热反应设备及使用其的方法

摘要

一种用于执行矩阵反应的M×N矩阵微流体设备，所述设备具有与样本入口或试剂入口中之一通过通孔相连通的多个反应单元，所述通孔形成在设备的弹性材料块。提供的方法包括在微流体设备的弹性材料块的弹性材料层中并行形成通孔的方法，所述方法包括使用已图案化的光致抗蚀剂掩膜和蚀刻剂蚀刻掉弹性材料块的弹性材料层中的区域或部分。

权利要求

1.一种微流体系统，其包括：

阵列设备，其用于包含多个分离反应腔，所述分离反应腔被设置在反应区域内且与设置在反应区域外侧的阵列设备的流体入口流体连通；

载体，其适于连接阵列设备且具有与流体入口流体连通的多个流体通道，所述载体包括与至少一个流体通道流体连通的井，使得装载到井中的样品能够流进所述流体入口；以及热传递界面，其包括热传导材料，所述热传导材料被设置以提供从热控制源至反应区域的大致均匀的热连通。

2.如权利要求1中所述微流体系统，其中热传导材料是反射性的。

3.如权利要求1中所述微流体系统，其中热传导材料包括半导体。

4.如权利要求1中所述微流体系统，其中热传导材料包括硅。

5.如权利要求1中所述微流体系统，其中热传导材料包括抛光硅。

6.如权利要求1中所述微流体系统，其中热传导材料包括金属。

7.如权利要求1中所述微流体系统，其中反应区域被定位在阵列设备的中心部分，以及流体入口被设置在阵列设备外周边。

8.如权利要求7中所述微流体系统，其中阵列设备与载体耦合在阵列设备外周边，以及热传导材料与阵列设备表面耦合在反应区域。

9.如权利要求1中所述微流体系统，进一步包括将作用力应用到热传递设备以将热传递设备推向热控制源的装置。

10.如权利要求9中所述微流体系统，其中施加作用力的装置包括通过形成在热控制设备的表面中或热传递界面中的通道将真空源施加至热传递界面的装置。

11.如权利要求10中所述微流体系统，进一步包括真空度检测器，其用于检测在热控制设备表面和热传递界面的表面之间得到的真空的水平。

12.如权利要求11中所述微流体系统，其中所述真空度检测器被定位在远离真空源位置的沿通道或多个通道的位置。

13.如权利要求1中所述微流体系统，进一步包括自动控制系统，所述自动控制系统可操作的与机器人控制系统相连通，用于从热控制设备中导入和去除阵列设备。

14.一种随时间在选择温度处或温度范围内实施反应的方法，所述方法包括：提供用于包含多个分离反应腔的阵列设备，阵列设备包括接近至少一个反应腔的热传递设备，热传递设备被成形以接触热控制源；

引入阵列设备试剂，用于执行想要的反应；和

使阵列设备接触热控制设备，从而热传递设备处于与热控制源相热连通中，以使至少一个反应腔中的反应温度随热控制源的温度改变而改变，其中热控制设备适于将作用力施加到热传递设备，以将热传递设备推向热控制源。

15.如权利要求14中所述方法，其中热传递设备包括半导体。

16.如权利要求14中所述方法，其中热传递设备包括硅。

17.如权利要求14中所述方法，其中热传递设备包括反射材料。

18.如权利要求14中所述方法，其中热传递设备包括金属。

19.如权利要求14中所述方法，其中作用力包括磁、静电或真空作用力。

20.如权利要求19中所述方法，其中作用力包括通过形成在热控制设备或热传递设备的表面中通道施加给热传递设备的真空作用力。

21.如权利要求20中所述方法，进一步包括检测真空度，所述真空在热控制设备表面和热传递设备表面之间得到。

22.如权利要求21中所述方法，其中使用真空度检测器执行检测真空度，所述真空度检测器位于距离真空源位置的沿通道或多个通道远端的位置。

23.如权利要求22中所述方法，其中真空度不超过报警所呈现的或重新校整协议所结合的预设置值。

24.如权利要求14中所述方法，其中通过一个或多个机械或电机械定位设备的使用，执行使阵列设备与热控制设备的接触。

25.如权利要求14中所述方法，进一步包括自动控制和监测所述方法的执行。

26.如权利要求25中所述方法，其中使用自动控制系统执行自动控制和监测所述方法的执行，所述自动控制系统与机器人控制系统可操作的相连通，用于从热控制设备中导入和去除阵列设备。

27.如权利要求14中所述方法，进一步包括监控反应的进程。

说明书

热反应设备及使用其的方法

[0001] 优先权声明

[0002] 本申请要求各个下面申请的优先权：2005年2月14日提出的美国专利申请No.11/058,106；2005年1月25日提出的美国专利申请No.11/043,895；2004年6月23日提出的No.10/876,046；以及2004年5月2日提出的美国专利申请No.10/837,885；各个申请通过引用以用于所有目的的其全文被结合。

[0003] 相关申请的交叉引用

[0004] 本申请还涉及2004年4月5日提出的美国专利申请No.10/818,642；2003年4月3日提出的美国临时专利申请No.60/460,634；2004年4月5日提出的美国专利申请No.10/819,088；2004年4月5日提出的美国专利申请No.10/818,642；2002年11月
27日提出的美国专利申请No.10/3063,798；2002年6月24日提出的美国临时专利申请No.60/391,529；以及美国临时申请No.60/335,292；各个申请通过引用以用于所有目的的其全文被结合。

[0005] 背景

[0006] 近来，为了实施提供用于准备和分析应用的各种化学和生化分析及合成，已经进行开发和制造微流体系统的尝试。因为相对于在宏大规模上实施的分析及合成根据微型化可以实现大量的优点，因此出现制造这种设备的目标。这种优点包括利用这种设备实施分析或合成所需要的时间、成本及空间的真正的减少。另外，微流体设备具有适用于使用自动系统的可能，从而因人为干扰减少而具有进一步成本降低和减少操作者失误的额外优点。微流体设备已经被提出用于各种应用，包括例如毛细管电泳、气相色谱和细胞分离。

[0007] 然而，这些优点的实现因与迄今为止已经被制造的微流体设备相关的各种错综复杂而经常受到阻碍。例如，许多目前微流体设备由基于硅石的基底制造；这些材料难于加工且是复杂的，并且由这些材料制造的设备是易碎的。另外，在许多现有微流体设备中的流体运输要求以使用所述设备的可控制方式对复杂电场的调节。

[0008] 因此，除了现有设备的目前限制之外，考虑到使用微流体设备可以实现的前述优点，仍旧存在对被设计用于实施各种化学和生化分析的微流体设备的需要。因为其在现代生物化学中的重要性，具体需要可被利用实施各种核酸扩增反应的的设备，该设备同时还具有用于各种类型分析中的足够的通用性。

[0009] 具有实施核酸扩增作用的设备将具有多种用途。例如，这种设备可能被用作分析工具，以确定在样本中是否存在或缺少感兴趣的具体目标核酸。因此，该设备可能被利用测试具体病原体(例如，病毒、细菌或真菌)的存在，以及识别用途(例如，父权(paternity)和法庭应用)。这种设备还可以被利用检测或特征化先前与具体疾病或基因紊乱相关联的特殊核酸。在用作分析工具时，该设备还可能被用于实施基因类型分析和基因表达分析(例如，不同基因表达研究)。可替换地，可以制备方式使用该设备以扩增足够核酸用于进一步分析，譬如扩增产物、细胞类型、DNA指纹等。在各种基因工程应用中还可使用扩增产物，例如插入在然后可被使用以转换细胞的向量中，用于想要的蛋白质产物的生产。

[0010] 概述

[0011] 在这里提供了用于实施微流体分析的多种设备和方法，包括可被利用以实施例如核酸放反应的热循环反应的设备。该设备不同于常规微流体设备在于：它们包括弹性部件；在某些例子中，许多或全部设备由弹性材料组成。

[0012] 具体设备被设计以实施热循环反应(例如，PCR)，所述设备包括一或多个弹性阀门，以调整流过设备的溶液。因此，还提供了使用这种设计的设备实施扩增反应的方法。

[0013] 一些设备包括盲流动通道，所述盲流动通道包括起到反应点作用的区域。具体这种设备包括形成在弹性材料内的流动通道，以及多个与流动通道流体相通的盲流动通道，各个盲流动通道的区域限定反应区域。所述设备还包括重叠和相交于各个盲流动通道的一个或多个控制通道，其中弹性隔膜在各个交叉点将一个或多个控制通道与盲流动通道隔开。在这种设备将弹性隔膜设置偏斜入盲流动通道或从盲流动通道收回，响应于激励作用力。所述设备可理想地进一步包括多个保护通道，其形成在弹性材料中和重叠流动通道和/或反应点中一个或多个。保护通道被设计具有贯通其间的流体流，以减少从所述设备中的流动通道和反应点的蒸发。另外，所述设备可理想地包括沉积在各个反应点内的一个或多个试剂。

[0014] 在某一设备中，流动通道是多个流动通道中之一，各个流动通道与从那里分支的多级盲流动通道相流体连通。在这种设计的设备中，在一些例子中，多个流动通道互相内部连接，以致于流体可经由单入口被导入各个反应点。在其它设备中，然而，多个流动通道互相隔离，以致于导入一个流动通道的流体不能流入另一流动通道，以及各个流动通道包括在流体可被导入的一端或两端处的入口。

[0015] 其它设备包括具有至少50个点/cm2的密度的反应点阵列，反应点典型地形成在2
弹性材料内。其它设备具有更高密度，例如至少250、500或1000个点/cm。

[0016] 另一其它设备包括形成在弹性基底内的反应点，在弹性基底处用于实施反应的试剂为非共价固定的。试剂可以是一种或多种试剂，用于实质上实施任意类型反应。在一些实施例中，试剂包括用于实施核酸扩增反应的一种试剂。因此，在一些设备中，试剂包括引物、聚合酶和一种或多种核苷酸。在其它设备中，试剂是核酸模板。

[0017] 还提供了各种矩阵或基于阵列的设备。这些设备中的某些包括：(i)第一多个流动通道，其形成在弹性基底内，(ii)第二多个流动通道，其形成在弹性基底内，与第一多个流动通道相交叉，以限定反应点阵列，(iii)可被激励的多个隔离阀门，其被设置在第一和第二多个流动通道内，以将各个反应点内的溶液与在另一反应点处的溶液相隔离，以及(iv)多个保护通道，其重叠一个或多个流动通道和/或一个或多个反应点，以阻止溶液从那里的蒸发。

[0018] 前面设备可以被利用以实施大量不同反应，包括涉及温度调整的那些(例如，核酸分析的热循环)。使用某些盲道性设备实施的方法涉及提供包括形成在弹性材料内的流动通道的微流体设备；以及与流动通道相连通的多个盲流动通道，各个盲流动通道的末端区域限定反应点。至少一种试剂被引入各个反应点，然后反应在一个或多个反应点处被检测。方法可优选择地包括在反应点内对至少一种试剂加热。因此，例如，方法可涉及引入用于核酸扩增反应的部件，以及然后对部件进行热循环以形成扩增的产物。

[0019] 其它方法涉及提供包括一个或多个反应点的微流体设备，各个反应点包括用于实施分析的第一试剂，所述试剂被非共价地沉积在弹性基底上。然后，第二试剂被导入一个或多个反应点，从而第一和第二试剂混合以形成反应混合物。在一个或多个反应点处在第一和第二试剂之间的反应随后被检测。

[0020] 另一其它方法涉及提供微流体设备，所述微流体设备包括形成在基底内的反应点2
阵列且具有至少50个点/cm 的密度。至少一个试剂被引入各个反应点。然后，检测在一个或多个反应点处的反应。

[0021] 又一其它方法涉及提供微流体设备，所述微流体设备包括形成在弹性基底内的至少一个反应点以及还有多个保护通道形成在弹性基底内。至少一个试剂被引入各个反应点，然后在反应点内被加热。在加热之前或期间流体流过保护通道，以降低从至少一个反应点的蒸发。在至少一个反应点内的反应随后被检测。

[0022] 还提供了被设计降低流体从设备蒸发的另外设备。一般地，这种设备包括腔体，所述腔体是形成在弹性基底中的微流体网络的部分；以及多个保护通道，其重叠腔体且通过隔膜与腔体相分离。在这种设备的保护通道被制成合适大小，(i)允许溶液流过其中，以及(ii)以致于因隔膜在激励作用力对保护通道的作用而偏转，流入、流出或流过腔体的溶液基本上没有减少。其它设备包括(i)一个或多个流动通道和/或一个或多个反应点；以及(ii)多个保护通道，其重叠微流体设备且通过弹性体与那里相分离，其中保护通道之间的间隔在1μm至1mm之间。在其它设备中，间隔在5μm至500μm之间，在其它设备中，在10μm至100μm之间，在另一其它设备中，间隔在40μm至75μm之间。

[0023] 还提供了在某些微流体设备的反应点中实施核酸分析的合成物。某些这些合成物包括下面中的一种或多种：阻滞蛋白质结合在弹性材料上的试剂和洗涤剂。阻滞剂典型地由包含蛋白质的组中选择(例如明胶或清蛋白，例如牛血清清蛋白(BSA))。洗涤剂例如可以是SDS或Triton。

[0024] 附图简要说明

[0025] 图1A是示例设备的示意表示，具有交叉垂直和水流动通道的矩阵设计。

[0026] 图1B-E显示图1A中所示设备的部分的扩增视图，并示出其操作。

[0027] 图1F是另一示例矩阵设计设备的示意表示，其利用保护通道减少样本蒸发。

[0028] 图2是示例盲道设备的平面图。

[0029] 图3A是另一示例盲道设备的平面图。

[0030] 图3B是更复杂盲道设备的示意表示，基于图3A中所示的通用设计的单元。

[0031] 图4是利用混合设计的设备的平面图。

[0032] 图5是显示实施热循环反应的上升(ramp up)和下降时间的图标。

[0033] 图6显示在盲道型设备中的反应点内点样试剂的位置(spotted reagent)的位置，示出试剂在设备拐角处反应点内正确的排列。

[0034] 图7A和7B分别是另一混合型微流体设备的横截面图和示意图，并且表示被用于实施例1-4中所述试验的这种设备。

[0035] 图8是条形图，在其中绘出用于六种不同β肌动蛋白TaqMan反应的平均FAM/PRI/控制比率。这些反应在微流体设备(芯片)中和Macro(宏)TaqMan反应中被热循环。所述控制为没有DNA的第一和第四条形集合。误差条是这些比率的标准偏差。

[0036] 图9是描绘示例针点样工艺的图。从源(例如微量滴定板(microtiterplate))中汲取试剂，然后通过使加载针接触基底被印刷。洗刷步骤包括在真空干燥之后在去离子水中的搅动。

[0037] 图10是条形图，描绘基于例2中所述试验的用于例1(见图7B)中所述微流体设备(芯片)的FAM信号强度。数据为由标准线道的FAM/PRI比率衡量的(FAM信号/PRI信号)形式。误差条线为沿线道的标准偏差。“1.3X”和“1X”指示指代点样极和探针相关于其标称值的集中度。

[0038] 图11是条形图，显示在微流体设备(实心条)中用于Macro TaqMan(条图)和TaqMan反应的9-10孔的平均VIC/PFI/控制比率。两个负控制(控制)和具有100pg/nl基因组DNA的两个样本被热循环，如上所述的反应部件具有4倍的标准极/探针。误差条线表示平均比率的标准偏差。

[0039] 图12是条形图，显示用于从微流体设备的单流通通道(见图7B)中分支的各个10-1nl孔的FAM/PRI/控制比率。基因组DNA的数量为0.25pg/nl，这产生每个孔的一个目标备份的平均。

[0040] 图13是条形图，描绘使用图7B中所示的微流体设备的用于CYP2D6SNP的平均VIC/PRI/控制比率。Allele 1(Al-1)是针对基准或野生型等位基因CYP2D6*1的用于VIC探针的位置控制。Allele 2(Al-2)是针对变型或突变等位基因CYP2D6*3的用于FAM探针的位置控制。控制没有DNA模板。以100pn/pl或20pn/pl使用基因组DNA。误差条线是这些比率的标准偏差。

[0041] 图14是条形图，显示在图7B中所示的微流体设备中用于CYP2D6SNP的平均FAM/PRI/控制比率。样本与相关于图13及例3中所述的相同。

[0042] 图15是用于例4中试验的微流体设备的示意图。

[0043] 图16是包含来自图7B中所示的微流体设备中Macro PCR和PCR反应的PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶。在左侧上结果示出不同DAN基对长度的近似漂移。包含散布带的线道为分子量标示。标示“Macro”的线道是来自不同稀释液的Macro反应的PCR产物。标示“In chip(芯片中)”的线道是在芯片中产生的PCR产物。包含贯通凝胶的许多条带线道非特异性背景信号。

[0044] 图17a-17d描绘在阀门关闭和阀门闭合状态中隔离微流体设备的两个优选设计。

[0045] 图18a和18b描绘在执行热循环反应之后隔离微流体设备的图像。图18a描绘两个彩色图像，以及图18b描绘减少控制红色信号的之后的剩余信号。

[0046] 图19描绘每孔复制的平均数量与正极性孔数量比较的图表。

[0047] 图20描绘等温扩增配置-SCORPION。

[0048] 图21描绘示例矩阵微流体设备平面图。

[0049] 图22A描绘根据本发明实施例的具有整体压力累积井(well)的微流体设备的基底；

[0050] 图22B描绘图8A中所示的微流体设备的展开图，进一步包括弹性块；

[0051] 图22C是图22B中所示的微流体设备的整体图；

[0052] 图22D是图22B中所示的微流体设备的平面图；

[0053] 图22E是图22B中所示的微流体设备的横截面图；

[0054] 图23是在本发明微流体设备中某些实施例中使用的通路(via)的横截面图。

[0055] 图24是根据本发明实施例的用于激励微流体设备的情形的透视图。

[0056] 图25描绘被推向根据本发明实施例的微流体设备的上表面的压盘的剖视图；

[0057] 图26A是根据本发明实施例的系统的简化整体图；

[0058] 图26B是图26A的系统中接收台的透视图；

[0059] 图26C是在根据本发明另一实施例的板接口或压盘内流体选择路线(routing)的后平面图；

[0060] 图27A和27B是显示根据本发明实施例的界面压盘的横截面侧视图，所示界面压盘被匹配到载体上；

[0061] 图28A是根据本发明实施例的整体载体的透视图；

[0062] 图28B是根据本发明中另一实施例的使用PCR的整体载体的透视图；

[0063] 图29A是用于约束图28A中载体的系统的简化横截面图；

[0064] 图29B是用于约束图28B中载体的系统的简化横截面图；

[0065] 图29C是图28B中载体部分的简化平面图；

[0066] 图29D是使用图28B中系统的真空卡盘(vacuum chuck)的简化平面图；以及[0067] 图30是使用图28B中系统的真空卡盘的简化整体图。

[0068] 详细说明

[0069] I.定义

[0070] 如果没有特定限定，这里使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员共同理解的含义。下面参考将本发明所使用的众多术语的一般性定义提供给技术人员：Singleton等，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(2d ed.1994)；THECAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walkered.，1988)；THE GLOSSARY OF GENETICS，5TH ED.，R.Rieger等(eds.)，Springer Verlag(1991)；以及Hale&Marham，THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY(1991).如这里所使用的，下面术语归若没有特定限定则属于它们的含义。

[0071] “流动通道”通常指的是溶液通过其可流动的流通路径。

[0072] 若没有特定指示，术语“阀门”指的是在其中内插入流通通道和控制通道且由弹性膈膜分隔开的结构，所述弹性膈膜响应激励力可被偏转入流动通道或从流动通道收回。

[0073] “盲道”或“死胡同通道”指的是流动通道，其具有入口单没有单独的出口。因此，进出盲道的溶液流出现在同样位置。充填一个或多个盲道的填充过程有时被简称为“盲目填充(blind fill)”。

[0074] “隔离反应点”通常指的是没有与设备上存在的其他反应点流体连通的反应点。在相关于盲道被使用时，隔离反应点为盲道末端的区域，所述区域可以由与盲道相关联的阀门堵塞。

[0075] “通孔(via)”指的是形成在弹性材料设备中的通道，以提供流体在设备的外部端口和一个或多个流动通道之间进出。因此，通孔可用作样本输入或输出，例如。

[0076] 术语“弹性材料体”和“弹性材料”具有本领域所使用的通常含义。因此，例如，Allcock等(Contemporary Polymer Chemistry，第二代Ed)描述了通常作为存在于其玻璃转化温度和液化温度之间温度处的聚合物的弹性材料体。弹性材料展示弹性性能，因为聚合物链容易受到扭转运动以响应于作用力而使主链伸直，在没有作用力下主链重新缠绕呈现先前形状。一般地，在施加作用力时弹性体变形，但然后在去除作用力时回复至其初始形状。由弹性材料展示的弹性可以由杨氏模量具体化。在这里公开的的利用在微流体设备中的弹性材料典型地具有在大约1Pa-1Tpa的杨氏模量，在其它例子中在大约10Pa-100Gpa之间，在另一其他例子中在大约20Pa-1Gpa之间，在又一其他例子中在大约50Pa-10Mpa之间，以及具体例子中在大约100Pa-1Mpa之间。取决于具体应用的需要，还可以利用具有这些范围之外的杨氏模量的弹性材料。

[0077] 这里所述的某些微流体设备由弹性体聚合物制造，例如，GE RTV 615(配方)、乙烯-硅烷交联(型)硅酮弹性体(族)。然而，本微流体系统不限于这一种配方、型号或这族聚合物；而是，几乎任意弹性体聚合物均是使用的。给定聚合物化学的差异性、母体、合成方法、反应条件和可能的添加剂，有大量可能弹性体系统，其可被使用制造单片弹性微阀门和泵。对材料的选择典型地取决于被实施应用所要求的具体材料参数(例如，耐溶剂性(solvent resistance)、硬度、可透气性和/或温度稳定性)。在这里公开的相关于在微流体设备部件的制造中可被使用的弹性体材料类型的另外细节被阐述在Unger等(2000)Science 288：113-116，和PCT公开WO02/43615及WO01/01025中，其在此通过引用以其用于所有目的的全文被结合。

[0078] 术语“核酸”、“多核苷酸”和“低聚核苷酸”在这里被使用用于包含任意长度的核苷酸的聚合体形式，包括但不限于核糖核苷酸(ribonucleotide)或脱氧核糖核苷酸。在这些术语之间在长度上没有想要的差别。另外这些属于仅仅指的是分子的主要结构。因此，在具体实施例中，这些术语可以包含三个、双个和单个绞合DNA，以及三个、双个和单个绞合RNA。它们还包括变更，例如通过甲基化和/或压盖(capping)，以及多核苷酸的未变化的形式。尤其是，术语“核酸”、“多核苷酸”和“低聚核苷酸”包括多脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(包含D-核糖)、为嘌呤或嘧啶碱的N-或C-糖苷的任意类型多核苷酸，以及包含非核苷酸主链(nonnucleotidic backbone)的其他聚合物，例如聚酰胺(譬如肽核酸(PNA))和聚吗啉代(polymorpholino)(与Neugene一样可以从Corvallis Oregon(康瓦利斯城俄勒冈州)Anti-Virals有限公司买到)聚合物以及其他合成序列特定核酸聚合物，假定聚合物在允许碱基配对和碱基堆积的结构中包含核酸基盐(nucleobases)，例如在DNA和RNA的构造中。

[0079] “探针”是一种核酸，其使用一种或多种化学键能够结合互补序列的目标核酸，通常使用互补基对，通常使用氢键构成，从而形成复式结构。探针结合或杂交“探针结合点”。探针可由可检测标示来标示，以允许探针的轻易检测，具体地曾经探针杂交至其互补目标。
例如，附连到探针的标示可包括任意本领域已知的各种不同标示，它们可以通过化学或物理手段来检测。可被附连到探针的适当标示包括但不限于放射性同位元素、荧光团、发色团、质量标示、电子密度颗粒、磁颗粒、自旋标示、发射化学萤光的分子、电化学活性分子、酶、辅助因子和酶基片。探针能够在大小上明显改变。一些探针是相当的端。通常，探针为至少7至15个核苷酸长。其它探针为至少20、30或40个核苷酸长。另一探针略微更长，为至少50、60、70、80、90个核苷酸长。又一探针更长，为至少100、150、200个或更多个核苷酸长。探针还可以为落入前面范围内的任意特定长。

[0080] “引物(primer)”是单旋多聚核苷酸，其在合适条件(也就是，四种不同三磷酸核苷和用于聚合的试剂例如或DNA或RNA聚合酶或反转转录酶的情况下)下在合适缓冲物基在适当温度处能够起到模板导向的DNA合成中的起始点作用。引物的合适长度取决于引物所要的长度，但是典型地为至少7个核苷酸长，以及更典型地在10至30个核苷酸长之间变化。短引物分子一般要求较低温度，以与模板形成足够稳定的复合联合体。引物不必反应模板的特定序列，但必须足够互补以与模板杂交。术语“引物点”或“引物结合点”指的是引物杂交的目标DNA的节段。“引物对”标示包括5′“上游引物”和3′“下游引物”的一序列引物，5′“上游引物”与将被扩增的DNA序列的5′端的补充物杂交，3′“下游引物”与将被扩增的DNA序列的3′端的补充物杂交。

[0081] “完美互补的”引物具有在引物整个长度上的完全互补的序列，并且没有失谐。引物对目标序列的部分(子序列)典型地是完美互补的。“失谐”指的是引物中的核苷酸和与其对齐的目标核酸中的核苷酸不是互补的点。参照引物使用时的术语“基本上互补”表示引物与其目标序列不是完美互补的；代替之，引物仅仅充分互补的，以在理想的引物结合点处选择地杂交至各自的螺旋。

[0082] 术语“互补”表示一个核酸与另一个核酸分子是一致的或选择性杂交的。相比总的特异性缺失，更多选择性的杂交选择性出现在杂交发生时。典型地，在至少14-25个核苷酸的拉伸上有至少大约55％相同时，，选择性杂交将发生，优选至少60％，更优选至少75％，进而最优选至少90％。优选地，一个核酸专门杂交至其余核酸。参见M.Kanehisa，Nucleic AcidsRes.12：203(1984)。

[0083] 术语“标示”指的是可以通过物理、化学、电磁和其它相关分析技术检测的分子或分子方面。可被利用的可检测标示的例子包括但不限于放射性同位元素、荧光团、发色团、质量标示、电子密度颗粒、磁颗粒、自旋标示、发射化学萤光的分子、电化学活性分子、酶、辅助因子、链接至核酸探针的酶和酶基片。术语“可检测标示”表示与标示共轭结合的试剂或具有某些固有特征(例如，大小、形状或颜色)的试剂，所述特征允许其没有共轭结合至分离标示而被检测。

[0084] “多形态标记”或“多形态点”为扩散发生处的地点。优选的标记具有至少两个等位基因，各个等位基因以大于所选择群体的1％的频率出现，更优选地以大于10％或20％。多形态地点可以与一基对一样小。多形态标记包括限制酶断片长度多晶型、可变数量衔接重复(VNTR′s)、超变量区域、小随体(minisatellite)、二核苷酸重复、四核苷酸重复、单序列重复和例如Alu的插入元素。第一可识别等位基因形式被任意设计为参考形式，以及其它等位基因形式被设计为替代的或可变的等位基因。在选择的基团中最频繁出现的等位基因形式有时被称为野生型形式。二倍有机体可以是等位基因形式的同型结合或杂合的。
二对等位基因多形态具有两种形式。三对等位基因多形态具有三种形式。

[0085] “单核苷酸多形态”(SNP)出现在由单核苷酸所占据的多形态点，所述多形态点为等位基因序列之间变化的位置。该部位之前或之后通常有等位基因的高度保守序列(例如，在小于人群1/100或1/1000的成员中改变)。单核苷酸多形态通常由于在多态位点一个核苷酸代替另一个而产生。转换是一个嘌呤被另一嘌呤代替或一个嘧啶被另一嘧啶代替。颠换是嘧啶代替嘌呤或反之。单核苷酸多形态也可由核苷酸缺失或核苷酸关于参考等位基因的插入而产生。

[0086] “试剂”广义地指任何在反应中应用的药剂。试剂可包含自身可被监测的单一试剂(例如，当其被加热时被监测的物质)或两者或更多试剂的混合物。试剂可以是有生命的(例如，细胞)或无生命的。用于核酸扩增反应的可仿效的试剂包含但不局限于：缓冲液、金属离子、多聚酶、引物、模板核酸、核苷酸、标记、染料、核酸酶以及诸如此类。用于酶反应的试剂包含，例如，底物、辅助因子、联结酶、缓冲液、金属离子、抑制剂和催化剂。用于基于细胞的反应的试剂包含但不局限于细胞、细胞特异性染料和结合至细胞受体的配基(例如，激动剂和拮抗剂)。

[0087] “配基”是指任何分子，对于该分子存在另一特异性或非特异性结合至该配基的分子(即，抗配基)，所述结合由于抗配基对配基某部分的识别。

[0088] II.概述

[0089] 在这里提供具有独特流动通道构造的大量不同微流体设备(有时成为芯片)，还有使用这些设备实施各种高吞吐量分析的方法。这些设备被设计用于需要温度控制的分析中，尤其涉及热循环的分析中(例如，核酸扩增反应)。微流体设备结合具体设计特征：假定具有明显小于许多常规微流体设备的足迹的设备，使该设备将容易地与其他仪器相结合以及用于自动分析。

[0090] 某些微流体设备使用了典型地在这里被称为“盲道”或“盲填充”的设计，其部分特征在于具有大量盲道，如在限定部分中所指示的，所述盲道是具有死端或封闭端的流动通道，以使溶液可以仅仅在一端进出盲道(也就是，没有分离的盲道的进口和出口)。这些设备仅仅需要用于各个盲道的单一阀门，以封闭盲道区域形成封闭的区域点。在这种设备的制造期间，将用于实施分析的一个或多个试剂沉积在反应点，从而导致输入和输出数量的明显减少。另外，盲道被连接到相互连接的通道网络，以使可以从单一或有限数量的样本输入填充所有反应点。因为输入和输出的复杂度的降低以及基金单一阀门被用于封闭各个反应点，所以增加了可用于反应点的空间。因此这些设备的特点意味着：各个设备可包括大量反应点(例如，直至数千个)且可以实现高反应点密度(例如，超过1000-4000反应点/2
cm)。单独地和共同地，相比于传统微流体设备，这些特点还直接转变为这些设备大小的明显减小。

[0091] 在这里公开的其他微流体设备使用矩阵设计。一般地，这种类型的微流体设备使用大量相互交叉的水平和垂直流动通道，以在交叉点处限定反应点阵列。因此，这种设计的设备还具有反应点阵列；然而，使用这种设计，为了调节大量样本而有大量样本输入和对应的输出。被称为可转换流动阵列结构的阀门系统使溶液能够选择性地仅仅流过水平流动通道，从而允许矩阵中的各种流动通道的可转换封闭。因此，尽管盲道设备被设计以在不同状况下使用有限数量样本实施大量分析，然而矩阵设备被构造以在有限数量状况下对大量样本进行分析。另一其他设备使这辆中通常设计类型的组合。

[0092] 被描述的微流体设备其另外特征部分在于，使用各种部件，例如由弹性体材料制造的流动通道、控制通道、阀门和/或泵。在一些例子中，实质上，整个设备由弹性体材料制造。因此，这种设备在形式和功能上明显不同于由基于硅的材料制造的常规微流体设备的主要特点。

[0093] 所述设备的设计使它们能够与大量不同加热系统相组合而被利用。因此，所述设备在实施要求温度控制的各种分析中是有用的。另外，在加热应用中使用的这些微流体设备可结合另外的设计特征，以是从反应点的样本蒸发最小化。这种类型的设备通常包括形成在弹性设备内的大量保护通道，水可以通过所述保护通道流入以增加形成所述设备的弹性材料内的水蒸气压力，从而降低从反应点的样本蒸发。

[0094] 在另一实施例中，可以使用温度循环设备以控制微流体的温度。优选地，微流体设备可能适于与微流体设备实现热接触。其中微流体设备由例如载玻片的基底材料或例如塑料载体的载体板底部支承，可以在载体或载片的区域中形成窗口，以使微流体设备优选具有弹性块的设备可以直接接触温度循环的加热/制冷块。在优选实施例中，加热/制冷块具有在其中的凹槽，以与供给微流体设备吸力的真空源相连通，优选在其中发生反应的部分。可替换地，可将刚硬热传导板粘结到微流体设备，所述微流体设备然后与加热和制冷块相匹配，用于实施热传导效应。

[0095] 某些设备的阵列格式意味着该设备能够实现高吞吐量。共同地，高吞吐量和温度控制能力使这些设备对执行大量核酸扩增(例如，聚合酶链反应-PCR)是有用的。这种反应在这里将被详尽地描述为所述设备效用的指示，尤其它们在需要温度控制的任意反应中的用途。然而，应当理解的是，所述设备不限于这些具体应用。所述设备可被用于多种其他类型分析或反应中。多个例子包括对蛋白质配合基相互作用和多个单元和各种化合物之间相互作用的分析。在下文中提供了另外的例子。

[0096] III.微流体设备的一般结构

[0097] A.泵和阀

[0098] 这里公开的微流体设备通常至少部分由弹性体材料构造和使用单一或多层柔软平版印刷(MSL)技术或牺牲层封装方法(参见，例如Unger等(2000)Science 288：113-116，和PCT公开WO01/01025中，其两者在此通过引用以其用于所有目的的全文被结合)构造。使用这种方法，微流体设备可被设计，在其中控制流过所述设备流动通道的溶液，至少部分地使用由弹性隔膜或扇形体与流动通道分离的一个或多个控制通道。这个隔膜或扇形体可被偏转进入流动通道或从流动通道中缩回，通过将激励力作用到控制通道使控制通道与流动通道相关联。通过控制隔膜被偏转进入流动通道或从流动通道中缩回的程度，溶液流动可以被减缓或完全被堵塞流动通道。使用这种类型的控制通道和流动通道的组合，人们可以制备各种不同类型的阀门和泵，用于调节溶液流动，如在Unger等(2000)Science288：113-116，和PCT公开WO/02/43615和WO01/01025中详细地所述的一样。

[0099] 这里所提供的设备结合了这种泵阀，以选择地隔离允许试剂发生反应处的反应点。反应点可被定位在设备内任意不同位置。例如，在一些矩阵型设备中，反应点被定位在一套流动通道的交叉处。在盲道设备中，反应点被定位在盲道的末端。

[0100] 如果在温度控制反应(例如，热循环反应)中使用该设备，然后，如在下文中更详细所述的，弹性体设备典型地被固定到支承上(例如，载玻片)。然后，可将得到的结构放置在温度控制板上，例如，以控制在各种反应点处温度。在热循环反应的情况中，可将该设备放置在任意数量的热循环板上。

[0101] 因为该设备由是相对光透明的弹性材料制造，使用各种不同检测系统可以容易地监控实质上在微流体设备上任意位置处的反应。然而，大多数检测典型地发生在反应点自身处(例如，在包含流动通道的交叉点或在流动通道的盲端的区域内)。该设备由基本上透明材料制造的事实还意味着：对常规基于硅的微流体设备没有用途的当前设备可以使用具体检测系统。使用被结合进所述设备或与所述设备分离但与将被检测设备的区域对齐的检测器，可以实施检测。

[0102] B.保护通道

[0103] 为了减少样本和试剂从这里提供的弹性微流体设备的蒸发，大量保护通道可以被形成在所述设备中。保护通道与控制通道类似之处在于典型地它们被成形在弹性体层中，所述弹性体层覆盖在流动通道和/或反应点上。因此，与控制通道一样，保护通道与下方流动通道和/或反应点由弹性材料的膈膜或扇形体分离开。与控制通道不一样，保护通道的横截面积是相当小的。一般地，具有较小面积的膈膜比具有较大面积的膈膜在同样施加的压力下将更小偏斜。设计保护通道，以将被压缩以使溶液(典型地是水)流入保护通道。源于保护通道的水蒸气可散布入邻近流动通道或反应点的弹性体孔径中，从而增加邻近流动通道或反应点的水蒸气密度，并且减少从那里的溶液蒸发。

[0104] 一般地，保护通道是足够小的，以使在压缩分离保护通道与下方流动通道或反应点的膈膜时，基本上不会限制溶液流入、流出或流过流动通道或保护通道重叠的反应点。术语“基本上限制”或其他类似术语在这个上下文中被使用时意味着：与在相同条件下进、出或通过流动通道或反应点的溶液流相比，在进、出或通过流动通道或反应点的溶液流没有减少多于40％，典型地少于30％，通常少于20％，以及在一些例子中少于10％，在保护2
通道没有被压缩以得到通过其中的溶液流时。通常这意味着保护通道具有在100μm 和
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50,000μm 之间的横截面积，或者在其间的任意整体或非整体横截面积。因此，例如，在某
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些例子中，横截面积小于50,000μm，在其它例子中小于10,000μm，在另一例子中小于
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1000μm，以及在又一例子中小于100μm，保护通道可以具有任意各种形状，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、矩形、六边形和八面体形状。

[0105] 保护通道被设计以在它采用实施热循环反应的期间和条件下减少来自所述设备的样本和试剂的蒸发至小于50％，在其它例子中小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％。因此，例如，包含40循环的典型PCR反应可以在120分钟内被实施。
保护通道系统被设计以在近似这个时间框架期间将蒸发减少至前述限制。为了达到这个蒸
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发减少的水平，保护通道典型地呈现在至少10线/cm 至1000线/cm 的密度，或者在其间的
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任意整数密度值。尤其是，保护通道一般为至少25线/cm，在其他例中至少50线/cm，在另
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一例中至少100线/cm，以及在又一例中至少500线/cm。为了达到蒸发减少的这个水平，保护通道典型地呈现如从一线的外边沿至相邻线最近外边沿被测量的在1mm至1μm之间间隔处，或者在其间的任意整数密度水平。尤其是，保护通道一般地间隔500μm至5μm之间，在其他例子中在100μm至10μm之间，在另外例子中在75μm至40μm之间。因此，间隔典型地为至少μml，而小于1mm，在其他例子中小于500μm，在另外例子中小于400μm，在又一例子中小于300μm，在其他例子中小于200μm，在另一例子中小于100μm、50μm或
25μm。

[0106] 保护通道可被形成为分离的通道网络，或者可是分支控制通道的较小通道。保护通道可伸展过所述设备或者仅有所述设备的具体区域或多个区域。典型地，保护通道被邻近和在流动通道和反应点上方设置，与这些是蒸发主要涉及的主要位置处。保护通道在具体矩阵设备上的示例位置被示出在图1C中，以及保护通道在具体盲道设备上的示例位置被示出在图3B和3C中，并且在下文中被详细说明。

[0107] 流过保护通道的溶液包括能够减少水蒸发的任意物质。所述物质可是增加邻近流线和/或反应点的水蒸气浓度的一种，或是尽管没有增加水蒸气浓度但是阻碍从流线和/或反应点的水蒸发的一种(阻塞剂)。因此，一种选择是实质上利用任意水溶液，在这种情况中合适的溶液包括但不限于水和缓冲溶液(例如，TaqMan缓冲溶液和磷酸缓冲盐水)。合适的阻塞剂包括例如矿物油。

[0108] 保护通道典型地被成形在弹性体中，利用上面引证的MSL技术和/或牺牲层封装方法。

[0109] 下面部分更详细地描述大量具体结构，其可被利用实施各种分析，包括需要温度控制的分析(例如，核酸扩增反应)。应当理解的是，然而，这些结构是示例性的且对这些系统的改型对于本领域技术人员将是显而易见的。

[0110] IV.矩阵图

[0111] A.概述

[0112] 利用矩阵图的设备一般具有多个垂直和水平流动通道，所述多个垂直和水平流动通道相互交叉形成连接点阵列，因为不同样本和试剂(或成套试剂)可被导入各个流动通道，因此大量样本可在相当多的反应条件下以高吞吐量格式被测试。因此，例如，如果不同样本被导入M个不同垂直流动通道中的每个，并且不同试剂(或成套试剂)被导入N个不同水平流动通道中的每个，然后可以同时实施M×N个不同反应。典型地，矩阵设备包括用于垂直和水平流动通道的可转换隔离的阀门。所述不同地，使阀门定位以允许选择仅仅穿过垂直流动通道或仅仅穿过水平流动通道的流动。因为这种类型的设备允许相关于样本的类型和数量、以及试剂数量和类型的选择的弹性，所以这些设备非常好地适于实施分析，在其中人们试图在相当多的反应条件下筛选大量样本。矩阵设备可优选地结合保护通道以有助于阻止样本和试剂的蒸发。

[0113] 本发明提供用于高密度矩阵设计，所述设计利用微流体设备中层间流体连通通孔，以构造贯通设备的控制线和流体线。例如，通过使流体线位于两层弹性体阻塞的各层中，更高密度反应单元布置是可能的。图21描绘了示例矩阵设计，其中各个具有流体通道的第一弹性层2110(第一层)和第二弹性层2120(第二层)形成在其间。例如，第一层2110中的试剂流体通道通过通孔2130被连接到第二层2120中的试剂流体通道，尽管第二层2120在其中也具有样本通道，样本通道和试剂通道分别终止在样本和试剂腔2180中。样本和试剂腔2180通过接口通道2150互相连通，所述接口通道2150具有与其相关联的接口阀门2140以控制反应单元2160中各个腔2180之间流体流通。使用中，接口被首先关闭，然后将试剂从试剂入口导入试剂通道，以及将样本通过样本入口导入样本通道，然后容器阀门2170被闭合，以将各反应单元2160与其它反应单元2160隔离。一旦反应单元2160被隔离，则打开接口阀门2140以使样本腔和试剂腔处于互相连通之中，以使可以发生想要的反应。

[0114] 因此，本发明的优选方面提供用于M数量不同样本与N数量不同试剂反应的微流体设备，所述微流体设备包括：多个反应单元、各个反应单元包括样本腔和试剂腔，样本腔和试剂腔通过接口通道处于流体连通中，所述接口通道具有在其间关联的接口阀，用于控制样本腔和试剂腔之间样本连通；多个试剂入口，各个处于与试剂腔的流体连通中；其中样本入口或试剂入口中之一通过通孔分别处于与样本腔之一或试剂腔之一相流体连通。具体实施例包括使反应单元形成在弹性块内，所述弹性块由结合在一起的多层形成，以及接口阀是可偏转隔膜；使样本入口通过样本通道与样本腔相连通，以及试剂入口通过试剂通道与试剂腔相连通，样本通道部分和试剂通道部分被大约彼此平行地定位，并且各个具有相互关联的容器阀，用于控制贯通的流体连通；使与样本通道相关联的阀门以及与试剂通道相关联的阀门互相是可操作地连通的，通过公共容易控制通道；使容器公共控制通道沿大约垂直样本通道或试剂通道之一的线被定位。

[0115] 本发明的另一方面提供用于实现弹性材料块中特征的方法，所述方法包括步骤：提供第一弹性材料层；在第一弹性材料层表面上施加光致抗蚀剂层；对光致抗蚀剂层施加光图案以形成反应的光致抗蚀剂材料的图案；去除未反应的光致抗蚀剂材料，在第一弹性材料层表面上剩下已反应的光致抗蚀剂图案；对第一弹性材料层施加蚀刻试剂以蚀刻没有由已反应光致抗蚀剂材料的图案覆盖的第一弹性材料层表面，从而去除没有由已反应光致抗蚀剂材料的图案覆盖的第一弹性材料层区域，而剩下对应于已反应光致抗蚀剂材料图案的弹性材料层图案。在本方法的具体优选实施例中，所述方法包括去除已反应光致抗蚀剂材料图案的步骤；通过将粘接带应用到弹性材料层和已反应光致抗蚀剂材料图案的表面，引起实施去除，然后从弹性材料层分离粘接带，同时一些或全部已反应光致抗蚀剂材料图案被从弹性材料的表面去除；使光致抗蚀剂为SU8；使蚀刻剂包括四丁铵氟化物-三水合物；使特征为通孔；使弹性材料块包括粘接在一起的多个弹性材料层，其中两个或多个弹性材料层具有形成在其中的进出口，并且一个弹性材料层中的一个进出口通过通孔与另一弹性材料层中的进出口相连通。

[0116] 本发明的微流体设备可被进一步集成入载体设备，所述载体设备被描述在由Unger于2004年3月29日提出的待审及共有的US专利申请序列号60/557,715中，其在这里用于所有目的而被结合。Unger载体提供板上连续流体压力，以使远离流体压力源的阀门保持闭合，例如家庭气压。Unger另外提供用于自动系统，用于对如这里所述的本发明的阀门进行装料(charge)和激励。另一优选实施例，用于对累积器装料和对阀门激励的自动系统采用具有压盘的设备，所述压盘匹配在微流体设备的一个或多个表面上，其中压盘具有于控制真空或压力源向流体连通的至少两个或多个口，以及可包括用于操纵微流体设备部分的机械部分，例如，但不限于止回阀。

[0117] 本发明的另一方面提供用于使用基底用于使弹性材料块、载体稳定，优选具有一个或多个下面特征：井(well)或蓄积槽，其与弹性材料块通过形成在载体中或使用载体的至少一个通道相流体连通；累积器与弹性材料块通过形成在载体中或使用载体的至少一个通道相流体连通，以及流体口与弹性材料块相流体连通，其中流体口对于自动真空或压力源优选是可访问的，譬如上述的自动系统，其中自动源进一步包括端口的压盘，所述端口与流体口相匹配，以形成自动系统之间封闭流体连接，用于将流体压力或真空施加给弹性材料块。在具体实施例中，自动源还可实现与相关联于载体的一个或多个激励器的流体连通，用于充斥和释放保持在积累器上的压力。在具体实施例中，载体可进一步包括定位在接触微流体设备的载体区域中的区域，其中区域有不同于载体另一部分的材料制造，被选择用于改进热传导和散布参数的区域材料不同于载体的其他部分。用于改进热传导和散布参数的优选材料包括，但不限于硅，优选地硅被高度抛光，例如在半导体场中可利用的硅类型，如从晶片切割抛光晶片或部分，例如芯片(芯片)。

[0118] 本发明的另一方面提供用于使用热源，例如，但不限于PCR热循环器，其可从其原始制造状态被改变，热源具有可以匹配载体部分的热调节部分，优选地，载体的热传导和散布部分用于对弹性块载体提供通过热传导和散布部分的热控制。在优选实施例中，通过将真空源应用至被形成在热源的热调节部分内一个或多个通道，改进热接触，其中通道被形成以接触载体的热传导和散布部分的表面，以施加吸引和保持载体的热传导和散布部分的位置。在优选实施例中，载体的热传导和散布部分没有实际与载体相接触，而是与载体和弹性材料块相关联，通过仅仅将热传导和散布部分粘结至弹性材料块，以及剩下围绕热传导和散布部分中边沿的间隙，以减小由载体引起的寄生热效应。应当理解的是，在这里所述的本发明的许多方面中，优选弹性材料块可能被取代，使用在这里没有描述的现有技术的任意已知的微流体设备，例如由美国加利福尼亚圣克拉拉的Affymetrix(R)或由美国加利福尼亚芒廷维尤的Caliper所制造的设备例如GeneChip(R)(基因芯片)。受让给Soane、Parce、Fodor、Wilding、Ekstrom、Quake或Unger的美国专利描述微流体或中等规模流体设备，所述设备可被取代本发明的弹性材料块以利用热优点和改进，例如吸引定位，减少至流体设备的其他区域的寄生热传递，这在上面使用弹性材料块的上下文中被描述。

[0119] B.示例设计和用途

[0120] 图1A提供一种示例矩阵设备的图示。这种设备100包括七个垂直流动通道102和七个水平直流动通道104，它们交叉形成49个不同交叉或反应点106的阵列。这种具体设备因此使七种样本能够与其中七种不同试剂或套试剂起反应。在垂直方向中调节溶液流量的列阀门110可以由控制通道118控制，所述控制通道118可以在单一入口114处被全部激励。

[0121] 类似地，行阀门108调节水平方向中的溶液流量；这些由控制通道116所控制，所述控制通道116由单一控制入口112所激励。如图1A所显示，调节行阀门108的控制通道116取决于位置在宽度上变化。在控制通道116交叉垂直流动通道102时，控制通道116是足够窄的，以使在它被激励时它不会偏转入垂直流动通道102，从而基本上减少贯穿其中的溶液流量。然而，控制通道116的宽度在它重叠水平流动通道104时被增加；这使控制通道的膈膜足够大以阻塞穿过水平流动通道104的溶液流动。

[0122] 在操作中，试剂R1-R7被引入它们各自的水平流动通道104和样本S1-S7被喷射入它们各自的垂直流动通道102。在各个水平流动通道104中的试剂因此与在各个垂直流动通道102样本在交叉106处混合，所述交叉106在具体设备中为井或腔的形状。因此，在核酸扩增反应的具体情况中，例如，扩增反应必需的试剂被导入各个水平流动通道104。不同核酸模板被导入垂直流动通道102。在某些分析中，被导入作为试剂混合物部分的引物(primer)可能在流动通道之间不同，所述试剂混合物被导入各个水平流动通道104中。这使将起反应的各个核酸模板具有大量不同引物。

[0123] 图1B-E显示图1A中所述设备中的邻近反应点的放大平面图，以更具体地说明设备如何在分析中操作。用于简明目的，没有显示反应孔形式的交叉106，以及控制通道116、118被省略，仅仅行及列阀门110、108被显示(矩形盒子)。如图1B中所示，通过闭合列阀门110和打开行阀门108开始分析，以允许溶液流过水平流动通道104，同时阻塞流过垂直流动通道102。试剂R1然后被导入水平流动通道104进而完全流过水平流动通道104的长度，以使所有反应点106被填充。通过外部泵可以得到穿过水平流动通道104的溶液流，但是更典型地通过将蠕动泵结合进弹性材料设备自身而得到。如在例如Unger等(2000)Science 288：113-116，和PCT公开WO01/01025中中详细所述的。

[0124] 一旦R1被导入，则关闭行阀门108及打开列阀门2(见图1C)。这使样本S1和S2被导入垂直流动通道102以及流过其各自流动通道。当样本流过垂直流动通道102时，它们从反应点106排出R1，从而在反应点106剩下样本。然后，如图1D中所示，打开行阀门108允许S1和S2散布且与R1混合。因此，在各个交叉点或反应点106区域中获得样本和试剂(R1S1和R1S2)的混合物。在使S1和S2与R1散布持续足够时间之后，所有行及列阀门108、110被闭合以将S1和S2隔离在其各自反应点106之内且阻止S 1和S2的相互混合(参见图1E)。然后允许混合物起反应，并且通过监测交叉部106或包含交叉部106的交叉形状区域检测反应。用于需要加热的分析(例如，在扩增反应的热循环中)，设备被放置在加热器上，并且在加热同时样本保持被隔离。

[0125] 图1A中所示设备的修改版本显示在图1F中。通常结构具有与图1A中所述的许多类似之处，以及两图中的共同部分共用相同参考标记。图1F中所示的设备150不同之处在于水平流动通道104对被连接到公共入口124。这实质上使用进入入口124的唯一单一注射口，使双套试剂被导入两相邻流动通道。公共入口的使用相对于垂直流动通道102进一步被扩展。在这个具体例子中，使用进入样本入口120的单一注射口，各个样本被导入五个垂直流动通道102。因此，使用这个具体设备，实质上有用于样本和试剂的各个具体组合的十个重复反应。当然，重复反应的数量可以理想地通过改变连接到公共入口120、124的垂直和/或水平流动通道102、104的数量而被改变。

[0126] 图1F所示的设备还包括调节控制通道130的分离控制通道入口128和调节控制通道134的另一控制通道入口132，所述控制通道130可被用于支配流向出口132的溶液流，所述控制通道134调节至出口136的溶液流。另外地，设备150结合保护通道138。在具体设计中，保护通道138被形成为控制通道116的部分。如前所述，保护通道138小于行阀门108；因此，保护通道138的隔膜没有被转转进入下面的水平流动通道104中，以使溶液流被中断。

[0127] 最后，图1F中所示设计不同之处在于在水平和垂直流线交叉处的孔中没有发生反应，而是在交叉自身中。

[0128] V.盲道设计

[0129] A.概述

[0130] 利用盲道设计的设备具有具体特点。首先，设备包括一个或多个流动通道，一个或多个盲道从所述一个或多个流动通道分支出来。如上所述，这种通道的末端区域可用作反应点。由重叠流动通道形成的阀门可被激励以隔离盲道末端处的反应点。阀门提供用于可转换地隔离反应点的机构。

[0131] 第二，与盲道相连通的流动通道网络被配置，以使反应点的所有或大多数可以使用单个或有限数量入口(例如，小于5个或小于10个)来填充。填充盲流动通道的能力是可能实现的，因为所述设备由弹性材料制造。弹性材料是足够多孔的，以使当溶液被导入通道时流动通道和盲道内的空气可以通过这些孔逃逸。在其他微流体设备中利用的材料的孔隙缺乏排除了盲道的使用，因为在容也被注入时如果在沿流体路径某处没有提供通孔则盲道中的空气不再溢出。

[0132] 第三特点在于，在反应点内制造期间，一个或多个试剂被非共价地沉积在弹性体的地层上(见下文的关于制造工艺的另外细节)。试剂被非共价地粘附，因为试剂被设计以在样本被导入反应点时被溶解。为了使分析数量最大化，不同试剂或成套试剂被沉积在各个不同反应点处。

[0133] 设计具体盲道设备，以使反应点以阵列形式被布置。

[0134] 因此，在被设计用于实施核算扩增反应的那些盲道设备中，例如，实施扩展反应所需要的一个或多个试剂在该设备被制造期间被沉积在各个反应点处。这种试剂包括例如下面的一些或全部：引物、聚合酶、核苷、辅助因子、金属离子、缓冲剂、添加的染料等。为了使高吞吐量最大化，被选择扩增DNA中不同区域的不同引物被沉积在各个反应点。因此，当核酸模板经由入口被导入反应点时，大量扩展反应可以在模板的不同区段处被执行。通过将设备放置在热循环板上和在各种所要求温度之间循环设备，可以完成必须用于扩增反应的热循环。

[0135] 可以以各种方法稳定试剂。例如在一些例子中，一种或多种试剂被非共价地沉积在反应点，而在另外例子中，一个或多个试剂被共价地在反应点粘附到基底。如果被共价粘接，试剂可被经由链接物(linker)链接至基底。各种链接物型号可以被利用，例如光化学/对光不安定的链接物、对热不安定连接物以及可由酶化作用裂开的链接物。某些链接物是双功能的(也就是，链接物包含在各端的功能基团，其与被定位在链接物将被附着的元素上基团是有反应的)；在各端的功能基团可以是相同的或不同的。在某些测定中可以被使用的合适链接物的例子包括直链或支链碳链接物、杂环链接物和肽链接物。各种型号链接物是可以从Rockford，Illinois(伊利诺斯州罗克福德)的Pierce Chemical Company得到，并且被描述在EPA188256；US专利No.4671958、4659839、4414148、4669784、4680338、4569789和4589071，并且由Eggenweiler，H.M，Pharmaceutical AgentDiscovery Today
1998，3，552所描述。NVOC(6硝基藜芦氧基碳酰基)链接物和其它NOVC相关链接物是合适的光化学链接物的例子(见，例如WO90/15070和WO92/10092)。例如在US5382513中讨论了具有蛋白酶劈裂点的肽。

[0136] 图2是一种利用盲道设计的示例设备的简化平面图。设备200包括形成在弹性材料基底202中的流动通道204和从那里分支的一套分支流动通道206。各个分支流动通道206终止于反应点208，从而形成反应点阵列。重叠分支流动通道206的是控制通道210，其由隔膜212与分支流动通道206相分离。对控制通道210的激励使隔膜212偏转入分支流动通道206(也就是起到阀门的作用)，从而使各个反应点208与其余反应点相分离。

[0137] 这种设备的操作包括将测试样本注入流动通道204，然后溶液流入各个分支通道206。一旦样本填充各个分支通道206，则激励控制通道210引起阀门/隔膜212启动以偏转入分之同道206，从而封闭各个反应点208。当样本流入和保持在反应点208时，它溶解预先被点样在各个反应点208的试剂。一旦被溶解，则试剂可与样本起反应。阀门212通过扩散防止在各个反应点208溶解的试剂互相混合。在样本和试剂之间反应然后被检测到，典型地在反应点208内。反应可以优选被加热，如在下文的温度控制部中所述的。

[0138] 图3A显示某种程度更复杂盲流通通道设计的例子。在这个具体设计300中，各个水平流动通道304套在其末端被连接直两个垂直流动通道302。多个分支流动通道306从各个水平流动通道304伸展出去。在这个具体设计的分支流动通道304是隔行交替的，以使附连到任意给定水平流动通道304的分支流动通道306被定位在被直接连接到相邻水平流动通道304的两个分支通道306之间，或者被定位在直接连接到相邻流动通道304的分支流动通道306和一个垂直流动通道302之间。当使用图3A所述的设计时，各个分支流动通道306终止于反应点308。还与图3A中所示设计相一致，控制通道310重叠各个分支通道且与下面分支通道由隔膜312相隔离。在端口316处启动控制通道。垂直和水平流动通道302、304相交叉，以使样本对入口314的诸如允许溶液流过水平和垂直流动通道网络，并且最终经由分支流动通道306进入各个反应点308。

[0139] 因此，在操作中，样本被注入入口以将溶液导入各个反应点。一旦反应点被填充，则通过在端口挤压控制通道启动阀门/隔膜以将溶液俘获在反应点内。预先沉积在反应点的试剂被重新悬浮在反应点内，从而允许在沉积试剂和样本之间的反应在各个反应点内。反应点内的反应由检测器来监控。再者，反应可优选地可控制加热的，根据在下面温度控制部中所阐述的方法。

[0140] 在图3A中显示的通常设计的更复杂的复制品被显示在图3B中。图3B中所示设备是一种图3A中所示的水平和分支流动通道302的单元组织被重复多次的设备。图3B中所示设备进一步显示了保护通道320在将被使用在涉及加热(例如，热循环)的应用中的这些设备的包含。保护通道320相对于流动通道304和分支通道306的示例定位以在图3B右平面中所述的扩增视图被显示。保护通道320重叠分支流动通道306和反应点308。如上所述，在对设备300的加热期间水流过保护通道320，以增加设备中水的局部浓度，从而减少从流动通道306和反应点308中的溶液中水的蒸发。

[0141] 在这部分开始论述的盲通道设备的特征使设备的痕迹最小化，以及使大量反应点将被形成在设备上以及用于将被获得高密度。例如具有2500个反应点的这种类型的设备可被容易地制造以装配在标准显微镜玻片上(25mm×75mm)前述特征还能够使用利用盲道设计的设备获得反应点中的非常高的密度。例如，可以轻易地获得至少50、60、70、80、90或2
100个反应点/cm 的密度或在其间的任意整数密度值。然后，具体设备具有更高密度范围，
2
例如在100至4000个反应点/cm，或在其间的任意整数密度值。例如，一些设备具有100、
150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000个反应点/cm2的密度。也可以获得
2
具有至少2000、3000或4000个反应点/cm 的非常高密度的设备。这种高密度直接转变为设备上的非常多的反应点。利用盲道结构的设备典型地具有至少10-100反应点，或者在其间的任意整数点。更具体地，设备具有至少100-1000反应点，或者在其间的任意整数点。
较高密度设备可以具有更多反应点，例如至少1000-10000反应点，或者在其间的任意整数点。因此，取决于设备的整个尺寸，具体设备具有至少100；500；1000；2000；3000；4000；
5000；6000；7000；8000；9000；10000；20000；30000；40000；50000或100000反应点。

[0142] 大量反应点和可以得到的密度还是制造非常小的井(well)或腔的能力的结果。例如，腔或井典型地具有小于50nL的容积；在另外例子中，小于40nL、30nL、20nL或10nL；
以及在又一例子中，小于5nL或1nL。作为具体例子，具体设备具有300微米长、300微米宽和10微米深的井。

[0143] 在这里提供的盲道设备可以利用具体设计特征和在PCT申请PCT/US01/44549(公告为WO02/43615)和PCT/US02/10875(公告为WO02/082047)中所述的方法论，包括例如用于填充死端通道、液体起动(priming)、压缩除气起动的手段，以及用于在微流体通道的填充期间置换气体的各种手段。这两个PCT公开在此通过标准以其全文被结合用于所有目的。

[0144] VI.混合设计

[0145] 又一设备使矩阵和盲填充设计的混合体。这种类型设备的设计类似于图3A中所示的盲道设备，除了各个水平流动通道被连接到其自身样本入口和水平流动通道经由垂直流动通道没有相互连接之外。因此，导入任意给定水平流动通道的样本仅仅填充水平流动通道和附连到那里的反应点。然而，在图3A所示的盲流动通道中，样本可经由垂直流动通道302在水平流动通道304之间流动。

[0146] 这种通常设备的设备例子被显示在图4中。设备400包括多个水平流动通道404，各个水平流动通道具有从它或自身样本入口414伸展的多个分支流动通道406。控制通道410重叠各个分支流动通道406，并且膈膜(阀门)412将控制通道410与下面分支流动通道406分离。当使用盲流动通道设计时，在入口416对控制通道的起动引起使膈膜412偏转向分支流动通道406，以及隔离反应点408。在这种设计的变化中，各个水平流动通道404可包括在各端的入口414，从而允许从两端导入样本。

[0147] 在一些例子中，试剂在设备制造期间被沉积在反应点。在相当多的反应状况下，这使大量样本以短时间被测试，无需如矩阵设备所要求的试剂额外的时间消耗。可替换地，在注射在芯片之前可以制备反应混合物。一旦注入混合物，它们可以被分析或进一步处理(例如，被加热)。

[0148] 通过将不同样本注入各个水平流动通道，大量样本可以被快速分析。假定试剂已经被预先沉积在反应点。与任意给定水平流动通道相关联的在各个反应点处相同试剂存在提供了容易的方法，以使用各个通道实施大量重复反应。如果替换，则在反应点处的试剂不同于任意给定的流动通道，然后各个样本实质上同时接受各种不同反应条件。

[0149] 因此，这里提供的设备被调整用于各种不同类型的研究。如果研究包括在用户控制条件下相当多的不同样本的筛选(例如，100样本对100种用户选择试剂)，则矩阵设备提供有用的溶液。然而如果研究包括对一种或有限数量样本在大量反应条件下的分析(例如，一个样本对10000个反应条件)，则盲道设计是有用的。最后，如果人们针对限定反应条件想检验相当多数量样本，不必注入试剂(例如，100样本对100种预先限定的试剂)，则混合设备是有用的。

[0150] VII.温度控制

[0151] A.设备和部件

[0152] 大量不同选择的变化复杂度(sophistication)是可以利用的，用于控制微流体设备或整个设备中选择区域内的温度。因此，如这里所使用的，术语温度控制器被广泛地意味着指代可以调节整个微流体设备或微流体设备部分内的温度的设备或部件(例如，在具体温度区域内或在盲道型微流体设备矩阵中的一个或多个连接点处)。

[0153] 通常地，将该设备放置在热循环板上以热循环该设备。大量这种板是容易通过商业渠道可以得到的，包括例如ThermoHybaid Px2(Franklin，MA)，MJ Research PTC-200(South San Francisco，CA)，Eppendorf Part#E5331(Westbury，NY)，Techne Part#205330(Princeton，NJ)。

[0154] 阵列设备与热控制设备相接触，以致于热控制设备与热控制源相连通，以使至少一个反应腔中的反应温度隋若控制源温度的改变而改变。

[0155] 在不同实施例中，热传递设备可以包括例如硅的半导体，可以包括反射材料和/或可以包括金属。

[0156] 热控制设备可以适于将作用力施加给热传递设备以将热传递设备推向热控制源。作用力在不同实施例中可以包括磁的、静电的或真空作用力。例如，在一个实施例中，作用力包括通过通道施加向热传递设备的真空作用力，所述通道形成在热控制设备或热传递设备的表面。在热控制设备的表面和热传递设备的表面之间得到的真空度可以被检测到。这种检测可以使用真空度检测器被执行，所述真空度检测器被定位在沿通道的位置或远离真空源位置的通道处。在真空没有超过预先设定值时，可以显示警报或可以符合重新排列协议。

[0157] 阵列设备可以与热控制设备相接触，通过一个或多个机械或电机械定位设备的使用。该方法的执行可以是自动控制的和监控的。例如，这种自动控制和监控可以使用自动控制系统来执行，所述自动控制系统可操作的与机器人控制系统相通讯，用于引入热控制设备或从热控制设备去除阵列设备。还可以监控反应的进程。

[0158] 可以提供包括热控制设备的单元。可以提供包括阵列设备和热控制设备的系统。

[0159] 为了确保热循环步骤的精确度，在具体设备中，有用的是将检测温度的传感器结合在设备的各个区域处。用于检测温度的一种结构是热电偶。这种热点偶可能如图案化在下面基底材料上的薄膜导线或者如直接结合进微制造弹性材料自身的导线一样被制造。

[0160] 还可以通过电阻变化来检测温度。例如，热电阻器中的电阻变化可以被校准为给定的温度变化，利用常规技术可将所述热电阻器制造在下面半导体基底上。可替换地，热电阻器可能被直接插入微制造弹性材料。通过电阻检测温度的另一方案被描述在Wu等“MEMS Flow Sensors forNano-fluidic Applications”，Sensors and Actuators A89152-158(2001)，该文因此通过引用以其全文被结合。这篇论文描述了掺杂多晶硅结构对控制和检测温度的用途。用于多晶硅和其它半导体材料，电阻的温度系数可以通过特性和杂质数量精确控制，从而优化用于给定应用的传感器的性能。

[0161] 热色(thermochromatic)材料是可用于检测扩增设备中区域上温度的另一类型结构。尤其是，具体材料当其经过不同温度时动态地和可再生地改变颜色。这种材料在其经过不同温度时可能被添加至溶液。热色材料可以被形成在下面基底上或被结合在弹性材料内。可替换地，热色材料可以颗粒形式被添加至样本溶液。

[0162] 检测温度的另一方法是通过红外照相机的使用。与显微镜连接的红外照相机可被用于确定整个扩增结构的温度曲线。弹性体材料对射线的渗透将会有助于这样分析。

[0163] 检测温度的另一方法是通过热电物质的使用。尤其是，某些水晶材料，具体地这些材料还展示压电行为，展示压电效应。这种效应描述了材料晶体点阵的极化以及材料两端电压高度依赖于温度的现象。这种材料可被结合在基底或弹性体上，以及被用于检测温度。

[0164] 其它电现象，例如电容和电感，根据本发明的实施例可被展示以检测温度。

[0165] B.精确热循环的校验

[0166] 如在下文制造部分详细所描述的，盲道设备具有基底层，试剂被放置在所述基底层上。包括包含流动通道和控制通道的两层的结构被重叠在基底层上，以使流动通道与沉积试剂相对齐。然后将基底层的外侧放置在基底(例如玻璃)上。通常，反应在其上发生的反应点为在基底/玻璃界面上面的大约100-150微米。使用已知热扩散率方程及设备中所使用的弹性体和玻璃的近似值，人们可计算在反应点内温度到达控制器试图保持的温度所要求的时间。在表1中示出的计算出的数值说明可以快速达到温度，即使使用比反应点为近似100-150微米的设备中所使用的厚许多的弹性体和玻璃(也就是，用于这里所述设备的典型距离)。

[0167] 表1：计算出的在指示时间处通过PDMS和玻璃层的热扩散长度。

[0168]1秒 10秒 100秒
PDMS 400μm 1.26mm 4.0mm
玻璃 640μm 2.0mm 6.4mm

[0169] 图5显示使用盲道设备到达理想温度的速度。

[0170] 在另一实施例中，通过使用具有已知溶解温度(tm)的双旋低聚核苷酸聚合物可以测量温度，其中可将其内部对照指示低聚核苷酸是否是杂交的或变性的内部对照染色剂(例如SYBR Green(TM)或溴化乙锭)用于确定各个腔体在阵列上是恒定的范围，其中通过将包含带有染色剂的低聚核苷酸的溶液导入微流体设备的腔体，所述微流体设备的腔体具有反应腔阵列。在这个实施例中，当温度升高到溶解温度之上时，内部对照染色剂将其对低聚核苷酸的关系变性(denataturation应为denaturation)改变为单线低聚核苷酸。可替换地，如果温度高于tm或被降低，则染料进入现有淬光低聚核苷酸的内部对照可以被监测。实质上染料的使用提供用于“低聚核苷酸温度计”，所述“低聚核苷酸温度计”相应于相对低聚核苷酸的溶解温度的温度改变而改变特性，例如荧光性。通过设计或使用选择的溶解温度的低聚核苷酸，以类似方式可以确定反应腔阵列改变温度的范围。

[0171] VIII.检测

[0172] A.概述

[0173] 在这里提供的微流体设备可以利用大量不同监测手段。对合适系统的选择部分上是关于被选择的事件和/或试剂的类型的信息。可以设计检测器以检测大量不同信号类型，包括但不限于来自放射性同位元素、荧光基团、发色团、电子密颗粒、磁颗粒、自旋标示、发射化学萤光的分子、电化学活性分子、酶、辅助因数、连接到核酸探针和酶基底的酶的信号。

[0174] 适于本发明微流体设备使用的图示的检测技术包括但不限于光散射、多通道荧光检测、UV和可见波长吸收、冷光、不同反射率和共焦激光扫描。在具体应用中可以使用的另外检测方法包括闪烁接近测定技术、辐射化学检测、荧光极化、荧光关联能谱法(FCS)、时间分辨能量转移(TRET)、荧光谐振能量转移(FRET)和例如生物荧光谐振能量转移(BRET)的变型。另外的检测选择包括电阻、电阻率、阻抗和电压检测。

[0175] 检测发生在“检测部分”或“检测区域”。这些术语和其它相关术语指代发生检测的微流体设备部分。如上所指示，使用利用盲道设计的设备，检测部分通常是如由与各个反应点相关联阀门所隔离的反应点。用于基于矩阵的设备的检测部分通常在邻近交叉点的流动通道的区域、交叉点自身或包围交叉点的区域和围绕区域内。

[0176] 检测部分可以与一个或多个显微镜、光激励设备(例如激光器)、光倍增管、处理器及前述的组合相连接，它们合作检测与具体事件和/或试剂相关联的信号。被检测的信号经常是光信号，其在检测部分由光检测器检测。光检测器可包括一个或多个光二极管(例如雪崩二极管)、光纤光导导管，例如光倍增管、显微镜和/或摄像机(例如CCD照相机)。

[0177] 可将检测器微制造在微流体设备内，或者可以是分离部件。如果检测器作为分离部件存在且微流体设备包括多个检测部分，则可在单个检测部分内在任意给定时刻发生检测。可替换地，可以使用扫描系统。例如，具体自动系统相对于微流体设备扫描光源；其它系统扫描在检测上发射的光，或者包括多通道检测器。作为具体说明的例子，微流体设备可被附连到可转移平台上或在显微镜目镜下被扫描。所要求的信号然后被传递给处理器，用于信号解释和处理。还可以利用光倍增管阵列。另外，可以利用具有从所有不同检测部分同时收集信号且同时根据各个部分确定信号能力的光学系统。

[0178] 外部检测器是有用的，因为提供的设备完全或大范围上由在被检测波长处是光透明的材料制造。这个特点使这里所述设备使用大量光检测系统，常规基于硅的微流体设备使用所述光检测系统是不可能的。

[0179] 具体优选检测器使用CCD照相机和提供用于大视场和高数值孔径的光路，以使从各个反应腔收集的光数量最大化。关于这一点，CCD被用作光检测器阵列，其中各个象素或象素组对应于反应腔而不是被用于产生阵列图像。因此，光学器件可以被改变以使图像品质被降低，或被重新聚焦以增加光学系统景深以从各个反应腔收集更多光线。在优选实施例中，有用的是采用高纵横比或柱状腔体，以集中将被检测器沿光学系统的光轴质询的样本，以及优选地通过对图像重新聚焦以增加景深。低NA透镜系统的使用，优选使用双侧向对称(symetrical)透镜系统。同样有用的是使用检测器设备，例如一个或更多CCD设备，其具有将被成像的弹性块面积的尺寸或大于将被成像的弹性块面积。在低NA光学器件中相连的使用中，可以实现改进的检测灵敏度。

[0180] 检测器可包括用于激发指示器的光源，所述指示器产生可检测的信号。所使用的光源类型部分取决于被激发的指示器的类型。合适的光源包括，但不限于激光器、激光二极管和高密度灯。如果使用激光器，可以使用激光器扫描一套检测部分或单个检测部分。激光二极管可被制造在微流体设备自身上。可替换地，激光二极管可被制造在邻近被使用的微流体设备而放置的另一设备中，以实施热循环反应，以致于来自二极管的激光被指向进入检测部分。

[0181] 检测部分可另外包括大量非光学方法。例如，检测器还可包括，例如温度传感器、导电传感器、电势测定传感器(例如pH电极)和/或电流测定传感器(例如，监测氧化和减少反应)。

[0182] 大量在市场上可以买到的外部传感器可以被使用。其中许多为荧光检测器，因为容易制备荧光标示试剂。可以得到的检测器的具体例子包括但不限于Applied Precision ArrayWoRx(Applied Precision Issaquah，WA)。

[0183] B.对扩增的核酸的检测

[0184] 1.嵌入染料(intercalation dye)

[0185] 在粘合至双旋DNA上仅仅发荧光的具体嵌入染料可被用于检测双旋扩增DNA。适合染料的例子包括但不限于SYBRTM和Picro Green(从OR，Eugene的Molecure Probe有限公司)、溴化乙锭、亚丙基、色霉素、吖啶橙、Hoechst 33258、Toto-1、Yoy-1和DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚氢氯化物)(4′，6-diamidino-2-phenylindole hydrochloride)。
涉及嵌入染料使用的另外论述由Zhu等于Anal.Chem.66：1941-1948(1994)提供其通过引用起全文被结合。

[0186] 2.基于FRET的检测方法

[0187] 这种类型的检测方法包括在施主/受主荧光团对中检测来自施主(指示剂)和/或受主(猝光剂)荧光团的荧光变化。选择施主/受主荧光团对以使施主的发射谱重叠受主的激发谱。因此，当荧光团对充分进入互相靠近时，可发生从施主至受主的能量转移。这种能量转移可以被检测到。

[0188] FRET和模板扩展反应。这些方法通常利用使用施主/受主对中一个元素标示的引物(primer)和使用施主/受主对中另一个元素标示的核苷酸。在模板依赖扩展反应期间在将标示的核苷酸进合金引物之前，施主和受主被间隔开足够远以使不能发生能量转移。然而，如果标示的核苷酸被结合进引物以及空间足够低靠近，则能量转移发生且能被检测到。这些方法对单核苷酸多态性的检测中实施单基底对扩展反应尤其是有用(见下文)，以及被描述在US专利No.5945283核PCT公开WO97/22719。

[0189] 定量PT-PCR。各种所谓“实时扩增”方法或“实时定量PCR”方法还可被用于检测存在于样本中的目标核酸数量，通过在扩增过程自身期间或之后测量扩增产物的数量。荧光团(fluorogenic)核酸酶测定是实时定量方法的一个具体例子，所述方法可被连续使用这里所述的设备。监测扩增产物形成的这种方法包括使用双标示荧光团低聚核苷酸探针对PCR产物累积的持续测量——经常在文献中被称为“TaqMan”方法的途径。

[0190] 在这种测定中使用的探针典型地是短(ca.20-25基数)多聚核苷酸(polynucleotide)，其使用两个不同荧光团染料被标示。探针的5′终端典型地被附连到指示器染料，以及3′终端被附连到淬光染料(quenching dye)，尽管染料也可被附连到探针的其它位置。设计探针，以至少具有与在目标核酸上探针结合点的真正序列互补。在反应混合物中还包括上游核下游的PCR引物，所述PCR引物备年接到与探针结合点成侧面的区域。

[0191] 在未触动探针时，在两个荧光体之间发生能量转移，以及猝光剂(quencher)对来自指示器的发射猝光。在PCR的扩展阶段期间，通过例如Taq核酸酶的核酸聚合酶的5′核酸酶活性穿过探针，从而从多聚核苷酸猝光剂中释放指示剂，从而导致可由合适检测器测量的指示剂发射浓度的增加。

[0192] 专门适用于测量如在荧光测定中产生的荧光团发射例的一种检测器是ABI 7700，其由Foster City，CA的Applied Biosystems有限公司制造。该仪器所使用的计算机软件能够记录指示剂的荧光基团浓度，并在扩增过程中淬光。然后，这些被记录的数值可被用于计算在连续基础上标准指示剂发射浓度的增加，以及最终统计被扩增的mRNA数量。

[0193] 关于用于实时确定扩增产物的浓度荧光团的理论剂操作的另外细节被描述，例如在授予Gelfand的US专利No.5210015、授予Livak等的US专利No.5538848、授予Haaland的US专利No.5863736以及Heid，C.A.等的Genome Research，6：986-994(1996)；Gibson，U.E.M 等 的 GenomeResearch，6：995-1001(1996)；Holland，P.M 等 的 Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：7276-7280，(1991)；以 及 Livak，K.J.等 的 PCR Methods and Applications357-362(1995)，其各个通过引用其全文被结合。

[0194] 因此，因扩增反应过程，增加的染料数量受到限制，并且由信号中伴随的增加而被相伴。

[0195] 还可以以不同途径使用例如上述的相互对照染料，以定量化PCR方法。如上所述，这些染料选优结合至双旋DNA(例如，SYBR GREEN)，进而仅仅在限制之后产生信号。因此，当扩增反应进行时，染料的增加数量被限制，以及由可被检测的信号中伴随的增加而被相伴。

[0196] 分子标记：使用分子标记，探针构造的改变当其杂交至扩增产物的互补区域时导致可检测信号的形成。探针自身包括两部分：在5′端处的一部分和在3′端处的另一部分。这些部分在对探针结合点淬火的探针部分的侧面，并且彼此是互补的。一末端部典型地被附连至指示剂染料，以及其余端部分被通常附连到淬光剂染料。

[0197] 在溶液中，两端部可以互相杂交以形成发夹环(hairpin loop)，在这种构造中，指示剂和淬光剂染料处于足够接近中，以使来自指示剂染料的荧光团由淬光剂染料有效地被淬光。相对比地，杂交探针产生线性构造，在所述构造中，淬光程度被降低。因此，通过监控两种染料的发射变化，可能的是间接监控扩增产物的形成。这种类型探针及其使用的方法被进一步描述，例如，通过Piatek，A.S.等的Nat.Biotechnol.16：359-63(1998)；Tyagi，S.和Kramer，F.R，Nature Biotechnology 14：303-308(1996)；以及Tyagi，S等的Nat.Biotechnol.16：49-53(1998)，其各个在这里通过以其全文用于所有目的的引用而被结合。

[0198] 侵入物(invader)：侵入物测定(第三波技术(Third WaveTechnologies/Madison，WI))被用于SNP基因定型和使用低聚核苷酸，指定信号探针，所述信号探针对目标核酸(DNA或RNA)或多形性点是互补的。第二低聚核苷酸，指定低聚侵入物，包含相同的5′核苷酸序列，但3′核苷酸序列包括核苷酸多形性(polymorphism)。低聚侵入物干涉信号探针至目标核酸的结合，以使信号探针的5′端在包含多形性的核苷酸处形成“片状物(flap)”。这种复合体由结构指定核酸内切酶(endonuclease)所确认，称为可分裂性酶制剂(cleavase enzyme)。可分裂性酶分裂核苷酸的5′片状物。释放的片状物与接收FRET标示的第三探针结合，从而形成由可分裂性酶制剂所确认的另一双结构。这次，可分裂性酶制剂分裂远离淬光剂的荧光团，进而产生荧光信号。用于SNP基因定型，信号探针将被设计以与基准(野生型)等位基因或变形(突变型)等位基因相杂交。与PCR不一样，有信号的线性扩增，所述扩增没有核酸的扩增。进一步细节足以引导本领域技术人员通过例如Neri，B.P.等Advances in Nucleic Acidand Protein Analysis 3826：117-125，2000而提供。

[0199] Nasba：基于核酸序列的扩增(NASBA)是使用RNA作为检测模板的检测方法。对RNA的引物互补包含用于T7启动子点(promoter site)的序列这个引物允许与模板RNA和添加的逆转录酶(reverse transcriptase)(RT)相结合，以产生从3′至5′的互补旋转。随后RNase H被添加，以消化掉RNA，剩下单旋cDNA。然后，引物的第二版可结合单选cDNA和制造双旋cDNA。添加T7RNA聚合酶，以通过第一引物从被结合进cDNA序列的T7促进剂点产生更多版的RNA。提及的所有酶能够在41℃处起作用(参见，例如Compton，J.Nucleic Acid Sequence-basedAmplification，Nature 350：91-91，1991)。

[0200] Scorpion。这种方法例如由Thelwell N等的Nucleice Acids Research，28：3752-3761，2000所描述，因此其通过引用其全文用于所有目的被结合，以及图20描绘了其方案，其中Scorpion探针机制如下。步骤1：目标和Scorpion主干序列的初始变性。步骤
2：将Scorpion引物退火至目标。步骤3：延长Scorpion引物产生双链DNA。步骤4：变性步骤3中产生的双链DNA。这产生附着Scorpion引物的单链目标分子。步骤5：通过冷却，Scorpion探针序列以分子内的方式结合至其目标。由于互补目标链的分子间结合这是具有优势的。Scorpion(如图24所示)包含容纳在由探针的3′和5′侧上互补的主干序列形成的发夹环内的特殊探针序列。附着于5′末端的荧光基团被连接至环的3′末端的部分(通常甲基红)猝灭。发夹环通过PCR终止序列(止动装置)连结至引物的5′末端。当引物在PCR扩增过程中延伸后，特异性探针序列能够在DNA的相同链内结合至它的互补序列。该杂交事件打开发夹环因此荧光基团不再被猝灭以及可观察到信号的增加。PCR终止序列防止通读，该通读可能导致发夹环在缺乏特异性目标序列的情况下打开。这种通读将导致检测非特异性PCR产物，例如，引物二聚物或引导错误事件。

[0201] 3.容性DNA检测

[0202] DNA浓度和电容改变之间具有线性关系，该电容改变由跨越1khz电场的核酸通道引起。已发现这种关系是不依赖物种的。(见，例如Sohn，等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：10687-10690)。这样，在某些设备中，流动通道内的核酸(例如，图1的几乎环形的流动通道或图2的反应腔)经受这样的场以确定扩增产物的浓度。可代替地，包含扩增产物的溶液被取出以及然后经受这样的电场。

[0203] IX.实施反应的合成物的成分

[0204] 此处披露的由微流体设备进行的反应典型地由某些添加剂实施以增强反应。因此，例如，在反映物沉积在其内的设备的例子中，这些添加剂可在例如反应部位被一种或更多试剂污染。一套添加剂为封闭弹性材料基质上蛋白结合位点的封闭试剂。很多种这样的合成物可以被使用包含多种不同蛋白(例如，凝胶和各种清蛋白，例如牛血清清蛋白)和甘油。

[0205] 洗涤剂添加剂也可以是有用的。可以使用多种不同洗涤剂中的任何洗涤剂。例子包含，但不局限于SDS和各种Triton洗涤剂。

[0206] 在核酸扩增反应的特异例子中，可以包含多种不同类型添加剂。一种是促进扩增反应的增强剂。这样的添加剂包含但不局限于减少核酸内二级结构的试剂(例如，三甲铵乙内酯)、和减少错误引导事件的试剂(例如，四甲基铵氯化物)。

[0207] 还发现在某些扩增反应的进行中某些多聚物酶增强效果。例如，虽然使用来自Thermus aquaticus(Applied Biosystems，Foster city,CA)的AmpliTaq Gold聚合酶获得良好效果，在某些情况下使用Finnzyme，Espoo，Finland的DyNAzyme聚合酶获得改善的反应。该聚合酶来自嗜热菌，Thermus brockianus。其它可被使用的范例的多聚酶包含但不局限于rTH多聚酶XL，其为Thermus thermophilus(Tth)和Thermococcus litoralis(Tli)、嗜超热原始细菌pyrosoccus woesei(Pwo)和Tgo DNA多聚酶的结合。在反应混合物中合并两种或更多多聚物酶对增加PCR反应的准确度或敏感度是有用的。其它试剂例如DMSO的加入尤其那些包含内部对照染料者加入至PCR混合物中可进一步辅助实施反应。使用甘油或PEG溶液用于对照列液体也可改善PCR反应的实施。

[0208] 关于添加剂在应用此处披露的某些设备进行反应包含核酸扩增反应中是有用的的其它细节，在下文例1中提供。

[0209] X.应用范例

[0210] 由于此处提供的微流体设备可被制造为包含巨大数量的反应部位，该设备在非常多种筛选和分析方法中是有用的。通常，该设备可用于检测发生反应以产生可检测信号的种之间的反应，或一旦和另一物种相互作用产生可检测信号的产物。考虑到它们在各种类型温度控制系统下的使用，设备也可被用在多个不同类型的需要温度控制的分析或反应中。

[0211] A.核酸扩增反应

[0212] 此处披露的设备主要可被用于进行任何类型核酸扩增反应。因此，例如，扩增反应可以是线性扩增，(使用单一引物扩增)，和指数扩增(即，由前向和逆向引物集实施的扩增)。

[0213] 当使用盲通道类型设备实施核酸扩增反应时，典型地沉积在反应部位内的试剂是那些实施所需类型扩增反应必须的试剂。通常这意味着以下物质的某些或全部是沉积的：例如引物、多聚酶、核苷酸、金属离子、缓冲液、和协同因子。在这样的例子中引导进入反应部位的样本是核酸模板。然而可替换的，模板可以被沉积以及扩增试剂流入反应部位。如以上讨论的，当矩阵设备用于进行扩增反应时，包含核酸模板的样本通过垂直流动通道流动以及扩增试剂通过水平流动通道或反之亦然。

[0214] 虽然PCR可能是最佳公知扩增技术，该设备不局限于进行PCR扩增。其它类型可被实施的扩增反应包含但不局限于(i)连接酶链反应(LCR)(见Wu和Wallace，Genomics4：560(1989)和Landegren等，Science241：1077(1988))；(ii)转录扩增(见Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1173(1989))；(iii)自身维持的序列复制(即Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：1874(1990))；和(iv)基于核酸的序列扩增(NASBA)(见，Sooknanan，R和Malek，L，BioTechnology13：563-65(1995))。每一前述参考以它们的整体为了所有目的在此通过参考被结合。

[0215] 使用任何以上描述的用于检测扩增的DNA的检测方法可以完成对产生的扩增产物的检测。

[0216] B.SNP分析和基因分型

[0217] 1.概述

[0218] 很多与或者宿主机体或者感染性机体的基因组更改相关的疾病是少数核苷酸改变的结果，常常包含单个核苷酸的改变。这样的单个核苷酸的改变指单核甘酸多形态或简单SNPs，以及SNP产生的位点典型地指多形态的位点。此处描述的设备可用于检测出现在这样的多形态位点处的核苷酸的鉴定。作为这种能力的扩展，该设备可用于基因分型分析。基因分型包含确定二倍体有机体(即每一基因具有两个拷贝的有机体)是否包含参考等位基因的两个拷贝(参考类型纯和体)、每一参考的一个拷贝和一个变异的等位基因(即杂合子)、或包含变异等位基因的两个拷贝(即变异型纯和体)。当进行基因分析分析时，本发明的方法可被用于检测单一变异位点。然而，如以下多元化部分中进一步描述的，该方法也可用于检测个体或在同一基因、或不同基因或它们的组合上的多个不同DNA基因座位的基因型。

[0219] 用于进行基因分型分析的设备设计为使用适当大小的反应部位以从统计学观点确保二倍体受试者的两个等位基因中的每一个的拷贝以可工作的DNA浓度出现在反应部位。否则，分析可能产生提示杂和子是纯和体的结果，仅仅由于第二等位基因的拷贝没有出现在反应部位。下面的表2指示了使用此处描述的设备可被使用的以各种示例的DNA浓度出现在1nl反应体积中的基因组拷贝的数目。

[0220] 表2：以指示的DNA浓度出现在1nl体积中的基因组拷贝的数目

[0221]体积(nl) [DNA](μg/μL) N
1 0.33 100
1 0.10 32
1 0.05 16
1 0.01 3
1 0.003 1

[0222] 通常而言，由于样本的随机比例，在扩增反应开始之前出现的拷贝数目决定检测中的可能错误。使用某些设备的基因分型分析典型地以具有大约0.1μg/μL DNA浓度的样本进行，尽管目前发明者们已以各浓度进行成功的每一反应部位有单一基因组的Taqman反应。

[0223] 2.方法

[0224] 基因型分析可以应用各种不同方法进行。在这些方法中，通常获得“是”或“否”的结果就足够了，即，检测只需能够回答某一等位基因是否存在的问题。因此，仅使用检测多形态位点可能出现的一个等位基因所必须的引物或核苷酸可进行分析。然而，更典型地，包含检测多形态位点每一可能的等位基因的出现的引物和核苷酸。以下是合适的方法的例子。

[0225] 单碱基对延伸(SBPE)反应。SBPE反应是为进行基因分型分析特异性发展起来的一项技术。尽管已发展了数个SBPE反应，总的方法是十分相似的。典型地，这些分析包含将与目标核酸互补的引物进行杂交，这样引物的3′末端紧密靠近变异位点的5′或与其毗邻。延伸在存在一个或更多标记的不可延伸核苷酸和多聚酶的情况下进行，所述不可延伸核苷酸与占据变异位点的核苷酸互补。不可延伸核苷酸是核苷酸类似物，它一旦结合进入引物阻止多聚酶作用下的进一步延伸。如果加入的非延伸核苷酸是在变异位点与核苷酸互补的，那么标记的非延伸核苷酸结合至引物的3′末端以产生标记的延伸产物。因此，延伸的引物提供核苷酸出现在目标核酸变异位点的指示。这样的方法和相关方法例如在美国专利第5,846,710；6,004,744；5,888,819；5,856,092和5,710,028和WO92/16657号中描述。

[0226] 延伸产物的检测可使用在上述检测部分描述的用于延伸反应的FRET检测方法检测。这样，例如，使用此处描述的设备，包含标记的供体/受体荧光基团中一个成员的试剂混合物、一至四种标记的非延伸核苷酸(如果包含多于一种非延伸核苷酸，被不同标记)、和多聚酶被引入(或之前被点样)至反应部位。然后包含模板DNA的样本被引入反应部位以允许产生模板延伸。任何形成的延伸产物被FRET信号的形成检测(见，例如，美国专利第5,945,283和PCT出版物WO97/22719)。可选择性地使反应热循环以使用温度控制方法和以上描述的装置增加信号。

[0227] 定量PCR。基因分型分析也可使用更早描述的定量PCR方法进行。在这种情况下，与等位基因形式的每一个互补的不同标记探针被包含作为试剂，还有引物、核苷酸和多聚酶。然而，反应可仅使用单一探针进行，尽管这在是否缺乏信号是由于缺乏特异性等位基因或仅由于反应失败上能产生含糊。对于典型的双等位基因的例子，其中对于多形态位点两个等位基因是可能的，通常在试剂混合物中包含两者不同标记的探针，每一个都与等位基因之一完美互补，还有扩增引物、核苷酸和多聚酶。包含目标DNA的样本被引入反应部位。如果探针与其互补的等位基因存在于目标DNA上，那么产生扩增，因而导致如在以上检测中所述的可检测信号。基于获得的不同信号的种类，可确定多形态位点核苷酸的鉴定。如果两种都被检测到，那么两种基因都存在。反应过程中的热循环如以上温度控制部分中所述一样被实施。

[0228] B.基因表达分析

[0229] 1.概述

[0230] 基因表达分析涉及测定特定细胞中一种或更多基因表达的水平。这种测定可以是定性的，但通常是定量的。在差异性基因表达分析中，一种细胞(例如检测细胞)中基因水平与另一种细胞(对照细胞)中相同基因表达的水平相比较。可进行非常多种这样的比较。例子包含但不局限于，健康和患病细胞之间、用一种药物治疗的个体的细胞与另一未治疗个体的细胞之间、暴露于特定毒物的细胞和未暴露细胞之间的比较等等。检测和对照细胞之间表达水平不同的基因可作为标志和/或治疗的目标。例如，如果发现某组基因在患病细胞中的上调多于健康细胞，这样的基因可作为该疾病的标志并可能用作诊断试验的基础。这些基因也可成为目标。治疗疾病的策略可包含导致上调基因的表达减少的程序。

[0231] 此处披露的设备的设计对于易化多种基因表达分析是有用的。因为该设备包含巨大数量的反应部位，巨大数量的基因和/或样本可以同时被检测。使用盲流动通道设备，例如，可同时检测数百或数千基因的表达水平。该设备还方便了差异基因表达分析。通过矩阵设计，例如，从健康细胞获得的样本可在一个流动通道检测，而来自患病细胞的样本在密切靠近的通道进行。该特征增强了检测的简便性和结果的准确性，因为该两样本在相同时间在相同设备和相同条件下进行。

[0232] 2.样本制备和浓度

[0233] 为了检测一基因或多个基因的转录水平(和从而表达水平)，获得包含该基因或基因片段的mRNA转录产物的核酸样本或来自mRNA转录产物的核酸。来自mRNA转录产物的核酸是指对于该核酸的合成而言，mRNA转录产物或其序列最终作为模板。这样从mRNA逆转录得到的cDNA、从该cDNA转录的RNA、从该cDNA扩增的DNA、从扩增的DNA转录的RNA都来自mRNA转录产物以及检测这样的转录产物指示了样本中原始转录产物的存在和/或丰度。这样，合适的样本包含但不局限于，基因或多个基因的转录产物、从mRNA逆转录得到的cDNA、从cDNA转录的cRNA、从基因扩增的DNA、从扩增的DNA转录的RNA。

[0234] 在有些方法中，核酸样本从生物样本分离的总mRNA；在其它例子中，核酸样本是来自生物样本的总RNA。术语“生物样本”，如此处应用的，指从有机体或从有机体的组分例如细胞、生物组织和液体中得到的样本。在某些方法中，样本来自人类患者。这样的样本包含唾液、血液、血细胞(例如白细胞)、组织或细针活检样本、尿、腹膜的液体、浆膜液或它们的细胞。生物样本也可包含组织的部分例如取来用于组织学目的的冷冻部分。常常提供两个样本用于比较的目的。样本可以是，例如，来自不同细胞或组织类型、来自不同个体或来自接受不同治疗的相同来源样本(例如药物治疗和对照)。

[0235] 任何不选择性反对mRNA分离的RNA分离技术可被用于这样的RNA样本的提纯。例如，核酸分离和提纯的方法在WO97/10365、WO97/27317、Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization With Nucleic Acid Probes，第一部分第3章、Theory and Nucleic AcidPreparation，(P.Tijssen，ed.)Elsevier，N.Y.(1993)、Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology：Hybridization With Nucleic Acid Probes，第一部分中第3章、Theory and Nucleic Acid Preparation，(P.Tijssen，ed.)Elsevier，N.Y(1993)、和Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring harbor Press，N.Y(1989)、Current Protocols in MolecularBiology，(Ausubel，F.M.等，eds.)John Wiley&Sons，Inc.，New York(1987-1993)中详细描述。巨大数量的组织样本可以使用本领域公知的技术容易地处理，包含例如，Chomczynski，P.在美国专利第4,843,155号中描述的单一步骤RNA分离程序。

[0236] 在使用所述设备的基因表达分析中，影响结果的重要因素是样本中核酸的浓度。在低拷贝数目时，干扰与拷贝数目的平方根相关。因此，认为可接受的错误水平决定了所需拷贝数目。在特定样本体积中所需的拷贝数目确定了所需DNA的浓度。尽管不一定最佳，定量反应可以用达50％的错误水平实施，但优选更低。假设1纳升体积，获得特定错误水平所需的DNA浓度如表3所示。如所示的，以微流体设备可工作的浓度，例如通过某些设备使用的1纳升体积具有足够的基因表达产物拷贝数。

[0237] 表3：基因表达&——DNA定量

[0238]错误(％) N(拷贝数) 体积(nL) [DNA](10-
2 2500 1 4.2
10 100 1 0.17
25 16 1 0.027
50 4 1 0.0066

[0239] 进一步的计算证实此处提供的使用1nL反应部位的设备中的某些包含足够的DNA以获得准确的表达结果。特别地，典型mRNA制备程序产生大约10μg mRNA。已证明典型地在每一细胞中具有每一mRNA的1到10,000个拷贝。在任何特定细胞中表达的mRNA中，大约四个最常见信息包含总mRNA水平的约13％。这样，这种高表达信息包含1.3μg mRNA(每一个是4×10-12克分子或大约2.4×1012拷贝)。根据前述表达范围，预期稀有信息以2×10-8拷贝的水平存在。如果在标准分析中mRNA样本溶解在10μl中，稀有信息的浓度约为2×107拷贝/μl；该浓度对应于每1nl孔20,000拷贝(或4×1011M)。

[0240] 3.方法

[0241] 由于表达分析典型地变化定量分析，典型地使用以上描述的定量实时PCR方法中之一完成检测。这样，如果使用Taqman方法，引入(或之前点样)反应部位的试剂可包含以下物质之一或全部：引物、标记探针、核苷酸和多聚酶。如果使用嵌入染料，试剂混合物典型地包含以下物质之一或全部：引物、核苷酸、多聚酶和嵌入染料。

[0242] D.多元化

[0243] 此处描述的基于阵列的设备(见，例如，图1A、1F、2、3A、和3B以及伴随的文本)本质上设计为为了同时实施巨大数量扩增反应。然而这个特点通过在每一反应部位内进行多种分析(例如，基因分型和表达分析)可以容易地进一步扩展。

[0244] 甚至可在单一反应部位实施多元扩增，通过例如在热循环过程中使用多种引物，每一种是特定感兴趣目标核酸特异性的。不同扩增产物的存在可以使用有差别地标记的探针检测以进行定量RT-PCR反应或通过使用有差别地标记的分子标志(见上述)。在这样的方法中，每一有差异地标记的探针设计为只与特定扩增目标杂交。通过明智选择所使用的不同探针，分析得以进行，其中不同标记在单一反应中在不同波长被激活和/或检测。关于适用于这样的方法的适当荧光标记的选择的进一步指导包含：Fluorescence Spectroscopy(Pesce等，Eda.)Marcel Dekker，New York，(1971)；White等，Fluorescence Analysis：Apractical Approach，Marcel Dekker，New York，(1970)；
Berlman，handbook of Fluorescence Spectra of AromaticMolecules，第二版，Academic Press，New York，(1971)；Griffiths，Colour andConstitution of Organic Molecules，Academic Press，New York，(1976)；Indicators(Bishop，Ed.).Pergamon Press，Oxford，
19723； 和 Haugland，handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，MolecularProbes，Eugene(1992)。

[0245] 多种基因分型和表达分析可在每一反应部位可选择地进行。如果使用定量PCR方法例如TaqMan，那么用于扩增感兴趣目标DNA不同区域的引物被包含在单一反应部位内。使用用于每一区域的有差别地标记的探针区别形成的产物。

[0246] E.非-核苷酸分析

[0247] 虽然对进行非常多种核酸分析是有用的，设备也可被用于多种其它用途。如更早提示的，设备可主要被用于分析两个或更多物种之间的相互反应，所述反应产生可检测信号或能与可检测试剂反应的反应产物，该可检测试剂一旦与反应产物反应可产生信号。

[0248] 因此，例如，该设备可被用于多个筛选应用以识别具有特定所需活性的检测试剂。作为特殊的例子，该设备可被用于筛选化合物，筛选其作为一种或更多酶的底物或抑制剂的活性。在这样的分析中，检测的化合物和其它必须的酶分析试剂(例如，缓冲液、金属离子、协同因子和底物)被引入(如果之前未沉积)反应部位内。然后引入酶样本以及反应(如果检测化合物是底物)或抑制反应(如果检测化合物是抑制剂)被检测。这样的反应或抑制可通过标准技术完成，例如直接或间接检测底物的丧失和/或产物的出现。

[0249] 具有足够大量流动通道和反应部位的设备也可被用于进行细胞分析以检测细胞和一种或更多试剂之间的相互作用。例如，某些分析涉及确定特定细胞类型是否存在于样本内。用于完成这种分析的一个例子是使用优先与某些细胞类型反应的细胞特异性染料。因此，这样的染料可被引入反应部位以及然后加入细胞。细胞的染色可使用标准显微技术检测。如另一例子，检测的化合物可被筛选触发或抑制细胞反应的能力，例如信号转导旁路。在这样的分析中，检测的化合物被引入反应部位然后加入细胞。然后检查反应部位以检测细胞反应的形成。

[0250] 相关设备和这样的设备的应用的进一步阐述在2001年11月30日提交的待审查和共同所有的美国临时申请第60/335,292号中阐述，其在此处为了所有目的以其整体通过参考被结合。

[0251] XI.制造

[0252] A.一般方面

[0253] 作为先前提及的，利用单和多层软光刻(MSL)技术和/或牺牲层封装方法，一般构造提供的微流体设备。基本MSL渐进法包括在微加工模具上铸造一系列弹性材料层，从模具去除该层，然后将该层熔化在一起。在牺牲层封装方法中，光致抗蚀剂层图案被沉积在通道是理想的地方。这些技术及其在生产微流体设备中的使用由下述文献详细论述，例如Unger等(2000)Science 288：113-116、Chou等(2000)“Integrated Elastomer FluidicLab-on-a-chip-Surface Patterning and DNA Diagonstics”、在Solid StateActuator and Sensor Workshop的Hilton Head，S.C.会议论文集中以及在PCT公开WO01/01025中，其中各个在这里通过引用器全文用于所有目的而被结合。

[0254] 简单地说，前面制造方法最初涉及通过使用光致抗蚀剂(Shipley SJR5740)光蚀刻在硅基片上制造用于顶层(例如，具有控制通道的弹性层)和底层(例如，具有流动通道的弹性层)的模模具。通过旋涂速率可以精确地控制通道高度。通过在显影之后将光致抗蚀剂暴露至UV光，形成光致抗蚀剂通道。热回流处理和保护处置典型地被实现，与M.A.Unger，H.-P.Chou，T.Throsen，A.Scherer和S.R.Quake，Science(2000)288：113，其在这里通过引用其全文而被结合。然后，混合两部硅弹性体(GE RTV 615)分别被旋进底部模具并且被倾泻在顶部模具上。这里，还有，可以利用旋涂控制底部聚合体流体层的厚度。局部固化顶层在烘箱中以80℃烘焙25分钟之后被从起模具中剥离，与底层对齐且组装。使用80℃、1.5小时最终烘焙不可逆地结合这两层。一旦被从底部硅母模具剥离，这个RTV设备典型地使用HCL被处置(0.1N，30分钟、80℃)。这种处置起到裂开某些Si-O-Si结合的作用，从而露出使通道更亲水的羟基团(hydroxy group)。

[0255] 然后，该设备可优选地被气密地密封至支座。该支座可以实质上由任意材料制造，尽管表面应当是平坦的以确保良好密封，因为形成的密封主要因粘结力。合适支座的例子包括剥离、塑料等。

[0256] 根据前面方法形成的设备产生形成流动通道中一个壁的基片(例如，载玻片)。可替换地，一旦从母模具移除的设备就被密封至薄弹性隔膜，以致于流动通道被整体密封在弹性材料中。因此，得到的弹性设备可被优选连接至基底支座。

[0257] B.利用盲道设计的设备

[0258] 1.层结构

[0259] 基于盲道设计的微流体设备典型地由三层形成，在所述微流体设备中试剂在制造期间被沉积在反应点。底层是试剂沉积在其上的层。底层可以由各种弹性材料形成，如在上面引证的MLS方法中在引用中所述的。典型地，材料是聚二甲基硅氧烷(PMDS)弹性体。基于该装置和理想的用于具体设备的反应点的定位，人们可以确定在适当试剂应当点样在其上的底层上的定位。因为PMDS是亲水的，则沉积的含水点收缩移形成非常小的点。沉积的试剂被沉积以使在试剂和弹性体表面之间没有形成共价键，因为如先前所述的试剂一旦被导入反应点中则被用于融解在样本溶液中。

[0260] 设备的其余两层是形成流动通道的层和形成控制和优选保护通道的层。这两层根据在这个部分先前所述的一般方法被制备，然后，将得到的两层结构放置在第一层的顶部，试剂已经被沉积在所述第一层上。三层中的组成的具体例子如下(组成A对组成B的比率)：第一层(样本层)30∶1(重量上)；第二层(流动通道层)30∶1；以及第三层(控制层)4∶1。然而，可以想象到的是，也可以利用弹性部件的其它组成和比率。使用结合两或多层和或基片的其它方法可以包括使用粘结剂或等离子结合，优选空气等离子体结合，以形成弹性材料块或微流体设备的其他部分。在一些实施例中，与其它层通过通孔内部连接的附加层，优选弹性层可被用于增加弹性材料块中每单元区域的反应密度或者减小弹性材料块的大小。

[0261] 在这种处理过程中，反应点与沉积的试剂相对齐，以致于试剂被定位在合适的反应点内。图6是一套从设备四角截取的照片；这些照片显示：利用前面方法，沉积的试剂可被精确地与反应点相对齐。这些照片显示保护通道和反应点被定位在分支流动通道的末端处。白色圆圈指示沉积试剂相对于反应点的位置。如所指示，各个试剂点很好地处于反应点的限制内。

[0262] 2.点样(spotting)

[0263] 利用任意数量的在市场上可以买到的试剂点样器和使用各种构建的点样技术，可以沉积试剂。在设备制备中可被利用的合适点样器的例子包括针点样器、超声点样器、自动微吸移管管理器、电泳泵、喷墨打印机设备、滴墨打印机和某些渗透泵。在市场上可以买到的点样器包括CartesianTechnologies MicroSys 5100(Irvine，CA)，Hitach SPBIO(Alameda，CA)，Genetix Q-Array(United Kingdom(大不列颠联合王国))，Affymetrix 417(Santa Clara，CA)和Packard Bioscience SpotArray(Aeriden，CT)。一般地，沉积非常小的试剂点；通常小于10nl的点被沉积，在另一例子中小于5nl、2nl或1nl，在又一例子中，小于0.5nl、0.25nl或0.1nl。

[0264] 使用Foder等的US专利No.5445935：名称为“Array of oligonucleotideon a solid substrate”中所述的方法还可以形成材料阵列，其中例如SNP探针的低聚核苷酸探针使用空间光引导光蚀刻在原位置被合成。这种阵列还将被用作本发明中微流体设备的基片或基底，以致于对应于反应点的基片区域例如盲填充腔将排列在基片上在一个已知位置中包含一个或者优选多余一个的低聚核苷酸探针。在分离微流体结构的情形中，例如在这里图15中所描绘的一种，被描绘为沿蛇形线(serpentine)的正方形盒子的反应点，流动通道将包含多个不同SNP探针，优选适于从单体的总和中识别单体的SNP探针的集合，以致于如果包含来自多个单体中的核酸序列的流体样本，在此处被导入蛇形线流动通道，和与蛇形线流动通道相连通的多个阀门，以致于被起动时导致蛇形线流动通道被分离，从而隔离互相隔离各个反应点，以在各个反应点中包含流体样本的片断。可以执行对样本组成的扩增以增加分子数，例如核酸分子，用于结合至被定位在各个反应点内的SNP探针阵列。在一些实施例中，沿蛇形线流动通道的各个反应点将是相同的阵列，也就是具有相同的排列SNP探针，以及在另一实施例中，沿蛇形线流动通道的两个或多个反应点将具有不同系列SNP探针。其它分离流动通道构造还可能被使用，例如分支的和/或分支的分支系统等等。其它排列技术，例如这里所述的点样，同样的可被用于形成定位在沿蛇形线或普通流动通道(例如分支的)的可分离反应点内的阵列。

[0265] 下面例子被表述，以进一步说明这里公开的设备和方法的具体方面。所述例子不被认为是对本发明的限制。

[0266] 例1

[0267] 信号强度评价

[0268] I.介绍

[0269] 这套实验的目的是证明使用此处阐述的设计的微流体设备可进行成功的PCR反应，信号强度比Macro TaqMan反应大50％。

[0270] II.微流体设备

[0271] 使用MSL程序制造的三层微流体设备被设计和制造，用于进行下面例子中描述的实验。图7A示出该设备的横截面图。如所示，设备700包含层722，在其内形成流动通道。该液体层722被夹在覆盖层720和底层密封层724之间，覆盖层720包含控制和保护层。封闭层724层形成流动通道的一个侧面。作为结果的三层结构被固定至基层726(在这个例子中，滑板或盖片)，基层726提供结构稳定性，增加热传导，并帮助防止从微流体设备700底部的蒸发。

[0272] 图7B示出流动层722内流动通道的设计的略图以及控制/保护层720内控制通道和保护通道的设计的略图。设备700包含十个独立的流动通道702，每一个带有自己的入口708，以及分支盲通道704，每一盲通道704具有1nl的反应部位706。设备700包含控制线712的网络，其在施加足够压力时分隔反应部位706。还包含一系列保护通道716以防止液体蒸发出反应部位706；液体通过入口718引入。

[0273] II.试验配置

[0274] 在设备700中实施PCR反应，所述PCR反应使用β肌动蛋白引物和TaqMan探针以从人类男性染色体组DNA(Promega，Madison WI)扩增β肌动蛋白基因的外显子3。TaqMan反应包括下面成分：1×TaqMan缓冲剂A(50mM KCI，10mM Tris-KCI，0.01MEDTA，60nM Passive Reference1(PR1)，pH8.3)；3.5-4.0mM Macl；200nM dATP，dCTP，dGTP，400nMdUTP，
300nM激动蛋白前向引物和逆向引物；200nMFAM标记的β肌动蛋白探针；0.01U/ul AmpEraseUNG(Applied Biosystems Foster 市，CA)；0.1-0.2U/ul DyNAzyme(Finnzyme，Fspoo，Finland(芬 兰))；0.5 ％Triton-x-100(Sigma，St.Louis，MO)；0.8ug/ul凝 胶(Calbiochem，San Diego，CA)；5.0％甘油(Sigma，St.Louis，MO)；去离子水和男性染色体组DNA。加入反应成分以生成25ul总反应容积。每一套PCR反应中包含阴性对照(negative control)，阴性对照包含除去目标DNA之外的所有TaqMan反应成分。

[0275] 一旦TaqMan反应样本和对照被制备，则使用连接至1毫升注射器的凝胶加载吸管尖端，将它们注射入微流体设备700中。吸管尖端被充满反应样本，然后通过708被注入流体。通过手动将反向压力施加给注射器，流动通道702被填充，直至所有整个盲道704和反应部位706被填充。控制线712被填充去离子水，并且在所有样本被加载进流线702、704之后被压缩至15-20psi。压缩的控制线712被激励以关闭阀门和将样本隔离在1nl孔706中。然后，将引导通道716填充去离子水，进而压缩至5-7psi。将矿物油(15ul)(Sigma)放置在热循环器的平板上，然后将微流体设备/盖片700放置在热循环器上。微流体设备700因而被热循环，使用初始斜面和三步或两步热循环曲线。

[0276] 1.初始斜面至95℃，并且保持1分钟(1.0℃/s至75℃，0.1℃/sec(秒)至95℃)。

[0277] 2.三步热循环持续40周(92℃持续30秒，54℃持续30秒以及72℃持续1分钟)或者；

[0278] 3.两步热循环持续40周(92℃持续30秒以及60℃持续60秒)

[0279] 带有残留反应混合物的MicroAmp(微安)管(Applied Biosystems Foster市，CA)，为了将它们与在微流体设备中进行的反应相区分而标明MacroTaqMan反应，被放置在GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems，Foster市，CA)中，并且在9600型号中被热循环。Macro TaqMan反应被用作微流体设备中进行的反应的宏观对照。热循环协议被设置以与微流体设备中的相匹配，除了初始斜面比率不是为Macro T aqMan反应而控制之外。

[0280] 一旦完成热循环，对照和保护线被减压以及该片被转移到玻璃滑片(VWR，West Chester，PA)上然后该片被放置进入具有改良的托架的ArrayWoRx扫描器(Applied Precision，Issaquah，WA)。荧光强度在三种不同激发/发射波长下被测量：475/510nm(FAM)，510/560nm(VIC)，和580/640nm(Passive Reference 1(PR1))。使用Array Works软件显像微流体设备中的荧光和测量每一1nl孔中的信号和背景强度。然后使用Microsoft Excel文件分析结果，计算β肌动蛋白TaqMan反应的FAM/PR1比值。对于传统MacroTaqMan，目标DNA的阳性样本使用制造商提供的协议(TaqMan PCR试剂盒协议)中描述的计算方法测定。信号强度通过用对照的FAM/PR1比值除样本的FAM/PR1比值来计算。
成功的反应定义为样本比值高于99％置信度阈值水平。

[0281] III.结果

[0282] 开始，AmpliTaq Gold(Applied Biosystems，Foster市，CA)被用在TaqMan反应中以及与Macro TaqMan反应5.0-14.0的反应比值相比，产生1.5-2.0的FAM/PR1对照比值。尽管结果是阳性的，需要增强信号强度。因此，由于DyNAzyme聚合酶的热稳定性、校正和对杂质的抵抗增强，AmpliTaq Gold聚合酶被DyNAzyme聚合酶代替。0.025U/μl的标准MacroTaqMan DyNAzyme浓度被用于微流体实验中。聚合酶改变为DyNAzyme产生了3.5-5.8的FAM/PR1对照比值。信号强度被改善，但难于获得稳定的结果。由于已知某些蛋白粘至PDMS，增加了多聚酶的浓度并包含了表面改良添加剂。以微流体设备中每nl 100pg或10pg基因组DNA检测了两种浓度增加的DyNAzyme，8×(0.2U/μl)和4×(0.1U/μl)用于MacroTaqMan的标准浓度。加入凝胶、甘油和0.5％Triton-x-100以防止多聚酶粘附到PDMS。微流体设备(片)中和Macro TaqMan对照的反应结果在图8示出。

[0283] 微流体TaqMan反应比值范围从4.9-8.3而Macro TaqMan反应范围从7.7-9.7。因此，片中TaqMan反应的信号强度达到Macro TaqMan反应的87％。4×和8×DyNAzyme之间没有显著差异。该结果证实PCR反应可以在微流体设备中进行，信号强度大于与Macro TaqMan反应相比的50％。该结果在至少四次的尝试中是一致的。

[0284] 例2

[0285] 试剂点样

[0286] I.介绍

[0287] 该实验的目的是证实微流体设备中成功的点样PCR反应。该文本中的术语“spotted”是指小滴试剂(斑点)在基质上的放置，该基质然后被组合成为微流体设备的部分。被点样的试剂通常是实施PCR所需的试剂混合物的子集。

[0288] II.过程

[0289] A.试剂的点样

[0290] 试剂的常规点样通过接触打印来实施。试剂从一套源孔被取到金属针上，以及通过使针接触目标基质而被沉积。该打印过程在图9中进一步概括。如所示，试剂被从源(例如微滴定板)取得，以及然后通过使装载的针与基质接触而被打印。洗涤步骤包含在去离子水中摇动然后真空干燥。用于打印试剂斑点的系统是Caresian Techologies MicroSys5100(IrvineCA)，使用TeleChem“ChipMaker”打印针，尽管如上所述可使用其它系统。

[0291] 使用的针是TeleChem ChipMaker 4针，其结合有电切削狭槽(见图9)以增加摄取的体积(以及因此可打印斑点的数量)。在使用的操作条件下(典型地，75％相对湿度和大约25℃)，每针每装载循环打印超过一百个斑点。在以上条件下，点样在PDMS基质上的试剂的体积是0.1nl级的。

[0292] 针尖端的大小为125×125μm。干燥的试剂的最终斑点实质上是小于此的(小到直径7μm)，针的大小依然决定可容易获得的斑点间距的下限。可获得的间距决定了最终设备中最小的孔-至-孔间距。使用这样的设备和前述的方法，可获得180μm间距的阵列。构建在工作片中的阵列趋向于具有从600到1300微米的间距。

[0293] 在某时间仅使用一个针进行点样。然而，使用的系统具有可容纳达到32个针的针头部。打印标准尺寸的片(20×25nm级阵列大小)花费低于5分钟。

[0294] B.点样的片的组合

[0295] PCR设备的流动和控制层根据以上描述的正常MSL程序组合。微流体设备设计与例1中所描述的那个相同。同时，包含A∶B成分比30∶1的150μm厚PDMS的基质层，通过旋转被覆空白硅晶片，以及然后在80℃固化90分钟。

[0296] 固化的PDMS空白基质层(图7A的封闭/基层724)用作为试剂点样的目标。点样的图案被打印在仍然在空白晶片上的基质上，用于PCR反应的点样的试剂是即将被扩增的特定基因的特异性引物和探针。点样的试剂包含体积比1∶1∶1的300nMβ肌动蛋白前向引物(FP)，300nM nMβ肌动蛋白逆向引物(RP)，和200nMβ肌动蛋白探针(Prb)。在某些情况下，通过浓缩点样的混合物进一步调整化学性质是有用的。已发现调整浓度以使引物和探针浓度等于或稍微高于常规宏观的配方值产生一致性良好结果。因此，点样的试剂被浓缩至宏观反应浓度的3倍和4倍。试剂的浓缩在Centrivap加热和抽空离心分离机内进行并且不改变FP∶RP∶Prb的相对比值。斑点浓度的增加产生当试剂在1nl反应体积被重新悬浮时的恰当终浓度。点样的试剂不需限制为引物和探针；也不必所有三者(FP、RP和Prb)被点样。可以进行只有探针、或甚至引物之一被点样的应用。点样的样本引物/探针套是TaqManβ肌动蛋白和TaqManRNAse-P的实验已经进行。

[0297] 在基质层上点样过程之后，结合的流动和控制层(即图7A的层720和722)与斑点图案对齐并接触。使用进一步在80℃烘烤60-90分钟以将基质结合至片的其余部分。在片组装后，PCR反应的其余成分(在例1中描述)被注入片的流动通道以及片被如例1中所述进行热循环。

[0298] III.结果

[0299] 使用其中引物(向前和反向引物)和探针分子被点样的设备，连续地和重复地执行PCR反应。类子芯片的数据例被显示在图10中，在该芯片中连续执行反应。点样的试剂产生如在例子1中限定的连续PCR反应。使用2阶和3阶热循环协议连续执行反应。

[0300] 例3

[0301] 基因定型

[0302] I.介绍

[0303] 下面试验的目的是阐述利用这里所述的例如微流体设备或芯片可以实施基因定型试验。具体地，这些试验被设计以确定在该设备中实施的反应是否具有足够的灵敏度且确保除β肌动蛋白之外其它引物/探针集合可被执行在微流体设备中。

[0304] II.方法/结果

[0305] A.Rnase P试验

[0306] 如例1中所述在微流体设备中执行Rnase P TaqMan反应(AppliedBiosystems，Foster city，CA)，以说明其它引物/探针集合产生可检测的结果。Rnase P反应还要求更高灵敏度，因为与β肌动蛋白引物/探针集合相对照Rnase P引物/探针集合检测单拷贝基因(2拷贝/染色体组)。β肌动蛋白集合检测单拷贝β肌动蛋白基因和几种假基因，它们每个染色体组集中总共近似17份。使用如例1中所述的相同组成运行Rnase P反应，除了β肌动蛋白引物/探针集合由Rnase P引物/探针集合取代之外。另外，Rnase P引物/探针集合在4×制造商推荐数值处被使用，以增强荧光信号。将VIC染料共轭结合至用于Rnase P的探针，并且关注针对VIC/PRI比率分析。四种试验之一的结果被显示在图11中。

[0307] 用于Macro TaqMan反应的VIC/PRI/对照比率是1.23。用于微流体设备中TaqMan反应的相应比率是1.11和1.21。微流体设备中染色体组DNA样本的比率在高于99％确信阈值之上。另外，微流体设备中TaqMan反应的信号强度为Macro TaqMan反应的50％和93.7％。微流体设备中对照TaqMan反应具有标准偏差.006和.012，说明了在微流体设备上的反应连贯性。因此，确定芯片中TaqMan反应是灵敏的，足够检测每个染色体组的2个拷贝。

[0308] B.DNA稀释试验

[0309] 为了进一步确定微流体设备中TaqMan反应的灵敏度，对染色体组DNA的稀释液进行测试，使用β肌动蛋白引物/探针集合。反应组成通常与例子1中所述的一样被组成，使用4×DyNAzyme和染色体组DNA的稀释液。染色体组DNA被稀释至0.25pg/nl之下，其相应于近似每nl 1份。一种稀释系列的结果被显示在图12中。

[0310] 根据泊松分布，如果平均目标数为一，则孔总数的37％应当为负的。孔数5、6和7低于计算的阈值，因此是负的。这建议：微流体芯片中的β肌动蛋白TaqMan反应可以检测每nl一份的平均值。因此，微流体设备中的反应灵敏度是足以执行基因定型试验的。

[0311] C.基因定型试验

[0312] 因为微流体设备中的TaqMan能够检测低目标数，预先测试SNP(单核苷酸多态)，所以使用针对CYP2D6 P450细胞色素基因的预定AllelicDiscrimination包(Applied Biosystems，Foster city，CA)执行基因定型。所述包包含一引物集和两探针；标示用于野生型或参考等位基因的FAM，CYP2D6*1和标示用于CYP2D6*3突变或变异等位基因的VIC。用于沿染色体组DNA的各个等位基因的正极性对照、PCR产物在设备中被测试，使用与例1中所述的相同条件。来自一个试验的结果被显示在图13和14中，该试验被重复至少三次，以验证结果和论述可靠性。

[0313] 如图13中所示，分别被产生3.5和2.2的平均VIC/PRI/对照比率的Al-1(Allele1，CYP2D6*1野生型等位基因)和染色体组DNA(100pg/nl)，指示染色体组DNA是用于CYP2D6*1野生型等位基因的正极性。这些数值在用于反应的阈值限之上。微流体设备中TaqMan反应的信号强度分别是Macro TaqMan对照的59％和40％。在VIC通道中应当位负的的Al-2(Allele 2，CYP2D6*3突变或变异等位基因)，被显示在对照(1.5)之上的一些信号，可能因为FAM荧光泄漏进检测器的VIC通道。使用改进的检测处理可将泄漏最小化。

[0314] Al-2正极性对照给出3.0的平均VIC/PRI/对照比率，其为MacroTaqMan信号的37％和在计算的阈值限之上(见图14)。用于CYP2D6*3突变等位基因的染色体组样本是负的，由于CYP2D6*3等位基因的频率是低的期望结果。再者，显示有一些Al-1、VIC探针的泄漏进入检测器的FAM通道。总的来说，SNP检测反应在微流体设备中是成功的。

[0315] 例4

[0316] 使用凝胶电泳的PCR校验

[0317] I.介绍

[0318] 当证实DNA扩增的可选择方法发生在微流体设备中时，使用凝胶电泳检测PCR产物的试验被执行。PCR反应组成与例子1中所述的一样，除了TaqMan探针被省略和β肌动蛋白向前引物被共轭结合至FAM。

[0319] II.过程

[0320] A.微流体设备

[0321] 使用MSL处理制造的三层微流体设备被设计和制造，用于实施在这个例子中所述的试验；图15显示该设计的示意图。设备1500一般包括样品区域1502和对照区域1504。样品区域1502包含三百四十一个1nl反应点1508，该反应点由沿流动通道1506排列的矩形所表示，流动通道1506包括进入通孔1510和出去通孔1512。对照区域1504包含三个控制流动通道1514，各个流动通道包含1nl反应点1518，同样由矩形和进入通孔1516所表示。在足够压力被施加给进入通孔1524中时，控制线网1522隔离各个反应点1508、1518。
包括一系列保护通道1520，以阻止流体蒸发到反应点1508、1518的外面。该设备与例1中所述的一样是三层设备(见图7A)。整个芯片被放置在盖玻片上。

[0322] B.试验配置

[0323] 使用例1中所述的3个温度曲线，加载和热循环微流体设备1500。残留的反应样本在GeneAmp 9700中被热循环，使用与用于微流体设备1500一样的热循环曲线。在热循环被完成之后，反应产物被再现。为了再现扩增的DNA，将3μl水注入样本通孔1506，并且从出通孔1512取出3-4μl产物。来自设备1500和Marco反应的反应产物被使用2μl ExoSAP-IT(USB，Cleveland，OH)被处理，ExoSAP-IT由DNA Exonuclease I和ShrimpAlkaline Phosphatase组成，以去除过量的核苷酸和引物。Marco产物被从1∶10稀释至1∶106。设备1500中的产物被脱水，以及被重新悬浮在4μl甲酰胺中。

[0324] III.结果

[0325] 针对聚丙烯酰胺凝胶，连同负对照一起对两个产物进行分析。图15显示凝胶电泳结果。在图16中观察到在长度上294带基对的合适大小DNA带。

[0326] 来自Marco反应的产物被示出在凝胶的左手侧，并且对应于大约294带基对(β肌动蛋白PCR产物所期望的大小)。负对照缺少PCR产物。类似地，从该设备中得到的产物给出期望的β肌动蛋白PCR产物。因此，目标DNA在微流体设备中被扩增。

[0327] 例5

[0328] 大块分割

[0329] 聚合酶链反应(PCR)成为分子生物学中的主要工具。其与灵敏度(DNA单个分子的扩增)、特异性(区分单带基失配)和动态范围(实时测试设备的105)的组合使其成为现有中最强大分析工具之一。描述了：当反应容积减小时PCR性能提高：我们在单微流体芯片上执行21000个同时发生的PCR反应，在每个反应90pL的容积中且具有单温度分子灵敏度。

[0330] 图17a-17d描绘了单排和双排分割微流体设备，其中多层软光蚀刻(MSL)(1)被用于产生弹性微流体芯片，该弹性微流体芯片起到活动阀门的作用，以将几种流体样本中的每个大块地隔离为大量隔离的反应容积。在样本备注如入口1703之后，所述入口1703与微流体设备1701中的分支隔离通道系统1705相连通(图17b)，2400个各个样本的90pL容积1709由沿单微流体通道(图17d)间隔开的关闭阀1707隔离开。然后，芯片设备在平板热循环器上被热循环，以及在在市场上可以买到的荧光度数器中成像。

[0331] 通过改变模板DNA的浓度以及测量给出正极性Taqmantm信号的孔的数量，评估芯片中的PCR性能。我们发现，在每孔复制品的平均数量是低的时观察到数字扩增(图18a和18b)。即使在每孔平均数量复制品低于1时，也观察到强化正极性和清楚的负极性信号；这意味着甚至目标的单复制品可能具有良好扩增。正极性孔的数量与计算的控数量是一致的，以通过Poisson(泊松)分布具有≥1的目标版本(图19)。这种结果确认：这种系统即使根据单目标版本也具有恒定的扩增。来自微流体TaqmantmPCR的荧光信号强度针对宏观PCR反应与相同DNA浓度是可比较的-即使宏观反应每个反应包含多于＞104个模板版本。

[0332] 也许被观察的确限度(fidelity)的主要来源是目标的有效浓度：90pL容积中的单分子比5μL容积中的单分子浓于55000倍。由于目标分子数nt没有改变(也就是，nt＝1)以及可产生侧反应的分子数ns(也就是，样本中的引物-二聚物和非互补DNA序列)与容积成线性比例的(也就是，ns∝V)，目标对侧反应的比率与容积成反比例：nt/ns∝1/V。由于侧反应是PCR事故(4)的主要原因，则减小反应容积的优点是显而易见的。

[0333] 从模板的单拷贝的PCR扩增已经在前面被报告(5)。然而，在宏观容积中实现从单拷贝可靠扩增的当前方法经常需要改变热循环协议(例如，长延展时间，许多循环)、对错误引物(mispriming)和非特定扩增(例如，“热启动”PCR(聚合酶的热激励)、“增压器”PCR、添加剂，以减少非特定杂交等)的预防措施，并且几乎一直使用两圈PCR作出，其中第一PCR中的部分被用作第二反应中的模板。相相反地，这种系统从单拷贝实现可靠的扩增，使用标准条件离开隔板引物和探针和单圈标准热循环协议。作为完整地封闭，还几乎不受环境污染的影响。相比于宏观容积(，同时作大量PCR反应的能力提供明确逻辑的、成本和时间益处具有21000个反应的1芯片对219个分离的96孔板，以及相关联时间、设备和跟踪基础结构)。

[0334] 使用数字PCR读出的大量分离的这种原理可以被用于样本中目标浓度的绝对数量。例如，可被使用的是，简单地通过统计给出如上所述的特定等位基因或多个等位基因正极性的孔数量，对染色体组DNA的存储(pool)样本基因定型。由于对侧反应的增强阻力，在量化野生型DNA中的突变异种(相关于癌症检测的问题)中，应当还是可使用的。通过隔离的浓度的一般原则在其它反应中可能还是有用的，在其中对单分子、细菌、病毒或细胞的检测是感兴趣的(例如，用于蛋白质检测的ELISA反应)。Brown等的US专利No.6143496、名称为“Method of sampling，amplifying and quantifying segment of nucleic acid，polymerase chain reactionassembly having nanoliter-sized chambers and methods of filling chambers”以及Vogelstein等的US专利No.6446706、名称为“Digital PCR”描述了数字PCR，从而其两者通过以其全文引用被结合。使用微流体设备可获得的小容积允许高度并行化和非常高的目标-背景浓度比率。高目标-背景浓度比率允许单分子扩增确限度。这些因素建议用于PCR，越小越好。

[0335] 本发明提供用于在微流体环境中实施数字PCR的方法和设备，所述方法包括步骤：提供在其中流体通道的微流体设备，所述流体通道具有在其间相关的两个或更多阀门，阀门被启动时能够将流体通道隔离为两个或多个反应点或腔体；引入包含至少一个目标核酸聚合体的样本，启动阀门将流体样本隔离为两个或多个部分，其中至少一部分包含目标核酸聚合体，而另一部分不包含目标核酸聚合体，扩增目标核酸聚合体，以及确定包含目标分子的流动通道部分的数量。在优选实施例中，微流体设备包括弹性体材料，更优选地包括包含弹性体材料的至少一层。在具体优选实施例中，微流体设备进一步包括可偏转的隔膜，其中可偏转的隔膜可偏转入流体通道或偏转出流体通道，以控制流体通道内的流体流和/或隔离流体通道中一部分与另一部分，优选地其中可偏转的隔膜对于微流体设备层来说是完整的，在其中具有形成在其中的通道或进出口，以及优选地其中形成可偏转的隔膜，在该处微流体设备的第一层中的第一通道由第二层中的第二通道所重叠。在一些实施例中，样本流体包含实施扩增反应所需的所有部件，而在其它实施例中，在引入样本流体之前，微流体设备包含扩增反应的至少一个部件。在一些实施例中，微流体设备进一步包括检测试剂，优选地对至少部分目标核酸聚合物有用的(complimentary)一个或多个核酸聚合物，优选地多种不同核酸聚合物在空间上排列在微流体设备的反应点或腔体内。

[0336] 通过例如PCR的热循环反应或者通过绝热反应可以获得扩增，所述绝热反应例如由Van Ness等描述在美国专利申请No.10/196740中，其被公告为US2003/0138800A1，其再次通过引用其全文用于教导绝热扩增放案的目的被结合。

[0337] 本发明进一步使用荧光染料用于蛋白质微量热法测定，例如SYBER绿(TM)，以测量蛋白质的构象变化，例如变性，尤其是如果在蛋白质与例如配合基或复合物或其他蛋白质的另一半族(moiety)相互作用时蛋白质变形温度改变。使用SYBR绿(TM)的另外优点在于：它在比其他UV范围染料低的波长处被使用，从而减少典型地与许多塑料材料相关的背景问题。

[0338] 图22B描绘了完整的微流体设备2899的展开图，所述微流体设备2899包括图22A中所示的部件，且进一步包括弹性材料块2808，所述弹性材料块2808被附连或更优选地使用粘结剂被粘结以及更优选地直接被粘结，优选地不使用至基底2800的弹性材料块位置2807的粘结剂以形成完整的微流体设备2899(图22C)。在弹性材料块2808内是处于与一个或多个通孔2814相流体连通的一个或多个通道，所述通孔2814接下来提供弹性材料块内通道和基底内通道之间的流体连通，所述流体连通然后在井排2806a-d内产生井(well)2805以提供基底2800的井(well)2805和弹性材料块2808内通道之间的流体连通。
累积器井(well)顶部2809和2810被附连至累积器井(well)2801和2802以形成累积器腔2815和2816。累积器井(well)顶部2809和2810分别包括阀门2812和2811，其优选为在压力下用于引导和保持气体进入累积器腔2815和2816的止回阀门。当存在于累积器腔2815和2816内时，阀门2811和2812为了保持液体而适于距离接触阀门2811和2812被定位在排水井2802和2804内侧。阀门2811和2812可优选是在优选止回阀门内通过挤压薄片、销钉等而被机械打开的，以克服止回阀门的自动关闭力，以允许从累积器腔释放压力从而降低被包含在累积器腔内的流体压力。

[0339] 图22B描绘了完整的微流体设备2899的展开图，所述微流体设备2899包括图22A中所示的部件，且进一步包括弹性材料块2808，所述弹性材料块2808被附连或更优选地被粘结以及更优选地直接被粘结，优选地不使用至基底2800的弹性材料块位置2807的粘结剂以形成完整的微流体设备2899(图22C)。在弹性材料块2808内是处于与一个或多个通孔2814相流体连通的一个或多个通道，所述通孔2814接下来提供弹性材料块内通道和基底内通道之间的流体连通，所述流体连通然后在井排2806a-d内产生孔(well)2805以提供基底2800的孔(well)2805和弹性材料块2808内通道之间的流体连通。累积器井(well)顶部2809和2810被附连至累积器井(well)2801和2802以形成累积器腔2815和2816。累积器井(well)顶部2809和2810分别包括阀门2812和2811，其优选为在压力下用于引导和保持气体进入累积器腔2815和2816的止回阀门。当存在于累积器腔2815和2816内时，阀门2811和2812为了保持液体而适于距离接触阀门2811和2812被定位在排水井2802和2804内侧。阀门2811和2812可优选是在优选止回阀门内通过挤压薄片、销钉等而被机械打开的，以克服止回阀门的自动关闭力，以允许从累积器腔释放压力从而降低被包含在累积器腔内的流体压力。

[0340] 图22D描绘了微流体设备2899和井(well)2805的平面图，其中断口被邻近井(well)基底被定位，优选底部，或可选择地井(well)2805的侧面，用于从京津如形成在基底2800中通道的流体的通过，优选在井(well)2805对过在基底2800的侧面上。在具体优选实施例中，基底2800被模制，在其中带有凹槽，所述凹槽通过优选粘结剂膜或密封层的密封层被制造在通道中。

[0341] 基底2800机器相关部件可以由聚合物制造，例如聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、高密度聚乙烯、聚三氟氯乙烯PTFE或Teflon(R)、玻璃、石英或金属(例如铝)、透明材料、多晶硅等等。累积器井(well)顶部2809和2810进一步可包括进口螺旋2812，可以将进口螺旋2812去除以从累积器腔2815和2816导入或去除气体或液体，优选地，阀门2812和2811可被启动以释放否则保持在累积器腔2815和2816内的流体压力。使用凹口2817协助校正微流体设备在其它仪器中的位置，例如，用于操作或分析微流体设备或在其中执行反应的仪器图22D进一步描述围绕弹性材料块区域2807的水合腔2850，所述水合腔可以使用水合盖体2851覆盖以形成湿润腔，以有利于对弹性材料块周围湿度的控制。通过将例如水的挥发性液体添加至水合腔2851可以增加湿度，优选通过对吸附材料或海绵增湿。可优选使用聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)。通过改变优选用于增湿吸附材料或海绵的聚乙烯醇和水的比率可以获得湿度控制。通过使用例如HUMIDIPAKTM湿润封装的湿度控制设备还可以控制水合，所述湿度控制设备例如使用水蒸气可透过的而液体不可透过的密封袋容纳具有适于维持理想湿度值的盐浓度的盐溶液。参见Saari等的US专利No.6244432，在这里通过引用用于包括湿度控制设备和方法的特定目的的所有目的被结合。水合盖体2850优选是透明的，以为了在使用期间在弹性材料块内不掩盖可视化的情况。同样地，在弹性材料块区域
2807下面的基底2800的部分优选是透明的，但也可是模糊的或反射的。

[0342] 图22E描绘了基底2800的横截面图，带有沿密封层2881被定位在弹性材料块区域2807的弹性材料块808，所述密封层2800在弹性材料块2808的对面被附连到基底2800的侧面。井(well)2805处于与弹性材料块2808流体连通中，通过第一端口2890、通道2870和第二端口2892、进而进入弹性材料层2808的凹槽，所述凹槽由基底2800的上顶面2897密封以形成通道2885。密封层2881由模制或加工入基底2800底表面2898的凹槽形成通道2870。密封层2881优选是透明材料，例如聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚丙烯。在一个实施例中，密封层2881是弹性的，例如粘接带，并且可通过粘接被附连到基底2800，例如使用粘接剂或加热密封或机械附连，例如通过压缩。用于密封层2881的材料优选是易于形成带有凹槽的流体密封的，以形成具有最小泄露的流体通道。密封层2881可进一步由是刚性的附加支承层(未显示)支承。在另一实施例中，密封层2881是刚性的。

[0343] 流体的闭合细节展示了基底2800的弹性材料块2808和弹性材料块区域2807之间界面。如在Grossman等待审查专利申请US11/043395中所描述的，其中用于这里这里和那里扫描述的所有目的而被结合，以及用于公开关于集成载体和自动启动设备的使用的进一步细节的目的，由被结合在一起以形成弹性材料块的多层弹性材料可以形成弹性材料块。优选地，具有形成在那里的凹槽的第一弹性材料层被粘接至具有形成在那里的凹槽的第二材料层，以形成形成在那里的凹槽的弹性材料块。第一弹性材料层的凹槽被整体或部分阻塞，以形成在第一弹性材料层中的通道。当弹性层被粘接至基底时，形成在第二材料层中的凹槽同样地被整体或部分阻塞，以形成第二弹性材料层中的通道，从而形成具有形成在其中带有通道的多层的微流体设备。

[0344] 在图23中，第一弹性材料层2920和第二弹性材料层2923被粘接在一起以形成具有通道2907(由第一凹槽2901和第二弹性材料层2923顶面形成)的弹性材料块，所述第一弹性材料层2920具有形成在其中带有第一凹槽2901的底表面，所述第二弹性材料层2923具有形成在其中的带有第二凹槽2905的顶表面和底表面。基底2800被附连到第二弹性材料层2923的底表面，以由基底2800的顶表面2897和第二弹性材料层2923的底表面形成通道2909。端口2892可使用第二弹性材料层的通道2909连接基底2800的通道2872，通道2909部分通过基底2800的顶表面形成。可替换地如图23中所示，经由通孔2950，端口2892使用弹性材料块2808的第一弹性材料层2920的通道2907连接基底2800的通道2872。通孔2950大约垂直于基底表面2897被形成，优选形成在第二弹性材料层2923，在其与弹性材料层2920粘接之前，以及更具体在第一和第二弹性层被粘接在一起之后。参见待审查的且共同受让的由Unger于2004年三月29日提出的US临时专利申请No.60/577715，其通过用于所有目的和教导经由构成使用自动激光消融系统和方法的专用目的而被结合。
用于制造通孔的示例方法包括包括微制造同时形成第二弹性材料层2923、激光专控、使用CO2激光器的激光钻孔、使用受激准分子激光器的激光钻孔、机械钻孔和取芯，优选地其中使用机器人钻孔系统执行钻孔，优选地具有x、y自动阶段的钻孔系统。

[0345] 图23描绘通孔的另一优选使用的横截面图，所述通孔位于这里所述的微流体设备中。微流体块2921包括具有形成在其中的第一层凹槽(或粘接至第二层时的通道)2907的第一层2920和具有在其中的第二层凹槽(或粘接至基底时的通道)2950的第一层2923。两个第二层通道处于穿过第一层通道的流体连通中，使用两个或多个通孔2950。优选地，至少一个通孔2950处于与基底2800中的孔2999另外流体连通中，穿过基底凹槽2892(或者通道，如果密封层(未显示)被结合至基底2800)。至少一个第二层通道2909被第一层通道2907重叠，没有处于流体连通中。在图23中所示的实施例中，因为一层中的流体通道可以在同一层中的居间流体通道上或下行进，所以得到微流体设备中每单元面积的较高密度的反应和/或检测带。有消融碎片腔2989，用于收集由激光消融通孔2950产生的碎片。
使用两层铸造方法可以将碎片腔2989铸入层2920内，其中在第一光致抗蚀剂层被图案化和开发出之后，第二光致抗蚀剂层被重叠在第一图案上，并且第二图案被形成在第一光致抗蚀剂层的图案上，以致于使光致抗蚀剂图案区域可以是不同高度。一个在另一个上可以构造多层，以产生变化高度的图案。不同光致抗蚀剂材料还可以被使用，以使例如光致抗蚀剂上层能够在被加热时重新流动，然而下层由在相同加热温度出基本上不会重新流动的光致抗蚀剂材料制造。

[0346] 本发明的流动通道取决于它们想要的应用可选择地被设计具有不同横截面尺寸和形状，呈现不同优点。例如下流动通道的横截面形状可以具有弯曲的上表面，或者沿其整个长度或处于设置在上横截通道下面的区域中。这种弯曲上表面有利于阀门密封，如下面。通过本发明实现的隔膜厚度剖面和流动通道横截面包括矩形的、梯形的、圆形的、椭圆形的、抛物面形的、双曲线形的和多边形的，还有上面形状部分。更复杂横截面形状，例如具有隆起部分(protrusion)的实施例或在流动通道中具有凹陷的实施例，还使用本发明被实现。

[0347] 另外，尽管本发明主要结合其中流动通道的壁和天花板由弹性体构成且流动通道的地面由下面基底构成的实施例被描述，但是本发明不限于这种具体定位。通道的壁和地面还可能被形成在下面基底中，流动通道中只有天花板由弹性体构造。响应施加的激励力，这种弹性体流动通道天花板将向下突出进入通道，从而控制穿过流动通道的材料的流动。一般地，单片弹性体结构优选用于微流体应用。尽管可能有用的是，采用形成在基底中的通道，其中这种结构具有多个优点。例如，包括光波导的基底可以被构造，以使光波导专门将光引导至微流体设备的侧面。

[0348] 本发明的微流体设备可被用作单独的设备，或优选地可被用作如由本发明所提供的系统中的部件。图24描绘了用于起动微流体设备的机器人站的透视图。自动气动控制和累积器装料站3200包括接受湾(bay)3203，用于保持本发明的微流体设备3205，例如在图22A-22E中所描绘的类型。压盘3207适于接触微流体设备3205的上面3209。压盘3207在其中具有于微流体设备3205对齐的端口，以将优选气体压力的流体压力提供至微流体设备3205内的孔和累积器。在一个实施例中，压案3207通过臂3211的运动被推动向微流体设备3205的上面3221，所述臂3211悬挂在枢轴3213上且通过活塞3215被激励，所述活塞3215在一端被连接至3211且在另一端被连接至平台3217。沿活塞3215的传感器检测活塞运动和将关于活塞位置的信息中转至控制器，优选地在遵循软件脚本(software script)的计算机(未显示)控制下的控制器。压盘检测器3219检测微流体设备3205在接收湾3203内侧的存在，优选地可检测为流体锁骨把3205的正确定位。例如通过将光偏离微流体设备3205的侧面使用光检测微流体设备3205的存在和位置，这可能实现。压盘3207可以机器人化地、气动地、电力地等等被下降。在一些实施例中，压盘3207被手动下降以结合设备3205。

[0349] 在一个实施例中，指向压盘3207的流线被定位在臂3211内且被连接到流体压力源，优选在控制器控制下的自动气动压力源。压力源将控制流体压力提供给压盘3207的压盘表面(未显示)内的端口，将受控压缩流体供给至微流体设备3205。通过采用压盘3207连接至臂3211的万向节(gimbal joint)3223，至少部分地实现对压盘3207的微定位，以使压盘3207可围绕垂直微流体设备3205上表面3221的轴用万向架固定。

[0350] 图25描绘了压盘3207的剖开侧面图，所述压盘3207被推向微流体设备3205的上表面3221。压盘3207被推向微流体设备3205上表面3221，以形成在微流体设备3205和压盘面3227之间或设备32056部分和表面3227之间的流体密封。在一个实施例中，压盘面3227包括或由顺应材料制造，例如弹性弹性体，优选耐久橡胶等。压盘3207内是分离流体压力线，优选气体压力线，其与微流体设备3205的上表面3221上各个位置相匹配。还示出的是止回阀(check valve)净化致动器3233，所述止回阀净化致动器3233优选气动地被激励以及在被激励时将销钉3231向下推入止回阀2812，以打开和缓解流体压力，或者通过克服其开启阻力允许流体通过止回阀2718的引入。在一个实施例中，压盘3207具有第一和第二净化致动器3233，其与止回阀2811和2812啮合(见图22B)。

[0351] 在另一实施例中，芯片或设备3205被制造具有常闭容器和/或分界阀门。在这个实施例中，累积器不必在在培养期间保持阀门关断。在分界面和/或容器阀是理想被打开时，将压力应用到载体或设备3205孔区域。用于全部或大多数其他时间，阀门将保持闭合以将各个芯片试验互相分离，和/或将芯片上的试剂和蛋白质孔互相分离。

[0352] 图25描绘了压盘3207的剖开图，所述压盘3207被推向微流体设备3205的上表面3221，其中通过将压盘表面3227接触在上表面3221的脊部3250上将压力腔3255形成在井排2806上方。然后，流体压力优选气体压力被应用至压力腔3255，通过将流体从追溯到装料站(chargingstation)3200的臂3211的压力线导入腔体3255。通过与装料站3200相关的压力调整器调整压力，优选地通过根据装料站控制器发送的信号而可变化输出压力的电受控可变压力调整器，优选在计算机控制下。压力腔体3255内的流体压力接下来驱动孔2805内的流体穿过基底2800内的通道，进而进入弹性材料块2808的通道和/或腔体内，以填充通道或腔体或激励弹性材料块2808的可偏转部分，优选如前所述的可偏转隔膜阀门。

[0353] 图27A和27B描绘了系统3500的具体实施例，更具体地，描绘了界面板3520的具体实施例。在图27A中，界面板3520被耦合至集成芯片和载体3400，以流体密封其某一区域的方式。具体地，流体密封被设置在分界板3520和载体3400和芯片中一个或多个区域之间，例如第一蛋白质区域3430、第二蛋白质区域3432、第一井区域3420、第二井区域3422分界累积器3460、止回阀3465、容器累积器3450和/或止回阀3455。在一个实施例中，分界板3520将流体密封提供给区域3420、3422、3430、3432，以及提供给累积器3450和3460。在一个实施例中，分界板3520提供一个或多个止回阀致动器3570，如在图27B中最佳看到的。

[0354] 在一些实施例中，分界板3520将所有理想的流体密封提供给载体3400和微流体设备。这样做时，分界板3520可包括密封垫圈3580。密封垫圈3580可包括广泛的材料，包括但不限于硅胶、弹性体等。在一些实施例中，垫圈3580包括顺应材料，以有助于在想要的位置出形成流体密封。以这种方式，系统3500可将想要的压力提供给芯片和载体3400中的合适区域。在其它实施例中，分界板3520为两个或多个板部件。例如，在载体3400和微流体设备上的区域或端口各个可被流体耦合至分离板3520，所述分离板3520适于装配所述端口或区域。系统3500然后将包括必要数量的分界板3520，用于各个端口或区域。另外，在一些实施例中，多于一个区域或端口被耦合至具体分界板3520，而其余区域或端口被耦合至分离分界板3520。分界板和载体/芯片区域和端口的其它组合还落入本发明的范围内。

[0355] 在一个实施例中，系统3500的操作包括将一个载体3400装载入接收站3510内。在某些实施例中，载体3400包括耦合至那里的微流体设备，并且在将载体放置入接收站
3510之前将想要的试剂和蛋白质装载入载体孔。在其它实施例中，载体3400被放置进接收站3510，随后使用试剂和蛋白质装载。载体3400进一步可装载有水合流体。水合流体可被放置在水合腔3440中。在载体3400被装载入系统3500之后，分界板3520被被降低或相反被转移结合载体3400。板3520可以手动地、机器人地或相反被降低以使用下片/载体3400的部分或全部流体密封。水合流体被提供给分界累积器3460和/或容器累积器3450，以及通过使用耦合至分界板3520的压力源将合适压力应用到累积器3450、3460而驱入芯片。
在具体实施例中，系统3500自动执行这个工艺，所述工艺在具体实施例中在水合流体被添加至载体3400之后在大约二十(20)小时内发生。结果是，使用水合流体将芯片充分加载，以操作芯片容器和/或分界阀，如这里及本专利更充分的所述的和在这里通过引用结合先前应用。

[0356] 通过将理想的压力施加给围绕合适入口的合适密封芯片区域，将包括试剂和样本的溶液分发进芯片。例如，将在大约1psi(磅/平方英寸)和大约35psi之间的压力施加给第一和第二井区域3420和3422，使驱动试剂进入芯片。类似地，将在大约1psi(磅/平方英寸)和大约35psi之间的压力施加给第一和第二井区域3420、和3422，使驱动蛋白质进入芯片。在具体实施例中，这在芯片装载水合流体之后在大约六十(60)分钟之内发生。一旦溶液被驱赶至芯片内的想要的孔、腔、蓄积库等等，通过释放分界累积器3460中的止回阀3465打开芯片内的分界阀门。在具体实施例中，止回阀3465被释放，以打开芯片中的分界阀，此时系统3500激励结合止回阀3465的止回阀致动器3570。在一些实施例中，止回阀致动器3570包括适于结合止回阀3465的销钉、接线柱等，以释放分界累积器3460内的压力。在可替换实施例中，止回阀3465被手动释放或打开。

[0357] 在使溶液混合理想时间之后，使用例如常规混合或重复打开和关闭分界阀以增加流体在腔中运动的分散或其它工艺，闭合分界阀。将压力施加给致动器3450和/或3460，以保持闭合的分界阀门和容器阀门。载体3400可以从系统3500中去除，用于在这里所述的工艺中培养或存储或使用。致动器3450和3460使压力保持持续想要的时间，从数小时至数天，以阻止或帮助阻止容器或分界阀打开。在具体实施例中，致动器3450和3460保持芯片内压力在理想阈值压力之上，足以保持容器和/或分界阀闭合。在一个实施例中，致动器3450和3460保持压力在阈值压力之上持续至少两(2)天、至少七(7)天等。致动器3450和3460保持理想压力的时间长部分取决于培养温度。部分取决于理想培养时期长和/或培养条件，载体3400可以往返至系统3500，为了重复装料或重复压缩致动器3450、3460。以这种方式，培养时期可以

[0358] 在具体实施例中，集成载体3400和微流体设备适于执行根据本发明实施例的想要的实验，通过使用本发明的系统。更具体地，如图26A中所示，系统3500包括一个或多个接收站3510，各个适于接收载体3400。在具体实施例中，系统3500包括四个(4)接收站3510，尽管在本发明的可选择实施例中提供更少或更多数量的站3510。图26B描绘在站3510中被组合设置的载体3400和设备，处于分界板3520下面。在图26B中，分界板3520适于向下传递，以使分界板3520结合载体3400的上表面及其微流体设备。在一些实施例中，站3510和压盘3520类似于站3200和压盘3207。分界板3520包括一个或多个端口3525，用于与适于在载体3400中容纳流体、压力等的区域相耦合。在一些实施例中，分界板3520包括两端口、三端口、四端口、五端口、六端口、七端口、八端口、九端口、十端口等。在优选实施例中，分界板3520被耦合至用于将压力提供至载体3400中想要区域的六条线以及用于提供激励止回阀3455和3465的机械的两条线。

[0359] 如图26A所示，系统3500进一步包括处理器，在一个实施例中所述处理器是与笔记本计算机或其它计算机设备3530相关联的处理器。计算机设备3530包括适于保存用于执行本发明的理想工艺的软件、方案等的存储器。另外，计算机设备3530包括用于呈现微流体设备的研究和分析结果的屏幕3540，在一个实施例中，系统3500使用GUI显示器。系统3500被耦合至一个或多个压力源，例如压力流体、气体等，用于将同样的传递给微流体设备，所述微流体设备被流动地耦合至分界板3520。

[0360] 图27A和图27B描绘了系统3500的具体实施例，更具体地，描绘了分界板3520。在图27A中，分界板3520被耦合至集成芯片和载体3400，以流体密封其中某一区域的方式。
具体地，流体密封被设置在分界板3520和载体3400及芯片中的一个或多个区域之间，例如第一蛋白质区域3430、第二蛋白质区域3432、第一井区域3420、第二井区域3422、分界累积器3460、止回阀3465、容器累积器3450和/或止回阀3455。在一个实施例中，分界板3520将流体密封提供给区域3420、3422、3430、3432，以及提供给累积器3450和3460。在一个实施例中，分界板3520提供一个或多个止回阀累积3570，如在图27B中最佳所看到的。

[0361] 在一些实施例中，分界板3520将全部理想流体密封至载体3400和微流体设备。这样作，分界板3520可包括密封垫圈3580。密封垫圈3580可包括广泛的材料，包括但不限于硅胶、弹性体等。在一些实施例中，垫圈3580包括顺应材料，以有助于在想要的位置出形成流体密封。以这种方式，系统3500可将想要的压力提供给芯片和载体3400中的合适区域。在其它实施例中，分界板3520为两个或多个板部件。例如，在载体3400和微流体设备上的区域或端口各个可被流体耦合至分离板3520，所述分离板3520适于装配所述端口或区域。
系统3500然后将包括必要数量的分界板3520，用于各个端口或区域。另外，在一些实施例中，多于一个区域或端口被耦合至具体分界板3520，而其余区域或端口被耦合至分离分界板3520。分界板和载体/芯片区域和端口的其它组合还落入本发明的范围内。

[0362] 在一个实施例中，系统3500的操作包括将一个或多个载体3400装载入接收站3510内。在某些实施例中，载体3400包括耦合至那里的微流体设备，并且在将载体放置入接收站3510之前将想要的试剂和蛋白质装载入载体孔。在其它实施例中，载体3400被放置进接收站3510，随后装载有试剂和蛋白质。载体3400进一步可装载有水合流体。水合流体可被放置在水合腔3440中。在载体3400被装载入系统3500之后，分界板3520被被降低或相反被转移以结合载体3400。板3520可以手动地、机器人地或相反被降低以与下片/载体3400的部分或全部流体密封。水合流体被提供给分界累积器3460和/或容器累积器
3450，以及通过使用耦合至分界板3520的压力源将合适压力应用到累积器3450、3460而驱入芯片。在具体实施例中，系统3500自动执行这个工艺，在具体实施例中所述工艺在水合流体被添加至载体3400之后在大约二十(20)小时内发生。结果是，芯片被充分加载水合流体，以操作芯片容器和/或分界阀，如这里及本专利更充分的所述的和在这里通过引用结合先前应用。

[0363] 通过将理想的压力施加给围绕合适入口的合适密封的芯片区域，将包括试剂和样本的溶液散布进芯片。例如，将在大约1psi(磅/平方英寸)和大约35psi之间的压力施加给第一和第二井区域3420和3422，驱动试剂进入芯片。类似地，将在大约1psi和大约35psi之间的压力施加给第一和第二井区域3420、3422，驱动蛋白质进入芯片。在具体实施例中，这在芯片装载水合流体之后大约六十(60)分钟之内发生。一旦溶液被驱至芯片内的想要的井、腔、蓄积库等等，通过释放分界累积器3460中的止回阀3465打开芯片内的分界阀门。在具体实施例中，止回阀3465被释放，以打开芯片中的分界阀，此时系统3500激励结合止回阀3465的止回阀致动器3570。在一些实施例中，为了释放分界累积器3460内的压力，止回阀致动器3570包括适于结合止回阀3465的销钉、接线柱等。在可替换实施例中，止回阀3465被手动释放或打开。

[0364] 在使溶液混合理想时间之后，使用例如常规混合或重复打开和关闭分界阀以增加流体在腔中运动的分散或其它工艺，闭合分界阀。将压力施加给致动器3450和/或3460，以保持闭合的分界阀门和容器阀门。载体3400可以从系统3500中去除，用于在这里所述的工艺中培养或存储或使用。致动器3450和3460使压力保持持续想要的时间，从数小时至数天，以阻止或帮助阻止容器或分界阀打开。在具体实施例中，致动器3450和3460保持芯片内压力在理想阈值压力之上，足以保持容器和/或分界阀闭合。在一个实施例中，致动器3450和3460保持压力在阈值压力之上持续至少两(2)天、至少七(7)天等。致动器3450和3460保持理想压力的时间长度部分取决于培养温度。部分取决于理想培养时期长度和/或培养条件，载体3400可以往返至系统3500，为了重复装料或重复压缩致动器3450、3460。

[0365] 在一些实施例中，如在这里一般所述的集成芯片载体(ICC)和附连至那里的弹性体芯片被使用，以促进聚合酶链反应(PCR)。然而，在使用PCR片进行PCR时，塑料ICC的热传导率可能不足于在隐蔽在弹性芯片内的反应阵列中产生均匀热场。例如，尽管图28A中所述的ICC对其它工艺中的蛋白质结晶是有用的，但不可能充分均匀地将热量传递给耦合至那里的芯片。另外，图28A中的ICC的操作可能要求将它保留约束在压盘上。如图29A中所示，收缩力的应用可对芯片产生不利影响。因此，在本发明的一些实施例中，使用结合图28B所述的ICC提供改进的均匀热场，并且改进的ICC保留方法被描绘在图29B中。

[0366] 在一些实施例中，弹性芯片被设计，以致于与ICC的流体连接被定位在弹性芯片的外边沿。以这种方式，ICC部分不必以来于流体传递。一种这样的实施例被描述在图28A中。在一些实施例中，没有与ICC表面相接触的弹性芯片中的区域位于反应腔阵列被定位的地方。这种反应区域3810包括弹性芯片和导热材料，弹性芯片和导热材料被匹配在芯片的下侧(另外地，弹性块侧面将接触ICC的塑料部分)。反应区域3810的大小和形状可在本发明的范围内发生变化，图29C中所述的一个实施例显示了ICC和芯片之间的关系。

[0367] 以这种方式，具有最小或降低的热阻抗，可将热能(例如，来自PCR设备)传递至弹性块。在一些实施例中，导热材料包括硅(Si)。在具体实施例中，使用来自抛光和平滑硅晶片的硅，与半导体工业中所使用的类似或相同。在本发明的范围内还可以使用其它低热阻抗材料，依赖于所寻求的热曲线的属性。在一些实施例中，导热材料具有低热量(也就是，影响温度快速改变的材料，即使良好热导体，例如铜)。在一些实施例中，使用抛光硅，以增强反射效应和增加可由系统中使用的检测器收集的光的数量，或实时地或如PCR反应中末端点分析的。这些益处还可改善绝热反应。

[0368] 使用ICC3800，执行PCR的一种清洗可以实现，通过使弹性块的反应区域与热控制源相匹配。热控制源可包括连同其它一道的PCR设备、受热压盘、分离热源。在一些实施例中，ICC装配入接收平底反应盘的标准PCR设备和/或具有平热压盘，其中用于基于管的PCR的各种制式的适配器可以被使用。然而，各个这些结构通常依赖于盘向下压缩，以得到良好(均匀)的热接触，如图29A中所示。在本发明的一些实施例中，弹性材料片对向下压缩是不可修正的，因为挠性阀门和弹性腔体在弹性片内可变形和引起不想要的流体行为。

[0369] 在其它实施例中，通过使用真空卡盘(vacuum chuck)以匹配在结合至其它暴露弹性块下侧的热材料上，降低或避免了对ICC的向下压缩的不利影响。以这种方式，在将真空施加至卡盘时，在真空卡盘和ICC热材料之间产生紧密密封。在如图29B中所示的一个实施例中，真空卡盘3950包括或由为良好导热体的一种或多种材料制造，所述良好导热体被结合至热控制源，例如一个或多个Peltier(珀耳帖)器件。在一个实施例中，使用多个热控制产生在反应阵列中的热剃度。

[0370] 使用中，ICC被定位在真空卡盘3950上方，以及向下降低或被转移，以使集成芯片3910和ICC3930中的热部分3920与真空卡盘3950相接触。再者，在一个实施例中，热部分3920包括硅。热部分3920被描绘耦合至弹性块或片3910，使用在一些实施例中的粘结剂等实时这种耦合。如所示，块3910结合ICC3930，以及在一个实施例中，间隙3940被保持在热部分3920和ICC3930之间。间隙3940由于与例如卡盘或压盘3950的热源的热隔离ICC3930。另外，在一个实施例中，间隙3940允许块3910和/或热部分3920的一些折曲。
以这种方式，在这些实施例中的间隙3940在对卡盘3950施加真空时有助于形成密封，通过一个或多个真空口3960以将热部分3920拉向卡盘3950。可以监测得到的真空数量，以变化在卡盘3950和热部分3920之间真正地需要制造的良好热接触。在一些实施例中，真空卡盘中的一个或多个端口被使用用于监测真空度。在图29D和图30中所示的具体实施例中，用于监测真空度的一个或多个端口将被定位在真空端口的远端以及通过通路彼此流体连通，所述通路优选曲折的且狭窄的通路。以这种方式，真空卡盘的一侧-ICC中的热部分之间差异可以与真空卡盘的另一侧-ICC中的热部分之间相比较，以确定在真空卡盘上重新放置ICC的努力能否可以解决真空损耗问题(若有的话)。折可以是自动或手动、或其中一些组合的迭代处理。

[0371] 图30描绘根据本发明的卡盘的一个实施例。在本发明范围内可以改变曲折通路的属性，所述曲折通路的属性被用于得到对真空卡盘热部分区域上不同真空度的精确测量，以及促进真空对ICC热部分的均匀或相对均匀地应用。通过使用这种方案，被用于执行PCR反应的弹性块可以处于与PCR设备的良好接触，如果将使用通常向下压缩，则没有对弹性块的弹性(可偏转的)部分的功能冒险。

[0372] 尽管本发明在这里已经参考其中的具体实施例被描述，但是大范围改变、各种变化和替代被意味在前面公开中，并且将会理解的是：在一些例子中，不脱离所述的本发明范围没有对应的其它特征的用途，本发明的一些特征将被采用。例如，除了上述的基于压力的制动系统之外，可选的静电和磁致动系统还被实现。还可能的是，激励所述设备，通过基于热能应用在控制通道中产生流体流动，或通过热膨胀或通过从液体的气体生成。另外，在另一实施例中，使用离心力将蛋白质和试剂驱动进入芯片。因此，不脱离本发明的真实范围和宗旨针对本发明教导可作出适于具体情形或材料的许多改进。其目的在于，本发明不限于如具体实施方式所公开的用于执行本发明的具体实施例，而是本发明将包括落入权利要求范围内的所有实施例和等价物。

[0373] 引用：

[0374] 1.Unger等，Science 288，113-116(2000)

[0375] 2.通过“盲填充”装载样本通道和控制线-PDMS是充分透气的，以几个磅/平方英寸(psi)压缩的液体将气体赶出通道，剩下完全由液体填充的它们。参见Hansen等，PNAS99，16531-16536(2002)

[0376] 3.人β肌动蛋白基因的294bp片段被使用5′核酸外切酶分析(Taqman)扩增。 前向 和逆 向引 物序 列 分别 是5′-TCACCACACTGTGCCCATCTACGA-3 ′和5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′。图1b是使用基于TAMRA的FRET探针，序列
5′-(FAM)ATGCCC-X(TAMRA)-CCCCCATGCCATCCTGCGTp-3′采取的。图1c中的数据是使用基于黑-猝灭剂的探针采取的，由于大量这些引物探针套开始能够商业提供。反应包含
1×Taqman缓冲液A(50nMKCL，10nM Tris-Hcl，0.01MEDTA，60nM Passive Reference 1，pH 8.3)，4mM MgC12，200nMdATP，dCTP，dTTP，400nMdUTP，300nM前向引物，300nM逆向引物，
200nM探针，0.01U/μlAmperase UNG(全部来自Applied Biosystems，Foster市，CA)，
0.2U/μlDyNAzyme(Calbiochem，San Diego，CA)，5.0％甘油，去离子水和人男性基因组DNA(Promega)。

[0377] 4.定量PCR技术。关于“基因定量”章节，LJ McBride，K Livak，M Lucero，等，编辑，Francois Ferre，Birkauser，Boston，MA，p97-110，1998。

[0378] 见E.T.Lafally，I.Medntz，R.A.Mathies，Anal Chem73(3)，565-570(2001)，和B.Vogelstein，K.W.Kinzler，PNAS96，9236-9241(1999)。

[0379] 理解的是，这里所示例子及实施例仅仅用于说明目的，其中阐述的各种改变或变化将给予本领域技术人员建议，并且被包含在本申请的宗旨和条款及附加的权利要求书的范围内。这里列举的全部公开、专利和专利申请通过以其全文应用用于所有目的而被结合，在相同程度上，与各个单个公开、专利和专利申请被专门和单独地指示一样，通过应用被结合。