花生健康组织和病组织简便快速DNA提取方法

摘要

本发明涉及花生健康组织和病组织简便快速DNA提取方法，包括两步，其准备样本材料，是试验取重量在3～10mg的叶片、茎组织、果壳组织或花生子叶；样本材料加入预置有碱裂解液或酶解液的1.5ml离心管中，以研磨棒研磨至无可视颗粒物；其制备DNA提取液，是指使用碱煮法或酶解法对上述研磨好的样本材料进行处理，获得样本DNA提取液。该法对于花生健康组织及花生病组织同样适用。与现有DNA提取方法相比，本发明耗时短，碱煮法单个样品用时不超过20min，酶解法单个样品不超过0.5h；样品用量少，每个样品仅需3～10mg；无需液氮研磨，费用低，可满足花生分子标记辅助育种和转基因育种的要求。对植株生长或种子萌发没有影响，对于花生分子育种技术实用化，具有重要意义。

权利要求

1.花生健康组织和病组织简便快速DNA提取方法，包括准备样本材料和制备DNA提取液步骤，其特征是：所述的准备样本材料，是指试验取的样本材料是重量在3～10mg的叶片、茎组织、果壳组织或花生子叶；样本材料加入预置有酶解液的1.5ml离心管，以研磨棒研磨至无可视颗粒物，备用；

所述的制备DNA提取液，是指使用酶解法对上述研磨好的样本材料进行处理，获得样本的DNA提取液，其中：所述的酶解法，是样品在100～200μl酶解液中研磨后，置55～58℃水浴20min，加入同体积的体积比为25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇，10000rpm离心5min，上清液转入另一离心管中，加入同体积异丙醇，10000rpm离心2～5min，弃上清液，沉淀于室温晾干，加入100～150μl TE缓冲液即为DNA提取液；

所述的酶解液是含10mMTris-HCl、5mMEDTA、5～8mg/ml PVP 40、50～100μg/ml蛋白酶K的溶液；

所述的TE缓冲液是20ml 0.1M Tris-HCl和0.4ml 5mM EDTA定容至200ml配制而成。

说明书

花生健康组织和病组织简便快速DNA提取方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组织的DNA提取范畴，具体涉及花生健康组织和病组织简便快速DNA提取方法。

背景技术

[0002] 现有技术中，普遍采用黄化苗叶片、整粒或半粒种子为起始材料、液氮研磨提取花生组织的DNA，其至少包括10个步骤，多耗时2h以上(Kochert et al.1991；Choi et al.1999；Burrow et al.2001；王传堂等.2002；陈静等.2008)。在处理大量样品时，即使利用球磨仪也是十分不便的，不能满足分子标记辅助育种、图谱构建和转化体筛选等高通量研究的要求。如果不是直接用于酶切和Southern杂交，DNA提取步骤可以大大简化。

[0003] PCR技术已成为现代分子生物学研究不可或缺的重要手段。为便于试验的整年进行，建立一套利用不同起始材料快速提取花生DNA用于PCR的技术流程是极为必要的。在花生生长季节直接从室外生长的植株上取样，可以省去发芽、暗培养的麻烦；利用种子胚芽直接提取DNA，可以满足基因克隆、种子检验、遗传多样性分析之需；在转基因和分子标记辅助育种等研究中，如果以种子为起始材料提取DNA，在北方花生产区无温室可用的情况下，可至少提早半年时间进行，从而节省人力和土地资源，但这样的DNA提取方法对种子必须是非破坏性的。迄今利用花生种子提取DNA的报导较少，耗时较长。Chenault等(2007)研究建立了一种非破坏性花生子仁DNA提取方法，需要20mg花生样品即可制备PCR模板，有20个步骤，需要2.5h。胡晓辉等(2009)改进了Kang(1998)等的方法，通过10个步骤，耗时1.5h从半片花生子叶中提取花生DNA，经试验此法影响种子萌发。

[0004] 与其他植物病害上所采用的传统研究方法类似，花生真菌病害的研究一般采用分离培养病原菌的办法进行。从病组织中直接提取DNA，可用于已知病原或未知病原的分子鉴定，推断其分类地位，为分离培养病原提供参考。

发明内容

[0005] 本申请的发明目的是弥补现行DNA提取方法的不足，提供一种花生健康组织和病组织简便快速DNA提取方法。该方法对于花生健康组织及花生病组织同样适用。

[0006] 本申请的DNA提取方法是一套成熟的技术体系，以田间生长的花生叶片、茎组织、成熟的果壳组织、种子胚芽、子叶为起始材料均可进行DNA提取，不受花生生长期的限制，随时都可以进行DNA提取，快速有效的可加速研究进程。

[0007] 本发明通过如下技术方案来实现：

[0008] 研究一种花生健康组织和病组织简便快速DNA提取方法，包括准备样本材料和制备DNA提取液步骤，其特征是：

[0009] 所述的准备样本材料，是指试验取的样本材料是重量在3～10mg的叶片、茎组织、果壳组织或花生子叶；样本材料加入预置有碱裂解液或酶解液的离心管，以研磨棒研磨至无可视颗粒物，备用；

[0010] 所述的制备DNA提取液，是指使用碱煮法或酶解法对上述研磨好的样本材料进行处理，获得样本的DNA提取液，其中：

[0011] 所述的碱煮法，是每个样品在20～60μl的碱裂解液中研磨后，沸水煮10～40sec，加入4倍体积的Tris-HCl，煮沸1～2min后，10000rpm离心5～10min，取上清液，加入等体积TE缓冲液即为DNA提取液；

[0012] 所述的酶解法，是样品在100～200μl酶解液中研磨后，置55～58℃水浴20min，加入同体积的体积比为25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇，10000rpm离心5min，上清液转入另一离心管中，加入同体积异丙醇，10000rpm离心2～5min，弃上清液，沉淀于室温晾干，加入100～150μl TE缓冲液即为DNA提取液。

[0013] 上述的花生组织的DNA提取方法，其特征是所述的碱裂解液是0.1～0.5M NaOH溶液。

[0014] 上述的花生组织的DNA提取方法，其特征是所述的Tris-HCl缓冲液含5～8mg/ml PVP40。

[0015] 上述的花生组织的DNA提取方法，其特征是所述的酶解液是含10mM Tris-HCl、5mMEDTA、5～8mg/ml PVP 40、50～100μg/ml蛋白酶K的溶液。

[0016] 上述的花生组织的DNA提取方法，其特征是所述的TE缓冲液是20ml 0.1M Tris-HCI和0.4ml 5mM EDTA定容200ml配制而成。

[0017] 上述的花生组织的DNA提取方法的应用，其特征是该方法对于花生健康组织及花生病组织同样适用。

[0018] 两种方法所得到的DNA提取液，以15μl反应体系加入2μl模板计算足够50次PCR反应使用。

[0019] 本发明的取样方法独特，在以叶片为起始材料取样时只需以相应内径的管状物(例如，普通中性笔笔芯的后端)按压叶片，使其与周围叶片组织分离即得到直径约1.12mm的叶盘；在以子叶为起始材料时则以普通剃须刀刀片为工具，固定住花生，在远离胚的一端切下重约5mg大小一片即可。

[0020] 本发明的优点：

[0021] 与现有DNA提取方法相比，本发明耗时短，样品用量少，费用低，可以满足花生分子标记辅助育种和转基因育种的要求。碱煮法单个样品用时不超过20min，酶解法单个样品不超过0.5h，而以往的方法至少需要1.5h且研磨时须用液氮。本发明DNA提取每个样品仅需3～10mg即可；无需液氮研磨，对植株生长或种子萌发没有影响，对于花生分子育种技术实用化，具有重要意义。

[0022] 本发明不但可用于花生健康组织的DNA提取，而且适用于花生病组织的DNA提取。

附图说明

[0023] 图1是以花生叶片提取的DNA为模板用引物rDNAa/rDNAb扩增出的花生ITS电泳图；

[0024] 图2是野生种A.duranensis ITS测序图。

[0025] 图3是以花生胚芽提取的DNA为模板采用引物TBPfex1/TBPrex1获得的PCR产物电泳图；

[0026] 图4是以花生病组织提取的DNA为模板扩增出的疮痂病原18s rDNA电泳图；

[0027] 图5是以花生果腐病受害果壳提取的DNA为模板，用引物ITS1/ITS4作PCR扩增获得的产物电泳图；

[0028] 图6是引物对IT-ISJ29R/IT-ISJ3F扩增产物6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。

[0029] 图7是以花生子叶提取的DNA为模板，用引物FL1/FR1扩增获得的花生FAD2基因电泳图；

[0030] 图8是以花生子叶提取的DNA为模板用引物rDNA a/rDNA b扩增出的花生ITS电泳图；

[0031] 图9中1-8是以待检测的花生材料子叶提取的DNA为模板用EGFP引物EGPF-F1/EGPF-R1作PCR扩增产物电泳图(P为阴性对照)。

具体实施方式

[0032] 以下结合附图和实施例对本发明进一步阐述。

[0033] 图1中，M为分子量标准，1为栽培种与野生种杂交后代，2为化学突变体。

[0034] 图3中，M为分子量标准，1、2、3为不同的栽培品种，4为A.rigonii杂种后代，5为A.glabrata的杂种后代。

[0035] 图4中，M为分子量标准，L为从病叶制备DNA扩增出的18s rDNA，S为茎部病斑制备DNA扩增出的18S rDNA。

[0036] 图5中，M为Takara DL2000DNA分子量标准，1～3为3个不同的果腐病荚果。

[0037] 图6中，M为分子量标准，1～20分别为B4、Valencia 101、08-29、08-30、08-31、花育16、08测-A2、A6、A7、A8、A10、A30、狮头企、伏花生、常青一丛生、沂北一窝猴、汶上爬蔓生、三荚公、睢宁二窝、兴城红崖伏大。

[0038] 图7中，M为分子量标准，1～7分别为泉花646、泉花10、粤油256、JYH1、CTWE、FB4、远杂9307的PCR产物。

[0039] 图8中，M为分子量标准，1～7分别为泉花646、泉花10、粤油256、JYH1、CTWE、FB4、远杂9307的PCR产物。

[0040] 图9中，M为分子量标准，1～8分别为通过转基因技术获得的待检测种子8粒。

[0041] 实施例一：从花生叶片中提取DNA

[0042] 一、试验材料及试剂

[0043] 材料：本试验采用3个基因型，包括野生种(Arachis.duranensis)、1个栽培种与野生种A.glabrata的杂交后代，1个化学突变体材料。

[0044] 试剂：碱裂解液，含5～8mg/ml PVP40的Tris-HCl缓冲液。

[0045] 二、试验方法

[0046] 1.模板制备

[0047] A、在花生植株上选取一片小叶，用中性笔芯在主脉一侧打孔，获取直径约1.12mm叶盘。当花生材料比较珍贵或花生生长早期叶片数目较少时为尽量减少对其生长发育的影响，可直接在植株上打孔取样。

[0048] B、将叶盘置于加有60μl碱裂解液的1.5ml离心管中(可冷冻保存备用)，用研磨棒研磨无肉眼可见的颗粒。

[0049] C、煮沸30sec，加入4倍体积Tris-HCl缓冲液。

[0050] D、煮沸2min，12000rpm离心5min。

[0051] E、取上清液，加入等体积的TE缓冲液即为DNA提取液。

[0052] 2.PCR

[0053] PCR体系：12.5μl 2×Tiangen Taq PCR MasterMix、10μM引物

[0054] 引物序列由我们在网上找到已经公开的特异性引物，然后由Genscript(金思特)公司合成的，一般是一管2OD。

[0055] (rDNAa：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG/rDNAb：CCTCCTCCGCTTATTGATATGC)各0.5μl、2μlDNA模版，9.5μl无菌去离子水。

[0056] PCR条件：94℃预变性3min，94℃50sec，55℃1min，72℃1.5min，35个循环，72℃延伸7min。

[0057] 3.PCR产物回收纯化、测序

[0058] PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，100V，30min，电泳图片显示得到目的片段，进一步将PCR产物回收(Tiangen，普通DNA产物纯化试剂盒)，按照试剂盒说明书进行操作。回收后的目的片段连接于pBS-T载体，转化(Tiangen，pBS-T克隆试剂盒)，按照克隆试剂盒说明书进行操作，挑取白色阳性单菌落接种于1ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃倒置培养过夜，送Genscript公司测序。

[0059] 三、结果

[0060] 电泳图片(说明书附图图1)显示目的DNA片段清晰，在另一项研究中显示即使蜡质层很厚的野生种花生也适用此方法提取DNA，其测序结果良好(说明书附图图2)，3个材料均得到了目的片段，证实此方法简单可靠，适用于不同类型花生栽培种材料叶片DNA的提取，且不需刻意选择幼嫩叶片。

[0061] 实施例二：从花生胚芽中提取DNA

[0062] 一、试验材料及试剂

[0063] 材料：本实验采用5个基因型材料，包括1个栽培种与野生种A.rigonii的杂种后代，1个化学突变体，3个花生栽培品种。

[0064] 试剂：碱裂解液，含5～8mg/ml PVP40的Tris-HCl缓冲液。

[0065] 二、试验方法

[0066] 1.模板制备

[0067] 取一粒花生种子，剥开两片子叶，用小刀切取胚芽部分，即几片未成熟叶片。以下步骤同方案一B、C、D、E。

[0068] 2.PCR

[0069] PCR体系：12.5μl 2×Taq PCR MasterMix、10nM引物(TBPfex1/TBPrex1) 各0.5μL、2μLDNA模版，9.5μL无菌去离子水。

[0070] PCR条件：94℃预变性3min，94℃50sec，55℃1min，72℃1.5min，35个循环，72℃延伸7min。

[0071] 3.PCR产物电泳分离

[0072] PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，100V，30min。

[0073] 三、结果

[0074] PCR产物电泳图片(说明书附图3)显示目的DNA提取效果较好，5个材料均得到了目的基因片段，证实此方法简单可靠，可适用于不同类型材料胚芽DNA提取。

[0075] 实施例三：从疮痂病病组织中克隆真菌18S rDNA

[0076] 一、试验材料及试剂

[0077] 材料：花生疮痂病病组织。

[0078] 试剂：碱裂解液，含5～8mg/ml PVP40的Tris-HCl缓冲液。

[0079] 二、试验方法

[0080] 1.模板制备

[0081] 在花生植株上选取一片疮痂病病叶，用中性笔芯在主脉一侧打孔，获取直径约1.12mm叶盘；茎部病害组织则以剃须刀片切取直径约4mm的薄片。以下步骤同实施例一中“模板制备”的B、C、D、E步骤。

[0082] 2.PCR

[0083] PCR体系：25μl 2×Tiangen Taq PCR MasterMix、10μM真菌特异性引物(NS26：5’-CTGCCCTATCAACTTTCGA-3’/R518：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)各2μl、1μLDNA模版，
20μl无菌去离子水。

[0084] PCR条件：95℃预变性6min，94℃1min，55℃50sec，72℃1min，32个循环，72℃延伸6min。

[0085] 3.PCR产物回收纯化、测序

[0086] PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，100V，30min，以下步骤同实施例一。

[0087] 三、结果

[0088] PCR反应后凝胶电泳(说明书附图4中)证实从病叶和病茎种提取的病原菌18sDNA完全一致，表明此方法简单可靠，重复性强。进一步测序得到的花生疮痂病病原菌的
18S rDNA序列如下：TGC CCT ATC AAC TTT CGA TGG TAG GAT AGT GGC CTA CCA TGG TGG TGACGG GTG ACG GAG AAT TAG GGT TCG ATT CCG GAG AGG GAG CCT GAG AAA CGGCTA CCA CAT CCA AGG AAG GCA GCA GGC GCG CAAATT ACC CAA TCC TG ACA CGGGGA GGT AGT GAC AAT AAA TAA CAA TAC CGG GCT CAT AGA GTC TGG TAA TTGGAA TGA GTA CAA TCT AAA TCC CTT AAC GAG GAT CCA TTG GAG GGC AAG TCTGGT GCC AGC AGC CGC GGT AAT。表明碱裂解法完全适用于花生真菌病原研究。

[0089] 实施例四：花生果腐病组织中提取真菌DNA，鉴定病原菌

[0090] 一、试验材料及试剂

[0091] 材料：花生果腐病受害果壳。

[0092] 试剂：碱裂解液，含5～8mg/ml PVP40的Tris-HCl缓冲液。

[0093] 二、试验方法

[0094] 1.模板制备

[0095] 取受害果壳的中间层约6.5mm2的薄片，以下步骤同实施例一。

[0096] 2.PCR

[0097] PCR体系：12.5μl 2×Tiangen Taq PCR MasterMix、10μM通用真菌特异性引物(ITS1：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’/ITS4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)各1μl、1μl DNA模版，4.5μl无菌去离子水。

[0098] PCR条件：95℃预变性5min，95℃30sec，50℃30sec，72℃1min，35个循环，72℃延伸5min。

[0099] 3.PCR产物回收纯化、测序

[0100] PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，100V，30min，回收测序等试验方法同实施例一。

[0101] 三、结果

[0102] PCR产物凝胶电泳(说明书附图5中)证实有目的片段，进一步测序得到的病原菌ITS序列与GenBank中收录的镰孢菌序列高度同源。表明此方法适用于果腐病真菌病原研究。具体序列如下：

[0103] TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTCATCAACCCTGTGAACATACCTAAAACGTTGCTTCGGCGGGAACAGACGGCCCTGTAACAACGGGCCGCCCCCGCCAGAGGACCCCTAACTCTGTTTTTATAATGTTTTTCTGAGTAAACAAGCAAATAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGGATCGGCGGAAGCCCCCTGTGGGCACACGCCGTCCCTCAAATACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAGAGCGGCGCGGCCATGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。

[0104] 实施例五：从叶片中提取DNA，进行IT-ISJ标记研究

[0105] 一、试验材料及试剂

[0106] 材料：如下表。

[0107] 表2.花生材料来源

[0108]

[0109] 试剂：碱裂解液，含5～8mg/ml PVP40的Tris-HCl缓冲液。

[0110] 二、试验方法

[0111] 1.模板制备

[0112] 同实施例一。

[0113] 2.PCR

[0114] PCR 体 系：7.5μl 2×Taq PCR MasterMix、10nM 引 物 各 (IT-ISJ29R：GGAATTCCACCTGCACTA/IT-ISJ3F：GCATGCCAGGTAAGTAAG)各0.75μl、2μlDNA模版，6μl无菌去离子水。

[0115] PCR条件：94℃预变性5min，94℃45sec，50℃45sec，72℃1min，40个循环，72℃延伸10min。。

[0116] 3.PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳

[0117] 6％聚丙烯酰胺凝胶电泳30min，快速银染法染色。

[0118] 三、结果

[0119] PCR反应后聚丙烯酰胺凝胶电泳(电泳图在说明书附图6中)，根据凝胶图统计其多态性情况见表3，显示材料条带多态性较好。本试验进行了3次重复，带型没有发生变化，说明此方法简单可靠，所提取的DNA可用于分子标记的研究。

[0120] 表3.引物对IT-ISJ29R/IT-ISJ3F对20份花生样品的扩增效果

[0121]

[0122] 实施例六：从子叶中提取DNA

[0123] 一、试验材料及试剂

[0124] 表1花生材料来源

[0125]

[0126]

[0127] 试剂：含10mMTris-HCl、5mM EDTA、5～8mg/ml PVP 40、50～100μg/ml蛋白酶K的酶解液、TE缓冲液。

[0128] 二、试验方法

[0129] 1.模板制备

[0130] A、取一粒花生种子，用剃须刀片切取约0.40mm厚一薄片子叶，尽量减少对子叶的损伤。

[0131] B、将其置于加有200μl酶解液的1.5ml离心管中(可冷冻保存备用)，用研磨棒研磨无肉眼可见的颗粒。

[0132] C、55℃水浴20min，加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇。

[0133] D、10000rpm离心5min。

[0134] E、取上清液，加入等积异丙醇，10000rpm离心2-5min。

[0135] F、弃上清液，沉淀于室温晾干，加入与上清等体积的TE缓冲液即为DNA提取液。

[0136] 2.PCR

[0137] PCR体系：7.5μl 2×Taq PCR MasterMix、10nM引物各(FL1：5’-AAG GGT TCC ACA TTCAAA CCC TCC ATT-3’，FR1：5’-CAA TGC TTT GTA AAC TGG GGT GCC ATC-3’以及rDNAa/rDNA b)各0.6μl、2μlDNA模版，4.3μl无菌去离子水。

[0138] PCR条件：引物FL1/FR1对应条件：94℃预变性3min，94℃1min，67℃30sec，72℃1min，35个循环，72℃延伸2min；引物rDNA a/rDNA b对应条件：94℃预变性3min，
94℃50sec，55℃1min，72℃1min 30sec，35个循环，72℃延伸7min。

[0139] 3.PCR产物电泳

[0140] FL1/FR1、rDNA a/rDNA b引物扩增的PCR产物分别经2％、0.8％琼脂糖凝胶电泳，30min。

[0141] 三、结果

[0142] PCR产物凝胶电泳(电泳图在说明书附图7、8中)显示此方法适用于不同基因型花生材料子叶DNA的提取。

[0143] 实施例七：从子叶中提取DNA鉴定转基因种子

[0144] 一、试验材料及试剂

[0145] 材料：通过转基因技术获得的待检测筛选种子8份。

[0146] 试剂：含10mM Tris-HCl、5mM EDTA、5～8mg/ml PVP 40、50～100μg/ml蛋白酶K的酶解液、TE缓冲液。

[0147] 二、试验方法

[0148] 1.模板制备

[0149] 同实施例六的模板制备。

[0150] 2.PCR

[0151] PCR 体 系：12.5μl 2×Taq PCR MasterMix、10nM 引 物 各 (EGPF-F1：ACCCTCGTGACCACCCTGACCTAC/EGPF-R1：GACCATGTGATCGCGCTTCTCGTT)各0.5μl、1μlDNA模版，10.5μl无菌去离子水。

[0152] PCR条件：94℃预变性3min，94℃1min，61.6℃40sec，72℃1min，35个循环，72℃延伸5min。

[0153] 3.PCR产物凝胶电泳

[0154] 1.0％琼脂糖凝胶电泳，30min。

[0155] 三、结果

[0156] PCR产物凝胶电泳(电泳图在说明书附图9中)显示有6份阳性材料。说明此方法适用于转基因材料的筛选鉴定研究。

[0157] 参考文献：

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