制备，或它可以是重组来源的。tSap2多肽可以使用编码蛋白的核酸分子重组制备。此外，它的序列可以进行修饰，只要它保留了本文公开的刺激白色念珠菌的免疫反应的能力。

[0144] 此外，本发明包含tSap2多肽的功能性变异体。本文所用的tSap2多肽的“功能变异体”或“变异体”是包含对免疫刺激性的tSap2多肽的初始氨基酸序列的一个或多个修饰而保留本文公开的免疫刺激效果的蛋白质。如果tSap2多肽的功能变异体涉及氨基酸取代，典型地优选保守氨基酸取代，即保留了原始氨基酸性质的取代，如电荷、疏水性、构造等。氨基酸保守取代的例子包括在具有下面的组的氨基酸中产生的取代：(1)M、I、L、V；(2)F、Y、W；(3)K、R、H；(4)A、G；(5)S、T；(6)Q、N；和(7)E、D。

[0145] 可以做出产生tSap2多肽的功能变异体的修饰以提高蛋白在表达系统中的稳定性，以提高蛋白-蛋白结合的稳定性，如HLA-肽结合，或以增加免疫受体的亲和力。可以使用任何用于制备修饰的或变异的蛋白的方法，如修饰的蛋白的合成或变异的蛋白的合成或它的使用突变核酸分子的重组产物。

[0146] 附加的或优化的免疫刺激tSap2多肽的鉴定还可以包括比较tSap2多肽对T或B细胞的刺激和功能变异体对T或B细胞的刺激的步骤，作为功能变异体对免疫效应细胞的刺激效力的判定。通过比较功能变异体tSap2多肽和已知的tSap2多肽，可以制备具有增加的免疫细胞刺激性质的蛋白质。

[0147] 单个的tSap2多肽可以在一个末端或两个末端添加一个或多个氨基酸。因此，例如，可以在蛋白的N-或C-末端或两个末端添加连接物或间隔氨基酸，以使得多肽便利地结合至传送载体如病毒体。在一些例子中，可能需要增加组氨酸标签至tSap2多肽，以便于实验纯化和/或操作。

[0148] 本发明还证明了作为人类兼容的免疫增强传递剂的病毒体和本发明的tSap2多肽的组合增强了抵抗念珠菌病的有效的免疫反应的产生。因此，本发明提供了一种新的tSap2多肽，其免疫原性功效可以通过与免疫增强传递系统和/或一种或多种佐剂的组合而进一步提高。虽然免疫增强重组流感病毒体(IRIVs)非常适用，许多其它的传递载体，如脂质体、病毒样颗粒、多抗原肽(MAPs)等等也可被本领域技术人员使用。病毒体由磷脂混合物制备的球形的、单层病毒样颗粒和流感病毒表面糖蛋白组成，但是它们不包括任何病毒核酸。流感病毒的红血球凝聚素膜糖蛋白在病毒体作用的方式中起重要作用。流感病毒的这个主要的抗原是膜融合诱导成分，促进抗原传递至免疫活性细胞。本领域已知病毒体作为有效的和高效的提高免疫反应的方法起作用，具有卓越的安全性能。

[0149] 本发明的病毒体传递系统进一步加强了抵抗由本发明的tSap2多肽引发的念珠菌免疫反应。病毒体可以进一步同时载有几种不同的B细胞和T细胞抗原决定簇(Poltl-Frank，F. 等，CHn.Exp.Immunol.，1999，117，496；Moreno，A.P. 等，J.Immunol.，1993，151：489)，包括通用的T辅助细胞抗原决定簇(Kumar，A.等，J.Immunol.1992，148，
1499-1505)和其它的本领域技术人员已知的抗原决定簇。

[0150] 根据本发明所示的结果表明，病毒体在组合的疫苗/佐剂系统的设计中具有很大的潜能。此外，基于病毒体的蛋白疫苗预期是安全的，因为基于病毒体的蛋白疫苗已经在人类中显示出非常好的安全性能(Glueck，R.，Vaccine 1999，17，1782)。本发明的tSap2多肽，可选择地与佐剂结合如CT(霍乱毒素)和HLT(源于大肠杆菌的黏膜表面蛋白)与作为有效的人类兼容性传递系统的病毒体一起使用的协同作用，表现了在抵抗念珠菌病的预防性以及治疗性疫苗的设计的重要进步，所述念珠菌病是阴道的、食管的或系统的。

[0151] 本发明还提供了免疫刺激组合物的应用，如在合适的药物制剂中tSap2多肽与合适的佐剂和/或病毒体或相当的传递载体的组合。因此，本发明的一种或多种多肽或包含多肽的组合物可以用于制备预防或治疗性的疫苗，用于给药于需要的病人。这样的包括一种或多种本发明的包含tSap2多肽的组合物的疫苗，作为主要的或部分的活性成分，可以在用于局部、黏膜(鼻、阴道、口腔)、系统、局部和肠胃外给药的常用载体中，以宽范围的治疗/预防剂量形式给药。因此，本发明提供用于肠胃外给药的组合物，包括溶解或悬浮在可接受的载体的、可选地与合适的佐剂和/或病毒体或相当的传递载体组合的tSap2多肽溶液，可接受的载体优选是水性载体。可以使用多种水性载体，如水、缓冲水、0.4％盐、0.3％氨基乙酸、透明质酸等等。这些组合物可以通过常规的、已知的灭菌技术灭菌，或可以过滤灭菌。得到的水性溶液可以包装使用，或冻干，冻干的制剂在给药前与灭菌溶液组合。组合物可以包括接近生理环境所需要的药物学可接受的辅助试剂，如pH调整和缓冲剂、张性调整剂、润湿剂等等，如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、去水山梨糖醇月桂酸酯、油酸三乙醇胺盐、许多其它的。制备肠胃外给药的化合物的实际方法是本领域技术人员已知或显而易见的，并在如下例子中详细描述：雷明顿：药剂学科学和实践(雷明顿的药物学科学)(The Science andPractice of Pharmacy(″Remington′s Pharmaceutical Sciences″))GennaroAR ed.第20版，2000：威廉斯和威尔金斯PA，美国，以引文方式并入本文。

[0152] 给药的途径和方法将依赖将治疗的疾病的阶段或程度而变化，并由本领域技术人员确定。例如，tSap2和包含它的组合物可以用于制备药物组合物，药物组合物可以用于皮下、皮内、或局部或黏膜(阴道、鼻)、或肌肉形式给药。在优选实施方式中，根据本发明的药物组合物可以阴道内给药。所有的这些形式都是制药学领域的普通技术人员熟知的。

[0153] 有利地，本发明的合适的制剂可以例如是以日剂量每日、每周或每月重复给药。此外，本发明的化合物，尤其是包含病毒体或脂质体的那些，可以以阴道内或鼻内形式给药，或通过本领域技术人员已知的皮肤给药途径。当然，为了以皮肤传递系统形式给药，剂量给药将是持续性的，而不是在给药方案中间歇性的。

[0154] 本发明的tSap2多肽和包含tSap2多肽的组合物可以用于制备药物组合物，该药物组合物包括与适于阴道内给药的药物学可接受的载体组合的活性化合物。阴道内的药物组合物可以是，例如，适于黏膜使用的以溶液、乳霜、药膏、凝胶、洗液、泡沫或气雾剂制剂的形式。这些包括本发明的化合物的阴道内药物组合物在活性化合物和药物学可接受的载体的混合中通常包括以重量计大约0.005％-5％的活性化合物。

[0155] 本发明的预防性或治疗性的组合物以药物学可接受的制剂给药。这样的制剂可以惯例地包括药物学可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、辅助性免疫增强剂如佐剂和细胞因子和任选地其它治疗剂。本发明的制剂以有效量给药。有效量是药物制剂单独或与进一步剂量一起刺激需要的反应的量。通常，取决于给药形式，范围在0.01微克/千克体重-500微克/千克体重的免疫原的剂量被认为是有效的。优选的范围被认为是0.1微克/千克体重和10微克/千克体重之间。绝对量取决于多种因素，包括选出用于给药的组合物、不管给药是以单一或多剂量，和个体病人数据包括年龄、身体状况、身高、体重和疾病阶段。这些因素是本领域普通技术人员熟知的，并且可只通过例行试验完成。

[0156] 利用本发明的组合物的给药方案根据多种因素选择，包括例如种类、年龄、体重和病人的身体状况、治疗的疾病的阶段和程度、以及使用的特别的化合物。具有普通技术的医生可以很容易的决定和处方有效量的疫苗以预防、治疗或阻止恶性病或传染病的进程。在达到具有产生没有毒性或有可接受的毒性的功效范围的药物浓度的最佳精度需要基于药物到达靶定位点的动力学的方案。这个过程包括考虑药物的分配、均衡和消除，并且是在技术人员的能力之内的。

[0157] 在本发明的应用中，本发明的详细描述的化合物可以形成活性组分并且典型地以与合适的药物稀释液或赋形剂的混合物给药，赋形剂在考虑给药的预期形式合适地选择，即，口服药片、胶囊、药酒、糖浆等等，并与常规的药物学实践相一致。例如，对于以药片或胶囊形式的阴道给药，活性疫苗成分可与非毒性的药物学可接受的惰性载体例如乙醇、甘油、水等等组合。此外，当需要或必须时，合适的粘合剂、润滑剂、分解剂和着色剂同样可以融合在混合物中。合适的粘合剂包括，但不限于，淀粉，凝胶，天然糖如葡萄糖或β-乳糖，玉米甜味剂，天然或合成的树胶如阿拉伯树胶、黄芪胶或藻酸钠，羧甲基纤维素，聚乙二醇，蜡等等。在这些剂量形式中使用的润滑剂包括，但不限于，油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、安息香酸钠、乙酸钠、氯化钠等等。分解剂包括，但不限于，淀粉、甲基纤维素、aga、斑脱土、黄原胶树脂等等。

[0158] 对于肠胃外给药，需要消毒的悬浮液和溶液。通常包括合适的防腐剂的等压制剂在需要阴道内给药时使用。在特别适合于黏膜使用的乳霜或凝胶制剂中，包括活性药物成分的阴道内或食道内制剂可以与本领域已知的多种载体材料混合，如乙醇、芦荟凝胶、尿囊素、甘油、维他命A或E油、矿物油、PPG2十四烷基丙酸盐等等，以形成例如含酒精的溶液、局部清洁剂、清洁乳霜、凝胶、泡沫和洗液。

[0159] 本发明的tSap2多肽、组合物或它们的制剂可以与一类用于实现药物缓释的可生物降解的聚合体耦合，例如聚乳酸、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联的或两性嵌段共聚物。通常，受治疗者可以接受阴道内给药有效量的tSap2多肽和组合物，以它们与传递载体如病毒体和/或额外的佐剂联合、或仅它们自己给药。本发明的tSap2多肽同样可以用于制备以脂质体传递系统形式给药的药物组合物，如小单层脂囊、大单层脂囊和多复层脂质体。脂质体可以从多种化合物形成，包括例如胆固醇、硬脂酰胺和多种卵磷脂。

[0160] 根据本领域标准的免疫方案，初始剂量可以接着激发剂量。本发明的组合物和方法的免疫刺激效果可以通过组合任何上述tSap2多肽组合物进一步增强，包括它们与病毒体的组合、与免疫反应加强化合物组合。免疫反应加强化合物被分类为佐剂或细胞因子。佐剂可以通过提供抗原的储存宿主(细胞外地或巨噬细胞内部)、激活巨噬细胞以及刺激特定淋巴细胞而提高免疫反应。

[0161] 在根据本发明的多肽用于制备治疗感染性疾病如念珠菌病的药物组合物中的例子中，期望的反应是控制传染和/或将传染原从系统中清除。在预防的例子中，期望的反应是对病原的保护性免疫，通过在病原或其抗原上的二次免疫反应测定。这些期望的反应通过常规方法监控或根据本发明讨论的诊断方法监控。本发明不限于本发明具体实施方式描述的范围内。确实，除本发明描述的那些之外，本发明的多种修改对于本领域技术人员从前面的描述以及实施例中变得显而易见。这样的修改意味着落入所附的权利要求的范围之内。

[0162] 实施例

[0163] 提供以下的实施例以更好的说明主张的发明，不是限定本发明范围的解释。至于提到的确定材料的范围，这仅仅是说明性目的，并不意味着限定发明。除非另有说明，使用如Voet，生物化学，Wiley，1990；Stryer1995；肽化学；实践手册，第二版，Miklos Bodanszky，Springer-Verlag，柏林，1993；Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室(2001)，Ausubel等(Eds.)分子生物学通用方案，John Wiley和Sons(2000)中列出的生物化学和分子生物学方法。本发明的技术人员可以在不进行需要创造能力的实验并且不背离本发明的范围下开发等同的方法或反应。应当理解，可以在本发明描述的组合物和过程中做出多种变化而仍然保留在本发明的范围之内。同样地，应当理解，由于已知的结构或氨基酸侧链间的化学相似性如极性、大小或方向，具有与本发明公开的等同的氨基酸或替代结构的肽序列将保留相似功能。发明人的意愿是这样的变化包含在本发明的范围内。

[0164] 实施例1：材料和方法

[0165] 1.1微生物和生长条件

[0166] 在本研究中，白色念珠菌ATCC20955用作真菌DNA来源。该菌生长在Winge(0.3％s s s - - - -酵母提取物，0.2％葡萄糖，Difco)中。大肠杆菌M15(nal，str，rif，lac，ara，gal，mtl，- + +
F，recA，uvr，[pUHA1])用作重组质粒的宿主菌株。大肠杆菌细胞典型地生长在LB肉汤中(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5NaCl、pH7.00)或LB平板上(1％胰蛋白胨、0.5％-1
酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％琼脂、pH7.00)，当需要时补充氨苄青霉素(50mg ml )、卡那-1
霉素(50mg ml )(Boehringer)。起始从急性阴道炎患者的阴道分泌物中分离的白色念珠菌SA-40被用于实验的阴道炎。在切除卵巢的大白鼠中实验的阴道感染的真菌生长、诱导和评估按照以前的描述(Cassone A.等，感染免疫(Infect.Immun.)(1995)，63：2619-2624；De Bernardis F.等，感染免疫(1997)，65：3309-3405)。

[0167] 1.2SAP2编码序列的壳隆

[0168] 对于SAP2编码序列的分子克隆，SAP2编码序列通过PCR从基因组DNA使用Ca70和Ca71寡核苷酸扩增。用1％琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物的正确大小，仅存在具有大约1200bp的估计大小的单一条带。限制性酶切消化之后，PCR产物从凝胶中分离并纯化。编码序列连接至消化的载体，形成pRLV141质粒。为检测插入的序列和重组的组氨酸标签蛋白的结构，pRLV141和pRLV143通过Genenco(意大利)完全测序。

[0169] 1.3重组的白色念珠菌蛋白的表达和纯化

[0170] 在携带产生lac阻遏物的pUHA1质粒的大肠杆菌M15中获得重组的6×组氨酸-Sap2的表达(La VaIIe R.等，感染免疫(1995)，63：4039-4045；Hochuli E.等，生物/技术(Bio/Technology)(1988)，6：1321-1325)。通过添加终浓度为1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG；Boehringer)，在包含卡那霉素和氨苄青霉素的LB培养基中对O.D.600为0.7的培养物实行诱导，然后在37℃继续培养5小时。重组的6×组氨酸-标签的蛋白根据生产商的说明(Qiagen；变性条件)通过镍螯合的亲和色谱法(Hochuli E.等，生物/技术(1988)，6：1321-1325)纯化。汇集包含纯化的多肽的片段，并用3倍体积的纯乙醇沉淀，在水中重悬并保存在-20℃。在诱导细胞中，观察到具有分子大小大约是48kDa的、与6×组氨酸-Sap2预期的大小一致的新的蛋白条带。

[0171] 实施例2

[0172] 2.1重组质粒的构建和截短的重组Sap2(tSap2)的制备

[0173] 全长的SAP如实施例1中的描述克隆。对于截短形式的Sap2的制备，质粒pRLV141用BamHI消化以切除与编码SAP2的1-76氨基酸的编码序列的核苷酸一致的片段。消化的质粒重新连接以产生pRLV143并用于转化细菌细胞。得到的克隆通过限制性酶切图谱、PCR和DNA测序(数据没有显示)分析DNA插入长度。

[0174] 可选地，合成制备包括组氨酸标签和在组氨酸标签与tSap2之间具有额外的蛋白酶分裂位点(凝血酶)的截短的Sap2(Geneart，雷根斯堡，德国)。对于在宿主系统中的优化表达，密码子采用宿主密码子(如根据Geneart，雷根斯堡，德国)。合成的tSap2基因具有两个限制性位点NdeI(5’末端)和BamHI(3’末端)，并克隆至表达载体pET-14b(Novagen/Merck生物科学，达姆施塔特，德国)的NedI/BamHI限制性位点，得到pET14-tSap2质粒。这个载体中的tSap2核苷酸序列通过测序确定。

[0175] 可选地，合成制备缺少组氨酸标签的截短的Sap2(Geneart，雷根斯堡，德国)。对于在宿主系统中的优化表达，密码子采用宿主密码子(Geneart，雷根斯堡，德国)。合成的tSap2基因具有两个限制性位点NcoI(5’末端)和BamHI(3’末端)，并克隆至表达载体pET-14b(Novagen/Merck生物科学，达姆施塔特，德国)的NcoI/BamHI限制性位点，得到pET-tSap2质粒。这个载体中的tSap2核苷酸序列通过测序确定。

[0176] 2.2重组的白色念珠菌蛋白的表达和纯化

[0177] 在携带产生lac阻遏物的pUHA1质粒的大肠杆菌M15中获得重组的6×组77-398
氨酸-tSAP2(6×组氨酸-SAP2 )的表达(La VaIIe R.等，感染免疫(1995)，63：
4039-4045；Hochuli E.等，生物/技术(1988)，6：1321-1325)。通过添加终浓度为1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG；Boehringer)，在包含卡那霉素和氨苄青霉素的LB培养基中对O.D.600为0.7的培养物实行诱导，然后在37℃继续培养5小时。重组的6×组氨酸-标签的蛋白根据生产商的说明(Qiagen；变性条件)通过镍螯合的亲和色谱法(HochuliE.等，生物/技术(1988)，6：1321-1325)纯化。汇集包含纯化的多肽的片段，并用3倍体积的纯乙醇沉淀，在水中重悬并保存在-20℃。在诱导细胞中，观察到具有分子大小大约是
35.5kDa的、与6×组氨酸-tSap2预期的大小一致的新的蛋白条带。

[0178] 在上述的条件下，在表达宿主系统中完成pET14-tSap2和pET-tSap2的表达，该表达宿主系统是抗菌素λDE3的溶原性细菌，如大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌Origami(DE3)(Novagen/Merck生物科学，达姆施塔特，德国)。

[0179] 组氨酸标签的蛋白水解移除和得到的没有组氨酸标签的重组tSap2蛋白的分离/纯化通过以下步骤完成：

[0180] 根据生产商(GE Healthcare，Dübendorf，瑞士)的说明，具有凝血酶分裂位点(来自载体pET14-tSap2)的6×组氨酸标签蛋白通过镍螯合的亲和色谱法在HiTrap FF Crude柱上纯化。纯化蛋白的汇集物用蛋白酶凝血酶处理以从tSap2蛋白移除6×组氨酸。因此，根据生厂商(Sigma，Buchs，瑞士)的推荐，纯化的蛋白汇集物与凝血酶-琼脂糖珠在室温下孵育5小时。未标签的tSap2蛋白吸附在离子交换色谱柱上(HiTrap Q FF，GEHealthcare，Dübendorf，瑞士)，并用超过5倍柱体积(CV)的梯度达到100％缓冲液B的缓冲液B(1xPBS，pH 7.4；1.5M NaCl)洗脱。汇集含有tSap2的片段，并用1×PBS、pH 7.4透析。

[0181] 没有组氨酸标签的重组的tSap2蛋白的分离/纯化通过以下步骤完成：

[0182] 大肠杆菌中pET-tSap2载体的表达参照上述pET14-Sap2的表达完成。培养后，细胞离心成球体，按照生厂商(Novagen/Merck生物科学，达姆施塔特，德国)的指示用BugBuster试剂处理以分离内含体(IB)。最后，在20mL裂解液每升细菌培养物(裂解液：1×PBS，pH 7.4；4M尿素)中重悬IB。这个材料吸附在HiTrap Q FF柱上(GE Healthcare，Dübendorf，瑞士)并用超过5倍柱体积(CV)的梯度达到100％缓冲液B的缓冲液B(1×PBS，pH 7.4；1.5M NaCl)洗脱。汇集包含tSap2的片段，并分几步用1×PBS、pH7.4、0.25M尿素透析(4M尿素->2M尿素->1M尿素->0.5M尿素->0.25M尿素)，每次在4℃下、1L体积进行24小时。然后，用缓冲液A(1×PBS，pH 7.4，10mM NaCl)和超过5柱倍体积的梯度至100％缓冲液B的缓冲液B(1×PBS，pH 7.4，1.5MNaCl)将该材料吸附在HiTrap Q FF柱上(GE Healthcare，Dübendorf，瑞士)。汇集包含tSap2的片段并根据说明浓缩在Amicon Ultra 10K柱上(Millipore，Zug，瑞士)。缓冲液添加NaCl后变成1×PBS、pH 7.4、
1.5MNaCl。用缓冲液A(1×PBS，pH 7.4，1.5M NaCl)和超过10倍柱体积的梯度至100％缓冲液B的缓冲液B(1×PBS，pH 7.4，10mM NaCl)将该材料吸附在HiTrap Phenyl FF柱上(GE Healthcare，Dübendorf，瑞士)。汇集含有tSap2的片段，浓缩在Amicon Ultra 10K柱上(Millipore，Zug，瑞士)，并用1×PBS、pH 7.4、10mM NaCl清洗三次。蛋白在4℃分装保存并冷冻。

[0183] 实施例3：重组Sap2和tSap2的稳定性

[0184] 如实施例1和2的描述，表达和纯化重组的Sap2和tSap2。3μg重组的Sap2和tSap2在PBS中孵育不同的时间长度(30分钟至24或48小时)，室温或37℃。孵育后，所有的制品用于SDS-PAGE分析并且用考马斯亮蓝染色。

[0185] 截短的重组Sap2非常稳定，与抗Sap2血清充分反应24小时(图1A)和48小时(数据没有显示)而没有任何降解的迹象。室温(37℃)孵育后，这个蛋白制品同样非常稳定，24-48小时仅显示极少降解的血清反应低分子量条带。相反，野生型Sap2制品甚至在室温孵育6-24小时后发生变化，并在37℃孵育甚至短时间、30分钟后完全降解(图1B)。

[0186] 实施例4

[0187] 在以下实验中使用的标准方法：

[0188] 4.1重组的Sap2和tSap2的免疫原性

[0189] 4.1.1动物

[0190] 贯穿本研究，使用来自Charles River饲养实验室的切除卵巢的雌性Wistar大白鼠(80-100克)。根据别处(De Bemardis F.等，感染免疫，(1997)，65：3309-3405)的描述喂养和照料动物。

[0191] 4.1.2大白鼠的阴道内免疫

[0192] 为有效免疫，对有5只大白鼠的组给药，使用1-100μg的重组的Sap2和tSap2制品并可选地与佐剂(如HLT ug)一起使用，每周一次采用阴道内(i.v.g.)给药，一共三次。对照动物仅接受灭菌的生理盐水。

[0193] 4.1.3阴道清洗

[0194] 通过轻柔注射并随后吸出0.5ml PBS清洗大白鼠阴道腔。汇集每一实验组中收集的液体，在冷冻的Biofuge中3500×g离心汇集的2.5ml液体15分钟，对上清液进行阴道抗体化验。

[0195] 4.2ELISA检测阴道液体中抗白色念珠菌成分的抗体

[0196] 通过之前描述的酶联免疫吸附实验(ELISA)化验阴道清洗物中抗体的存在(Cassone A.等，感染免疫(1995)，63：2619-2624；De Bernardis F.等，感染免疫(2000)，68：3297-3304)。200μl纯化的天然的Sap2制品(由P.A.Sullivan，Massey，University，Palmerston North，新西兰友情提供)用作检测抗体的包被抗原，并分装在聚苯乙烯微滴定盘的孔中，保持4℃过夜。用吐温20-PBS缓冲液洗三次后，阴道液体的1∶2稀释液分装在三倍的孔中，滴定盘在室温孵育1小时。每一孔用吐温20PBS缓冲液再次清洗，加入预先确定最佳稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白IgG或IgA(从Serotec Ldt获得；
Kidlington，牛津，英国)。通过在二乙醇胺缓冲液中添加对硝基苯磷酸盐溶液检测绑定的碱性磷酸酶，滴定盘在A405处用自动微读仪(Labsystem Multiscan，MS，芬兰)读数，空气做空白。对于检测的抗体，当其O.D.比用同样抗原包被，并用非免疫的、未感染的大白鼠的阴道液体检测的孔的数值大于2倍时，这样的阴道液体被认为是阳性的。

[0197] 检测数量变量用于分析正态分布并通过Student的双尾t-检验方式进行比较。通2
过使用x 检验评估群比例的差异，对于小数量，使用Fisher的精确检验。变量的ANOVA分析用于比较成对样品。双尾检验在p＜0.05水平的显著性的用于确定统计显著性。所有的统计分析使用软件程序lntercooled Stata(Stata公司，德克萨斯州)完成。

[0198] 实施例5：免疫的大白鼠中tSap2抗体的检测

[0199] 对两组、每组五只切除卵巢的雌性大白鼠通过阴道内方案每周一次免疫，共三次：一组接受100μg/剂量的野生型Sap2，第二组按20μg/剂量截短的Sap2给药。最后一次免疫的一周后，从每组收集阴道清洗物的汇集物，然后1∶2稀释用于ELISA(实施例4概述的标准方法)。野生型Sap2制品用作免疫试验中抗体检测的包被抗原。在阴道液体中特异于野生型Sap2的抗体的存在根据λ＝405nm读出的吸光率表示。在抗体制品中观察到的主要的增加是IgA，IgA是包含在黏膜免疫性的主要免疫球蛋白。结果在图2中示出，证明了在免疫的大白鼠的阴道液体中，截短的Sap2(tSap2)比酶活性的野生型Sap2(Sap2)诱导了更高的抗体水平。

[0200] 实施例6：用Sap2和tSap2接种疫苗后对白色念珠菌感染的保护

[0201] 最后一次免疫的一周后，所有的动物用107个细胞的白色念珠菌阴道内感染，感染情况通过计算克隆形成单位(CFU)记录，如同别处记录的方式(De Bernardis F.等，感染免疫(1997)，65：3309-3405；De BernardisF.等，感染免疫(2000)，68：3297-3304)。进行两个独立的实验。如同别处的描述(De Bernardis F.等，感染免疫(1997)，65：3309-3405；De BernardisF.等，感染免疫(2000)，68：3297-3304)，为了抗体(Ab)分析，每隔一定时间，通过用0.5ml的PBS温和清洗阴道腔，从每只动物获得阴道液体的样品。收集的液体在冷冻的Biofuge中3500×g离心15分钟，对上清液进行如上所述的化验。结果显示在图3中。

[0202] 实施例7：包含tSap2的基于病毒体的制剂诱导更高的IgG和IgA水平

[0203] 对三组、每组五只大白鼠每周一次阴道内免疫三次：第一组接受20μg/剂量的单独的截短的蛋白；第二组接受20μg/剂量连接至病毒体表面的截短的蛋白；第三组用缓冲液处理。最后一次免疫的一周后，从每一组收集阴道清洗物的免疫汇集物，并1∶2稀释用于ELISA。野生型的Sap2制品用作免疫试验中抗体检测的包被抗原。阴道液体中的抗体的存在根据λ＝405nm读出的吸光率表示。结果在图4中示出。

[0204] 实施例8：包含tSap2的基于病毒体的制剂赋予更高的感染清除率

[0205] 具体地，三组、每组5只切除卵巢的雌性大白鼠用不同的制剂按照通常的免疫方法进行免疫：第一组接受20μg/剂量单独的截短的蛋白；第二组接受20μg/剂量连接至病毒体表面的截短的蛋白；第三组用缓冲液处理。最后一次免疫的4周后，所有的大白鼠用阴道原发性剂量的白色念珠菌株SA-40感染，并在感染后的1、2、7、13、21和28天后计算念珠菌克隆形成单位(CFU)。结果显示的图5中。

[0206] 四组切除卵巢的雌性大白鼠阴道内免疫三次，每周一次，使用以下制品：1)连接至病毒体的截短的蛋白Sap2(20μg/剂量)；2)连接至病毒体的并与HLT组合的截短的蛋白Sap2(20μg/剂量)；3)单独的截短的蛋白(20μg/剂量)；4)缓冲液。最后处理的一个月后，所有的大白鼠用阴道原发性剂量的白色念珠菌感染。对阴道感染过程监控28天。结果显示在图6中。

[0207] 实施例9：包含tSap2蛋白的病毒体赋予更好的保护

[0208] 在这个体内实验中，两组切除卵巢的雌性大白鼠阴道内免疫三次，每周一次分别使用包含截短的蛋白的病毒体和单独的截短的蛋白。最后一次免疫4周后，所有的大白鼠用阴道原发性剂量的白色念珠菌株SA-40感染。通过计算克隆形成单位(CFU)对阴道感染3
的状况进行28天的监控。当CFU≥1x10/ml阴道液体时，该大白鼠被认为是已感染。结果显示在表1中。

[0209] 表1

[0210]

[0211] 表1：该表显示在动物感染模型中，包含截短的蛋白的病毒体比单独的蛋白赋予更好的保护。具体地，感染一周后，用基于病毒体的制剂免疫的大白鼠感染的数量低于单独用蛋白处理的大白鼠的数量。

[0212] 实施例10：将Sap2/tSap2连接至磷酸乙醇胺

[0213] 10.1通过半胱氨酸基团将念珠菌蛋白连接至磷酸乙醇胺

[0214] 对于4ml病毒体制剂，使用规定量的蛋白，并用1ml的含有100mMOEG的PBS重悬。溶液转移至Amberlite珠子(Merck生物科学Novabiochem， 瑞士)上的50mg固定的Tris-(2-羧乙基)磷化氢(TCEP)，并室温孵育30分钟。移走珠子，溶液转移至4mg新鲜的N-MCC-PE(ca.4.3μmol；Avanti极性脂质，Alabaster，阿拉巴马州)并在
30℃下震动孵育至少4小时。最后，通过添加痕量的pH7.4的Tris缓冲液消耗磷酸乙醇胺中未使用的马来酰亚胺基团。该溶液保存在4℃直至使用。

[0215] 10.2通过初级氨基基团将念珠菌蛋白连接至磷酸乙醇胺

[0216] 对于4ml病毒制剂，使用指定量的蛋白，并用0.1-0.5ml的pH7.4、10mM EDTA的PBS重悬。该溶液加至12.5mg Sulfo-SMCC试剂(大约25μmol；阿波罗科学，柴郡，英国)并在室温下缓慢震动孵育1小时。未使用的Sulfo-SMCC试剂通过Sephadex柱(GE Healthcare，Otelfingen，瑞士)上的凝胶过滤移除，并用含有100mM OEG的PBS补充至1ml终体积。这个混合物然后加入至4mg的新鲜的N-MCC-PE(ca.4.3μmol；Avanti极性脂质，Alabaster，阿拉巴马州)并在室温震动孵育至少4小时。最后，通过添加痕量的pH7.4的Tris缓冲液消耗磷酸乙醇胺中的未使用的马来酰亚胺基团。该溶液保存在4℃直至使用。

[0217] 实施例11：包含与病毒体结合的Sap2或tSap2的疫苗

[0218] 11.1制备和使用实施例中使用的试剂

[0219] 试剂：辛乙二醇-单-(n-十二烷)醚(OEG，C12E8)购自Fluka ChemieGmbH-(Buchs，瑞士)。蔗糖(Eur.Phar.)购自Merck(Dietikon，瑞士)。卵磷脂(PC)从Lipoid(Cham，瑞士)获得。1-油酰-3-棕榈酰-rac-甘油-2-磷酸乙醇胺从Bachem获得(Bubendorf，瑞士)。生物珠SM2购自Bio-Rad实验室(Glattbrugg，瑞士)。胆固醇N-(三甲基铵乙基)氨基甲酸氯(TC-chol)购自Merck Eprova(Schaffhausen，瑞士)。

[0220] 在卵胚尿囊腔中繁殖的流感病毒A/Singapore/6/86(A/Sing)株和其它的流感A株(Gerhard，W.(1976)，实验医学杂志，144：985-995)从BernaBiotech AG(伯尔尼，瑞士)获得并按照描述(Skehel，J.等，(1971)，病毒学44：396)纯化。根据 (等，(1961)，Anal.Chim.Acta24，203)测定红血球凝聚素/磷脂比例，SDS-PAGE后HA的量化使用根据Ball(Ball(1986)，分析生物化学，155，23)描述的考马斯亮蓝提取方法进行量化。

[0221] 11.2病毒体的制备

[0222] 对于PE-类-IRIV的制备，磷酸盐缓冲液(PBS)中的纯化的病毒A/Singapore红血球凝聚素(4mg)溶液在100000g下离心30分钟，离心产物溶解在含有100mM辛乙二醇单十二烷醚的PBS(PBS-OEG)(1.33ml)中。淀粉-肽-磷脂酰乙醇胺结合物(4mg)、卵磷脂(32mg；Lipiod，路德维希港，德国)以及磷脂酰乙醇胺(6mg)溶解在总体积是2.66ml的PBS-OEG中。磷脂和红血球凝聚素溶液混合并超声降解1分钟。该溶液在100000g下离心1小时，上清液过滤灭菌。通过去除清洁剂形成病毒体(SM生物珠，BioRad，Glattbrugg，瑞士)。

[0223] 11.3连接至病毒体的SAP2/tSAP2制备(蛋白-GIRIVs)

[0224] 通过清洁剂去除方法制备蛋白-GIRIVs。对于4ml终体积，32mg卵PC和4mgPE溶解在2ml含有100mM OEG的PBS(PBS/OEG)中，制备的蛋白-PE连接物(1ml，见上)添加至该混合物。2mg灭活的流感A/Singapore/6/86病毒的HA在4℃下100,000×g离心1小时，离心产物溶解在1ml的PBS/OEG中。清洁剂溶解的磷脂和病毒混合并超声降解1分钟。该混合物在18℃下100,000×g离心1小时，上清液用于后面步骤。然后室温下震动，通过使用两次1.5g湿的SM2生物珠、每次1小时去除清洁剂而形成病毒体。该病毒体溶液保存在4℃。

[0225] 实施例12：包含与冻干的病毒体结合的Sap2或tSap2的疫苗

[0226] 12.1包含TC-Chol的病毒体的准备

[0227] 通过清洁剂去除的方法制备包含TC-Chol的病毒体。对于4ml终体积，32mg卵PC、8mgOPPE和5mg胆固醇N-(三甲基铵乙基)氨基甲酸氯(TC-chol)溶解在2.6ml含有100mM OEG的PBS(PBS/OEG)中。2mg灭活的A/Singapore/6/86流感病毒或另一个流感A株的HA在4℃下100000×g离心1小时，离心产物溶解在1ml的PBS/OEG中。清洁剂溶解的磷脂和病毒用0.4mL的50％(w/v)蔗糖混合，并超声降解1分钟。该混合物在18℃下100,000×g离心1小时。室温下震动，通过使用两次1.5g湿的SM2生物珠、每次1小时去除清洁剂而形成病毒体。然后新形成的病毒体过滤灭菌(0.22μm)并均分至灭菌玻璃瓶中。密封的瓶子冷冻在-70℃，然后在-40℃下冻干20小时以及10℃下冻干2小时。冷冻保存密封的瓶子直至使用。

[0228] 12.2连接至冻干的病毒体的SAP2/tSAP2(蛋白-TIRIVs)的制备

[0229] 为得到含有连接至磷脂锚的念珠菌蛋白的TIRIVs，在与灭活的H1N1流感病毒的清洁剂溶解的病毒HA结合之前，如上所述将该蛋白连接至PE并溶解在含有卵PC、PE和TC-Chol的PBS/OEG溶液中。清洁剂溶解的磷脂和病毒与5％(w/v)终浓度蔗糖混合并超声降解1分钟。该混合物在18℃下、100,000×g离心1小时。室温下震动，通过使用两次1.5g湿的SM2生物珠、每次1小时去除清洁剂而形成具有念珠菌蛋白连接至它们的膜的病毒体。该病毒体过滤灭菌(0.22μm)并均分至灭菌的玻璃瓶中。密封的瓶子冷冻在-70℃，然后在-40℃下冻干20小时以及10℃下冻干2小时。冷冻保存密封的瓶子直至使用。

[0230] 用等体积的灭菌水完成冻干的TIRIVs重构。瓶子在漩涡仪的中度水平立刻混合10秒钟，4℃保存直至使用。

[0231] 实施例13：抗tSap2多肽的单克隆抗体提供被动防御

[0232] 在用107白色念珠菌细胞(株系SA40)的感染剂量给药30分钟之前，五只大白鼠的组阴道内接种抗tSap2抗体，抗tSap2抗体通过包被tSap2的Dynabeads吸收从免疫阴道液体中洗脱。单克隆抗tSap2抗体(MAbs)的使用浓度是100μg/ml。贯穿在本研究中使用的单克隆抗体是抗截短的Sap2蛋白的单克隆抗体NL2/2A8、单克隆抗体NL2/9B9和抗烯醇酶重组蛋白的单克隆抗体NL2/7C9。

[0233] 检测数量变量用于分析正态分布并通过Student的双尾t-检验方式进行比较。通2
过使用x 检验评估群比例的差异，对于小数量，使用Fisher的精确检验。变量的ANOVA分析用于比较成对样品。双尾检验在p＜0.05水平的显著性用于确定统计显著性。所有的统计分析使用软件程序lntercooled Stata完成。

[0234] 如图7所示，相对于对照，也就是，仅接受白色念珠菌细胞或抗烯醇酶单克隆抗体的大白鼠，通过诱导非常快速的从阴道中的真菌细胞的清除，抗tSap2单克隆抗体(NL2/2A8和NL2/9B9)均给予大白鼠保护。在检测的条件下，抗tSap2单克隆抗体的效果随后与从普及的抗真菌药氟康唑的处理中、或从众所周知的Sap抑制剂抑肽素的处理中获得的效果进行比较。