抗阿片肽的拮抗肽与该拮抗肽的应用

摘要

本发明公开了一种抗阿片肽及其拮抗肽与应用。该抗阿片肽是下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的SEQ ID NO：1；2)SEQ ID NO：3-5；3)将序列表中SEQ IDNO：1；SEQ ID NO：3-5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有拮抗吗啡抗伤害作用的多肽。其拮抗肽是下述氨基酸残基序列之一：1)序列表中的SEQ ID NO：9-11；2)将序列表中SEQ ID NO：9-11的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状作用的多肽。本发明的抗阿片肽及其活性片段与拮抗肽将在医学及戒毒药物的制备领域发挥重要作用，应用前景广阔。

权利要求

1.抗阿片肽的拮抗肽，其氨基酸残基序列如序列表中的SEQ ID NO：11所示。

2.编码权利要求1所述的抗阿片肽拮抗肽的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：14的DNA序列所示。

4.含有权利要求2或3所述的基因的表达载体。

5.含有权利要求2或3所述的基因的转基因细胞系。

6.含有权利要求2或3所述的基因的宿主菌。

7.以权利要求1所述的抗阿片肽的拮抗肽为活性成分的增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状作用的药物。

说明书

抗阿片肽的拮抗肽与该拮抗肽的应用

[0001] 本申请是申请号为200710118104.2、申请日为2007年06月28日、发明创造名称为“一种抗阿片肽及其拮抗肽与该拮抗肽的应用”的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及肽段及其编码基因与应用，特别是涉及一种具有拮抗吗啡抗伤害作用的抗阿片肽及其拮抗肽，与该拮抗肽在制备具有增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状作用的药物中的应用。

背景技术

[0003] 众所周知，在世界范围内猖獗的贩毒吸毒活动已成为危害社会的一个毒瘤，严重干扰了有序的经济建设和社会安定，此外，静脉吸毒还造成了艾滋病人群感染率的攀升。目前，各国政府虽都加大联合打击毒品走私的力度，但吸毒、贩毒活动仍屡禁不止，其中一个重要的原因就是吗啡耐受及依赖的原理尚未真正或完全被阐明，国际上尚无有效的戒毒手段。国外最先采用的”替代疗法”是在戒毒过程中用美沙酮一类的药代替阿片，这种疗法将导致病人对美沙酮类药物的耐受和依赖。在国内，宁波戒毒所杨国栋先生采用东莨菪硷配合其它药物戒毒，也未完全解决心瘾问题。韩济生教授采用针灸治疗仪治疗戒断症状，试图通过特定频率的电脉冲刺激提高体内内源性阿片的合成来减轻症状，但它的最大缺陷是人群中针刺镇痛的有效率有限而且持续地针刺也存在耐受问题。近来，石家庄中医药专家王岩对阿片戒断症状进行辩症施治，采用“金甲丸”治疗戒断综合症，正在经临床进一步检验和完善。因此，迫切需要一种可从源头上彻底消除吗啡耐受及依赖，以及减弱或消除戒断症状的戒毒药物。

[0004] 已知PEBP家族的蛋白，在自然界里广泛存在于酵母、线虫、果蝇及各种植物及哺乳动物的不同器官，它们极具保守性，与其它已知结构或功能的蛋白的序列无同源性。PEBP蛋白的生物功能十分多样，在植物它对开花信号及分生组织生长的信号起调节作用。在哺乳类动物，PEBP蛋白可通过Raf-1抑制MEK的磷酸化使之不被激活，故又有Raf激酶抑制蛋白(RKIP)之称，它调节Raf/MEK/ERK一组信号，与细胞的有丝分裂和分化有关，涉及肿瘤细胞的转移。在中枢神经系统，PEBP蛋白不仅作为海马刺激胆碱能神经肽(HCNP)的前身蛋白，而且也作为ATP，阿片和磷脂酰乙醇氨的结合蛋白。Ojika K.等人(Ojika K.，Mitake S.，Tohdoh N.，Appel S.H.，Otsuka Y.，Katada E.And Matsukawa N.(2000)Hippocampal cholinergic neurostimulating peptides(HCNP).Prog.Neurobiol.60，37-83.Iwase T，Ojika K，Matsukewa N，et al.Muscarinic cholinergic and glutamatergic reciprocal regulation of expressionof hippocampal cholinergic neurostimulating peptide precursor protein gene inrat hippocampus.Neuroscience，2001，102(2)：341-352)指出在离体内侧隔核，海马胆硷能刺激神经肽(HCNP)提高胆硷乙酰化酶(ChAT)的产物而不是胆硷脂酶(AchE)的产物。HCNP在11天大鼠脑免疫反应阳性较强的部位，主要有大脑皮层、海马齿状回、杏仁核、脊髓三叉神经核和脊髓后角等，而在成年大鼠脑HCNP前身物信使RNA相对标记强的，主要分布在大脑皮层、海马、杏仁核、隔核、内侧缰核、黑质、小脑的蒲肯野氏细胞和颗粒层细胞等部位。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种具有拮抗吗啡抗伤害作用的抗阿片肽。

[0006] 本发明所提供的抗阿片肽，命名为21Kd，是下述氨基酸残基序列之一：

[0007] 1)序列表中的SEQ ID NO：1；

[0008] 2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，具有拮抗吗啡抗伤害作用的多肽。

[0009] 所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响，例如，增加的组氨酸标签等。

[0010] 序列表中的SEQ ID NO：1由186个氨基酸残基组成。

[0011] 编码本发明抗阿片肽21Kd的基因，是下述核苷酸序列之一：

[0012] 1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

[0013] 2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

[0014] 3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列；

[0015] 4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

[0016] 所述高严谨条件为：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

[0017] 序列表中的SEQ ID NO：2由558个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

[0018] 试验表明，上述抗阿片肽21Kd具有一系列的活性片段，它们可为下述氨基酸残基序列之一：

[0019] 1)序列表中的SEQ ID NO：3；

[0020] 2)序列表中的SEQ ID NO：4；

[0021] 3)序列表中的SEQ ID NO：5；

[0022] 4)将序列表中SEQ ID NO：3-5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有拮抗吗啡抗伤害作用的多肽。

[0023] 所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

[0024] 序列表中的SEQ ID NO：3由13个氨基酸残基组成，将其命名为21Kd-13；序列表中的SEQ ID NO：4由14个氨基酸残基组成，将其命名为21Kd-14；序列表中的SEQID NO：5由21个氨基酸残基组成，将其命名为21Kd-21。

[0025] 编码上述抗阿片肽活性片段的基因、与该基因具有90％以上同源性的核苷酸序列或在高严谨条件下可与其限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，也受本发明的保护。

[0026] 所述高严谨条件为：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

[0027] 序列表中的SEQ ID NO：6由39个碱基组成，编码SEQ ID NO：3所示的抗阿片肽21Kd活性片段；序列表中的SEQ ID NO：7由42个碱基组成，编码SEQ ID NO：4所示的抗阿片肽21Kd活性片段；序列表中的SEQ ID NO：8由63个碱基组成，编码SEQ ID NO：5所示的抗阿片肽21Kd活性片段。

[0028] 本发明抗阿片肽21Kd的拮抗肽，是下述氨基酸残基序列之一：

[0029] 1)序列表中的SEQ ID NO：9；

[0030] 2)序列表中的SEQ ID NO：10；

[0031] 3)序列表中的SEQ ID NO：11；

[0032] 4)将序列表中SEQ ID NO：9-11的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状作用的多肽。

[0033] 所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

[0034] 序列表中的SEQ ID NO：9由13个氨基酸残基组成，将其命名为CP-21Kd-13；序列表中的SEQ ID NO：10由14个氨基酸残基组成，将其命名为CP-21Kd-14；序列表中的SEQ ID NO：11由21个氨基酸残基组成，将其命名为CP-21Kd-21。

[0035] 编码上述抗阿片肽21Kd拮抗肽的基因、与该基因具有90％以上同源性的核苷酸序列或在高严谨条件下可与其限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，也受本发明的保护。

[0036] 所述高严谨条件为：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

[0037] 序列表中的SEQ ID NO：12由39个碱基组成，编码SEQ ID NO：9所示的抗阿片肽21Kd的拮抗肽；序列表中的SEQ ID NO：13由42个碱基组成，编码SEQ ID NO：10所示的抗阿片肽21Kd的拮抗肽；序列表中的SEQ ID NO：14由63个碱基组成，编码SEQ ID NO：11所示的抗阿片肽21Kd的拮抗肽。

[0038] 含有上述抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增该基因中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

[0039] 上述抗阿片肽21Kd的拮抗肽可采用常规的人工合成方法直接获得，如可用fmoc保护的固相合成法等方法人工合成，或可委托专业的生物公司合成(如美联(西安)生物科技有限公司或上海闪晶生物多肽合成有限公司等)，此外，也可利用微生物发酵表达的方法获得。本发明所提供的表达上述拮抗肽的方法，是将含有上述抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到抗阿片肽21Kd的拮抗肽。

[0040] 所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。

[0041] 所述大肠杆菌可为E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α或E.coli Top10等。

[0042] 用于构建所述含有抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的表达载体的出发载体可为任意一种可在大肠杆菌中表达外源基因的原核表达载体，如pET-22b、pET-11c、pET-30a、pET-28a、pET-28b或pET-28c等。

[0043] 其中，以pET-22b为出发载体，构建的含有抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的表达载体为pET-CP-21Kd-8+5、pET-CP-21Kd-13、pET-CP-21Kd-14或pET-CP-21Kd-21。

[0044] 上述重组表达载体均可按照常规方法构建。

[0045] 将上述重组表达载体转化宿主菌的方法可为生物工程领域中常用的转化方法，如热激法、电转化法、接合转化法或PEG介导的原生质体转化法等。

[0046] 培养含有抗阿片肽21Kd的拮抗肽基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度可为0.1-1.0mmol/L，优选为0.2mmol/L，诱导温度可为16-37℃，优选为30℃，诱导时间可为2-4小时，优选为3小时。

[0047] 所述抗阿片肽21Kd的拮抗肽在制备增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状作用的药物中的应用也是本发明要保护的。当然，以所述抗阿片肽21Kd的拮抗肽为活性成分的药物，更是本发明需要保护的内容，该药物具有增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状的作用。

[0048] 以抗阿片肽21Kd的拮抗肽为活性成分的药物中，其活性成分可选自以下氨基酸残基序列中的一个或几个：

[0049] 1)序列表中的SEQ ID NO：9；

[0050] 2)序列表中的SEQ ID NO：10；

[0051] 3)序列表中的SEQ ID NO：11；

[0052] 4)将序列表中SEQ ID NO：9-11的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状作用的多肽。

[0053] 需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂等。

[0054] 本发明的药物可以制成注射液、干粉针剂、片剂或粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

[0055] 上述药物的成人用量一般为0.01-0.5mg/kg体重/次，可以一次或多次使用，疗程一般为10至20天。

[0056] 本发明提供了一种从猪脑中分离纯化出的抗阿片肽21Kd及其活性片段，它具有拮抗吗啡抗伤害作用。吸毒过程伴随着毒品剂量的增加可促使该蛋白的合成增加，导致吗啡耐受及依赖的形成。本发明利用蛋白质分子之间存在相互作用的原理，根据其三个活性片段的序列，设计出了的该抗阿片肽21Kd的拮抗肽。实验证明，人工合成的拮抗肽可作为内源性抗阿片肽的抑制剂，通过静脉注射三个活性片段的拮抗肽，可以提高吗啡抗伤害作用的效应，减少吗啡用量，此外，这些拮抗肽的分子量小于2000道尔顿，较容易通过血脑屏障，在中枢神经系统的相关部位起到抵消内源性抗阿片肽效应的作用，因而可以将其作为活性成分制备成增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状作用的药物。该药物具有以下优点：1)疗效显著：活性成分拮抗肽是通过消除吸毒者体内多余的内源性抗阿片肽及其效应来达到增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和消除或减弱吸毒者戒断症状的目的，可从源头上消除戒断症状；2)获得的拮抗肽都是一些氨基酸残基数量不超过25个的短肽，容易合成，便于开发研究；3)这些短肽进入体内容易被降解，不具备产生抗体的副作用，安全性高；4)用药方便，可通过静脉注射方式或舌下含片等多种方式给药，以消除或减弱吗啡戒断的症状；5)该短肽稳定、制备方法简便易行，可应用于大规模工业化生产，且生产成本低廉，可减轻病人的经济负担。本发明的抗阿片肽21Kd及其活性片段与其拮抗肽将在医学及戒毒药物的制备领域发挥重要作用，应用前景广阔。

[0057] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

[0058] 图1为狗脑提取物对电脉冲引起小鼠输精管收缩影响的检测结果

[0059] 图2为侧脑室内注入狗脑粗提物对大鼠针刺镇痛效应影响的检测结果[0060] 图3A和图3B为抗阿片肽21Kd对吗啡抗伤害作用的拮抗效应的检测结果[0061] 图4A-图4C为抗阿片肽21Kd的活性肽段21Kd-21，21Kd-14和21Kd-13对吗啡抗伤害作用影响的检测结果

[0062] 图5为ScFv对吗啡抗伤害作用影响的检测结果

[0063] 图6为在吗啡耐受小鼠侧脑室内注入不同剂量的ScFv对挑战剂量吗啡(50mg/kgi.p.)抗伤害作用的影响的检测结果

[0064] 图7为NMDA受体和NOS在抗阿片肽21Kd及其活性片段拮抗吗啡抗伤害作用中的影响的检测结果

[0065] 图8A-图8C为CP-21Kd-21，CP-21Kd-14和CP-21Kd-13对吗啡抗伤害作用影响的检测结果

具体实施方式

[0066] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual>(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular rd
Cloning：A Laboratory Manual，3 edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

[0067] 所用引物及DNA序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

[0068] 下述实施例中所用实验小鼠均为将8-10周龄、体重20-22g的昆明雄性小鼠(购自中国科学院动物研究所)

[0069] 实施例1、抗阿片肽21Kd及其活性片段的获得与功能验证

[0070] 一、猪脑抗阿片肽21Kd的获得

[0071] 1、抗阿片肽的发现

[0072] 在离体的小鼠输精管标本，给以方波脉冲(0.1MS波宽，1次/秒)刺激可引起收缩(具体方法参见文献：J.Hughes et al(1975)Effect of morphine on adrenergictransmission in the Mouse Vas deferens.Assessment of agonist and antagonistpotencies of Narcotic analgesics 53，371-381)，然后，先后在灌流液中加入盐酸吗啡(3.2nM)或狗脑提取物(AOS，200μg/mL)(为狗脑提取浓缩液先后经Sephadex G-50凝胶(购自pharmacia公司)过滤，羧甲基-纤维素(CM-C，购自H.Reeve-Angel&.Co.Ltd公司)阳离子交换层析后，得到样品)，观察对电刺激小鼠输精管引起收缩效应的影响。如图1所示(M代表给吗啡，MAP代表给狗脑提取物)，实验发现在狗脑粗提物中，存在着可增强电刺激小鼠输精管收缩的成分，且该样品的增强收缩效应与吗啡抑制电刺激小鼠输精管收缩的效应恰恰相反，因此，将该狗脑粗提物注入小鼠侧脑室内后，可观察到吗啡的抗伤害作用被显著地抑制。

[0073] 此外，将上述狗脑粗提物注入针刺镇痛有效大鼠(6只)的侧脑室(400μg/20μl/只)，以生理盐水(Saline)为对照(6只)，10分钟后开始电针诱导刺激，每间隔十分钟，观察大鼠对伤害刺激的嘶叫反应。结果如图2所示(I.C.V.代表通过预先埋藏于侧脑室内的导管微量注射样品，EA代表电针诱导针刺镇痛；横坐标为狗脑粗提物注射后时间，纵坐标为嘶叫阈的变化)，以生理盐水(Saline)为对照，经针刺诱导后，大鼠出现针刺镇痛效应；狗脑粗提物注射后，再进行针刺诱导，大鼠的针刺镇痛效应则消失，上述实验结果提示脑内存在的抗阿片物质可能是针麻镇痛不全的内在因素。

[0074] 2、猪脑抗阿片肽21Kd的获得

[0075] 从猪脑中分离纯化抗阿片肽-21Kd的方法，同样是参考杨树长等人的方法并稍做改进(杨树长等人(1997)，猪脑抗吗啡镇痛肽的分离纯化及其抗血清对吗啡耐受影响的初步研究，中国生物化学杂志13卷3期322-326)，具体方法为：将猪脑提取物的浓缩液先后经Sephadex-G50凝胶过滤，S-sepharose Fast Flow离子交换层析(S-sepharose Fast Flow层析柱购自Pharmacia公司)分离后，取第4个洗脱峰的样品，经FPLC monos阳离子(FPLC monos层析柱购自Pharmacia公司)交换后，用微量反相HPLC纯化，得到经纯化的抗阿片肽物质。由于该蛋白N-末端的20个氨基酸残基及部分水解片断的氨基酸残基序列，与牛脑存在高度的同源性。在已测定的106个氨基酸残基中，仅N-末端第5、95、103位残基存在差异。其分子量为20932道尔顿，与牛脑的21Kd蛋白(又称磷脂酰乙醇氨结合蛋白PhosphatidylethanolamineBinding Protein，PEBP)的分子量20，847道尔顿相当，故将该蛋白称为21Kd(又称PEBP或RKIP)。因此，上述猪脑21Kd蛋白可能属于PEBP蛋白家族。对获得的抗阿片肽进行全序列测定，测序结果表明该抗阿片肽具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列，由186个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列，由558个碱基组成。

[0076] 二、猪脑抗阿片肽21Kd拮抗吗啡抗伤害作用检测

[0077] 1、侧脑室注射途径检测猪脑抗阿片肽21Kd拮抗吗啡抗伤害作用

[0078] 将纯化的21Kd蛋白在腹腔注入吗啡(20mg/kg)10分钟后，作小鼠侧脑室内注射，注射剂量分别为0.24nM、0.48nM和0.96nM，以相同体积的生理盐水(Saline)为对照，然后检测吗啡的抗伤害作用。结果如图3A所示(横坐标表示吗啡注射后时间，纵坐标表示嘶叫阈的变化(％)，n为每组小鼠数量，i.p.表示腹腔注射，i.c.v.表示侧脑室内注射)。21Kd蛋白对小鼠的基础痛反应无效应，但对吗啡(20mg/kg i.p.)的抗伤害作用具有显著的拮抗效应，而且受不同浓度21Kd蛋白(0.24nM，0.48nM和0.96nM)的影响，21Kd蛋白不同注射浓2
度下吗啡抗伤害曲线下的面积分别为98.5±9.5、67.7±8.0和55.6±6.6(cm)，而对照组
2
的面积为134.3±6.7(cm)，方差分析结果表明实验组与对照组之间存在显著的统计学差异(P＜0.05，P＜0.001和P＜0.001，df＝28)。

[0079] 2、尾静脉注射途径检测猪脑抗阿片肽21Kd拮抗吗啡抗伤害作用

[0080] 在小鼠腹腔注射20mg/kg吗啡(M20)10分钟后，在小鼠侧脑室内由尾静脉注入纯化的21Kd蛋白，注射剂量分别为1mg/kg、2mg/kg和4mg/kg，以相同体积的生理盐水(Saline)为对照，然后检测吗啡的抗伤害作用。结果如图3B所示(横坐标表示吗啡注射后时间，纵坐标表示嘶叫阈的变化(％)，n为每组小鼠数量，i.p.表示腹腔注射，i.v.表示尾静脉内注射)，尾静脉内注射不同浓度的21Kd蛋白对吗啡(20mg/kg i.p.)的抗伤害作用也具有显著的拮抗效应，而且与21Kd蛋白的浓度有关。21Kd蛋白不同注射浓度下吗啡抗伤害曲线2 2
下的面积分别为111.2±8.5、61.7±5.4和36.5±6.1(cm)，与对照组128.0±5.0(cm)相比，存在显著的统计学差异(P＜0.1、P＜0.001和P＜0.001)。

[0081] 上述试验结果证明，本发明的抗阿片肽21Kd具有显著的拮抗吗啡抗伤害作用。

[0082] 三、抗阿片肽21Kd活性片段的获得及其活性检测

[0083] 1、抗阿片肽21Kd活性片段的获得

[0084] 推测由步骤二证实尾静脉注射途径给于抗阿片肽21Kd对吗啡抗伤害作用的拮抗效应是因21Kd蛋白在血液中被降解为较小的片断，通过血脑屏障在中枢起作用的结果。为验证上述推测，参考文献(Zh.W.Chen etal(1988)Isolation andcharacterization of porcine diazepam-binding inhibitor，a polypeptide not onlyof cerebral occurrence but also common in intestinal tissues and with effectson regulation of insulin release Eur.J.Biochem 174，239-245)，将21Kd蛋白用胰酶降解后，经微量HPLC分离得到21个峰样品，用与步骤二相同的方法检测其中几个主要成分样品的拮抗吗啡抗伤害作用，结果获得三个具有拮抗吗啡抗伤害作用的成分，测定其氨基酸残基序列，将具有序列表中SEQ ID NO：3的氨基酸残基序列的肽段命名为21Kd-13，由13个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO：6的核苷酸序列，由39个碱基组成；将具有序列表中SEQ ID NO：4的氨基酸残基序列的肽段命名为21Kd-14，由14个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ ID NO：7的核苷酸序列，由42个碱基组成；将具有序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸残基序列的肽段命名为21Kd-21，由21个氨基酸残基组成，其编码基因具有序列表中SEQ IDNO：8的核苷酸序列，由63个碱基组成。由于这三个肽段的氨基酸残基序列与牛脑PEBP蛋白相应的肽段的氨基酸残基序列完全一致，因此证明本发明的21Kd蛋白确实属于PEBP蛋白家族。

[0085] 2、抗阿片肽21Kd活性肽段21Kd-21，21Kd-14和21Kd-13的活性检测[0086] 由美联(西安)生物科技有限公司及上海闪晶生物多肽合成有限公司人工合成21Kd-21，21Kd-14和21Kd-13这三个肽段。用与步骤二相同的方法检测不同剂量的活性肽段21Kd-21(1.0、2.0、4.0nM)、21Kd-14(0.64、3.2、6.4nM)和21Kd-13(5.7、11.4、22.7nM)对吗啡(M20，20mg/kg i.P.)抗伤害作用的影响，以生理盐水(Saline)为对照。检测结果如图4A-图4C所示(横坐标表示吗啡注射后时间，纵坐标表示嘶叫阈的变化(％)，n表示各组实验小鼠数量，i.p.表示腹腔内注射，i.c.v.表示测脑室内注射)，21Kd-21，21Kd-14和21Kd-13拮抗吗啡抗伤害作用的剂量范围依次分别为1.0-2.0-4.0nM、1.6-3.2-6.4nM和
5.7-11.4-22.7nM，它们拮抗吗啡抗伤害作用都与剂量相关

[0087] 实施例2、检测抗阿片肽21Kd与吗啡耐受及依赖的关系

[0088] 一、抗阿片肽21Kd的可溶性单链可变区抗体片段的获得及其功能检测[0089] 利用噬菌体展示技术，使用意大利International School for Advanced Studies(SISSA)Daniele Sblattero和Andrew Bradbury等构建的人原噬菌体抗体库[构建方法参见：Sblattero D，Lou J L，Marzari R，et al.In vivo recombinat ion as atool to generate molecular diversity in phage antibody libraries.Reviews inMolecular Biotechnology.2001，74：303～315]，从噬菌体抗体库中筛选出分子量约20,000道尔顿的抗阿片肽21Kd的可溶性单链可变区抗体片段，简称为ScFv。在腹腔注入吗啡(M10，10mg/kg)10分钟后，将ScFv单独注入正常小鼠的侧脑室内，注射剂量为4.8μg/6μl，以相同体积的磷酸缓冲液(PBS)为对照，然后检测吗啡的抗伤害作用。检测结果如图5所示(n为每组小鼠数量，i.p.表示腹腔内注射，i.c.v.表示测脑室内注射)，侧脑室内注入ScFv可使吗啡(10mg/kg i.p.)的抗伤害作用显著增强。在110分钟内，实验组小鼠吗啡抗伤害曲线下的面积为603.8±38.4，是对照组(239.4±16.1)的2.5倍，存在显著的统计学差异(P＜0.001，t＝8.7407，t0.001＝4.140，df＝14)，该实验结果进一步证明正常小鼠脑中确实存在21Kd蛋白对吗啡抗伤害作用的抑制作用。

[0090] 二、检测抗阿片肽21Kd与吗啡耐受的关系

[0091] 选取20只健康小鼠，每天三次，皮下注射递增剂量的盐酸吗啡，注射剂量由10mg/kg递增至60mg/kg，持续10天形成吗啡耐受小鼠。然后将20只吗啡耐受小鼠分成吗啡耐受对照组(不注射21Kd-ScFv)及注射三个不同浓度的21Kd-ScFv抗体组(每组5只)。在第11天，先由腹腔注入挑战剂量的吗啡(50mg/kg)，10分钟后，再于侧脑室内分别注入
4μg/6μl，6μg/6μl和8μg/6μl三种剂量的21Kd-ScFv，分别观察它们的吗啡抗伤害效应，以非吗啡耐受的健康小鼠为空白对照组。结果如图6所示(n为小鼠数量，纵坐标为吗啡抗伤害作用曲线下的面积，横坐标为不同实验组)，在形成吗啡耐受的对照组，90分钟内
2
挑战剂量吗啡抗伤害作用曲线下的面积为121.52±21.2(cm)，21Kd-ScFv(4.0μg/6μl，
6μg/6μl和8μg/6μl)三个剂量组的吗啡(50mg/kgi.p.)抗伤害作用曲线下的面积分
2
别为170.18±25.3，224.25±49.6和269.97±31.3(cm)。不同剂量的21Kd-ScFv都不同程度地逆转了挑战剂量吗啡的抗伤害作用，其中，21Kd-ScFv 6μg/6μl和8μg/6μl剂量组的逆转吗啡抗伤害作用具有统计学意义(*代表与耐受的对照组相比p＜0.05；
2
**代表与耐受的对照组相比p＜0.01)。与非耐受的空白对照组(261.65±27cm)相比，
21Kd-ScFv(8μg/6μl)组已达到完全逆转吗啡耐受的程度。上述实验结果表明，在吗啡耐受的形成过程中，内源性抗阿片肽21Kd的合成量增加，可能是形成吗啡耐受的重要因素之一。

[0092] 三、检测抗阿片肽21Kd与吗啡依赖的关系

[0093] 选取12只健康小鼠，每天三次，皮下注射递增剂量的吗啡，注射剂量由10mg/kg递增至80mg/kg，持续12天形成吗啡耐受及依赖小鼠。然后将12只吗啡耐受及依赖小鼠分成对照组和实验组。其中，对照组是在最后一次注射吗啡后6-8小时期间，腹腔注射阿片肽拮抗剂纳络酮(Naloxone)(购自Sigma公司，10mg/kg i.p.)，观察小鼠可能诱发的戒断症状-跳跃的次数。实验组与对照组是完全配对进行实验观察，操作上的差异仅仅是腹腔注射Naloxone(10mg/kg)前，先经侧脑室注入21Kd-ScFv(8μg/10μl)。结果如表1所示，对照组小鼠出现跳跃的次数依次为0、1、15、36、89、90；而实验组小鼠出现跳跃的次数均消失，但经侧脑室注入21Kd-ScFv抗体的量不等，有1只需三次侧脑室注入21Kd-ScFv后跳跃才消失，有2只在两次侧脑室注入21Kd-ScFv后跳跃消失，有3只仅一次注入21Kd-ScFv后就不再出现跳跃。上述实验结果说明，每天三次，以递增剂量皮下注射吗啡持续12天形成吗啡耐受及依赖的小鼠存在较大的个体差异，Naloxone所诱发的跳跃的次数可达0-90次，而侧脑室注入21Kd-ScFv可以消除次戒断症状-跳跃，但所需要的21Kd-ScFv抗体量却不等，从而证明吗啡耐受及依赖的形成也与脑内21Kd蛋白合成量的增加密切不可分。

[0094] 表1 在吗啡耐受及依赖小鼠，侧脑室内注入不同剂量的21Kd蛋白可溶性单链抗体(ScFv i.c.v.)后对由纳络酮(10mg/kg i.p.)诱发的戒断症状-跳跃次数的影响[0095]编号 对照组 编号 实验组
No.5 0 No.1 0 ScFv(i.C.v.)8μg×1
No.3 1 No.11 0 ScFv(i.C.v.)8μg×1
No.9 15 No.12 0 ScFv(i.C.v.)8μg×1
No.6 36 No.10 6→0ScFv(i.C.v.)8μg×2
No.7 89 No.4 8→0ScFv(i.C.v.)8μg×2
No.8 90 No.2 45→0ScFv(i.C.v.)8μg×3

[0096] 实施例3、检测NMDA受体和NOS在抗阿片肽21Kd及其活性片段拮抗吗啡抗伤害作用中的作用

[0097] 研究表明，兴奋性氨基酸NMDA受体和一氧化氮合成酶系统(NOS)在成年小鼠吗啡耐受及依赖过程起到至关重要的作用，用NMDA受体拮抗剂或NOS抑制剂对小鼠进行预处理后，可抑制吗啡耐受及依赖的形成，防止戒断症状的出现[Adams ML，Kalicki JM，Meyer ER，Cicero TJ(1993)Inhibition of the morphine withdrawal syndrome bynitric oxide synthase inhibitor，NG-Nitro-L-arginine methyl ester.Life Sci52：PL245-PL249；Cappendijk SL，Vries R，Dzoljic MR(1993)Inhibitory effectof nitric oxide(NO)synthase inhibitors on naloxone-precipitated withdrawalsyndrome in morphine-dependent mice.Neurosci Lett 162：97-100；Herman BH，Vocci F，Bridge P(1995)The effect of NMDA receptor antagonists and nitricoxide synthase inhibitors on opioid tolerance and withdrawal.Neuropsychopharmacology
13：269-293；Vaupel DB，Kimes AS，London ED(1995b)Nitric oxide synthase inhibitors：preclinical studies of potential use fortreatment of opiate addiction.Neuropsychopharmacology 13：315-322；Trujillo K.A.(2000)A review of preclinical studies：Are NMDA receptorsinvolved in opiate-induced neural and behavioral plasticity ？ Psychopharmacology 151：121-141；Heinzen EL，Pollack G.M.(2004)Thedevelopment of morphine antinociceptive tolerance in nitric oxidesynthase-deficient mice.Biochem.Pharmacology vol 67(4)：735-741]。分别用兴奋性氨基酸NMDA受体拮抗剂MK-801(购自Sigma公司，0.1mg/kg i.p.)于注射吗啡前15分钟以及用一氧化氮合成酶NOS抑制剂L-NAME(购自Sigma，45mg/kg i.p.)于注射吗啡前20分钟，对小鼠进行预处理，以未经预处理的小鼠为空白对照(Blank)，再用21Kd(0.96nM)、
21Kd-13(22.7nM)、21Kd-14(6.4nM)和21Kd-21(4.0nM)检测对吗啡(20mg/kg i.P.)抗伤害效应的影响，以生理盐水(Saline)为对照(Control)。结果如图7所示(纵坐标为吗啡
2
抗伤害作用曲线下的面积，单位cm，横坐标各项目为三种对照，21Kd，21Kd-13，21Kd-14和
21Kd-21)，抗阿片肽21Kd及其活性片段21Kd-13，21Kd-14，21Kd-21肽段对吗啡抗伤害作用的拮抗作用被解除，说明抗阿片肽21Kd及其活性短肽拮抗吗啡抗伤害作用需要NMDA受体和NOS的介导。上述实验结果表明，用NMDA受体拮抗剂及NOS抑制剂处理，可抑制吗啡耐受及依赖的形成及防止戒断症状的出现，可能是脑内21Kd蛋白及其活性片段对吗啡抗伤害作用的抑制效应被解除，进一步说明脑内21Kd蛋白与吗啡耐受及依赖密切相关。

[0098] 实施例4、抗阿片肽21Kd拮抗肽的获得及其活性检测

[0099] 一、CP-21Kd-13、CP-21Kd-14和CP-21Kd-21拮抗肽的获得

[0100] 根据蛋白质分子之间存在相互作用的原理，参考文献(J.R.Heal et al(2002)Specific interactions between sense and complementary peptides：The Basis forthe proteomic code ChemBIOChem 3，136-151)设计出21Kd-13、21Kd-14、21Kd-21三个短肽的拮抗肽，其中，将21Kd-13的拮抗肽命名为CP-21Kd-13，具有SEQ ID NO：9的氨基酸残基序列，由13个氨基酸残基组成，其编码序列具有序列表中的SEQ ID NO：12的核苷酸序列，由49个碱基组成；将21Kd-14的拮抗肽命名为CP-21Kd-14，具有SEQ ID NO：10的氨基酸残基序列，由14个氨基酸残基组成，其编码序列具有序列表中的SEQ ID NO：13的核苷酸序列，由42个碱基组成；将21Kd-21的拮抗肽命名为CP-21Kd-21，具有SEQ ID NO：11的氨基酸残基序列，由21个氨基酸残基组成，其编码序列具有序列表中的SEQ ID NO：14的核苷酸序列，由63个碱基组成；

[0101] 二、CP-21Kd-13、CP-21Kd-14和CP-21Kd-21拮抗肽的活性检测

[0102] 1、检测CP-21Kd-13、CP-21Kd-14和CP-21Kd-21对吗啡抗伤害作用的影响[0103] 用与实施例1步骤二中相同的方法检测CP-21Kd-21、CP-21Kd-14、CP-21Kd-13肽段对吗啡抗伤害作用的影响，方法为：选取正常昆明小鼠，分三组(每组5或6只，n＝5或6)，分别由尾静脉注入CP-21Kd-13(6mg/Kg i.v.)、CP-21Kd-14(5mg/Kg i.v.)和CP-21Kd-21(5.6mg/Kg i.v.)，再检测对吗啡(20mg/kg i.P.)抗伤害效应的影响，以生理盐水为对照(Saline 50μl i.V.)，其中CP-21Kd-13，CP-21Kd-14和CP-21Kd-21注射组的检测结果如图8A-图8C所示(横坐标表示吗啡注射后时间(min)，纵坐标表示嘶叫阈的变化(％)，n表示各组实验小鼠数量，i.p.表示腹腔内注射，i.v.表示尾静脉内注射)，与对照组相比，注射CP-21Kd-21、CP-21Kd-14或和CP-21Kd-13后，吗啡的抗伤害作用显著地增强，显然这些拮抗肽起着抗阿片肽抑制剂的作用，抵消了内源性抗阿片肽的效应。此外，由于这些拮抗肽分子量小于2000道尔顿，由尾静脉注入体内可通过血脑屏障进入中枢神经系统，奠定了拮抗肽CP-21Kd-21、CP-21Kd-14、CP-21Kd-13具有制备增强吗啡镇痛、逆转吗啡耐受和/或减弱或消除戒断症状作用的药物，并可对所述药物进行临床应用的前景。

[0104] 2、CP-21Kd-21、CP-21Kd-14和CP-21Kd-13对由纳络酮(Naloxone)诱发的吗啡戒断效应的影响

[0105] 选取健康小鼠，每天三次，皮下注射递增剂量的吗啡，注射剂量为10mg/kg递增至80mg/kg，持续12天形成吗啡耐受及依赖小鼠。然后将吗啡耐受及依赖小鼠分成对照组(注射生理盐水)和实验组。在第13天最后一次注射吗啡后6-8小时，尾静脉分别注射拮抗肽CP-21Kd-21(15mg/kg)、CP-21Kd-14(15mg/kg)和CP-21Kd-13(15.5mg/kg)，以生理盐水(Saline 80μl i.V.)为对照，5分钟后腹腔注射Naloxone(10mg/kg)，观察小鼠诱发戒断症状-跳跃的次数。CP-21Kd-21、CP-21Kd-14和CP-21Kd-13组的实验结果如表2和表3所示，说明由尾静脉分别注射拮抗肽CP-21Kd-21(15mg/kg)、CP-21Kd-14(15mg/kg)和CP-21Kd-13(15.5mg/kg)，Naloxone(10mg/kg i.P.)诱发的戒断效应-跳跃可被消除或明显减弱。此外，秩和检验结果表明：与对照组-1相比较，CP-21Kd-21、CP-21Kd-14和CP-21Kd-13实验组都存在显著差异(P＝1-0.025＝0.975)，加大剂量的CP-21Kd-14和CP-21Kd-13组与对照3相比也存在极显著的差异，因此，拮抗肽CP-21Kd-21、CP-21Kd-14和CP-21Kd-13均可有效抑制或消除戒断效应。

[0106] 表2 尾静脉注射拮抗肽CP-21Kd-21、CP-21Kd-14和CP-21Kd-13对纳络酮(Naloxone 10mg/kg i.P.)诱发吗啡戒断症状--跳跃的影响

[0107]No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 No.7
对照组-1(Saline 80μl i.V.) 8 18 25 35 38 51 71
CP-21Kd-21***(15mg/kg i.V.) 0 1 5 11 18 18 25
CP-21Kd-14***(15mg/kg i.V.) 0 0 3 3 7 10 21
CP-21Kd-13***(15.5mg/kg i.V.) 0 0 0 1 6 9 56

[0108] ***秩和检验表明：与对照组相比，差异极显著(P＝1-0.025＝0.975)。

[0109] 表3 尾静脉注射拮抗肽CP-21Kd-14(64mg/kg i.v.)和CP-21Kd-13(48mg/kg i.v.)对纳络酮(Naloxone 10mg/kg i.P.)诱发吗啡戒断症状--跳跃的影响

[0110]No.1 No.2 No.3 No.4 No.5 No.6 No.7
对照组-3(Saline 80μl i.V.) 66 83 91 97 114 147 554
CP-21Kd-14***(64mg/kg i.V.) 0 1 4 23 39 57 62
CP-21Kd-13***(48mg/kg i.V.) 0 0 3 8 23 36 /

[0111] ***秩和检验表明：与对照组相比，差异极显著(P＝1-0.025＝0.975)。