一种培育大颗粒有核珍珠的方法

摘要

本发明属于养殖技术领域，涉及一种培育大颗粒有核珍珠的方法，为了解决现有培育有核珍珠的过程中，插入珠核后，珍珠培育生物(例如河蚌等)一般具有高吐珠率的问题，本发明提供了一种培育大颗粒有核珍珠的方法，该方法包括：a、从蚌体上获得外套膜外表皮细胞，b、用得到的外套膜外表皮细胞孵育珠核，得到孵育珠核，c、将孵育珠核植入育珠蚌内进行培育；其中c步骤分为①在育珠蚌内开一用于放置孵育珠核的囊袋；②将孵育珠核塞入囊袋，囊袋开口处用生物缝合线缝合；③对经②步骤处理后的育珠蚌进行培育，本发明方法能够顺利解决上述技术问题，并且能够使培育出来的珍珠的直径一般在10mm以上。

权利要求

1.一种培育大颗粒有核珍珠的方法，采用1龄左右健康、活力强的小蚌为外套膜外表皮组织的获取来源，该方法包括以下步骤： 第一、采用撕膜法分离河蚌的外套膜外表皮组织，所采用的撕膜法，能够使获得的外套膜组织成分单一，不含内表皮组织或细胞，从而有助于高纯度外套膜外表皮细胞的获得； 第二，在无菌室内，取外套膜外表皮组织在PBS溶液洗涤，其中PBS溶液含8g/L NaCl、

0.2g/L KCl、1.44g Na2HPO4/L和0.24g/L KH2PO4，pH为7.4，然后用PBS+200IU/mL双抗青霉素及链霉素、PBS+1000IU/mL双抗、PBS+200IU/mL双抗洗液的次序各冲洗组织一次，最后用PBS再次冲洗； 3

第三、取处理过的组织剪成2mm 大小的小块，用PBS冲洗小片2次，然后在组织小片中加入0.3％的胰酶消化液于37℃下消化30min，以完全培养基终止胰酶反应并分散细胞，静止10min后取水相，离心后收集细胞；用血球计数板对细胞悬液进行计数调整细胞数在

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5×10-1×10 个/mL，置于26℃、CO2恒温培养箱培养细胞；

第四、采用与珍珠同质的贝壳磨制的圆球形、扁平形珠核，直径为8mm，洗涤后高压蒸汽灭菌，干燥后用0.1mg/mL的多聚赖氨酸，分子量为15,000，浸泡8小时，取出珠核，使用恒温干燥箱在60℃下干燥，期间确保处理过程无菌污染，在细胞培养室内，用获得的外表皮细胞及培养液在CO2恒温培养箱内孵育处理的珠核，温度26℃，孵育时间为8h，用具体实施方式提供的判断标准进行判断，使珠核外充分附着大量的外套膜外表皮细胞；所述用具体实施方式提供的判断标准为孵育后的珠核在倒置显微镜下，技术人员能够观察到：外套膜外表面细胞已经铺满了珠核表面，形成单层细胞层，并且在水相中轻轻弹动珠核，细胞不会 从珠核上脱离； 第五、选取健康有活力的3龄育珠蚌，其长达到13cm、宽达到10cm、壳高达到3.5cm以上，清洗外壳泥土和藻类，开壳器开壳后用“U”型架支撑壳的开口，使用75％的酒精棉球对手术部位进行擦拭，用开口针在内脏团与斧足交界处水平钩开约15mm开口，并使用通片针向内脏团方向打开一口袋装囊袋，将附着外套膜细胞的珠核用镊子塞进内脏团囊袋深处，插核完成后，采用单手打结法用生物缝合线对伤口进行缝合，防止吐珠，使伤口处组织贴附在一起，同时用抗菌素和促肌肉生长药物在伤口缝合处加以清洗和涂抹以降低伤口感染，促进肌肉再生，经术后缝合的育珠蚌在清水池中暂养8小时后竖直吊养于水下20cm中，进行珍珠培育； 植入的珠核采用一蚌一珠的方式。

说明书

一种培育大颗粒有核珍珠的方法

技术领域

[0001] 本发明属于养殖技术领域，涉及一种培育有核珍珠的方法，本发明所述方法用于培育直径在8-10mm的孵育珠核，从而能够使培育出来的珍珠具有更大的直径(一般能达10mm以上)，所使用的培育生物一般为淡水贝类，例如三角帆蚌等。

背景技术

[0002] 我国淡水资源丰富，淡水贝类育珠前景广阔。目前，我国淡水珍珠年产量千吨以上，但优质、高档的珍珠却不足百吨，直径为8mm以上的珍珠在短期内难以满足国际市场的要求。珍珠颗粒的大小在很多程度上决定了珍珠生产的经济效益。对于淡水贝类大颗粒珍珠培育在生产上仍是一个难题。近10年来，人工育珠工艺的理论基础得到了新的发展：“游离细胞植入法培育有核珍珠”及“内脏团育珠技术”在培育淡水有核珍珠上取得了突破性进展，为优质珍珠的培育提供了良好的生物学基础，也为大颗粒珍珠培育提供了空间的可能。但是，大颗粒珠核插核后吐珠率高和伤口难以愈合一直困绕着大颗粒有核珍珠的培育，迫切需要在生产工艺上进行技术创新，降低插核手术给珍珠产业带来的风险。

发明内容

[0003] 本发明所要解决的主要技术问题在于现有内脏团培育有核珍珠的过程中，插入珠核后，珍珠培育生物(例如三角帆蚌等)一般具有高吐珠率的问题，并针对该问题提供一种培育有核珍珠的方法。

[0004] 本发明所采用的技术方案是：

[0005] 一种培育大颗粒有核珍珠的方法，包括：a、从蚌体上获得外套膜外表皮细胞，b、用得到的外套膜外表皮细胞孵育珠核，得到孵育珠核，c、将孵育珠核植入育珠蚌内进行培育；c步骤所述的培育包括：

[0006] ①、在育珠蚌内开一用于放置孵育珠核的囊袋；

[0007] ②、将孵育珠核塞入囊袋，囊袋开口处用生物缝合线缝合；

[0008] ③、对经②步骤处理后的育珠蚌进行培育。

[0009] 珍珠培育生物的吐珠率，如果从时间过程上看，可以分成前后两种情况，前一种情况是指，在孵育珠核塞入囊袋的过程中，发生吐珠现象(即孵育珠核难以塞入囊袋)；后一种情况是，在孵育珠核塞入囊袋后，发生吐珠现象。这两种现象均会造成珍珠培育生物的吐珠率增高，给珍珠培育工作带来困难。

[0010] 现有技术在遇到本发明上述困难时，一般只能有意识的解决后一种情况所带来的吐珠率提高的问题，所采取的方案通常是将插入的珠核直径减少，虽然这种做法能够从某种程度上解决后一种情况所带来的吐珠率提高的问题，但这一方案却在解决问题的同时带来了新的技术问题，即插入的珠核直径减少，所培育出来的珍珠颗粒也就比较小，满足不了国际市场的需求。

[0011] 本发明的解决思路是同时针对珍珠培育生物吐珠率高的两个方面全面展开的，一方面，对于后一种情况，本发明通过生物缝合的技术手段能够从根本上杜绝育珠蚌在插入珠核后，发生吐珠现象；另一方面，对于前一种情况，本发明经过研究发现，孵育珠核囊袋的开口处并不是设置在珍珠培育生物的培育器官上的(以蚌类为例，培育器官为蚌体的内脏团)，这样的器官往往不具有良好的肌肉收缩性能，孵育珠核塞入其中后，囊袋开口处的珠核容纳量并没有多大变化，在这种情况下，孵育珍珠很容易从囊袋开口处突出，并最终脱离蚌体。本发明进一步发现，以蚌类为例，蚌体内脏团与斧足的交界处具有较好的肌肉收缩性能，因此，将囊袋开口处设置在这一部位，可以大大的增加囊袋开口处的珠核容纳量，从而使孵育珠核塞入囊袋过程变得容易。

[0012] 使用本发明的技术方案不但能够解决珍珠培育生物高吐珠率的技术问题，而且还得到了一个附加的技术效果，那就是囊袋开口处由于可以用生物缝合线缝合，因此囊袋开口处可以尽可能的开大些(不影响有核珍珠培育效果的前提下)，以容纳直径更大的孵育珠核，从而为培育出大直径的珍珠创造基本条件，一般说来，本发明所述孵育珠核的直径为8-10mm。

[0013] 当然，生物缝合线缝合后，塞入口(即囊袋开口处)也需要进行必要的处理，以使塞入口不至于受到感染而产生病变，从而严重影响珍珠培育效果，或者导致育珠蚌的死亡。

[0014] 为此，本发明方法中的c步骤在②步骤和③步骤之间还增设了清洗消毒步骤：

[0015] 先用抗菌素在②步骤的囊袋开口处进行清洗，然后将促肌肉生产药物涂抹到②步骤的囊袋开口处上以使囊袋开口处的肌肉快速复原。

附图说明

[0016] 图1为实施例所述将附着外套膜细胞的珠核用镊子塞进内脏团囊袋深处的操作示意图。

具体实施方式

[0017] 为了使本领域技术人员很好的理解本发明的具体技术特征，以利于本发明的实施，现对本发明做进一步的解释。

[0018] 一种培育大颗粒有核珍珠的方法，包括：第一、从蚌体上获得外套膜外表皮细胞，第二、用得到的外套膜外表皮细胞孵育珠核，得到孵育珠核，第三、将孵育珠核植入育珠蚌内进行培育。

[0019] 其中每个步骤中又包含若干小步骤，对于第三步骤而言，它又可以分为：

[0020] 1、在育珠蚌内开一用于放置孵育珠核的囊袋；

[0021] 2、将孵育珠核塞入囊袋，囊袋开口处用生物缝合线缝合；

[0022] 3、对经2步骤处理后的育珠蚌进行培育。

[0023] 技术人员可以明白的从本说明书发明内容得知，上面提到的第一、第二、第三、1、2以及3步骤分别对应发明内容部分的a、b、c、①、②以及③步骤，技术人员可以将发明内容部分所涉及的各种为产生相应技术效果而提供的改进的技术方案应用到本具体实施方式中来。

[0024] 本具体实施方式的主要目的就是在以上技术方案的基础上，再对技术方案进行进一步的扩充或者改进，以帮助本领域技术人员实现更好的技术效果。

[0025] 其一，本具体实施方式对第一步骤进行进一步的细化，细化后的第一步骤包括：

[0026] I、从蚌体上分离外套膜外表皮组织；

[0027] II、将外套膜外表皮组织放入胰酶消化液消化，收集外套膜外表皮细胞。

[0028] 为了减少细菌等有害病原物对外套膜外表皮组织的感染，可以进一步的在在I步骤和II步骤之间设置冲洗步骤：

[0029] 用PBS及抗生素(例如青霉素及链霉素的混合物等)的混合洗液冲洗外套膜外表皮组织。

[0030] 并且最好将II步骤中的胰酶消化液的质量百分比浓度设定在0.25％-0.32％之间，本具体实施方式发现，这样的浓度设置可以完全将外套膜外表皮细胞从外套膜外表皮组织上剥离，而又不会给外套膜外表皮细胞造成伤害。

[0031] 其二，本具体实施方式对第二步骤进行进一步的细化，细化后的第二步骤包括：

[0032] (1)、用多聚赖氨酸处理珠核；

[0033] (2)、用第一步骤获得的外套膜外表皮细胞，孵育(1)步骤得到的珠核，使珠核外附着至少一层外套膜外表皮细胞，形成孵育珠核。

[0034] 第二步骤在上述(1)、(2)工作之前，一般需要对珠核进行灭菌处理。

[0035] (2)步骤在保障本具体实施方式珍珠培育效果方面的作用是十分巨大的，具体的来讲：

[0036] 大量外套膜外表皮细胞均匀附着外膜上表皮细胞，使外表皮细胞在移行增值过程中能均匀包裹珠核，珍珠质的分泌和沉积分布均匀，避免了疵珠，并有效地缩短育珠时间。

[0037] 为了便于本领域技术人员知晓如何判断珠核外已经附着至少一层外套膜外表皮细胞，并且能够保证外套膜外表皮细胞是均匀的附着在珠核外表面上，本具体实施方式提供了一种判断标准：

[0038] 孵育后的珠核在倒置显微镜下，技术人员能够观测到：外套膜外表皮细胞已经铺满了珠核表面，形成单层细胞层，并且在水相中轻轻弹动珠核，细胞不会从珠核上脱离。

[0039] 为了保证(2)步骤中的孵育工作能够顺利进行，必须事先在珠核表面用粘附剂(例如(1)步骤中的多聚赖氨酸)处理以使最先接触珠核表面的外套膜外表皮细胞能够顺利的粘附在珠核表面上，然后再利用这些已经附在珠核表面的外套膜外表皮细胞进行繁殖培养。

[0040] 在实际操作过程中，对粘附剂粘度大小的选择是有限制的，一般来说，粘度太大，不便于珠核孵育的操作，粘度太小细胞附着在珠核上的能力较小。

[0041] 采用的调控粘附剂粘度的手段，一般有两种，对于本具体实施方式提到的多聚赖氨酸而言，可以从多聚赖氨酸的分子量及多聚赖氨酸的浓度这两方面来调节粘度，任何一种调节手段都可以单独使用，但是两种调节手段同时使用时，本领域技术人员一般能够获得更为精准的粘度调节效果。

[0042] 为满足本具体实施方式在珠核表面上粘附外套膜外表皮细胞的需要，(1)步骤的多聚赖氨酸的分子量在10000-150000之间，多聚赖氨酸的浓度可以设定为0.1-0.2mg/ml。

[0043] (2)步骤中孵育(1)步骤得到的珠核的温度一般能够适应外套膜外表皮细胞的生长繁殖即可，本具体实施方式将该温度设定为25℃-27℃。

[0044] 下面再向本领域技术人员演示下，应用本具体实施方式的实施例。

[0045] 实施例

[0046] 本实施例采用1龄左右健康、活力强的小蚌为外套膜外表皮组织的获取来源。

[0047] 第一、采用撕膜法分离河蚌的外套膜外表皮组织。所采用的撕膜法，能够使获得的外套膜组织成分单一，不含内表皮组织或细胞，从而有助于高纯度外套膜外表皮细胞的获得。

[0048] 第二，在无菌室内，取外套膜外表皮组织在PBS溶液(含8g/LNaCl、0.2g/LKCl、1.44g Na2HPO4/L和0.24g/L KH2PO4，pH为7.4)中洗涤，然后用PBS+200IU/mL双抗(青霉素及链霉素)、PBS+1000IU/mL双抗、PBS+200IU/mL双抗洗液的次序各冲洗组织一次，最后用PBS再次冲洗。

[0049] 第三、取处理过的组织剪成2mm3大小的小块，用PBS冲洗小片2次，然后在组织小片中加入0.3％的胰酶消化液于37℃下消化30min，以完全培养基终止胰酶反应并分散细胞，静止10min后取水相，离心后收集细胞。用血球计数板对细胞悬液进行计数调整细胞数5 6
在5×10-1×10 个/mL，置于26℃CO2恒温培养箱培养细胞。

[0050] 第四、采用与珍珠同质的贝壳磨制的圆球形、扁平形珠核，直径为8mm，洗涤后高压蒸汽灭菌，干燥后用0.1mg/mL的多聚赖氨酸(分子量为15,000)浸泡8小时。取出珠核，使用恒温干燥箱在60℃下干燥，期间确保处理过程无菌污染。在细胞培养室内，用获得的外表皮细胞及培养液在CO2恒温培养箱内孵育处理的珠核，温度26℃，孵育时间为8h，用具体实施方式提供的判断标准进行判断，使珠核外充份附着大量的外套膜外表皮细胞。

[0051] 第五、选取健康有活力的3龄育珠蚌，其长达到13cm、宽达到10cm、壳高达到3.5cm以上，清洗外壳泥土和藻类，开壳器开壳后用“U”型架支撑壳的开口，使用75％的酒精棉球对手术部位进行擦拭，用开口针在内脏团2与斧足3交界处水平钩开约15mm开口4，并使用通片针向内脏团2方向打开一口袋装囊袋，将附着外套膜细胞的珠核1用镊子塞进内脏团囊袋深处(插核部位见图1)。插核完成后，采用单手打结法用特殊生物线对伤口进行缝合，防止吐珠，使伤口处组织贴附在一起，同时用抗菌素和促肌肉生长药物在伤口缝合处加以清洗和涂抹以降低伤口感染，促进肌肉再生。经术后缝合的的育珠蚌在清水池中暂养8小时后竖直吊养于水下20cm中，进行珍珠培育。

[0052] 此外，本实施例植入的珠核直径较大(为8mm)，为了降低珠核对内脏团的机械损伤，降低蚌的死亡率，植入的珠核采用一蚌一珠的方式。其培育结果可达75％左右的成珠率，获得珍珠直径至少在10mm以上，培育时间为两年半左右。