法呢基焦磷酸合成酶RNA干扰重组慢病毒载体构建及用途转让专利
申请号 : CN200910156609.7
文献号 : CN101805750B
文献日 : 2011-11-30
发明人 : 胡申江 , 叶炀
申请人 : 浙江大学
摘要 :
本发明提供一种针对法呢基焦磷酸合成酶RNA干扰重组慢病毒载体的构建，在工具细胞293T细胞中筛选出FDS基因RNAi最有效靶序列，合成最有效靶序列的双链DNA连接到pGCSIL-GFP载体，通过酶切测序鉴定成功构建该重组载体。研究表明所构建的RNA干扰载体LV-sh-FDS在新生乳鼠心肌细胞中可下调FDS mRNA水平的表达，同时也能下调心肌肥厚标记如细胞面积和标记基因beta-MHC及BNP的表达，另外在下调FDS的同时也能有效抑制RhoA的活性，可在制备治疗心肌肥厚疾病的药物中应用。也可在制备胆固醇代谢调控药物中的应用。
权利要求 :
1.一种针对法呢基焦磷酸合成酶RNA干扰重组慢病毒载体，其特征在于，所述载体含有慢病毒骨架质粒重组载体pGCSIL-sh-FDS，所述的重组载体是在p-GCSIL-GFP骨架质粒载体的MCS中连接了针对shRNA的双链DNA片段，针对的靶序列为：
1#-GACAGCTTTCTACTCTTTC，合成的DNA片段信息为：1#-1：5’-CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAA GCTGTCt tT TTTTg-3’，
1#-2：5’-aattcaaaaaaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAG T AGAAAGCTGTCtt-3’。
2.一种针对法呢基焦磷酸合成酶RNA干扰重组慢病毒载体制备方法，其特征在于，根据FDS mRNA序列，设计合成了针对shRNA的双链DNA片段如下：正 义 链：5’-CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGT AGAAA GCTGTCt tT TTTTg-3’反 义 链：5’-aattcaaaaaaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAG T A G AAA GCTGTCtt-3’然后将上述DNA片段连接到慢病毒骨架质粒载体pGCSIL-GFP中MCS中建成pGCSIL-sh-FDS重组载体，再将pGCSIL-sh-FDS重组载体、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞，获得所述的重组慢病毒载体LV-sh-FDS。
3.根据权利要求2所述的针对法呢基焦磷酸合成酶RNA干扰重组慢病毒载体制备方法，其特征在于，在合成的DNA片段末端引入Age I和EcoRI酶切位点。
4.根据权利要求2所述的针对法呢基焦磷酸合成酶RNA干扰重组慢病毒载体制备方法，其特征在于，用Age I和EcoRI酶将pGCSIL-GFP酶切消化，回收大片段后将其与DNA片段连接后转化感受态菌，获得重组阳性克隆。
5.根据权利要求1所述的针对法呢基焦磷酸合成酶RNA干扰重组慢病毒载体在制备治疗心肌肥厚药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的针对法呢基焦磷酸合成酶RNA干扰重组慢病毒载体在制备胆固醇代谢调控药物中的应用。
说明书 :
法呢基焦磷酸合成酶RNA干扰重组慢病毒载体构建及用途
技术领域
[0001] 本发明属分子生物学，生物医药及基因工程技术领域，主要涉及针对法呢基焦磷酸合成酶(Farnesylpyrophosphate synthase，FDS)基因的RNA干扰重组慢病毒载体(LV-sh-FDS)的构建及其在心肌肥厚和胆固醇代谢调控中的应用。
背景技术
[0002] 目前研究表明小G蛋白参与心肌肥厚的发生。RhoA属于小G蛋白的超家族成员，有GDP结合的非活性态和GTP结合的活性态两种形式。目前很多研究表明RhoA参与心肌肥厚的发生如血管紧张素II(Ang II)诱导的心肌肥厚。有研究发现过表达Rho-GDI(Rho-GDP分离抑制体)及Rho抑制剂C3exeoezyme可以明显抑制Ang II诱导的心肌肥厚。
[0003] 法呢基焦磷酸合成酶(Farnesylpyrophosphate synthase，FDS)是甲羟戊酸途径中的关键酶，甲羟戊酸途径是哺乳动物体内胆固醇合成的唯一途径。同时FDS也是异戊二烯途径中的关键酶，分解产生的类异戊二烯中间产物为RhoA活化进而发挥功能提供了重要的底物。我们前期的实验表明在培养的乳鼠心肌细胞用1μM Ang II诱导的心肌肥厚模型及自发性高血压大鼠(SHRs)肥厚心肌(该模型心肌中含有高浓度的Ang II)，FDS抑制剂阿伦磷酸钠可以通过明显抑制RhoA活性来抑制心肌肥厚。这些充分显示了FDS在心肌中调节RhoA活性及在心肌肥厚中的可能重要作用。另外我们的研究也表明在培养的乳鼠心肌细胞中用1μM Ang II孵育12-48h，FDS基因得到上调，尤其在24h最为明显。同时在18周自发性高血压大鼠(SHRs)肥厚心肌中也发现了FDS基因的上调。这些前期研究表明了FDS在心肌肥厚中可能的重要作用。
[0004] FDS在其他领域的研究中也表现出相当的重要性。生物学研究显示通过抑制FDS的表达，寄生虫生长速度下降直至最后死亡。另外也有研究表明大鼠前列腺癌细胞中发现FDS高表达。另研究显示下调FDS的表达能通过Vγ9Vδ2T细胞介导的免疫监视作用来靶向治疗肿瘤细胞。
[0005] 所有这些证据表明抑制FDS基因的表达可能阻止Ang II相关的心肌细胞/组织肥厚反应。
[0006] RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是抑制基因表达的常用手段，又叫基因沉默。RNA干扰的原理是当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。
[0007] RNA干扰过程主要有两个步骤：一、双链RNA被细胞源性双链RNA特异性的核酸酶切成21-23个碱基对的短双链RNA，即小干扰RNA(smallinterference RNA，siRNA)二、siRNA的反义链与核酸酶形成了沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，该复合体具有识别结合与小干扰RNA有同源序列的mRNA，并在特异位点将该mRNA切断。RNA干扰技术目前在基因治疗及研究中得到了广泛的应用，同时那些在靶标实验中证明有效的siRNA/shRNA本身可以进一步开发成为RNAi药物。shRNA即短发夹RNA(short hairpin RNA)包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补)，中间loop序列分隔组成发夹结构。在体内shRNA被加工成siRNA有效降解目的基因抑制其表达。但是要将该技术应用于临床治疗，需要解决RNA干扰片段表达持续及表达效率等重要问题。
[0008] 目前基因治疗的载体主要有非病毒载体及病毒载体，然而非病毒载体无法满足长时间的表达，这一缺陷无疑被病毒载体填补。近年来慢病毒介导的RNA干扰技术在研究中已经取得了良好的开端。慢病毒载体是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但又有不同逆转录病毒的组分特性，该病毒既可以转染分裂细胞又可以转染非分裂细胞。病毒基因组可以整合宿主中，使得基因长时间稳定的表达，并且慢病毒具有较低的免疫源性，这使得慢病毒成为RNA干扰的最佳载体，目前广泛用于基因表达调控，基因治疗等领域。我们选用的是第三代复制缺陷型慢病毒载体是自杀性病毒(SIN)，在体内可以较长期的表达且安全性高。因此慢病毒载体介导的RNA干扰效应在靶细胞内长期存在，可为更好发挥干扰作用创造条件。
发明内容
[0009] 本发明的一个目的是提供一种干扰载体，即法呢基焦磷酸合成酶(Farnesylpyrophosphate synthase，FDS)基因RNA干扰重组慢病毒载体(LV-sh-FDS)。
所述载体含有慢病毒骨架质粒重组载体pGCSIL-sh-FDS，所述的重组载体是在
p-GCSIL-GFP骨架质粒载体的MCS中连接了针对shRNA的双链DNA片段，针对的靶序列为：
1#-GACAGCTTTCTACTCTTTC，合成的DNA片段信息为：
所述载体含有慢病毒骨架质粒重组载体pGCSIL-sh-FDS，所述的重组载体是在
p-GCSIL-GFP骨架质粒载体的MCS中连接了针对shRNA的双链DNA片段，针对的靶序列为：
1#-GACAGCTTTCTACTCTTTC，合成的DNA片段信息为：
[0010] 1#-1：5’-CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTg-3’，
[0011] 1#-2：5’-aattcaaaaaaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt-3’。
[0012] 该载体能有效转染细胞或组织后特异性降低FDS基因的表达，从而应用于基因治疗或基因功能研究。本发明提供的LV-sh-FDS最重要特征在于提供靶向性FDS抑制效应，并用重组慢病毒载体作为载体，使得干扰效果得到持续性作用。整个制备过程全部使用质粒，避免传统方法腺病毒污染。本发明中针对的靶基因FDS是甲羟戊酸途径中的关键酶，也是异戊二烯途径中的关键酶，产生的异戊二烯化中间产物为小G蛋白家族包括RhoA活化及功能学提供了重要的底物。甲羟戊酸途径是哺乳动物体内胆固醇合成的唯一途径。通过抑制FDS的表达进而降低RhoA的活性，从而有效抑制Ang II相关的心肌肥厚。另外通过降低FDS表达，也减少了甲羟戊酸途径中胆固醇的产生。本发明通过筛选最有效FDS干扰序列，合成其双链DNA，连接到慢病毒骨架质粒载体中，与辅助质粒共转染工具细胞(293T细胞)制备出FDS干扰重组慢病毒载体：LV-sh-FDS。
[0013] 本发明的另一个目的是提供所述载体的制备方法，通过以下步骤实现：
[0014] (1)针对FDS基因干扰有效序列的合成、筛选及鉴定；
[0015] (2)FDS基因干扰慢病毒骨架质粒重组载体pGCSIL-sh-FDS的构建和鉴定；
[0016] (3)FDS基因干扰重组慢病毒载体LV-sh-FDS的包装、收集、纯化、鉴定和滴度测定。
[0017] 步骤(1)中FDS基因有效干扰序列的筛选，主要分以下几步：(a)、购买FDS cDNA(imaGenes，Germany)，通过酶切测序成功克隆GFP-FDS-FLAG融合蛋白质粒；(b)按照RNA干扰序列设计原则，设计四个针对FDS的四个RNA干扰(RNAi)靶点，靶向序列(Target Seq) 分 别 为 1#：5’-GACAGCTTTCTACTCTTTC-3；2#：5’-CACGCTAATGCCCTGAAGA-3’；3#：5’-CTGTAGGAGGCAAGTACAA-3；4#：5’-CTGGTGGAAC CAAG GAAAC-3’(FDS mRNA NM_031840 GenBank GI：13929205)，并分别合成其双链DNA，序列分别为：
[0018] 1#-1：5’-GATCCCaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTGGAT-3’[0019] 1#-2：5’-AGCTATCCAAAAAaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttGG-3’[0020] 2#-1：5’-GATCCC-aaCACGCTAATGCCCTGAAGATTCAAGAGATCTTCAGGGCATTAGCGTGttTTTTTGGAT-3’[0021] 2#-2：5’-AGCTATCCAAAAAaaCACGCTAATGCCCTGAAGATCTCTTGAATCTTCAGGGCATTAGCGTGttGG-3’[0022] 3#-1：5’-GATCCCaCTGTAGGAGGCAAGTACAATTCAAGAGATTGTACTTGCCTCCTACAGtTTTTTGGAT-3’[0023] 3#-2：5’-AGCTATCCAAAAAaCTGTAGGAGGCAAGTACAATCTCTTGAATTGTACTTGCCTCCTACAGtGG-3’[0024] 4#-1：5’-GATCCCaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTTCAAGAGAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttTTTTTGGAT-3’[0025] 4#-2：5’-AGCTATCCAAAAAaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTCTCTTGAAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttGG-3’；并合成阴性对照(NC)，DNA片段信息如下：
[0026] NC-1：5’-GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTT-3’；
[0027] NC-2：5’-AGCTAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAGGG-3’。然后连接到酶切后的质粒pGC-U6/Neo/DsRed(质粒载体含有RFP红色荧光标记，便于观察)。pGC-U6/Neo/DsRed重组载体构建框架
[0028] NO. 5’ STEMP Loop STEMP[0029] 1#-1 GATCCC aaGACAGCTTTCTACTCTTTC TTCAAGAGA GAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt TTTTTGGAT[0030] 1#-2 AGCTATCCAAAAA aaGACAGCTTTCTACTCTTTC TCTCTTGAA GAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt GG[0031] 2#-1 GATCCC aaCACGCTAATGCCCTGAAGA TTCAAGAGA TCTTCAGGGCATTAGCGTGtt TTTTTGGAT[0032] 2#-2 AGCTATCCAAAAA aaCACGCTAATGCCCTGAAGA TCTCTTGAA TCTTCAGGGCATTAGCGTGtt GG[0033] 3#-1 GATCCC aCTGTAGGAGGCAAGTACAA TTCAAGAGA TTGTACTTGCCTCCTACAGt TTTTTGGAT[0034] 3#-2 AGCTATCCAAAAA aCTGTAGGAGGCAAGTACAA TCTCTTGAA TTGTACTTGCCTCCTACAGt GG[0035] 4#-1 GATCCC aaCTGGTGGAACCAAGGAAAC TTCAAGAGA GTTTCCTTGGTTCCACCAGtt TTTTTGGAT[0036] 3#-2 AGCTATCCAAAAA aaCTGGTGGAACCAAGGAAAC TCTCTTGAA GTTTCCTTGGTTCCACCAGtt GG[0037] NC-1 GATCCCC TTCTCCGAACGTGTCACGT TTCAAGAGA ACGTGACACGTTCGGAGAA TTTTTT[0038] NC-2 AGCTAAAAAA TTCTCCGAACGTGTCACGT TCTCTTGAA ACGTGACACGTTCGGAGAA GGG[0039] (c)将构建好的FDS融合蛋白和四个不同靶点的RNAi载体质粒或阴性对照质粒(NS，编码无序序列，无干扰效果)，共同转染生长状态良好的工具细胞293T细胞，36到48小时后分别采用免疫荧光及免疫印迹的方法观察GFP/RFP表达和检测FLAG蛋白的表达情况，判断不同靶点的干扰效果。
[0040] 步骤(2)中，本发明采用的慢病毒载体构建系统(吉凯，上海)由骨架质粒pGCSIL-GFP，携带病毒gag、pol、及rev基因的辅助质粒pHelper 1.0及含有VSV-G的辅助质粒pHelper 2.0组成。FDS干扰质粒pGCSIL-sh-FDS的构建和鉴定步骤在前(1)外源筛靶结果中获得最有效序列为1#设计并合成其shRNA的双链DNA。1：5’-CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTg-3’；2：5’-aattcaaaaaaaGACAGCTT TCTAC TCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt-3’，与pGCSIL-GFP慢病毒骨架质粒载体连接。
连接后产物转化DH5大肠杆菌后PCR及测序鉴定(上海美季公司)。PCR鉴定阳性克隆的引物为Primer：Up：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’；Down：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3。
慢病毒骨架质粒重组载体构建框架：
连接后产物转化DH5大肠杆菌后PCR及测序鉴定(上海美季公司)。PCR鉴定阳性克隆的引物为Primer：Up：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’；Down：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3。
慢病毒骨架质粒重组载体构建框架：
[0041]gTT
’3 TTT
tt tt
CTGT CTGT
CGAA CGAA
AGAT AGAT
PM GAGA GAGA
ETS AAG AAG
AGAG AAGT
poo AACT TCTC
L T T
C C
TTTC TTTC
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CTTT CTTT
P CGAC CGAC
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.ON 1 2
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[0042] 连接产物PCR鉴定循环条件：
[0043]
[0044] 步骤(3)FDS干扰重组慢病毒载体LV-sh-FDS的包装、收集、纯化、鉴定和滴度测定。高纯度无内毒素抽提三种质粒pGCSIL-GFP，pHelper 1.0和pHelper 2.0，制备三种DNA溶液吸取pGCSIL-sh-FDS(20μg)，pHelper 1.0(15μg)和pHelper 2.0(10μg)按Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T细胞，同时设立重组病毒的阳性对照。转染后8h更换为完全培养基，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液。
[0045] 本发明的再一目的是提供该基因药物LV-sh-FDS在心肌肥厚中的应用。在Ang II(1μM)诱导的心肌细胞肥厚模型中，LV-sh-FDS的应用在有效抑制FDS表达的同时，有效逆转了心肌细胞对血管紧张素II所致的心肌肥厚反应(具体包括细胞面积减小，β-MHC、BNP等肥厚标记基因的减少等)。在自发性高血压大鼠中通过心肌注射LV-sh-FDS，在降低心肌组织FDS表达水平的同时也减轻了β-MHC、BNP等肥厚标记基因的表达，并部分逆转心脏指数包括全心/体重(HW/BW)、左室重/体重(LVW/BW)，不同程度改善了心超指标IVSD，EF，FS％。
[0046] LV-sh-FDS除了应用于基因治疗外，还能够用于小G蛋白相关的研究，例如：通过western及Rho活性试剂盒检测到，LV-sh-FDS预孵育心肌细胞能有效抑制Ang II(1μM)诱导的RhoA活性增加，总RhoA蛋白的表达量没有改变，进而揭示了在Ang II(1μM)诱导的心肌肥厚中，FDS与RhoA之间的关系。
[0047] LV-sh-FDS也能用于研究甲羟戊酸途径中的关键酶FDS的功能，例如通过商业化试剂盒发现自发性高血压大鼠血清中的总胆固醇水平(TC)，低密度脂蛋白(LDL-C)得到下降，同时肝脏组织中FDS也得到了抑制。
[0048] 本发明的载体能有效转染细胞或组织后特异性降低FDS基因的表达，从而应用于基因治疗或基因功能研究。本发明提供的LV-sh-FDS最重要特征在于提供靶向性FDS抑制效应，并用重组慢病毒载体作为载体，使得干扰效果得到持续性作用。整个制备过程全部使用质粒，避免传统方法腺病毒污染。本发明中针对的靶基因FDS是甲羟戊酸途径中的关键酶，也是异戊二烯途径中的关键酶，产生的异戊二烯化中间产物为小G蛋白家族包括RhoA活化及功能学提供了重要的底物。甲羟戊酸途径是哺乳动物体内胆固醇合成的唯一途径。通过抑制FDS的表达进而降低RhoA的活性，从而有效抑制Ang II相关的心肌肥厚。另外通过降低FDS表达，也减少了甲羟戊酸途径中胆固醇的产生。
[0049] 同时本发明的LV-sh-FDS带有荧光标记EGFP便于检测转染效率。实验表明，LV-sh-FDS可以有效的转染心肌细胞及心肌组织，细胞水平转染实验表明MOI为20时，心肌细胞转染效率可以达到80％以上。同时给药途径可采用直接心肌注射也可静脉给药冠脉给药等多种方式。
[0050] 本发明的药效实验表明，LV-sh-FDS能有效抑制心肌细胞及心肌组织中FDS基因的表达。
[0051] 本发明的有益之处是：
[0052] 1本发明针对FDS靶基因根据在线原则设计出四个有效干扰序列，为克服原代细胞转染效率低及靶基因无商业化抗体，构建出四个FDS干扰质粒与FDS融合基因质粒通过共转染293T细胞，通过检测标记蛋白筛选出最有效干扰片段，并在靶细胞中得到验证，为进一步有关FDS基因研究奠定良好实验基础。
[0053] 2.本发明中在构建出最有效的FDS干扰质粒基础上进一步通过重组的慢病毒干扰载体构建系统，构建包装获得LV-sh-FDS，不仅克服非病毒载体的低转染效率，也避免了重组腺病毒产生的免疫原性，表达时间较短等缺点，这种重组的慢病毒载体是“自杀性”病毒比较安全能整合到宿主的基因组中，使得干扰作用更加持续，能广泛用于体内基因治疗及基因功能研究。
[0054] 3.本发明中的LV-sh-FDS本身带有EGFP标记在转染后表达“增强荧光蛋白”便于转染后的检测快捷方便。
[0055] 4.本发明构建的LV-sh-FDS能有效转染培养的心肌细胞，FDS的mRNA水平得到明显抑制(78.56％)，心肌细胞对Ang II(1μM)诱导的肥厚反应得到了明显的抑制。在自发性高血压大鼠心肌注射LV-sh-FDS 11周后，FDS的mRNA水平得到抑制(37.25％)的同时，肥厚基因β-MHC、BNP得到明显抑制，心脏指数(HW/BW，LVW/BW)部分逆转，同时心超指标(IVSD，EF，FS％)得到部分改善。预示该载体为心肌肥厚的研究提供了重要的实验资源。
[0056] 5.本发明LV-sh-FDS心肌注射有效转染心肌组织，肥厚反应改善的同时，血清TC LDL-C也有不同程度减轻，肝脏组织FDS水平也能有效抑制，预示LV-sh-FDS可能通过血液循环影响肝脏FDS的表达，进而调控胆固醇代谢，预示该载体可以通过心肌注射静脉注射冠脉注射等多种方式实施。
[0057] 6.本发明能有效转染心肌细胞，在MOI为20时，转染效率可以达到80％以上，活体研究中心肌注射LV-sh-FDS得到高效表达，适用于细胞活体内基因功能研究及基因治疗等领域的应用。
附图说明
[0058] 图1为pGC-U6/Neo/DsRed载体结构示意图。
[0059] 图2为pEGFP-C1载体结构示意图。
[0060] 图3为慢病毒骨架质粒pGCSIL-GFP载体结构示意图。
[0061] 图4为外源筛靶有效靶点干扰效果图片。
[0062] 图5为pGCSIL-sh-FDS琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
[0063] 图6为pGCSIL-sh-FDS测序鉴定图。
[0064] 图7为LV-sh-FDS在心肌细胞及心肌组织中的转染效率图片。
[0065] 图8为LV-sh-FDS有效下调心肌细胞/组织中FDS mRNA图片。
[0066] 图9为LV-sh-FDS有效改善血管紧张素II相关的心肌细胞肥厚反应图片。
[0067] 图10为LV-sh-FDS改善自发性高血压大鼠心肌肥厚反应图片。
[0068] 图11为LV-sh-FDS影响自发性高血压大鼠心脏超声图片。
[0069] 图12为LV-sh-FDS影响RhoA活性及表达的图片。
[0070] 图13为LV-sh-FDS影响自发性高血压大鼠肝脏FDS mRNA图片。
具体实施方式
[0071] 本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0072] 实施例1：FDS融合基因质粒和干扰质粒共转染工具细胞筛选FDS干扰最有效靶序列siRNA：
[0073] 一、按照设计原则，根据在线RNAi系列设计软件，设计4个干扰靶点，并合成其双链DNA连接到BamHI和HindIII酶切线性化的pGC-U6/Neo/DsRed载体(购自上海吉凯基因化学技术有限公司，参见图1)后鉴定正确的克隆进行质粒抽提备用。
[0074] 靶点序列(Target Seq)如下：
[0075] 1#：GACAGCTTTCTACTCTTTC
[0076] 2#：CACGCTAATGCCCTGAAGA
[0077] 3#：CTGTAGGAGGCAAGTACAA
[0078] 4#：CTGGTGGAACCAAGGAAAC
[0079] 同时各自的DNA合成片段信息如下：
[0080] 1#-1：5’-GATCCCaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTGGAT-3’[0081] 1#-2：5’-AGCTATCCAAAAAaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttGG-3’[0082] 2#-1：5’-GATCCC-aaCACGCTAATGCCCTGAAGATTCAAGAGATCTTCAGGGCATTAGCGTGttTTTTTGGAT-3’[0083] 2#-2：5’-AGCTATCCAAAAAaaCACGCTAATGCCCTGAAGATCTCTTGAATCTTCAGGGCATTAGCGTGttGG-3’[0084] 3#-1：5’-GATCCCaCTGTAGGAGGCAAGTACAATTCAAGAGATTGTACTTGCCTCCTACAGtTTTTTGGAT-3’[0085] 3#-2：5’-AGCTATCCAAAAAaCTGTAGGAGGCAAGTACAATCTCTTGAATTGTACTTGCCTCCTACAGtGG-3’[0086] 4#-1：5’-GATCCCaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTTCAAGAGAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttTTTTTGGAT-3’[0087] 4#-2：5’-AGCTATCCAAAAAaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTCTCTTGAAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttGG-3’，并合成阴性对照(NC)，DNA片段信息如下：
[0088] NC-1：5’-GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTT-3’；
[0089] NC-2：5’-AGCTAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAGGG-3’。
[0090] 二、FDS融合蛋白质粒载体的制备
[0091] 购买FDS cDNA文库(imaGenes，Germany)，利用PCR方法钓取其目的基因与表达载体pEGFP-C1 Vector(clonetech，#632465，参见图2)分别进行双酶切后定向连接并在表达载体的C端加上FLAG标记蛋白，产物转化感受态细胞进行PCR鉴定测序分析比对正确构建成功的融合蛋白表达质粒载体pEGFP-FDS-FLAG，并进行超纯去内毒素抽提备用。
[0092] 三、外源共转染293T细胞筛选FDS RNAi最有效靶序列
[0093] 培养生长状态良好的工具细胞(即293T细胞)，将构建好的FDS过表达融合基因质粒(1μg)和针对不同靶点的RNAi载体质粒(1μg)及阴性参照质粒(1μg)，按
Invitrogen公司的lipofectamine 2000使用说明共转染293T细胞，36h后在荧光显微镜下观察GFP/RFP的表达，初步判断不同靶点的干扰效果，同时转染效率大于70％以上的实验组才可进入后续检测，48h后采用Western blot的方法同时检测FLAG蛋白的表达情况，进而进一步确认最有效的靶点为1号(参见图4)。图4中A：免疫荧光观察293细胞过表达质粒和干扰质粒共转染GFP/RFP的变化，其中a：绿色荧光(GFP)，b：红色荧光(RFP)，c：
平光显微镜；B：Western-blot检测293细胞过表达质粒和干扰质粒蛋白共转染后FLAG蛋白改变，其中OV：过表达质粒转染组，NC：阴性病毒转染组，α-Tubilin：内参照。
Invitrogen公司的lipofectamine 2000使用说明共转染293T细胞，36h后在荧光显微镜下观察GFP/RFP的表达，初步判断不同靶点的干扰效果，同时转染效率大于70％以上的实验组才可进入后续检测，48h后采用Western blot的方法同时检测FLAG蛋白的表达情况，进而进一步确认最有效的靶点为1号(参见图4)。图4中A：免疫荧光观察293细胞过表达质粒和干扰质粒共转染GFP/RFP的变化，其中a：绿色荧光(GFP)，b：红色荧光(RFP)，c：
平光显微镜；B：Western-blot检测293细胞过表达质粒和干扰质粒蛋白共转染后FLAG蛋白改变，其中OV：过表达质粒转染组，NC：阴性病毒转染组，α-Tubilin：内参照。
[0094] 实施例2：慢病毒重组质粒pGCSIL-sh-FDS的构建和鉴定
[0095] 外源筛靶获得的最有效靶序列为1号：GACAGCTTTCTACTCTTTC，合成其shRNA的双链DNA，合成片段信息如下：
[0096] 1：CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTg；
[0097] 2：aattcaaaaaaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt。
[0098] 连接到经AgeI和EcoRI双酶切后的线性pGCSIL-GFP载体(购自上海吉凯基因化学技术有限公司，参见图3)，连接反应体系：酶切回收的载体DNA(100ng/μl)1μl，退火的双链DNA(100ng/μl)1μl，10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液1μl，T4噬菌体
DNA连接酶1μl，dd H2O 7μl，于4℃连接12h后，然后37℃培养16h转化到DH5大肠
杆菌，提取阳性克隆菌后行PCR及测序鉴定。PCR鉴定阳性克隆的引物为Primer：Up：
5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’；Down：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3，细菌克隆的PCR产物鉴定结果(图5)和测序结果(图6)确证了pGCSIL-sh-FDS插入方向和序列的正确性。
测序后进行阳性克隆质粒抽提，获得的重组质粒pGCSIL-sh-FDS，用于制备慢病毒载体。
DNA连接酶1μl，dd H2O 7μl，于4℃连接12h后，然后37℃培养16h转化到DH5大肠
杆菌，提取阳性克隆菌后行PCR及测序鉴定。PCR鉴定阳性克隆的引物为Primer：Up：
5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’；Down：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3，细菌克隆的PCR产物鉴定结果(图5)和测序结果(图6)确证了pGCSIL-sh-FDS插入方向和序列的正确性。
测序后进行阳性克隆质粒抽提，获得的重组质粒pGCSIL-sh-FDS，用于制备慢病毒载体。
[0099] 图5中泳道1是阴性对照(ddH2O)，泳道2是阴性对照(空载体组)306bp，泳道3是Marker：10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3.5kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，泳道4-8是连接入pGCSIL-shFDS载体的阳性克隆343bp。
[0100] PCR循环条件(表2)：
[0101]
[0102] 实施例3：FDS基因RNA干扰重组慢病毒载体(LV-sh-FDS)的制备
[0103] 本慢病毒载体构建系统(购于上海吉凯基因化学技术有限公司)由骨架质粒载体pGCSIL-GFP，携带病毒gag、pol、及rev基因的辅助质粒pHelper1.0及含有VSV-G的辅助质粒pHelper 2.0组成。
[0104] 制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及辅助质粒即pGCSIL-sh-FDS，pHelper1.0和pHelper 2.0质粒，分别进行高纯度无内毒素抽提。吸取质粒pGCSIL-sh-FDS(20μg)，pHelper 1.0(15μg)和pHelper 2.0(10μg)，按Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T细胞成功包装FDS)基因RNA干扰重组慢病毒(LV-sh-FDS)，同时设立阳性对照，即pGCSIL-NS(阴性参照)(20μg)，pHelper 1.0(15μg)和pHelper
2.0(10μg)共转染293T细胞构建阴性对照重组慢病毒载体，
2.0(10μg)共转染293T细胞构建阴性对照重组慢病毒载体，
[0105] 转染后8h更换为完全培养基，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液。4℃，4000g离心10min除去细胞碎片后并以0.45μM滤器过滤上清液获得慢病毒备用可满足一般细胞试验。若要获得较高浓度的慢病毒可对其进一步浓缩纯化后得到高滴度的慢病毒浓缩液，分装病毒浓缩液-80度长期保存，取其中一支进行病毒生物学滴度测定。
[0106] 实施例4：FDS基因RNA干扰重组慢病毒载体(LV-sh-FDS)用于血管紧张素II相关的心肌肥厚模型基因治疗研究。
[0107] 一、LV-sh-FDS在体外培养的心肌细胞肥厚的应用
[0108] 取1-3日龄新生WKYs鼠的心室剪成1mm2左右小块碎，同时用0.125％胰酶与0.05％胶原酶II型混合物重复消化，200目钢网过滤1000g离心6min后收集细胞，5％CO2培养箱37℃培养1h后，除去贴壁细胞，将细胞密度调整至5×10E5-1×10E6/mL接种于六孔板种培养。按照病毒与细胞比值(MOI)为20加入LV-sh-FDS及阴性病毒颗粒(对照)，感染乳鼠心肌细胞，24h后换完全培养基，感染48h后在荧光显微镜下通过观察GFP表达判断转染效率(效率约80％以上)，参见图7A，感染72h后换无血清培养基24h后加入Ang II(1μM)孵育24h后结束实验。结果显示：LV-sh-FDS有效抑制乳鼠心肌细胞中FDS的表达，Ang II(1μM)共孵时这种抑制作用更加明显，阴性病毒颗粒对FDS的表达没有影响，参见图8A(i)。同时实验结果表明LV-sh-FDS能有效抑制心肌细胞对Ang II(1μM)的肥厚反应，表现为细胞面积的逆转及肥厚基因BNP、β-MHC表达的下调。参见图9；另外预孵LV-sh-FDS可以明显抑制Ang II(1μM)(孵育15min)诱导的RhoA活性增加，RhoA蛋白表达量不改变，参见图12。
[0109] 图7A：免疫荧光镜观察转染后的心肌细胞(10×)(MOI＝20)；B：Western-blot检测心肌组织中GFP蛋白表达，其中a：SHR大鼠未注射病毒液组，b：SHR大鼠阴性病毒转染组，c：SHR大鼠干扰病毒敲除组，d：WKY大鼠组。
[0110] 图8数据以均数±标准误表示。图8A细胞水平：其中1：未转染组，2：阴性病毒转染组，3：干扰病毒敲除组，4：阴性病毒转染心肌肥厚模型组(AngII孵育)，5：干扰病# ## **毒转染心肌肥厚模型(Ang II孵育)，P＜0.05and P＜0.01vs.2 group. P＜0.01
vs.4group；图8B心肌组织，其中b：SHR大鼠阴性病毒转染组，c：SHR大鼠干扰病毒敲除组，* **
d：WKY大鼠组，P＜0.05and P＜0.01 vs.b group。
vs.4group；图8B心肌组织，其中b：SHR大鼠阴性病毒转染组，c：SHR大鼠干扰病毒敲除组，* **
d：WKY大鼠组，P＜0.05and P＜0.01 vs.b group。
[0111] 图9的数据以均数±标准误表示。图9中A：细胞面积，B：肥厚标记基因β-MHC，##C：肥厚标记基因BNP；其中横坐标的1是阴性病毒感染组，2是干扰病毒敲除组；P＜0.01 **
vs.1 group(Ang II-)and P＜0.01 vs.1 group(Ang II+)。
vs.1 group(Ang II-)and P＜0.01 vs.1 group(Ang II+)。
[0112] 图12的数据以均数±标准误表示。图中1：阴性病毒转染组，2：阴性病毒转染心#肌肥厚模型组(Ang II孵育)，3：干扰病毒转染心肌肥厚模型组(Ang II孵育)。P＜0.05 *
vs.1 group and P＜0.05 vs.2group。
vs.1 group and P＜0.05 vs.2group。
[0113] 二、LV-sh-FDS用于自发性高血压大鼠(SHRs)心肌肥厚的研究
[0114] 7周龄SHR大鼠共12只及7周龄WKYs大鼠6只入组，水合氯醛(400mg/kg/mg)腹腔注射全身麻醉，取仰卧位，气管切开，连接动物呼吸机，打开胸腔，暴露心脏，吸取LV-sh-FDS7
或者阴性病毒颗粒80uL(约5×10TU)于心尖及左心室壁取3-4点注射重组病毒，其中WKYs大鼠心肌注射以同剂量生理盐水以正常对照。关闭胸腔，撤除呼吸机。大鼠清醒后于清洁级环境普通饲料饲养11周后予以心脏超声检查，大鼠称重后取心脏称重留取左心室予以逆转录和实时定量PCR检测FDS、BNP、β-MHC的基因检测。结果显示：LV-sh-FDS能明显下调FDS的转录(图8B)，同时肥厚基因BNP、β-MHC降低，心脏指数(HW/BW和LVW/BW)部分减轻，参见图10。另外心超结果也有不同程度的改善，参见图11。
或者阴性病毒颗粒80uL(约5×10TU)于心尖及左心室壁取3-4点注射重组病毒，其中WKYs大鼠心肌注射以同剂量生理盐水以正常对照。关闭胸腔，撤除呼吸机。大鼠清醒后于清洁级环境普通饲料饲养11周后予以心脏超声检查，大鼠称重后取心脏称重留取左心室予以逆转录和实时定量PCR检测FDS、BNP、β-MHC的基因检测。结果显示：LV-sh-FDS能明显下调FDS的转录(图8B)，同时肥厚基因BNP、β-MHC降低，心脏指数(HW/BW和LVW/BW)部分减轻，参见图10。另外心超结果也有不同程度的改善，参见图11。
[0115] 图10数据以均数±标准误表示。图10的A：HW/BW(心脏重/体重)，B：LVW/BW(左室重/体重)，C：肥厚标记基因β-MHC，D：肥厚标记基因BNP。各图中b：SHR大鼠# *
阴性病毒转染组，c：SHR大鼠干扰病毒敲除组，d：WKY大鼠组；P＜0.05 vs.d group。P**
＜0.05 and P＜0.01 vs.b group。
阴性病毒转染组，c：SHR大鼠干扰病毒敲除组，d：WKY大鼠组；P＜0.05 vs.d group。P**
＜0.05 and P＜0.01 vs.b group。
[0116] 图11数据以均数±标准误表示。图11的A：IVSD(舒张末期室间隔壁厚度)，B：LVPWD(舒张末期心室后壁厚度)，C：FS(短轴缩短率)，D：EF(射血分数)。各图中b：SHR#
大鼠阴性病毒转染组，c：SHR大鼠干扰病毒敲除组，d：WKY大鼠阴性对照组。P＜0.05 and ## * **
P＜0.01 vs.d group；P＜0.05 and P＜0.01 vs.bgroup。
大鼠阴性病毒转染组，c：SHR大鼠干扰病毒敲除组，d：WKY大鼠阴性对照组。P＜0.05 and ## * **
P＜0.01 vs.d group；P＜0.05 and P＜0.01 vs.bgroup。
[0117] 实施例5：LV-sh-FDS在胆固醇代谢调控中的研究
[0118] 7周龄SHR大鼠共12只及7周龄WKYs大鼠6只入组，水合氯醛(400mg/kg/mg)腹腔注射全身麻醉，取仰卧位，气管切开，连接动物呼吸机，打开胸腔，暴露心脏，吸取LV-sh-FDS7
或者阴性病毒颗粒80uL(约5×10TU)于心尖及左心室壁取3-4点注射重组病毒，其中WKYs大鼠心肌注射以同剂量生理盐水以正常对照。关闭胸腔，撤除呼吸机。大鼠清醒后于清洁级环境普通饲料饲养11周后取大鼠全血，3000g离心15min后取血清分装后置-80度保存。
取500uL血清检测大鼠血清胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)。结果显示LV-sh-FDS心肌注射有效转染心肌组织，肥厚反应改善的同时，血清TC LDL-C有不同程度减轻，同时肝脏组织FDS mRNA水平也得到有效抑制，分别参见表1和图13，预示LV-sh-FDS可能通过血液循环影响肝脏FDS的表达，进而影响胆固醇代谢，血清胆固醇浓度下降，也预示该载体可能可以通过心肌注射静脉注射冠脉注射等多种方式实施。
或者阴性病毒颗粒80uL(约5×10TU)于心尖及左心室壁取3-4点注射重组病毒，其中WKYs大鼠心肌注射以同剂量生理盐水以正常对照。关闭胸腔，撤除呼吸机。大鼠清醒后于清洁级环境普通饲料饲养11周后取大鼠全血，3000g离心15min后取血清分装后置-80度保存。
取500uL血清检测大鼠血清胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)。结果显示LV-sh-FDS心肌注射有效转染心肌组织，肥厚反应改善的同时，血清TC LDL-C有不同程度减轻，同时肝脏组织FDS mRNA水平也得到有效抑制，分别参见表1和图13，预示LV-sh-FDS可能通过血液循环影响肝脏FDS的表达，进而影响胆固醇代谢，血清胆固醇浓度下降，也预示该载体可能可以通过心肌注射静脉注射冠脉注射等多种方式实施。
[0119] 表1：LV-sh-FDS影响自发性高血压大鼠血清胆固醇数据
[0120]
[0121] 注：数据以均数±标准误表示；b：SHR大鼠阴性病毒转染组；c：SHR大鼠干扰病毒# ## *敲除组；d：WKY大鼠阴性对照组。；P＜0.05 and P＜0.01 vs.d group and P＜0.05 vs.bgroup。
[0122] 图13中b：SHR大鼠阴性病毒转染组，c：SHR大鼠干扰病毒敲除组，d：WKY大鼠阴# *性对照组。P＜0.01 vs.d group andP＜0.05 vs.b group。
[0123] 本发明涉及的序列
[0124] <110>浙江大学
[0125] <120>法呢基焦磷酸合成酶RNA干扰慢病毒载体构建及用途
[0126] <160>14
[0127] <210>1
[0128] <211>66
[0129] <212>DNA
[0130] <213>人工序列
[0131] <220>
[0132] <221>Target seq
[0133] <222>9-27
[0134] <223>人工设计的正义链
[0135] <400>1
[0136] gatcccaaga cagctttcta ctctttcttc aagagagaaa gagtagaaag ctgtcttttt ttgga t 66[0137] <210>2
[0138] <211>66
[0139] <212>DNA
[0140] <213>人工序列
[0141] <220>
[0142] <221>Target seq
[0143] <222>16-34
[0144] <223>人工设计的反义链
[0145] <400>2
[0146] Agctatccaa aaaaagacag ctttctactc tttctctctt gaagaaagag tagaaagctg tcttg g 66[0147] <210>3
[0148] <211>66
[0149] <212>DNA
[0150] <213>人工序列
[0151] <220>
[0152] <221>Target seq
[0153] <222>9-27
[0154] <223>人工设计的正义链
[0155] <400>3
[0156] Gatcccaaca cgctaatgcc ctgaagattc aagagatctt cagggcatta gcgtgttttt ttggat 66[0157] <210>4
[0158] <211>66
[0159] <212>DNA
[0160] <213>人工序列
[0161] <220>
[0162] <221>Target seq
[0163] <222>16-34
[0164] <223>人工设计的反义链
[0165] <400>4
[0166] Agatatccaa aaaaacacgc taatgccctg aagatctctt gaatcttcag ggcattagcg tgttgg 66[0167] <210>5
[0168] <211>64
[0169] <212>DNA
[0170] <213>人工序列
[0171] <220>
[0172] <221>Target seq
[0173] <222>8-26
[0174] <223>人工设计的正义链
[0175] <400>5
[0176] Gatcccactg taggaggcaa gtacaattca agagattgta cttgcctcct acagtttttt ggat 64[0177] <210>6
[0178] <211>64
[0179] <212>DNA
[0180] <213>人工序列
[0181] <220>
[0182] <221>Target seq
[0183] <222>15-33
[0184] <223>人工设计的反义链
[0185] <400>6
[0186] Agctatccaa aaaactgtag gaggcaagtacaatctcttg aattgtactt gcctcctaca gtgg 64[0187] <210>7
[0188] <211>66
[0189] <212>DNA
[0190] <213>人工序列
[0191] <220>
[0192] <221>Target seq
[0193] <222>9-27
[0194] <223>人工设计的正义链
[0195] <400>7
[0196] Gatcccaact ggtggaacca aggaaacttc aagagagttt ccttggttcc accagttttt ttggat 66[0197] <210>8
[0198] <211>66
[0199] <212>DNA
[0200] <213>人工序列
[0201] <220>
[0202] <221>Target seq
[0203] <222>16-34
[0204] <223>人工设计的反义链
[0205] <400>8
[0206] Agctatccaa aaaaactggt ggaaccaagg aaactctctt gaagtttcct tggttccacc agttgg 66[0207] <210>9
[0208] <211>60
[0209] <212>DNA
[0210] <213>人工序列
[0211] <220>
[0212] <221>Target seq
[0213] <222>8-26
[0214] <223>人工设计的正义链
[0215] <400>9
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[0218] <211>60
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[0220] <213>人工序列
[0221] <220>
[0222] <221>Target seq
[0223] <222>8-26
[0224] <223>人工设计的反义链
[0225] <400>10
[0226] Agctaaaaaa ttctccgaac gtgtcacgtt ctcttgaaac gtgacacgtt cggagaaggg 60[0227] <210>11
[0228] <211>61
[0229] <212>DNA
[0230] <213>人工序列
[0231] <220>
[0232] <221>Target seq
[0233] <222>7-25
[0234] <223>人工设计的正义链
[0235] <400>11
[0236] Ccggaagaca gctttctact ctttcttcaa gagagaaaga gtagaaagct gtcttttttt g 61[0237] <210>12
[0238] <211>61
[0239] <212>DNA
[0240] <213>人工序列
[0241] <220>
[0242] <221>Target seq
[0243] <222>13-31
[0244] <223>人工设计的反义链
[0245] <400>12
[0246] Aattcaaaaa aagacagctt tctactcttt ctctcttgaa gaaagagtag aaagctgtct t 61[0247] <210>13
[0248] <211>24
[0249] <212>DNA
[0250] <213>人工序列
[0251] <220>用于PCR反应的上游引物
[0252] <400>13
[0253] Cctatttccc atgattcctt cata 24[0254] <210>14
[0255] <211>20
[0256] <212>DNA
[0257] <213>人工序列
[0258] <220>用于PCR反应的下游引物
[0259] <400>14
[0260] Gtaatacggt tatccacgcg 20