基于VSIG4的模拟病毒及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种基于VSIG4的模拟病毒及其制备方法和应用，该模拟病毒是以穿膜肽HIV-Tat49-57和路易斯寡糖-x的复合物为基因载体包裹VSIG4基因重组表达载体自组装而成；将该模拟病毒转染树突状细胞并与同种异体T细胞共培养，能够有效降低同种异体T细胞的增殖能力、细胞因子分泌能力和表面分子的活化分子表达率，表明该模拟病毒能够有效诱导T细胞耐受，可用于制备诱导T细胞耐受的药物，在移植排斥、自身免疫性疾病和过敏性疾病的治疗领域具有良好的开发应用前景。

权利要求

1.基于VSIG4的模拟病毒，其特征在于：该模拟病毒是以穿膜肽HIV-Tat

49-57和路易斯寡糖-x的复合物为基因载体包裹VSIG4基因重组表达载体自组装而成；所述穿膜肽HIV-Tat49-57和路易斯寡糖-x的复合物是由穿膜肽HIV-Tat49-57与路易斯寡糖-x通过链霉亲和素与生物素的高亲和力结合而成。

2.根据权利要求1所述基于VSIG4的模拟病毒，其特征在于：所述VSIG4基因重组表达载体是将VSIG4全长cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1中而得到。

3.权利要求1所述基于VSIG4的模拟病毒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、构建VSIG4基因重组表达载体：提取人肺组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以总cDNA为模板，PCR扩增VSIG4全长cDNA，将VSIG4全长cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点，制得VSIG4基因重组表达载体pcDNA3.1/VSIG4；

b、穿膜肽HIV-Tat49-57和路易斯寡糖-x的复合物的制备：将链霉亲和素与Traut’s试剂反应制得巯基化修饰的链霉亲和素，再将巯基化修饰的链霉亲和素与穿膜肽HIV-Tat49-57于4℃保温反应3～5小时，制得穿膜肽HIV-Tat49-57与链霉亲和素的交联物，再将穿膜肽HIV-Tat49-57与链霉亲和素的交联物与(路易斯寡糖-X)-聚丙烯酸钠-生物素于37℃保温反应0.5～2小时，再于室温反应10～60分钟，制得穿膜肽HIV-Tat49-57与路易斯寡糖-x的复合物；

c、模拟病毒的制备：于室温、涡旋条件下，向含有VSIG4基因重组表达载体pcDNA3.1/VSIG4和NaCl的水溶液中，缓慢滴加穿膜肽HIV-Tat49-57和路易斯寡糖-x的复合物，滴加完毕后，室温涡旋25～35分钟，再静置25～35分钟，即得基于VSIG4的模拟病毒。

4.根据权利要求3所述基于VSIG4的模拟病毒的制备方法，其特征在于：步骤a的具体方法为：提取人肺组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以巢式PCR扩增VSIG4全长cDNA：第一轮PCR以总cDNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列为上下游引物；第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列为上下游引物；每轮PCR的循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，

72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pMD19-T载体，得重组载体pMD19-T/VSIG4；自重组载体pMD19-T/VSIG4中用Pst I和EcoR I双酶切出VSIG4全长cDNA，经纯化后与同样经Pst I和EcoR I双酶切的真核表达载体pcDNA3.1连接，得VSIG4基因重组表达载体pcDNA3.1/VSIG4。

5.根据权利要求3所述基于VSIG4的模拟病毒的制备方法，其特征在于：步骤b的具体方法为：将链霉亲和素与Traut’s试剂在含有PBS和乙二胺四乙酸的水溶液中4℃避光反应2小时，超滤脱盐，再用含有PBS和乙二胺四乙酸的水溶液稀释后继续超滤以稀释Traut’s试剂，制得巯基化修饰的链霉亲和素；将巯基化修饰的链霉亲和素与穿膜肽HIV-Tat49-57于4℃保温反应4小时，制得穿膜肽HIV-Tat49-57与链霉亲和素的交联物；

再在酶标板中加入(路易斯寡糖-X)-聚丙烯酸钠-生物素溶液，4℃包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，加入牛血清白蛋白溶液，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，加入穿膜肽HIV-Tat49-57与链霉亲和素的交联物溶液，37℃保温反应1小时，再室温反应30分钟，即得穿膜肽HIV-Tat49-57与路易斯寡糖-x的复合物。

6.根据权利要求3所述基于VSIG4的模拟病毒的制备方法，其特征在于：步骤c的具体方法为：于室温、涡旋条件下，向含有浓度为500μg/ml的pcDNA3.1/VSIG4和浓度为1mg/ml的NaCl的水溶液中，缓慢滴加等体积的浓度为200μg/ml的穿膜肽HIV-Tat49-57与路易斯寡糖-x的复合物溶液，滴加完毕后，室温下涡旋30分钟，再静置30分钟，即得基于VSIG4的模拟病毒。

7.权利要求1所述基于VSIG4的模拟病毒在制备诱导T细胞耐受的药物中的应用。

说明书

基于VSIG4的模拟病毒及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种模拟病毒，特别涉及一种基于VSIG4的模拟病毒，还涉及该模拟病毒的制备方法和应用。

背景技术

[0002] 诱导免疫耐受是治疗移植排斥、自身免疫性疾病和过敏性疾病的重要方式。由于T细胞的活化在机体免疫系统的活化中扮有重要角色，因此，在诱导免疫耐受的各种策略中，诱导T细胞耐受是一种比较理想的策略。研究表明，T细胞的活化不仅需要抗原肽与主要组织相容性复合体(MHC)的复合刺激，而且需要B7家族成员提供关键的共刺激信号。

[0003] 含 V-set 和 免 疫 球 蛋 白 域 4(V-set and Ig domain containing 4，VSIG4)又称补体受体免疫球蛋白超家族分 子(Complement receptor of the immunoglobulinsuperfamily，CRIg)，是一种新发现的B7家族相关蛋白。VSIG4的mRNA高表达于成人肺、胎盘、肝和心脏等组织，但VSIG4主要局限表达于巨噬细胞，在单核细胞中几乎没有表达，并且当巨噬细胞受外来刺激活化后VSIG4表达下调。既往研究发现，VSIG4是巨噬细胞上的补体受体，可结合补体C3的降解片段C3b和iC3b，对于病原体的吞噬起重要作用。最近的研究显示，VSIG4有抑制T细胞活化的作用，且作用强于PD-Ls/PD-1途径，是一个有力的T细胞活化负调节分子。

[0004] 树突状细胞(DC)不仅是机体内功能最强大的抗原递呈细胞，可以有效激活初始T细胞启动免疫应答反应，而且树突状细胞本身具有调节免疫反应、诱导免疫耐受的作用。体外构建携带免疫抑制分子基因的重组病毒并转染树突状细胞制成树突状细胞疫苗，再将其回输体内，已广泛应用于诱导免疫耐受等方面的治疗。而将蛋白或基因疫苗直接体内靶向树突状细胞，是更简便、更易于临床操作的方式，但其存在如下问题：既往研究的蛋白疫苗多以树突状细胞表达的Fc受体、补体受体、甘露糖受体、CD40或B7为靶向受体，因这些受体在血细胞上也有表达，从而在树突状细胞特异性靶向方面有所欠缺；基因疫苗多采用具有高转染率的病毒载体，但大多数病毒载体并不能特异性靶向树突状细胞，且病毒载体本身可能表达大量的具有免疫原性的蛋白，不仅会干扰目的基因的免疫效果，而且可能导致含目的基因的病毒载体被机体迅速清除，另外，生物安全性也是病毒载体的固有缺陷。

[0005] 树突状细胞表面特异性C型凝集素-细胞间黏附分子3结合非整合素分子(DC-SIGN)是新近发现的限制性表达于树突状细胞和某些组织巨噬细胞上的凝集素受体，可以有效摄取颗粒性抗原和可溶性抗原，再以MHC I类分子和II类分子限制性方式进行抗原递呈，因此，DC-SIGN是较好的树突状细胞特异性靶向受体。进一步研究发现，与DC-SIGN结合的实际是表达于自然配体上的结构简单的寡糖，主要有高甘露糖结构和Lewis系列包括路易斯寡糖-a(Lea)、路易斯寡糖-x(Lex)和路易斯寡糖-y(Ley)等。其中，高甘露糖结构虽然可被DC-SIGN高效摄取，但对DC-SIGN的靶向特异性较差，同时可被甘露糖受体等其他凝集素受体识别、摄取；而路易斯寡糖-x是DC-SIGN的高亲和力配体，对DC-SIGN具有较强的特异性。

[0006] 来源于人类免疫缺陷病毒(HIV)I型的穿膜肽HIV-Tat49-57为带正电荷的短肽，可通过静电作用与带负电荷的质粒DNA聚合形成致密颗粒，显著增强质粒DNA在体内外的转染效率。

发明内容

[0007] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于VSIG4的模拟病毒，能够有效诱导T细胞耐受；目的之二在于提供所述基于VSIG4的模拟病毒的制备方法；目的之三在于提供所述基于VSIG4的模拟病毒在医药方面的应用。

[0008] 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0009] 1、基于VSIG4的模拟病毒，该模拟病毒是以穿膜肽HIV-Tat 49-57和路易斯寡糖-x的复合物为基因载体包裹VSIG4基因重组表达载体自组装而成。

[0010] 进一步，所述穿膜肽HIV-Tat49-57和路易斯寡糖-x的复合物是由穿膜肽HIV-Tat49-57与路易斯寡糖-x通过链霉亲和素与生物素的高亲和力结合而成；

[0011] 进一步，所述VSIG4基因重组表达载体是将VSIG4全长cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1中而得到。

[0012] 2、所述基于VSIG4的模拟病毒的制备方法，包括以下步骤：

[0013] a、构建VSIG4基因重组表达载体：提取人肺组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以总cDNA为模板，PCR扩增VSIG4全长cDNA，将VSIG4全长cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点，制得VSIG4基因重组表达载体pcDNA3.1/VSIG4；

[0014] b、穿膜肽HIV-Tat49-57和路易斯寡糖-x的复合物的制备：将链霉亲和素与Traut’s试剂反应制得巯基化修饰的链霉亲和素，再将巯基化修饰的链霉亲和素与穿膜肽HIV-Tat49-57于4℃保温反应3～5小时，制得穿膜肽HIV-Tat49-57与链霉亲和素的交联物，再将穿膜肽HIV-Tat49-57与链霉亲和素的交联物与(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素于37℃保温反应0.5～2小时，再于室温反应10～60分钟，制得穿膜肽HIV-Tat49-57与路易斯寡糖-x的复合物；

[0015] c、模拟病毒的制备：于室温、涡旋条件下，向含有VSIG4基因重组表达载体pcDNA3.1/VSIG4和NaCl的水溶液中，缓慢滴加穿膜肽HIV-Tat49-57和路易斯寡糖-x的复合物，滴加完毕后，室温涡旋25～35分钟，再静置25～35分钟，即得基于VSIG4的模拟病毒。

[0016] 进一步，步骤a的具体方法为：提取人肺组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以巢式PCR扩增VSIG4全长cDNA：第一轮PCR以总cDNA为模板，以SEQID No.1和SEQ ID No.2所示序列为上下游引物；第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列为上下游引物；每轮PCR的循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pMD19-T载体，得重组载体pMD19-T/VSIG4；自重组载体pMD19-T/VSIG4中用Pst I和EcoR I双酶切出VSIG4全长cDNA，经纯化后与同样经Pst I和EcoR I双酶切的真核表达载体pcDNA3.1连接，得VSIG4基因重组表达载体pcDNA3.1/VSIG4；

[0017] 进一步，步骤b的具体方法为：将链霉亲和素与Traut’s试剂在含有PBS和乙二胺四乙酸的水溶液中4℃避光反应2小时，超滤脱盐，再用含有PBS和乙二胺四乙酸的水溶液稀释后继续超滤以稀释Traut’s试剂，制得巯基化修饰的链霉亲和素；将巯基化修饰的链霉亲和素与穿膜肽HIV-Tat49-57于4℃保温反应4小时，制得穿膜肽HIV-Tat49-57与链霉亲和素的交联物；再在酶标板中加入(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素溶液，4℃包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，加入牛血清白蛋白溶液，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，加入穿膜肽HIV-Tat49-57与链霉亲和素的交联物溶液，37℃保温反应1小时，再室温反应30分钟，即得穿膜肽HIV-Tat49-57与路易斯寡糖-x的复合物；

[0018] 进一步，步骤c的具体方法为：于室温、涡旋条件下，向含有浓度为500μg/ml的pcDNA3.1/VSIG4和浓度为1mg/ml的NaCl的水溶液中，缓慢滴加等体积的浓度为200μg/ml的穿膜肽HIV-Tat49-57与路易斯寡糖-x的复合物溶液，滴加完毕后，室温下涡旋30分钟，再静置30分钟，即得基于VSIG4的模拟病毒。

[0019] 3、所述基于VSIG4的模拟病毒在制备诱导T细胞耐受的药物中的应用。

[0020] 本发明的有益效果在于：穿膜肽HIV-Tat49-57与路易斯寡糖-x的复合物带正电荷，可以与带负电荷的VSIG4基因重组表达载体通过静电作用聚合形成与天然病毒大小相近的致密颗粒，该颗粒具有穿膜肽HIV-Tat49-57的穿膜活性，易于被抗原递呈细胞摄取，体内转染效率高；通过路易斯寡糖-x的导向作用，该颗粒特异性靶向树突状细胞，使VSIG4基因重组表达载体在树突状细胞内表达VSIG4，从而有效诱导T细胞耐受；研究结果显示，本发明模拟病毒转染的树突状细胞与同种异体T细胞共培养，能够有效降低同种异体T细胞的增殖能力、细胞因子分泌能力和表面分子的活化分子表达率，表明本发明的模拟病毒能够有效诱导T细胞耐受，可用于制备诱导T细胞耐受的药物，在移植排斥、自身免疫性疾病和过敏性疾病的治疗领域具有良好的开发应用前景。

附图说明

[0021] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

[0022] 图1为VSIG4基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；

[0023] 图2为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测穿膜肽HIV-Tat49-57与链霉亲和素的交联物；

[0024] 图3为SDS-PAGE检测穿膜肽HIV-Tat49-57与路易斯寡糖-x的复合物；

[0025] 图4为T细胞增殖能力检测图；

[0026] 图5为T细胞分泌细胞因子能力检测图；

[0027] 图6为T细胞表面分子的活化分子表达率检测图。

具体实施方式

[0028] 以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0029] 一、基于VSIG4的模拟病毒的制备

[0030] 1、VSIG4基因重组表达载体的构建

[0031] 按Trizol试剂说明书提取人肺组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再用巢式PCR法扩增VSIG4全长cDNA：第一轮PCR以总cDNA为模板，以F1：5’-ggtagcaggaggctggaagaaag-3’(SEQ ID No.1)和R1：5’-tcagcagatcctggcctaatgg-3’(SEQ ID No.2)为上下游引物；第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，以F2：5’-aatctgcaggccaccatggggatcttactgggcctg-3’(SEQ ID No.3，下划线部分为Pst I酶切位点)和R2：5’-tacgaattcttaacagacacttttgccctcag-3’(SEQ ID No.4，下划线部分为EcoR I酶切位点)为上下游引物；每轮PCR的体系为50μl，循环条件参数为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pMD19-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，双酶切和PCR法鉴定，并送上海英骏生物技术有限公司测序验证，将阳性克隆质粒命名为pMD19-T/VSIG4。琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约1200bp处出现唯一特异性条带(图1)，与目的片段大小相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列(SEQ ID No.5)与GenBank登录号为NM 007268的VSIG4全长cDNA序列一致。

[0032] 自阳性克隆质粒pMD19-T/VSIG4中用Pst I和EcoR I双酶切出VSIG4全长cDNA，经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经Pst I和EcoR I双酶切的真核表达载体pcDNA3.1连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，双酶切和PCR法鉴定，并送上海英骏生物技术有限公司测序验证，所得阳性克隆质粒即为获得VSIG4基因重组表达载体，将其命名为pcDNA3.1/VSIG4。

[0033] 2、穿膜肽HIV-Tat49-57与路易斯寡糖-x的复合物的制备

[0034] 取浓度为5mg/ml的链霉亲和素溶液1ml，加入新鲜配制的浓度为2mg/ml的Traut’s试剂68.8μl、10×PBS 0.2ml、浓度为0.5mol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液8μl和超纯水1ml，混匀，4℃避光反应2小时，超滤离心管10KD超滤脱盐，再用由1×PBS和浓度为2mmol/L的EDTA组成的平衡溶液稀释后继续超滤以稀释Traut’s试剂，得巯基化修饰的链霉亲和素溶液；向上述巯基化修饰的链霉亲和素溶液中，加入浓度为10mg/ml的穿膜肽HIV-Tat49-57溶液200μl，混匀，4℃反应4小时，得穿膜肽HIV-Tat49-57与链霉亲和素的交联物HIVtat-SA溶液，用Sepharose 4B柱纯化后，冻干保存，取样进行SDS-PAGE鉴定，结果如图2所示，其中M泳道为蛋白质分子量标准，1泳道为HIVtat-SA，可见1泳道在14KD处出现电泳带，与预期结果相符。

[0035] 在酶标板中，每孔加入浓度为10μg/ml的Lex-PAA-biotin，4℃包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，再加入质量百分浓度为2％的BSA溶液(以PBS为溶剂)，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，加入浓度为10μg/ml的HIVtat-SA溶液，37℃反应1小时，再室温反应30分钟，即得穿膜肽HIV-Tat49-57与路易斯寡糖-x的复合物HIVtat-Lex溶液，冻干保存，取样进行SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示，其中M泳道为蛋白质分子量标准，1泳道为HIVtat-Lex，可见1泳道在14KD处出现电泳带，与预期结果相符。

[0036] 3、基于VSIG4的模拟病毒的制备

[0037] 于室温、涡旋条件下，向含有浓度为500μg/ml的pcDNA3.1/VSIG4和浓度为1mg/ml的NaCl的水溶液100μl中，以5μl/min的速度滴加浓度为200μg/ml的HIVtat-Lex溶液100μl，滴加完毕后，室温下涡旋30分钟，再静置30分钟，即得基于VSIG4的模拟病毒。

[0038] 二、基于VSIG4的模拟病毒诱导T细胞耐受能力的检测

[0039] 1、分选树突状细胞

[0040] 取健康志愿者外周血浓缩白细胞，用淋巴细胞分离液密度梯度离心，获得外周血单个核细胞(PBMC)，将PBMC用完全RPMI1640培养基重悬后接种于6孔板，在温度为37℃、CO2气体体积分数为5％的条件下培养2小时，吸弃培养上清液，洗涤培养板2次去除非贴壁细胞，获得贴壁的单核细胞，每孔加入完全DMEM培养基3.3ml，并加入浓度为50 ng/mL的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和浓度为20ng/mL的白介素4(IL-4)，在温度为37℃、CO2气体体积分数为5％的条件下培养，每隔48小时补充完全培养基、GM-CSF和IL24，培养第5天收获细胞，即得树突状细胞。

[0041] 2、基于VSIG4的模拟病毒转染树突状细胞

[0042] 将树突状细胞于6孔板内单层培养至覆盖面积约30％，换入无血清DMEM培养基2ml，再加入基于VSIG4的模拟病毒100μl，孵育4小时，换入完全DMEM培养基培养48小时，收集细胞，用PBS洗涤并重悬，即得基于VSIG4的模拟病毒转染的树突状细胞。

[0043] 3、T细胞增殖能力检测

[0044] 取健康志愿者外周血浓缩白细胞，用淋巴细胞分离液密度梯度离心获得PBMC，将PBMC用完全RPMI1640培养基重悬后接种于6孔板，在温度为37℃、CO2气体体积分数为5％的条件下培养2小时，收集悬浮细胞，磁珠分选CD4+T细胞和CD8+T细胞(纯度大于95％)作为同种反应细胞。取基于VSIG4的模拟病毒转染树突状细胞，用丝列霉素处理2小时作6
为刺激细胞，用完全RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×10 个/ml，接种至96孔板，每孔
100μl，同时设对照组(未经模拟病毒转染的树突状细胞)，每组设3个复孔，每孔再加入
5
1×10 个同种CD4+T细胞或CD8+T细胞，在温度为37℃、CO2气体体积分数为5％的条件下共
3
培养96小时，再每孔加入浓度为1×10μCi/L的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)溶液0.1ml，继续培养12小时，用PBS漂洗细胞3次，甲醛固定10分钟，再用温度4℃预冷的体积分数为
5％的三氯醋酸溶液漂洗3次，每孔加入0.5ml浓度为0.3mol/L的NaOH溶液，60℃水浴反应30分钟，冷却至室温，转移入闪烁瓶中，加入5ml闪烁液，用液体闪烁计数器计数每分钟的闪烁次数(cpm)，测定DPM值(反映细胞DNA合成速率)，每组重复测定3次。

[0045] 结果见图4，与基于VSIG4的模拟病毒转染树突状细胞共培养的CD4+T细胞的cpm值为28000±3600，相应对照组的cpm值为55000±6200；而与基于VSIG4的模拟病毒转染树突状细胞共培养的CD8+T细胞的cpm值为36000±3900，相应对照组的cpm值为53000±5900；表明本发明模拟病毒转染树突状细胞能够有效降低CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖能力。

[0046] 2、T细胞分泌细胞因子能力检测

[0047] 取健康志愿者外周血浓缩白细胞，用淋巴细胞分离液密度梯度离心获得PBMC，将PBMC用完全RPMI1640培养基重悬后接种于6孔板，在温度为37℃、CO2气体体积分数为5％的条件下培养2小时，收集悬浮细胞，磁珠分选CD4+T细胞和CD8+T细胞(纯度大于95％)作为同种反应细胞。取基于VSIG4的模拟病毒转染树突状细胞，用丝列霉素处理2小时作6
为刺激细胞，用完全RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×10 个/ml，接种至96孔板，每孔
100μl，同时设对照组(未经模拟病毒转染的树突状细胞)，每组设3个复孔，每孔再加入
5
1×10 个同种CD4+T细胞或CD8+T细胞，在温度为37℃、CO2气体体积分数为5％的条件下共培养96小时，用ELISA法检测白介素2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)的含量。

[0048] 结果见图5，与基于VSIG4的模拟病毒转染树突状细胞共培养的CD4+T细胞分泌IL-2和IFN-γ的量分别为52.7±4.5pg/ml和47.3±5.3pg/ml，相应对照组分泌IL-2和IFN-γ的量分别为111.2±13.4pg/ml和97.6±11.5pg/ml；而与基于VSIG4的模拟病毒转染树突状细胞共培养的CD8+T细胞分泌IL-2和IFN-γ的量分别为46.7±5.1pg/ml和40.3±5.8pg/ml，相应对照组分泌IL-2和IFN-γ的量分别为108.2±10.5pg/ml和92.1±8.4pg/ml；表明本发明模拟病毒转染树突状细胞能够有效降低CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌细胞因子的能力。

[0049] 3、T细胞表面分子的活化分子表达率检测

[0050] 取健康志愿者外周血浓缩白细胞，用淋巴细胞分离液密度梯度离心获得PBMC，将PBMC用完全RPMI1640培养基重悬后接种于6孔板，在温度为37℃、CO2气体体积分数为5％的条件下培养2小时，收集悬浮细胞，磁珠分选CD4+T细胞和CD8+T细胞(纯度大于95％)作为同种反应细胞。取基于VSIG4的模拟病毒转染树突状细胞，用丝列霉素处理2小时作6
为刺激细胞，用完全RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×10 个/ml，接种至96孔板，每孔
100μl，同时设对照组(未经模拟病毒转染的树突状细胞)，每组设3个复孔，每孔再加入
5
1×10 个同种CD4+T细胞或CD8+T细胞，在温度为37℃、CO2气体体积分数为5％的条件下共培养96小时，用CD25或CD69抗体标记细胞，用流式细胞仪检测。

[0051] 结果见图6，与基于VSIG4的模拟病毒转染树突状细胞共培养的CD4+T细胞的CD25和CD69的表达率分别为8.4±2.5％和13.5±2.7％，相应对照组CD25和CD69的表达率分别为13.1±2.7％和23.9±3.6％；而与基于VSIG4的模拟病毒转染树突状细胞共培养的CD8+T细胞的CD25和CD69的表达率分别为7.2±1.8％和8.2±2.3％，相应对照组CD25和CD69的表达率分别为12.1±2.2％和17.9±2.5％；表明本发明模拟病毒转染树突状细胞能够有效降低CD4+T细胞和CD8+T细胞表面分子的活化分子表达率。

[0052] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

[0053] 序列表

[0054] <110>中国人民解放军第三军医大学

[0055] <120>基于VSIG4的模拟病毒及其制备方法和应用

[0056] <160>5

[0057] <210>1

[0058] <211>23

[0059] <212>DNA

[0060] <213>人工序列

[0061] <220>

[0062] <223>引物F1

[0063] <400>1

[0064] ggtagcagga ggctggaaga aag 23

[0065] <210>2

[0066] <211>22

[0067] <212>DNA

[0068] <213>人工序列

[0069] <220>

[0070] <223>引物R1

[0071] <400>2

[0072] tcagcagatc ctggcctaat gg 22[0073] <210>3

[0074] <211>36

[0075] <212>DNA

[0076] <213>人工序列

[0077] <220>

[0078] <223>引物F2

[0079] <400>3

[0080] aatctgcagg ccaccatggg gatcttactg ggcctg 36[0081] <210>4

[0082] <211>32

[0083] <212>DNA

[0084] <213>人工序列

[0085] <220>

[0086] <223>引物R2

[0087] <400>4

[0088] tacgaattct taacagacac ttttgccctc ag 32[0089] <210>5

[0090] <211>1200

[0091] <212>DNA

[0092] <213>智人(homo sapiens)

[0093] <400>5

[0094] atggggatct tactgggcct gctactcctg gggcacctaa cagtggacac ttatggccgt 60[0095] cccatcctgg aagtgccaga gagtgtaaca ggaccttgga aaggggatgt gaatcttccc 120[0096] tgcacctatg accccctgca aggctacacc caagtcttgg tgaagtggct ggtacaacgt 180[0097] ggctcagacc ctgtcaccat ctttctacgt gactcttctg gagaccatat ccagcaggca 240[0098] aagtaccagg gccgcctgca tgtgagccac aaggttccag gagatgtatc cctccaattg 300[0099] agcaccctgg agatggatga ccggagccac tacacgtgtg aagtcacctg gcagactcct 360[0100] gatggcaacc aagtcgtgag agataagatt actgagctcc gtgtccagaa actctctgtc 420[0101] tccaagccca cagtgacaac tggcagcggt tatggcttca cggtgcccca gggaatgagg 480[0102] attagccttc aatgccaggc tcggggttct cctcccatca gttatatttg gtataagcaa 540[0103] cagactaata accaggaacc catcaaagta gcaaccctaa gtaccttact cttcaagcct 600[0104] gcggtgatag ccgactcagg ctcctatttc tgcactgcca agggccaggt tggctctgag 660[0105] cagcacagcg acattgtgaa gtttgtggtc aaagactcct caaagctact caagaccaag 720[0106] actgaggcac ctacaaccat gacatacccc ttgaaagcaa catctacagt gaagcagtcc 780[0107] tgggactgga ccactgacat ggatggctac cttggagaga ccagtgctgg gccaggaaag 840[0108] agcctgcctg tctttgccat catcctcatc atctccttgt gctgtatggt ggtttttacc 900[0109] atggcctata tcatgctctg tcggaagaca tcccaacaag agcatgtcta cgaagcagcc 960[0110] agggcacatg ccagagaggc caacgactct ggagaaacca tgagggtggc catcttcgca 1020[0111] agtggctgct ccagtgatga gccaacttcc cagaatctgg gcaacaacta ctctgatgag 1080[0112] ccctgcatag gacaggagta ccagatcatc gcccagatca atggcaacta cgcccgcctg 1140[0113] ctggacacag ttcctctgga ttatgagttt ctggccactg agggcaaaag tgtctgttaa 1200