大体积颗粒样品中的病原体检测

摘要

本发明公开了用于在样品(例如食品样品)中检测微生物的方法和过滤器系统。所述过滤器构造为例如通过静电荷吸引微生物。将包含微生物的过滤器温育以使微生物生长，从而使其可以被检测。所述过滤器可以为可降解的并且所述检测可以包括从用于检测的过滤器提取微生物或微生物的分子标记。所述过滤器系统还可以包括经选择的多孔微珠成分以捕获污垢和其它来自所述样品的污染物，同时允许微生物在所述微珠之间通过。公开了使用所述的过滤器系统用于检测在样品中的微生物的方法。所述方法还可以包括将聚合物和/或微生物检测试剂添加至所述过滤器以使微生物生长局部化和防止试剂的蒸发。

权利要求

1.用于从颗粒样品中分离微生物的方法，所述方法包括用分层的复合过滤器过滤所述颗粒样品，所述分层的复合过滤器包括：构造为通过选自静电、亲水、疏水、物理和生物相互作用的相互作用吸引微生物并且具有构造为防止过滤期间堵塞的孔的过滤器介质，所述过滤器介质为包含纤维素纤维、玻璃微纤维或水凝胶纤维的、截留率为0.1至10μm的深层过滤器；和过滤器的上游表面上的多孔球形微珠层，其中所述微珠的孔径小于微生物的尺寸，由此微生物在过滤步骤期间在所述微珠之间通过，并且所述微珠具有1至1000μm的直径，并且，其中所述多孔球形微珠层置于网筛载体的上游表面上，且所述网筛载体置于所述过滤器上或所述过滤器的上游，并且，其中所述多孔球形微珠层的表面为高度惰性，并且与微生物具有低的非特异性结合，并且，其中所述微珠包含交联亲水性聚合物。

2.权利要求1的方法，其中将识别微生物的试剂特异性或非特异性地固定在过滤器基体上，其中所述试剂是抗体。

3.权利要求1的方法，其中将识别微生物的试剂特异性或非特异性地固定在过滤器基体上，其中所述试剂是抗原。

4.权利要求1的方法，其中将识别微生物的试剂特异性或非特异性地固定在过滤器基体上，其中所述试剂是适配体。

5.权利要求1的方法，其中将识别微生物的试剂特异性或非特异性地固定在过滤器基体上，其中所述试剂是蛋白质。

6.权利要求1的方法，其中将识别微生物的试剂特异性或非特异性地固定在过滤器基体上，其中所述试剂是核酸。

7.权利要求1的方法，其中所述样品已用具有50-1000μm孔的筛进行了过滤。

说明书

大体积颗粒样品中的病原体检测

[0001] 相关申请

[0002] 本申请要求2007年8月1日提交的美国临时申请号60/953,422、2007年11月1日提交的美国临时申请号60/984,624、2007年12月31日提交的美国临时申请号61/018,079和2008年5月21日提交的美国临时申请号61/055,099的优先权。在此将所有上述引用的申请引入以作参考。

技术领域

[0003] 本申请涉及用于在大体积颗粒样品中检测病原体的试剂、方法和设备。

背景技术

[0004] 相关领域的描述

[0005] 根据疾病控制中心(CDC)的最新估计，每年仅在美国内食源性病原体就为76百万例食源性疾病、325,000例住院治疗和5,000例死亡的病因。除了对人类的有害医学作用之外，由于医疗费用、丧失生产力、产品召回和出口停止，这些食源性爆发具有有害的经济学效应。对于某些食源性病原体USDA推荐零容忍政策，因为即使少量的病原体也可以存活和引起食物中毒或甚至爆发。因此，需要开发能够在食品样品中检测甚至单一病原体的敏感的病原体检测技术。

[0006] 为了检测食源性病原体目前可利用许多检测技术和产品，但是对于在24小时时间范围内检测污染几克食品样品的单一病原体，仍然是一个挑战。通常，病原体通过稀释和匀质化从食品样品中提取，导致样品体积多达几百mL，或甚至更大。为了在大体积样品中检测少量病原体，需要培养细胞直至病原体浓度达到适合病原体检测检验的水平。所需的预富集时间依赖于倍增时间(doubling time)、靶病原体的活力、检测所需的病原体浓度。预富集通常花费至少12至48小时。因此，即使使用高敏感性检测检验例如聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸附检验(ELISA)，在食品样品中病原体污染的检测仍然需要1至2天。
此外，这些检验通常是昂贵的并且需要熟练的实验室人员。

[0007] 此外，使用培养预富集的食品病原体检验需要处理富集的病原体，其可能引起实验室和人员的二次污染。这样，这些检验不适合在食品制造厂现场测试，而是可能需要例如在参考实验室处场外进行。同样地，培养预富集将引起关于污染的食品病原体的定量信息的损失，这是因为污染的病原体的活力和食品样品的成分可以影响病原体生长率和因为样品多久达到细胞生长的稳定期或衰退期可能依赖于病原体的污染水平。因此，使用预富集的食品病原体检验为非定量的并且评估食品病原体污染的水平是困难的。

[0008] 为了克服使用预富集的病原体检验的上述缺点，备选的富集方法例如将大样品体积离心或过滤以增加病原体浓度可能是必要的。然而，离心需要离心机，并且通常为繁琐的过程，特别是当大量的大体积样品需要测试时。

[0009] 过滤可以以更高通量进行并且可以浓缩在大体积样品中存在的甚至少量病原体。为了浓缩病原体，过滤方法通常使用微滤(MF)膜过滤器，其通常具有小于靶病原体的孔径。这样，病原体可以在此类过滤器上浓缩并且通过几种检测方法检测，例如集落形成和DNA探针杂交。然而，这些膜过滤器具有非常低的纳污能力并且由于其小孔径，倾向于容易被颗粒食品提取物堵塞。这些过滤器适合用于包含较少颗粒的样品，例如饮用或环境水，或适合于非常小体积的颗粒样品。具有合适截留率的深度过滤器也用于捕获病原体；然而，在此类深度过滤器中捕获的病原体的检测由于其三维基体结构(matrix structure)和过滤器厚度而复杂化。

发明内容

[0010] 本发明的实施方式涉及通过以下步骤的一步或多步在样品中检测微生物的方法：

[0011] 通过过滤器过滤所述样品，所述过滤器构造为吸引微生物并具有构造为防止过滤期间堵塞的孔，以便微生物在所述过滤器中收集，

[0012] 将聚合物和微生物检测试剂施加至所述过滤器；所述聚合物构造为使微生物的生长局部化和/或防止微生物检测试剂的蒸发；

[0013] 将所述过滤器温育对于使微生物生长至可检测水平而言足够的一段时间；和[0014] 检测在样品中微生物的存在。

[0015] 在优选的实施方式中，所述聚合物为水凝胶。优选地，所述水凝胶为环境敏感性水凝胶。所述环境敏感性水凝胶在施以环境变化前可以至少部分地为具有低粘度的溶胶形式，并且当施以所述环境变化时至少部分地变成具有增加的粘度的凝胶形式。在优选的实施方式中，环境变化为温度、pH、入射光的量、离子浓度、压力、磁场、电场、声辐射(sonic radiation)、或生化分子浓度。在优选的实施方式中，将所述环境敏感性水凝胶施加至所述过滤器，包括将具有至少部分溶胶形式的环境敏感性水凝胶的溶液施加至所述过滤器；并且通过施以所述环境变化使所述溶液凝胶化。

[0016] 在优选的实施方式中，所述水凝胶为水凝胶颗粒。优选地，所述水凝胶颗粒通过例如以下方法施加：吸附、抽吸、过滤或浸泡和喷射所述水凝胶颗粒的悬浮液。在优选的实施方式中，所述水凝胶颗粒小于过滤器孔，由此有效地占据过滤器孔。

[0017] 在优选的实施方式中，所述水凝胶以脱水形式施加至所述过滤器孔，并且然后在所述过滤器孔内部水合。优选地，所述脱水水凝胶的水合花费1分钟至6小时的时间。优选地，将脱水水凝胶在溶液中施加至所述过滤器孔，并且在所述孔内通过温育1分钟至6小时来水合。

[0018] 在优选的实施方式中，施加至过滤器的聚合物为粘性聚合物溶液。使所述粘性聚合物溶液流入所述过滤器，由此填充所述孔并有效地使微生物的生长局部化。优选地，粘性聚合物溶液包括水溶性聚合物或水凝胶悬浮液。

[0019] 在优选的实施方式中，施加至过滤器的微生物检测试剂包含生长介质，所述生长介质构造为选择性地促进微生物的生长。优选地，所述生长介质包括选择性试剂或抗生素，微生物对所述选择性试剂或抗生素是抗性的，但其它有机体对其是无抗性的；经选择的pH和温度，用于使微生物快速生长和/或减缓或抑制其它有机体的生长；或营养物，其易于被微生物代谢，但不易于被其它有机体代谢。在某些优选的实施方式中，所述生长介质包括充足的氧气以用于好氧菌的生长或不充足的氧气以用于厌氧菌的生长。

[0020] 在优选的实施方式中，所述检测步骤包括检测来自信号试剂(signaling reagent)的信号，所述信号试剂构造为在微生物的存在下产生信号，并且由此检测微生物。优选地，所述信号试剂为对微生物特异的酶的底物，对微生物特异的酶的发色或荧光底物，或对微生物特异的酶的底物与发色或荧光指示剂的组合，以检测所述底物的消化。

[0021] 在某些优选的实施方式中，所述信号试剂为识别微生物或微生物的细胞组分的试剂，例如抗体、抗原、适配体、蛋白质、核酸或碳水化合物。优选地，所述试剂具有例如来自以下的标记：染料分子、金属胶体、聚合物颗粒、磁性颗粒、半导体颗粒、脂质体、聚合物组装聚集体(polymersome)、蛋白质、酶或核酸。

[0022] 本发明的备选实施方式涉及这样的方法，其包括从颗粒样品中通过用分层的复合过滤器(layered filter composite)过滤所述颗粒样品来分离微生物，所述分层的复合过滤器具有过滤器，其构造为吸引微生物并且具有构造为防止过滤期间堵塞的孔；并且还包括多孔球形微珠层。优选地，所述方法包括检测固定在所述过滤器中的微生物。

[0023] 本发明的实施方式还可以包括在上述方法中的过滤步骤后将所述过滤器洗涤一段时间，该段时间对除去抑制微生物的检测或生长的物质而言是足够的。

[0024] 在优选的实施方式中，在所述方法中的过滤器为具有纤维材料的深度过滤器。优选地，所述纤维材料为纤维素纤维或玻璃微纤维。

[0025] 优选地，所述过滤器构造为通过相互作用例如静电、亲水、疏水、物理或生物相互作用吸引微生物。在优选的实施方式中，将识别微生物的试剂特异性或非特异性地固定在过滤器基体上。所述试剂可以为抗体、抗原、适配体、蛋白质、核酸或碳水化合物。

[0026] 在优选的实施方式中，在上述方法中的过滤器进一步包括多孔球形微珠层。在某些优选的实施方式中，将所述多孔球形微珠层置于所述过滤器的上游表面上。在某些优选的实施方式中，将所述多孔球形微珠层置于网筛载体(mesh support)的上游表面上。所述网筛载体置于所述过滤器上或所述过滤器的上游。

[0027] 在优选的实施方式中，所述多孔球形微珠层形成均匀层或梯度层。优选地，所述多孔球形微珠层的表面为高度惰性，并且与微生物具有低的非特异性结合。

[0028] 在优选的实施方式中，所述微珠的直径为1至1000μm，更优选所述微珠的直径为15至600μm，还更优选所述微珠的直径为50至300μm。优选地，所述微珠的孔径小于微生物的大小，并且微生物在所述过滤步骤期间在所述微珠之间通过(pass among)。在某些优选的实施方式中，所述微珠包括交联亲水性聚合物。

[0029] 在某些优选的实施方式中，将所述多孔球形微珠层在过滤步骤后通过添加洗涤介质破坏，然后使所述微珠悬浮；并且用所述过滤器过滤所述洗涤介质。

[0030] 本发明的实施方式涉及用于检测微生物的试剂盒，其包括一种或多种以下组分：

[0031] 过滤器，其构造为吸引微生物并且具有构造为防止过滤期间堵塞的孔；

[0032] 微生物检测试剂，其构造为检测微生物的存在；和

[0033] 聚合物，其构造为使微生物的生长局部化和/或防止微生物检测试剂的蒸发。

[0034] 在优选的实施方式中，所述过滤器为具有纤维材料的深度过滤器。优选地，所述纤维材料选自纤维素纤维和玻璃微纤维。

[0035] 优选地，所述过滤器构造为通过相互作用例如静电、亲水、疏水、物理和生物相互作用吸引微生物。

[0036] 在优选的实施方式中，将识别微生物的检测试剂特异性或非特异性地固定在所述过滤器基体上。所述试剂优选为抗体、抗原、适配体、蛋白质、核酸或碳水化合物。

[0037] 在优选的实施方式中，所述试剂盒的聚合物成分为水凝胶。优选地，所述水凝胶为环境敏感性水凝胶，其至少部分为溶胶形式。所述环境敏感性水凝胶在施以环境变化前具有低粘度，并且当施以环境变化时至少部分地变成具有增加的粘度的凝胶形式。优选地，所述环境变化为温度、pH、入射光的量、离子浓度、压力、磁场、电场、声辐射、或生化分子浓度上的变化。

[0038] 在优选的实施方式中，所述水凝胶为水凝胶颗粒。优选地，所述水凝胶颗粒小于所述过滤器孔，由此有效地占据所述过滤器孔。更优选地，所述水凝胶可以为脱水形式。

[0039] 在优选的实施方式中，所述试剂盒中的过滤器还包括多孔球形微珠层。在某些优选的实施方式中，将所述多孔球形微珠层置于所述过滤器的上游表面上。在某些优选的实施方式中，将所述多孔球形微珠层置于网筛载体的上游表面上，并且将所述网筛载体置于所述过滤器上或所述过滤器的上游。

[0040] 在优选的实施方式中，所述多孔球形微珠层形成均匀层或梯度层。在优选的实施方式中，所述多孔球形微珠层的表面为高度惰性，并且与微生物具有低的非特异性结合。

[0041] 在优选的实施方式中，所述微珠的直径为1至1000μm，更优选所述微珠的直径为15至600μm，还更优选所述微珠的直径为50至300μm。

[0042] 在优选的实施方式中，所述微珠的孔径小于微生物的尺寸，由此微生物在过滤步骤期间在所述微珠之间通过。在某些优选的实施方式中，所述微珠包括交联亲水性聚合物。

[0043] 在优选的实施方式中，在所述试剂盒中的微生物检测试剂包含生长介质，所述生长介质构造为选择性地促进微生物的生长。优选地，所述生长介质包括选择性试剂或抗生素，微生物对所述选择性试剂或抗生素是有抗性的，但其它有机体对其是无抗性的；经选择的pH和温度，用于使微生物快速生长和/或减缓或抑制其它有机体的生长；或营养物，其易于被所述有机体代谢，但不易于被其它微生物代谢。在某些优选地实施方式中，所述生长介质包括充足的氧气以用于好氧菌的生长或不充足的氧气以用于厌氧菌的生长。

[0044] 在优选的实施方式中，所述生长介质包括信号试剂，所述信号试剂构造为在微生物的存在下产生信号，并且由此检测微生物。优选地，所述信号试剂为对微生物特异的酶，对微生物特异的酶的发色或荧光底物，或对微生物特异的酶的底物与发色或荧光指示剂的组合，以检测所述底物的消化。

[0045] 在某些优选的实施方式中，所述信号试剂为识别微生物或微生物的细胞成分的试剂，例如抗体、抗原、适配体、蛋白质、核酸或碳水化合物，并且所述试剂优选包括例如以下的标记：染料分子、金属胶体、聚合物颗粒、磁性颗粒、半导体颗粒、脂质体、聚合物组装聚集体、蛋白质、酶和核酸。

[0046] 本发明的实施方式涉及用于检测微生物的分层的复合过滤器，其包括过滤器介质，构造为吸引微生物并且具有构造为防止过滤期间堵塞的孔；以及多孔球形微珠层。

[0047] 在优选的实施方式中，在所述分层的复合过滤器中的过滤介质为具有纤维材料的深度过滤器。优选地，所述纤维材料为纤维素纤维或玻璃微纤维。

[0048] 在优选的实施方式中，所述分层的复合过滤器的过滤介质构造为通过相互作用例如静电、亲水、疏水、物理和生物相互作用吸引微生物。在优选的实施方式中，将识别微生物的试剂特异性或非特异性地固定在过滤器基体上，并且所述试剂选自抗体、抗原、适配体、蛋白质、核酸和碳水化合物。

[0049] 在优选的实施方式中，将在所述分层的复合过滤器中的多孔球形微珠层置于所述过滤器的上游表面上。在其它优选的实施方式中，将所述多孔球形微珠层置于网筛载体的上游表面上，并且将所述网筛载体置于所述过滤器上或所述过滤器的上游。优选地，所述多孔球形微珠的层形成均匀的或梯度的层。优选地，所述多孔球形微珠的层的表面为高度惰性，并且与微生物具有低的非特异性结合。

[0050] 在优选的实施方式中，所述微珠的直径为1至1000μm，更优选所述微珠的直径为15至600μm，还更优选所述微珠的直径为50至300μm。在优选的实施方式中，所述微珠的孔径小于微生物的尺寸，由此微生物在过滤步骤期间在所述微珠之间通过。在某些实施方式中，所述微珠包括交联亲水性聚合物。

[0051] 本发明的实施方式涉及多孔过滤器，其包括三维聚合物网络的水凝胶，其可以膨胀，但不溶于水；以及构造为吸引微生物并且具有构造为过滤期间防止堵塞的孔的过滤器。

[0052] 在优选的实施方式中，所述多孔过滤器的水凝胶为脱水形式。

[0053] 在优选的实施方式中，所述过滤器具有包括纤维材料的过滤器基体。

[0054] 在优选的实施方式中，所述三维聚合物网络的水凝胶包括聚合物例如琼脂、壳聚糖、纤维素、角叉菜胶、藻酸盐、丙烯酸酯聚合物和共聚物、聚乙二醇、聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、果胶、刺槐豆胶、聚羟基丁酯(PHB)、聚羟基戊酯(PHV)、聚己内酯、聚二氧杂环己酮、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、聚(氨基酸)、聚(原酸酯)、聚磷腈、聚(富马酸丙二醇酯)、聚(草酸亚烷基酯)(poly(alkylene oxalates))、硅酮聚合物、胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝胶、淀粉、直链淀粉、右旋糖苷、丝、角蛋白、弹性蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、糖胺聚糖或聚乙烯醇。

[0055] 在优选的实施方式中，所述过滤器被构造为通过例如静电、亲水、疏水、物理和生物相互作用吸引微生物。

[0056] 在优选的实施方式中，将识别微生物的试剂特异性或非特异性地固定在过滤器基体上。优选地，所述试剂选自金属氢氧化物或金属氧化物、抗体、抗原、适配体、蛋白质、核酸或碳水化合物。优选地，所述金属氢氧化物或金属氧化物为氢氧化锆、氢氧化钛、氧化铪、羟基磷灰石、氧化铁、氧化钛或氧化铝。

[0057] 在优选的实施方式中，所述过滤器包含微生物检测试剂，并且在过滤包含微生物的样品期间保留微生物检测试剂。优选地，微生物检测试剂包括生长介质，其构造为选择性地促进要检测的微生物的生长；和信号试剂，其构造为在微生物的存在下产生信号。优选地，所述生长介质包括选择性试剂或抗生素，微生物对所述选择性试剂或抗生素是有抗性的，但其它有机体对其是无抗性的；经选择的pH和温度，用于使微生物快速生长和/或减缓或抑制其它有机体的生长；或营养物，其易于被微生物代谢，但不易于被其它有机体代谢。在某些优选的实施方式中，所述生长介质具有充足的氧气以用于好氧菌的生长或不充足的氧气以用于厌氧菌的生长。

[0058] 在优选的实施方式中，所述信号试剂选自对微生物特异的酶的底物，对微生物特异的酶的发色或荧光底物，和对微生物特异的酶的底物与发色或荧光指示剂的组合，以检测所述底物的消化。

[0059] 在优选的实施方式中，所述信号试剂为识别微生物或微生物的细胞成分的试剂，例如抗体、抗原、适配体、蛋白质、核酸和碳水化合物。优选地，所述试剂包括例如以下的标记：染料分子、金属胶体、聚合物颗粒、磁性颗粒、半导体颗粒、脂质体、聚合物组装聚集体、蛋白质、酶或核酸。

[0060] 本发明的实施方式涉及上述多孔过滤器在检测样品中的微生物上的用途，具有一步或多步以下步骤：

[0061] 通过使所述样品过滤通过所述多孔过滤器来固定微生物；

[0062] 将所述过滤器温育充足的一段时间以使微生物生长至可检测水平；和

[0063] 使用信号试剂检测微生物。

[0064] 在某些优选的实施方式中，所述多孔过滤器在过滤后是可溶的。例如，所述多孔过滤器可以包括可降解聚合物。优选地，所述可降解聚合物以例如以下形式提供：纤维、表面涂层、珠、颗粒、薄片(sheet)或层。在某些优选的实施方式中，所述可降解聚合物经由水解、氧化或酶解机制变成溶液。

[0065] 在某些实施方式中，所述可降解多孔过滤器用于通过以下步骤的一步或多步检测样品中的微生物：

[0066] a)通过使所述样品过滤通过所述过滤器来固定微生物；

[0067] b)将所述可降解过滤器降解以变成溶液；

[0068] c)从所述溶液中提取微生物或对微生物特异的分子标记；和

[0069] d)检测微生物或微生物特异性分子标记，由此确认在样品中微生物的存在。

[0070] 从以下优选实施方式的详细描述，本发明进一步的方面、特征和优点将变得明显。

附图说明

[0071] 现在本发明的这些和其它特征将参考优选实施方式的图进行描述，所述优选实施方式旨在描述本发明而不是限制本发明。

[0072] 图1显示多孔球形珠辅助过滤的示意性描述。

[0073] 图2显示使用环境敏感性水凝胶的病原体检测检验的步骤的示意性描述。

[0074] 图3显示使用水凝胶微珠的病原体检测检验的步骤的示意性描述。

[0075] 图4A至4D显示水凝胶复合过滤器的各种构造。图4A显示其中水凝胶位于过滤器基体层之间的实施方式。图4B显示其中水凝胶颗粒位于过滤器基体层之间的实施方式。图4C显示其中水凝胶颗粒分散在整个过滤器基体的实施方式。图4D显示其中水凝胶纤维形成过滤器基体的实施方式。

[0076] 图5显示包括其中引入病原体检测试剂的智能水凝胶颗粒(smarthydrogel particles)的复合水凝胶过滤器。

[0077] 图6A至6C显示可降解过滤器的各种构造。图6A显示其中滤膜由可降解颗粒制成的实施方式。图6B显示其中滤膜由可降解纤维制成的实施方式。图6C显示其中滤膜由具有可降解涂层的水溶性颗粒制成的实施方式。

[0078] 图7图解地显示使用可降解过滤器的检验以收集和检测所述病原体。

[0079] 图8显示对于使用玻璃纤维深度过滤器过滤的250mL 10％全乳样品的病原体检测检验的结果。图8A和8B显示用200cfu李斯特菌(Listeria)细胞接种的乳样品在30℃下在40小时的温育后的结果。图8C和8D显示对于不使用李斯特菌细胞的乳样品在30℃下在40小时的温育后的结果。

[0080] 图9显示水凝胶微粒的显微图像。为了更高的对比将微粒用台盼蓝染色。

[0081] 图10A至E显示对于用正电性过滤器过滤的每10mL BHI肉汤235，23.5，2.35，0.235，和0cfu李斯特菌细胞的病原体检测检验的结果。

[0082] 图11显示10％熟食肉(deli meat)(A)和10％棒状干酪(stickcheese)匀浆(B)的过滤速度，使用具有2g多孔微珠的正电性深度过滤器(●)，具有15g非多孔玻璃珠的正电性深度过滤器(■)，和无助滤剂的正电性深度过滤器(▲)。

[0083] 图12显示10％熟食肉(A)和10％法兰克福香肠匀浆(B)的过滤速度，使用具有几种等级的多孔球形微珠助滤剂的玻璃纤维深度过滤器：交联聚甲基丙烯酸酯微珠(45-90μm直径：0.5g(○)，1.0g(●))和交联右旋糖酐微珠(17-70μm直径：0.5g(□)，35-140μm直径：0.5g(◇)，86-258μm直径：0.5g(△)，1.0g(▲)，170-520μm直径：
0.5g(×))。

[0084] 图13显示对于使用玻璃纤维深度过滤器和多孔微珠助滤剂过滤的每～225mL10％熟食肉匀浆(25g熟食肉)220cfu(图13A，13B)，22cfu(图13C，13D)，和0cfu(图13E，
13F)李斯特菌细胞的病原体检测检验的结果。图13A，13C和13E显示在30℃下24小时的温育后的结果，并且图13B，13D和13F显示40小时的温育后的结果。

[0085] 图14显示在用玻璃纤维深度过滤器和多孔微珠助滤剂过滤的～225mL 10％熟食肉匀浆(25g熟食肉)中的病原体检测检验的结果。A.从过滤器的上游(顶部)和下游侧(底部)观察的有色斑点的数量总结于该表。B.将观察的有色斑点的总数针对接种的病原体浓度绘图。封闭和开放的圆分别表示单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)和无害李斯特菌(Listeria innocua)。

[0086] 图15显示制作的过滤器上的检验的结果，显示温育后在过滤器上发现的李斯特菌细胞。

[0087] 图16显示具有通过智能水凝胶固定的病原体检测试剂的复合过滤器上的检验的结果。

[0088] 图17显示用于病原体检测的可降解过滤器上的检验的PCR结果。循环表示PCR循环的数量，ΔRN表示减去基线强度后在各反应中的标准化的相对荧光强度。

具体实施方式

[0089] 尽管所述实施方式代表本发明的优选实施方式，应该理解对本领域技术人员而言在不背离本发明的精神的情况下可以出现改进。因此本发明的范围仅由所附权利要求确定。

[0090] 本申请涉及这样的方法，其允许低成本和短实际操作时间(hands-on time)地在大体积颗粒样品中灵敏检测病原体，涉及在所述方法中使用的过滤器的制作，以及涉及所述多孔球形微珠助滤剂在所述方法中的用途。

[0091] 使用高度多孔过滤器、多孔球形微珠助滤剂和水凝胶材料的病原体检测的过滤检验

[0092] 在一种实施方式中，所述方法使用具有病原体吸附能力和高纳污能力的高度多孔过滤器，以有效地从大体积颗粒样品中浓缩病原体。用于所述方法的实施方式中的高度多孔过滤器可以通过静电、亲水、疏水、物理或生物相互作用吸引靶病原体，以及还可以是足够多孔的以防止过滤器被颗粒样品堵塞。在特定实施方式中，所采用的过滤器为具有三维基体的深度过滤器，其提供高纳污能力和捕获病原体的能力。有用的深度过滤器可以由纤维材料例如玻璃纤维和硝酸纤维素纤维制成，并且包含单层或具有相同或不同的颗粒截留率的多层过滤器。所述过滤器具有合适的颗粒截留率和厚度以有效地捕获病原体和以避免由于在所述样品中的颗粒导致的过滤器堵塞。例如，为了捕获在深度过滤器中的病原体例如李斯特菌(其长度上0.5-2μm，直径上0.4-0.5μm)，深度过滤器的合适颗粒截留率可以为0.1至10μm，优选0.7至2.4μm。同样地，所述过滤器具有充足的机械强度以耐受过滤期间施加的真空力或压力。

[0093] 在其它实施方式中，所述过滤器为深度过滤器，其使用正电性电荷(electropositive charge)以吸引病原体，因为病原体表面通常具有由于其中包含的脂多糖、磷壁酸和表面蛋白而导致的净负电荷。所述病原体可以通过正电性电荷而不是通过过滤器基体固定在所述过滤器上，从而使其可以进一步增加过滤器多孔性和获得更高的纳污能力以更有效地避免过滤器堵塞。正电性电荷可以通过将过滤器基体用阳离子分子表面涂层或通过引入由正电性材料制成的正电性胶体、颗粒或纤维来提供。正电性材料的实例为金属氢氧化物和金属氧化物，例如氢氧化锆、氢氧化钛、氧化铪、氧化铁、氧化钛、氧化铝和羟基磷灰石。优选地，所述金属氢氧化物或金属氧化物的等电点可以比所述样品和检测试剂的pH值高。存在少数带正电细菌的罕见例子，例如嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。此类微生物通过具有负电性电荷的过滤器更易于被截留，其可以以与上述正电性过滤器类似的方式使用负电性电荷而不是正电性电荷制备。

[0094] 在其它实施方式中，所述过滤器包括病原体识别试剂例如抗体、抗原、蛋白质、核酸、碳水化合物、适配体或噬菌体。与在所述样品中发现的其它微生物相比(vis-à-vis)这些病原体识别试剂可以选择性或非选择性地识别病原体，并且可以通过化学结合、物理结合或其它标准固定方法固定在过滤器基体上。在特定实施方式中，所述病原体识别试剂为toll样受体(toll-like receptor)(TLR)，其识别在各种微生物表面上呈递的结构保守性分子。TLR2可以识别革兰氏阳性肽聚糖和脂磷壁酸质，并且TLR4可以识别革兰氏阴性细菌上的脂多糖。

[0095] 除了所述过滤器之外，本申请涉及使用多孔球形微珠助滤剂以防止过滤器被待测试的样品中的颗粒堵塞(图1)。使用的微珠可以为具有小尺寸分布的球形、类球形(spheroidally)或椭球形多孔微珠。所述微珠可以采用最严密堆积结构例如立方最严密堆积结构和六方(hexagonal)最严密堆积结构或与其接近的结构。所述微珠典型地可以具有1至1000μm，优选15至600μm，更优选50至300μm的直径，以使待测试的病原体在样品过滤期间在所述微珠之间穿过。有用的微珠具有合适的比重以悬浮在而不是漂浮在水、缓冲液、生长介质或样品溶液中。所述微珠可以典型地具有比靶病原体小的孔，由此防止所述病原体在样品过滤期间被捕获在所述多孔球形微珠的孔的内部。优选地，所述微珠可以具有惰性表面，优选亲水性表面，并且与生物分子和微生物(包括蛋白质，核酸、碳水化合物、细菌、病毒和细胞)具有低的非特异性结合。在特定实施方式中，所述微珠助滤剂由交联聚合物例如聚甲基丙烯酸酯和右旋糖酐制成。任选地，由于其多孔结构所述微珠可以除去可能抑制下游检测反应的材料。

[0096] 多孔球形微珠助滤剂可用于至少以以下方式或其组合辅助过滤大体积颗粒样品。在样品过滤前助滤剂可以作为多孔球形微珠的均匀层或梯度层置于具有病原体吸附能力的高度多孔过滤器的上游表面上。作为选择，可以在过滤前将助滤剂添加至颗粒样品并在样品过滤期间形成多孔球形微珠层，由此连续地提供新微珠层，并进一步改进过滤。网筛载体可以置于所述高度多孔过滤器和所述助滤剂层之间以在样品过滤后容易地除去所述助滤剂层。任选地，在使用前将所述多孔微珠助滤剂预温育或悬浮在包含阻断试剂(例如肽或蛋白质)的溶液中，以使病原体与所述微珠表面的结合最小化。

[0097] 待检测的病原体可以在所述微珠之间通过，并且可以不被捕获在所述微珠的表面上或孔中。另一方面，在样品中的颗粒，其典型地堵塞没有助滤剂层的过滤器，可以被捕获在所述微珠表面上和所述多孔球形微珠之间的间隙中。由于所述微珠的多孔结构，过滤期间所述样品流不仅在所述珠之间通过，还渗透所述微珠本身，因此所述样品颗粒趋于被捕获在所述珠表面上而不是在所述珠的间隙中，并且由此所述多孔球形助滤剂层可以提供高纳污能力和防止过滤大体积颗粒样品期间过滤器堵塞。将样品完全过滤之后，可以破坏所述助滤剂层，并且使所述微珠可以悬浮在洗涤溶液中，可以将所述洗涤溶液过滤以收集在所述颗粒样品的起始过滤期间可能在助滤剂层中捕获的病原体，由此提高过滤器中病原体的固定化率。该洗涤过程可以重复几次以最大化在所述过滤器中的病原体回收率。所述洗涤溶液典型地为对病原体无害的缓冲液或生长介质。

[0098] 除了所述过滤器和助滤剂之外，本申请涉及使用聚合物材料以防止病原体检测反应期间病原体检测试剂的蒸发并使所述病原体在所述过滤器中的生长局部化。有用的聚合物材料包括天然或合成聚合物例如多糖和蛋白质。所述聚合物材料的一些实例包括，但不限于，琼脂、藻酸盐、角叉菜胶、纤维素、壳聚糖、右旋糖酐、果胶、胶原、纤维蛋白原、丙烯酸酯聚合物、聚乙二醇、聚乙烯醇包括它们的衍生物和共聚物。所述聚合物材料可以优选通过分子内-和/或分子间交联形成水凝胶。水凝胶为三维聚合物网络，其可以在水中膨胀但不溶于水，并且其可以保持水或溶液特定的时间段不蒸发。

[0099] 在特定实施方式中，所述水凝胶为环境敏感性水凝胶。有用的环境敏感性水凝胶可以响应一种或多种环境刺激例如温度、pH、光、离子、压力、磁场、电场、声辐射、或生化分子。当环境敏感性水凝胶为溶胶形式时，所述材料以水溶性聚合物的形式，然而，作为施加刺激的结果，所述材料转化成凝胶形式(水凝胶)并且变为水不溶性和分子内或分子间交联的。溶胶和凝胶形式的转化可以完全地或部分地发生。在特定实施方式中，所述环境敏感性水凝胶和环境刺激对病原体无害，特别是当要检测活病原体时。在特定实施方式中，所述溶胶形式不过度粘以容易地流入过滤器孔以便容易地填充所述孔，并且所述凝胶形式防止病原体检测试剂的蒸发和有效地使病原体的生长局部化。所述环境敏感性水凝胶的一些实例包括，但不限于，琼脂糖、低熔点琼脂糖、角叉菜胶、果胶、甲基纤维素和Pluronic F127。琼脂糖在～45℃下为溶胶形式并且当冷却至～37℃时为凝胶。低熔点琼脂糖在～37℃下为溶胶形式并且当在～20℃下为凝胶。角叉菜胶和果胶在不存在特定离子例如钾和钙时为溶胶形式并且当添加这些离子时为凝胶。甲基纤维素和Pluronic F127在～4℃下为溶胶形式并且加热至～37℃后为凝胶。在特定实施方式中，对于不同的水凝胶，合适的水凝胶浓度可以变化。在特定实施方式中，琼脂糖或低熔点琼脂糖的合适浓度为0.01％至30％，优选0.1％至10％，且更优选0.5％至5％。在特定实施方式中，在样品过滤后通过吸附、抽吸、毛细作用、过滤、浸渍、喷雾或其它技术，溶胶形式可以施加至所述深度过滤器孔，并且通过环境刺激转化成凝胶形式。

[0100] 在特定实施方式中，所述过滤器孔在样品过滤后填充有水凝胶颗粒。所述水凝胶颗粒可以为单分散或多分散的。水凝胶颗粒的有用几何构型包括，但不限于，球形、四面体、六面体、多面体或柱体。然而，可以使用任何规则或不规则形状。为了用水凝胶颗粒有效地填充所述过滤器孔，所述水凝胶颗粒可以比所述过滤器孔小以进入所述过滤器孔。任选地，所述水凝胶颗粒可以足够大以截留在所述过滤器中并且可以大于所述高度多孔过滤器的截留率。可以通过吸附、抽吸、毛细作用、过滤、浸渍、喷雾或其它技术将水凝胶颗粒施加入所述过滤器孔。有用的水凝胶颗粒可以通过几种传统技术合成或制备，例如模塑、乳液聚合/凝胶化、沉淀聚合、膜乳化、切割、剪切和研磨。在某些实施方式中，所述水凝胶颗粒由琼脂糖凝胶制成，并且合适的琼脂糖浓度为0.01％至10％(w/v)，更优选0.1％至5％(w/v)。

[0101] 在特定实施方式中，所述过滤器孔充满脱水水凝胶的水合作用。当脱水水凝胶在水合情况下膨胀时，水凝胶体积显著地增加。脱水水凝胶可以通过吸附、抽吸、毛细作用、过滤、浸渍、喷雾或其它技术施加到所述过滤器孔，并且所述脱水水凝胶的水合可以在施加溶液例如水、缓冲液或生长介质后完成。在特定实施方式中，所述脱水水凝胶可以为单分散或多分散的颗粒，并且所述脱水水凝胶颗粒的尺寸可以足够小以有效地进入所述过滤器孔。脱水水凝胶颗粒可以通过将水凝胶颗粒通过加热、干燥、冷冻干燥和任何其它技术脱水来制备。在特定实施方式中，脱水水凝胶颗粒的水合作用耗费10秒至6小时，更优选1至30分钟的时间，由此悬浮在溶液中的脱水水凝胶颗粒可以在水合前通过上述技术施加至所述过滤器孔，然后通过温育在所述孔内部水合。

[0102] 在特定实施方式中，所述过滤器孔填充有粘性聚合物溶液，其可以不过粘以容易地流入所述过滤器孔以便容易地填充所述孔，但足够粘以有效地使所述病原体的生长局部化。所述聚合物溶液可以包括水溶性聚合物或水凝胶悬浮液。

[0103] 在特定实施方式中，所述病原体检测试剂包含用于病原体的生长介质。所述生长介质通常包括一种或几种用于病原体生长的碳源、氮源、氨基酸和各种盐。在特定实施方式中，所述生长介质可以为选择性培养基，其通过抗菌/抗真菌效应、温度或pH抗性、或合成特定代谢产物的能力，选择性地促进特定病原体的生长，由此允许所述病原体与其它竞争性细菌或微生物相比选择性地生长。在某些实施方式中，所述病原体检测试剂可以包含化合物例如L-半胱氨酸和Oxyrase(Oxyrase Inc.，Mansfield，OH)以促进特定病原体的生长或通过降低在所述生长介质中的氧气浓度使受损的病原体复苏。

[0104] 在某些实施方式中，所述病原体检测试剂可以包含信号试剂，其将病原体与其它细菌或微生物区分开。所述信号试剂的一个实例为病原体-特异性酶的发色或荧光底物。所述底物的实例包括：X-，Lapis-，Magenta-，Salmon-，Green-，ONP-和MU-联底物例如β-D-葡糖苷酸，β-D-吡喃半乳糖苷，β-D-吡喃葡萄糖苷，N-乙酰-β-D-氨基半乳糖苷，N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷，辛酸盐(酯)-壬酸盐(酯)，丁酸盐(酯)，肌醇-1-磷酸(myo-inositol-1-phosphate)，和磷酸盐(酯)。所述信号试剂的另一实例为pH指示剂例如酚红与病原体-特异性酶的底物例如木糖的组合。底物的代谢改变所述检测试剂的pH，并且所述pH指示剂以比色方式指示pH变化。所述信号试剂的其它实例为核酸包括DNA，KNA，LNA，PNA或其它核酸、抗体、抗原或适配体以识别所述病原体或病原体特异性细胞成分。这些探针分子可以被以下标记以用于信号产生：荧光染料分子、金或银胶体、聚合物颗粒、磁性颗粒、半导体颗粒、量子点(quantum dot)、光子晶体颗粒、脂质体、聚合物组装聚集体、酶、蛋白质和核酸。

[0105] 在特定实施方式中，使用环境敏感性水凝胶在大体积颗粒样品中的病原体检测包括以下步骤(图2)：

[0106] (1)使可能包含要检测的病原体的大体积颗粒样品过滤通过分层的过滤器，所述分层的过滤器包括高度多孔过滤器和多孔微珠助滤剂，由此在所述过滤器中收集靶病原体。

[0107] (2)如果需要，将所述过滤器和所述多孔微珠助滤剂洗涤以使所述过滤器中的病原体的回收最大化并且除去病原体检测检验中的任何潜在的抑制剂。

[0108] (3)收集所述过滤器，并且施加溶胶形式的包含病原体检测试剂的环境敏感性水凝胶以通过吸附、浸渍、喷雾或其它技术填充所述过滤器孔。

[0109] (4)施以环境刺激以将所述环境敏感性水凝胶的溶胶形式转化为凝胶形式。

[0110] (5)将包含水凝胶的过滤器温育对病原体生长而言充足的一段时间以使所述病原体可检测。

[0111] (6)使用所述信号试剂检测经生长的病原体。

[0112] 在特定实施方式中，使用水凝胶颗粒在大体积颗粒样品中的病原体检测包括以下步骤(图3)：

[0113] (1)使可能包含要检测的病原体的大体积颗粒样品过滤通过分层的过滤器，所述分层的过滤器包括高度多孔过滤器和多孔微珠助滤剂，由此在所述过滤器中收集靶病原体。

[0114] (2)如果需要，将所述过滤器和/或所述多孔微珠助滤剂洗涤以使所述过滤器中的病原体的回收最大化并且除去病原体检测检验中的任何潜在的抑制剂。

[0115] (3)收集所述过滤器，并且施加包含病原体检测试剂的水凝胶颗粒以填充所述过滤器孔。

[0116] (4)将包含水凝胶-颗粒的过滤器温育对病原体生长而言充足的一段时间以使所述病原体可检测。

[0117] (5)使用所述信号试剂检测经生长的病原体。

[0118] 任选地，为了复苏和检测受损的病原体，在样品过滤和病原体检测前可以将所述颗粒样品在允许受损的病原体复苏的生长介质或溶液中制备和温育。作为选择，受损的病原体可以在样品过滤后直至温育在所述过滤器中复苏，其可以在允许受损的病原体复苏的生长介质、溶液或环境中完成，并且通过病原体检测试剂检测。作为选择，所述病原体检测试剂构造为使受损的病原体复苏，并且所述病原体检测试剂的浓度、成分或pH可以在温育期间通过用或不用本文所述的水凝胶材料补充附加的试剂例如抗生素，由此所述受损的病原体可以复苏和检测。

[0119] 所述颗粒样品的过滤和包含检测试剂的水凝胶的施加可能需要人工处理，并且这些过程可以在1小时内完成。这些过程可以使用标准自动化仪器容易地自动化。病原体生长和检测所需的温育时间依赖于病原体的倍增时间和所述信号试剂的敏感性。为了检测在所述过滤器中的单一病原体，所需的温育时间可以如表1中所示。即使当较不敏感的发色底物用于鉴定所述病原体时，总的检验也可以在24小时内完成，具有非常短的实际操作时间。

[0120] 表1检测单一病原体所需的温育时间

[0121]

[0122] 在特定实施方式中，备选的病原体检测检验可以在高度多孔过滤器中的病原体固定化后使用。一种有用的病原体检测方法为在具有病原体-特异性酶底物的不具有水凝胶的选择性培养基中的过滤器温育。发色或荧光酶底物，或pH指示剂例如酚红和病原体-特异性酶的底物例如木糖的组合，可以用于检测所述病原体。所述培养基的光密度、光吸收或荧光强度可以在所述温育后或整个温育期间(throughout)测定或监视，以检测所述病原体的存在，或在所述培养基中的生长的病原体可以通过传统的病原体检测检验来检测，例如聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合物链反应(RT-PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、环介导等温扩增(LAMP)、任何其它等温核酸扩增、酶联免疫吸附检验(ELISA)、免疫色谱、生物传感器或核酸探针。作为选择，所述病原体或指示所述特异性病原体的存在的所述病原体的细胞成分例如基因组DNA、核糖体RNA、转移RNA、信使RNA或蛋白质，可以利用洗涤剂、离液剂、有机溶剂或电泳破坏或不破坏所述过滤器结构地从过滤器中提取，并且使用传统的病原体检测方法检测。作为选择，在过滤器中固定的病原体可以通过将敏化剂(sensing agent)施加至所述过滤器来检测。有用的敏化剂还可以通过静电、亲水、疏水、物理或生物相互作用固定在所述过滤器内部。敏化剂的实例为在美国专利号6,087,114和Rider等人，″A B Cell-Based Sensor for RapidIdentification of Pathogens，″Science，301，213-15(2003)中公开的病原体-特异性抗体固定B-细胞。

[0123] 可以检测的病原体的实例包括病原性细菌和对人类、动物、植物、环境和/或工业是感染性或有害的其它微生物。病原性细菌的实例包括，但不限于埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、李斯特菌属(Listeria)、弯曲菌属(Campylobacter)、志贺氏菌属(Shigella)、布鲁氏菌属(Brucella)、螺杆菌属(Helicobactor)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)和假单胞菌属(Pseudomonas)。病原性病毒可以与本文描述的传统病原体检测方法组合来检测。病原性病毒科的实例包括，但不限于，腺病毒科(Adenoviridae)、小核醣核酸病毒科(Picornaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、黄 病 毒 科 (Flaviviridae)、逆 转 录 病 毒 科 (Retroviridae)、正 粘 病 毒 科(Orthomyxoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)和披膜病毒科(Togaviridae)。此外，所揭示的过滤系统对于在大体积颗粒样品中检测病原性和非病原性微生物这二者都是有用的。

[0124] 可以测试的颗粒样品的实例包括，但不限于，食品样品，食品样品的匀浆、食品样品的洗涤溶液、饮用水、海水/河水、环境水、泥和土壤。此外，擦拭各种环境表面的拭子、海绵和毛巾也可测试。此外，所揭示的过滤系统用于测试其它大体积颗粒样品包括人类体液、尿、血液和生产用水(manufacturing water)/溶液。样品，特别是固体形式，可以在样品过滤前被稀释、匀质化和/或用具有50-1000μm孔的筛过滤以更有效地过滤。

[0125] 用于病原体检测的复合水凝胶过滤器

[0126] 在特定实施方式中，水凝胶包括在具有病原体识别能力的高度多孔过滤器中以形成复合水凝胶过滤器。所述复合水凝胶过滤器可以以许多方式制作。在一种实施方式中，所述水凝胶或水凝胶颗粒可以置于所述过滤器基体的顶部、底部或内部，其包括纤维材料例如玻璃纤维或硝酸纤维素纤维。在另一实施方式中，所述过滤器基体由水凝胶纤维形成。由于水凝胶为三维聚合物网络，它们在其脱水状态下是高度多孔的。该多孔性可以根据用于产生所述水凝胶的聚合方法调整。在一种实施方式中，样品溶液可以在过滤期间渗透所述水凝胶内部的孔。在另一实施方式中，所述溶液可以过滤通过水凝胶颗粒之间的间隙。这样所述复合水凝胶过滤器在过滤期间不能被堵塞。复合水凝胶过滤器的各种实施方式图解于图4A-4D。

[0127] 在一种实施方式中，所述复合水凝胶过滤器包含在水凝胶内部或表面上的病原体检测试剂，并且甚至在将要测试的样品溶液过滤后仍有效地保持所述溶剂。在另一实施方式中，使用环境敏感性水凝胶(智能水凝胶)以保持和释放病原体检测试剂以便防止样品过滤期间所述病原体检测试剂的洗脱。所述智能水凝胶可以响应小的物理、生物或化学刺激，伴随着大的性质变化例如收缩、膨胀和在溶胶和凝胶形式之间转化。在该实施方式中，当其膨胀时将所述病原体检测试剂引入所述智能水凝胶。所述智能水凝胶在样品过滤期间不释放所述病原体检测试剂。当施以环境刺激以使所述智能水凝胶在过滤后收缩时，所述病原体检测试剂从所述智能水凝胶释放并且分散至整个过滤器(图5)。具有病原体检测试剂的智能水凝胶或水凝胶颗粒可以装配在所述过滤器基体的顶部、之间或遍及所述过滤器基体，如图4A-4C所示。在另一实施方式中，当智能水凝胶为溶胶形式时，引入所述病原体检测试剂。在样品过滤期间凝胶形式的智能水凝胶不释放所述病原体检测试剂。在过滤后当施以环境刺激以将所述智能水凝胶转化为溶胶形式时，所述病原体检测试剂从所述智能水凝胶释放并且分散至整个过滤器。

[0128] 使用包含病原体检测试剂的复合水凝胶过滤器在大体积颗粒样品中的病原体检测包括以下步骤，允许比图3中所示的方法更少的步骤：

[0129] (1)使可能包含要检测的病原体的大体积颗粒样品过滤通过复合水凝胶过滤器，由此在所述过滤器中收集靶病原体。

[0130] (2)如果需要，将所述过滤器洗涤以便除去病原体检测检验或病原体生长的任何潜在的抑制剂。

[0131] (3)将所述过滤器温育对病原体生长而言充足的一段时间以使所述病原体可检测。

[0132] (4)使用信号试剂检测经生长的病原体。

[0133] 可降解滤膜

[0134] 在特定实施方式中，具有病原体识别能力的高度多孔过滤器为在溶剂中可降解或可溶的以在样品过滤后有效地收集固定的病原体。可降解的过滤器在过滤前和期间保持完整，但是通过简单的处理后就是可降解的了。所述过滤器由可降解材料制成，例如合成的可降解或易受侵蚀聚合物或天然的可降解或易受侵蚀的聚合物或它们的共聚物。合成的可降解聚合物包括聚(乙醇酸)、聚(乳酸)、聚羟基丁酯(PHB)、聚羟基戊酯(PHV)、聚己内酯、聚二氧杂环己酮、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、聚(氨基酸)、聚(氨基酸)、聚(原酸酯)、聚磷腈、聚(富马酸丙二醇酯)，和它们的共聚物。天然聚合物包括胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝胶、纤维素、壳聚糖、淀粉、直链淀粉、藻酸盐、右旋糖苷、丝、角蛋白、弹性蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白、糖胺聚糖、角叉菜胶和它们的共聚物。所述过滤器的降解可以经由水解、氧化或酶促机制发生。

[0135] 可降解过滤器可以以许多方式制作。在一种实施方式中，过滤器由可降解聚合物组成，因此在过滤期间样品溶液可以渗透通过所述多孔可降解聚合物内部的孔。在另一实施方式中，滤膜由许多可降解聚合物颗粒组成，因此所述溶液可以过滤通过所述可降解聚合物颗粒之间的间隙。这样所述复合可降解过滤器在过滤期间不能堵塞。在另一实施方式中，过滤器由具有可降解聚合物涂层的水溶性聚合物组成。在另一实施方式中，过滤器由具有可降解聚合物涂层的许多水溶性聚合物颗粒组成。所述复合水凝胶过滤器的许多实施方式示于图6A-6C。

[0136] 使用包含病原体检测试剂的可降解过滤器在大体积颗粒样品中的病原体检测包括以下步骤(图7)：

[0137] (1)通过可降解过滤器过滤可能包含要检测的病原体的大体积颗粒样品，由此在所述过滤器中收集靶病原体。

[0138] (2)施加刺激以使所述过滤器变成溶液。

[0139] (3)从所述降解溶液收集所述病原体或病原体-特异性分子标记。

[0140] (4)检测所述病原体或病原体-特异性分子标记。

[0141] 实施例1：使用环境敏感性水凝胶在10％全乳中的病原体检测检验

[0142] 病原体检测检验在用各种剂量的李斯特菌细胞接种的250mL 10％全乳中进行。

[0143] 无害李斯特菌在BHI肉汤中在37℃下培养过夜；所述李斯特菌浓度在1/106稀释后通过集落计数来评估。10％全乳通过将25mL全乳稀释在225mL无菌PBS缓冲液(pH 7.4)中来制备。李斯特菌检测试剂如下制备：(1)将11.5g Fraser肉汤基础(Fraser Broth Base)(Oxoid，UK)和2g Bacto琼脂糖溶解于200mL蒸馏水中，在120℃下灭菌20分钟，并且在45℃下保持溶胶形式，和(2)向所述溶液补充1瓶/500mL的Fraser添加物(Oxoid，UK)和50mg/L X-葡糖苷(Sigma，MO)。

[0144] 所述病原体检测检验如下进行：(1)200cfu李斯特菌-接种的样品或李斯特菌阴性样品用GMF150 1μm(Whatman，NJ)通过真空过滤来过滤，(2)将GMF150 1μm过滤介质转移至无菌容器并且在45℃下保持5分钟，(3)在45℃下将所述过滤器在5mL李斯特菌检测试剂中浸泡5分钟，并且将所述李斯特菌检测试剂通过冷却至室温转化成凝胶形式，以及(4)使所述过滤器在30℃下温育过夜以检测李斯特菌细胞生长。

[0145] 24小时温育后，对于李斯特菌-阳性样品由于X-葡糖苷被李斯特菌细胞代谢而在所述过滤器中观察到集落样有色斑点。这些着色在40小时时比在24小时时变得暗得多，指示李斯特菌细胞的生长(图8A，8B)。相反，李斯特菌阴性样品不显示任何着色(图8C，8D)。

[0146] 实施例2：水凝胶颗粒的制备

[0147] 水凝胶颗粒使用油包水(W/O)乳液方法制备。将低熔点(LMP)琼脂糖(Invitrogen，Carlsbad，CA)溶液以3％的浓度(w/v)溶解于水中并且保持在55℃。1mL LMP琼脂糖溶液逐滴地混合入保持在55℃下的40ml矿物油，并且用磁性搅拌器剧烈地搅拌以形成W/O乳液。通过在搅拌同时使温度降至4℃，包含LMP琼脂糖的乳液凝胶化以形成LMP琼脂糖颗粒。所述琼脂糖颗粒用无菌水洗涤3次并且保持在4℃下直至使用。显微分析确认获得的琼脂糖颗粒在形状上为球形并且在直径上为5至50μm(图9)。

[0148] 实施例3：使用水凝胶微珠的病原体检测检验

[0149] 将无害李斯特菌在37℃下在BHI肉汤中新鲜地培养过夜。使琼脂糖颗粒(250μL当量)在室温下悬浮在5mL包含50mg/L X-葡糖苷，8g/L LiCl2和66.4μL/mL Rapid L.Mono Supplement 2(Biorad，CA)的无菌BHI肉汤中至少1个小时。

[0150] 包含李斯特菌细胞的连续稀释液的样品用47-mm Nanoceram过滤器(Argonide，FL)使用真空抽吸来过滤。包含悬浮的琼脂糖颗粒的溶液施加至所述过滤器的顶部，温育1分钟，并且使用真空抽吸过滤。将包含琼脂糖颗粒的过滤器在37℃下温育达2天，并且在17-至24-小时温育后通过肉眼观察指示李斯特菌生长的蓝色斑点。蓝色斑点的数量与在样品中接种的李斯特菌细胞的量有关(图10)。

[0151] 实施例4：食品匀浆的过滤

[0152] 食品匀浆的过滤速度在使用以下的Nanoceram过滤器(47-mm直径，Argonide，FL)或GMF150 1μm(Whatman，NJ)上来比较：0.5-1g多孔球形微珠(交联聚甲基丙烯酸酯，EG50OH，HitachiChemical，Japan)、0.5-2g多孔微珠(交联右旋糖苷，Sephadex G25，GE Healthcare，NJ)、15g非多孔助滤剂(玻璃珠，40μm直径，Filteraid 400，3M，MN)、或无助滤剂。在将所述食品匀浆过滤前将助滤剂沉积在所述Nanoceram过滤器或GMF150 1μm过滤器的上游表面上。

[0153] 食品匀浆如下制备：(1)使25g食品样品(熟食肉，法兰克福香肠或棒状干酪)与225mL蒸馏水混合，(2)将所述食品样品手动地或通过stomacher匀浆器(Seward，UK)在
230rpm下匀质化(stomached)2分钟，和(3)使用与stomacher匀浆器袋(Nasco，WI)连接的过滤器将食品匀浆分离。

[0154] 在10％熟食肉匀浆中，不使用助滤剂的Nanoceram过滤器(▲)被少于100mL的匀浆堵塞(图11A)。然而，使用玻璃珠(■)或多孔微珠助滤剂(交联右旋糖苷，2g，86-258μm)(●)允许全部225mL匀浆样品过滤而没有过滤器堵塞。使用多孔微珠助滤剂的过滤在5分钟内完成并且比使用玻璃珠助滤剂的过滤快得多。

[0155] 在10％干酪匀浆中，不使用助滤剂(▲)和使用玻璃珠助滤剂(■)的Nanoceram过滤器分别被少于5和75mL的匀浆堵塞(图11B)。然而，使用多孔微珠助滤剂(交联右旋糖苷，2g，86-258μm)(●)允许全部225mL匀浆在5分钟内过滤。

[0156] 几种等级的多孔球形微珠助滤剂的过滤性能使用10％熟食肉匀浆比较。在GMF150 1μm过滤器上评价交联聚甲基丙烯酸酯微珠(45-90μm直径：0.5g(○)，1.0g(●))和交联右旋糖苷微珠(17-70μm直径：0.5g(□)，35-140μm直径：0.5g(◇)，
86-258μm直径：0.5g(△)，1.0g(▲)，170-520μm直径：0.5g(×))(图12A)。全部225mL匀浆在5分钟内完全地过滤，除了具有170-520μm直径的交联右旋糖苷微珠。

[0157] 几种等级的多孔球形微珠助滤剂的过滤性能也使用10％法兰克福香肠匀浆比较。在GMF150 1μm过滤器上评价交联聚甲基丙烯酸酯微珠(45-90μm直径：0.5g(○))和交联右旋糖苷微珠(17-70μm直径：0.5g(□)，35-140μm直径：0.5g(◇)，86-258μm直径：0.5g(△)，170-520μm直径：0.5g(×))(图12B)。全部225mL匀浆在5分钟内完全地过滤。这些实验描述了多孔微珠助滤剂比传统的非多孔助滤剂的优越的纳污能力和过滤能力。

[0158] 实施例5：在225mL 10％熟食肉匀浆中的病原体检测检验

[0159] 病原体检测检验在用各种剂量的李斯特菌细胞接种的225mL 10％熟食肉匀浆中进行。

[0160] 单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和无害李斯特菌在37℃下在6
BHI肉汤中培养过夜，李斯特菌浓度在1/10 稀释后通过集落计数来评估。10％熟食肉匀浆如下制备：(1)将25g熟食肉与225mL无菌PBS缓冲液(pH 7.4)混合，(2)将熟食肉样品通过stomacher匀浆器(Seward，UK)在230rpm下匀质化2分钟，和(3)使用与stomacher匀浆器袋(Nasco，WI)连接的过滤器将熟食肉匀浆分离。在过滤前将熟食肉匀浆用各种剂量的李斯特菌细胞接种。多孔微珠助滤剂(交联右旋糖苷，86至258μm直径，Sephadex G25，GEHealthcare，NJ)悬浮在50g/L的BHI肉汤中并且在120℃下灭菌20分钟。李斯特菌检测试剂如下制备：(1)将11.5g Fraser肉汤基础(Fraser Broth Base)(Oxoid，UK)和
2g Bacto琼脂糖溶解于200mL蒸馏水中，在120℃下灭菌20分钟，并且在45℃下保持溶胶形式，和(2)向所述溶液补充1瓶/500mL的Fraser添加物(Oxoid，UK)和50mg/L X-葡糖苷(Sigma，MO)。

[0161] 病原体检测检验如下进行：(1)将0.5g多孔微珠助滤剂沉积在GMF150 1μm过滤介质(47-mm直径，Whatman，NJ)和聚乙烯筛网分离器(polyethylene mesh separator)(330μm直径孔)的顶部上，(2)将0.5g多孔微珠助滤剂与李斯特菌-接种的熟食肉匀浆混合，(3)将熟食肉匀浆通过真空过滤来过滤，(4)多孔微珠用20mL无菌PBS溶液(pH 7.4)彻底地洗涤3次，(5)将GMF150 1μm过滤介质转移至无菌容器并且在45℃下保持5分钟，(6)在45℃下将所述过滤器在5mL李斯特菌检测试剂中浸泡5分钟，并且将所述李斯特菌检测试剂通过冷却至室温转化成凝胶形式，以及(7)将所述过滤器在30℃下温育过夜以检测李斯特菌细胞生长。

[0162] 24小时温育后，由于X-葡糖苷被李斯特菌细胞代谢，在所述过滤器中观察到集落样有色斑点(图13A，13C)。这些着色在40小时时比在24小时时暗得多，指示了李斯特菌细胞的生长(图13B，13D)。相反，李斯特菌阴性样品甚至3天温育后也不显示任何着色(图13E，13F)。有色斑点的数量与接种的李斯特菌细胞的量密切相关，并且在来自～225mL10％熟食肉匀浆(25g熟食肉)的过滤介质中收集约60％的接种的李斯特菌细胞(图14A，
14B)。

[0163] 实施例6：复合水凝胶过滤器

[0164] 为了制作所述复合水凝胶过滤器，将包括氧化铝纳米纤维(病原体识别试剂)的47-mm Nanoceram过滤器(Argonide，FL)，用作基体以承载水凝胶。由于其低成本而使用琼脂水凝胶。新的过滤器通过将所述琼脂凝胶过滤通过所述Nanoceram过滤器来制作。由于病原体识别试剂(此处为氧化铝纳米颗粒)当它们用水凝胶涂布时，由于与病原体的静电相互作用的损失，通常可能变得功能失常，此处所述Nanoceram过滤器为由多个层组成的深度过滤器，并且顶层涂布有琼脂水凝胶以防止该问题发生。

[0165] 所述制作步骤如下讨论。将Nanoceram过滤器的顶层从主体膜(bulk membrane)剥离，并且将1％琼脂溶液倾倒在所述顶层上。然后将所述琼脂溶液在真空下过滤通过所述顶层以维持所述顶层的起始孔隙率。其后，将所述顶层在室温下风干并且通过将少量的水喷雾到其上并使用压缩机将所述层压缩在一起而重新整合入所述主体膜。将最后整合的滤膜在室温下干燥。

[0166] 制作的滤膜使用所述病原体溶液根据以下步骤测试：

[0167] (1)将滤膜用150ml无菌水洗涤。

[0168] (2)将在10mL BHI肉汤中的约103cfu李斯特菌细胞施加至所述过滤器并且在真空下过滤。

[0169] (3)过滤后，将5mL BHI肉汤和50mg/L X-葡糖苷(发色底物)施加至滤膜。

[0170] (4)将所述滤膜在37℃下温育15小时。

[0171] 图15图解说明了结果，着色指示了温育后在所述过滤器上发现的李斯特菌细胞的存在。

[0172] 实施例7：具有通过智能水凝胶固定的病原体检测试剂的复合水凝胶过滤器[0173] 使用热敏水凝胶，聚(N-异丙基丙烯酰胺)/壳聚糖，因为当温度达到37℃-温育温度时，其具有收缩的能力。合成包括以下步骤：

[0174] (1)将壳聚糖(0.03g)、乙酸(240μl)，和NIPAm(1.6g)溶解于蒸馏水(20mL)中。

[0175] (2)将交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(0.06g)，引发剂2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(0.01g)和催化剂N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(200μl)添加至所述溶液并且在氮气下脱气40分钟。

[0176] (3)使所述溶液在陪替氏培养皿中在365nm UV-光下光聚合2小时。

[0177] (4)将所述水凝胶于蒸馏水中浸泡3天，每天换水。

[0178] 将产生的智能水凝胶研磨成小颗粒并且在具有200mg/L X-葡糖苷(发色底物)的BHI肉汤中浸泡，并且在37℃和25℃之间加热/冷却几次。然后收集所述颗粒并使用水凝胶复合Nanoceram过滤器(如实施例6中所示)通过如图5中所示在顶层和主体层(bulk layer)之间添加智能水凝胶颗粒来整合。

[0179] 将干燥的滤膜使用病原体溶液根据以下步骤测试：

[0180] (1)将滤膜用150ml无菌水洗涤。

[0181] (2)将5mL在BHI肉汤中的～104cfu/mL李斯特菌细胞过滤。

[0182] (3)在密封容器中将所述过滤器在37℃下温育15小时。

[0183] 图16显示结果；在将待测试的样品过滤后，在不添加任何发色底物溶液的过滤器上发现着色。

[0184] 实施例8：可降解滤膜

[0185] 使用κ角叉菜胶和藻酸钠制作可降解过滤器。0.4g藻酸钠、0.2g κ角叉菜胶和0.2g Pluronic F127(表面活性剂)于90℃下溶解于30ml的蒸馏水，然后将100μl乙酸添加至所述溶液。将0.2g碳酸氢钠转移入所述溶液以产生气泡。形成泡沫溶液后，将10mL的所述溶液倾倒入直径60mm陪替氏培养皿中。当在陪替氏培养皿中的溶液冷却至室温时，形成多孔凝胶。然后将滤膜在0.5M CaCl2和0.5M KCl溶液中浸渍1小时以形成交联水凝胶结构。其后，所述交联水凝胶结构在真空下冷冻干燥以制备所述可降解水凝胶过滤器。

[0186] 我们使用可降解过滤器进行病原体检测检验。将用～109cfu无害李斯特菌接种的50mL PBS缓冲液过滤通过在真空抽吸下的所述可降解水凝胶过滤器。然后所述过滤器在10mL 100mM EDTA溶液中在80℃下温育15分钟以制备完全溶解的水凝胶过滤器。李斯特菌基因组DNA使用DNA Clean & Concentrator-5试剂盒(Zymo research，CA)按照说明手册从240μL的过滤器-溶解溶液中提取。提取的李斯特菌基因组DNA通过实时PCR在ABI7900(Applied biosystems，CA)上检测，阈值(Ct)下的循环数为23至24.5(图17)。另一方面，李斯特菌基因组DNA在阴性对照(10mL的李斯特菌阴性PBS缓冲液)中未检测出。

[0187] 本领域技术人员将理解，在不背离本发明的精神的情况下可以形成多种改进。因此，应该清楚地理解本发明的形式只是示例性的，并且不旨在限制本发明的范围。