猪痢疾短螺旋体的基因和蛋白质及其用途

摘要

本发明描述了新的猪痢疾短螺旋体的多核苷酸和氨基酸。这些序列可以用于诊断动物中的猪痢疾短螺旋体疾病，和在动物中治疗或预防猪痢疾短螺旋体疾病。这些序列还可以用于诊断以及治疗和/或预防动物中由其他短螺旋体属物种，包括B.intermedia、B.suanatina、B.alvinipulli、B.aalborgi、B.innocens、B.murdochii和毛肠短螺旋体，引起的疾病。

权利要求

1.多核苷酸，其中所述多核苷酸

-编码SEQ ID NO：60的氨基酸序列；或-为SEQ ID NO：59的序列。

2.质粒，其包含权利要求1的多核苷酸。

3.权利要求2的质粒，其中所述质粒是表达载体。

4.细胞，其包含权利要求2的质粒。

5.细胞，其包含权利要求3的质粒。

6.免疫原性组合物，其包括权利要求3的质粒。

7.用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体的疫苗组合物，其包括权利要求3的表达载体。

8.用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体的疫苗组合物，其包括权利要求4的细胞。

9.DNA分子，其由与调节序列可操作地连接的权利要求1的多核苷酸组成。

10.质粒，其包括权利要求9的多核苷酸。

11.由权利要求1的多核苷酸或权利要求9的DNA分子编码的多肽。

12.权利要求11的多肽，其为SEQ ID NO：60的序列。

13.多核苷酸，其为编码权利要求11的多肽的序列。

14.质粒，其包含权利要求13的多核苷酸。

15.权利要求14的质粒，其中所述质粒是表达载体。

16.细胞，其包含权利要求14的质粒。

17.免疫原性组合物，其包括权利要求16的细胞。

18.免疫原性组合物，其包括权利要求11或12的多肽。

19.用于治疗或预防猪痢疾短螺旋体的疫苗组合物，其包括权利要求11或12的多肽。

20.单克隆抗体，其可以通过使用SEQ ID NO：60的多肽作为免疫原而产生，并且与SEQ ID NO：60的多肽结合。

21.用于诊断动物中猪痢疾短螺旋体的存在的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求20的单克隆抗体。

22.用于诊断动物中猪痢疾短螺旋体的存在的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求11或

12的多肽。

23.用于诊断动物中猪痢疾短螺旋体的存在的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO：59的多核苷酸。

24.权利要求11或12的多肽在制备用于在动物中产生针对猪痢疾短螺旋体的免疫应答的药物中的用途。

25.权利要求3的质粒在制备用于在动物中产生针对猪痢疾短螺旋体的免疫应答的药物中的用途。

26.权利要求16的细胞在制备用于在动物中产生针对猪痢疾短螺旋体的免疫应答的药物中的用途。

27.权利要求3的表达载体在制备用于治疗或预防在需要所述处理的动物中由猪痢疾短螺旋体引起的疾病的药物中的用途。

28.权利要求4的细胞在制备用于治疗或预防在需要所述处理的动物中由猪痢疾短螺旋体引起的疾病的药物中的用途。

29.权利要求11或12的多肽在制备用于治疗或预防在需要所述处理的动物中由猪痢疾短螺旋体引起的疾病的药物中的用途。

说明书

猪痢疾短螺旋体的基因和蛋白质及其用途

发明领域

[0001] 本发明涉及猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae)中的新基因和其中编码的蛋白质。本发明进一步涉及这些新基因和蛋白质用于诊断猪痢疾短螺旋体疾病、
用于抗猪痢疾短螺旋体疫苗和用于筛选杀死猪痢疾短螺旋体或阻断猪痢疾短螺旋体的致
病效应的化合物的用途。这些序列还可以用于诊断以及治疗和/或预防动物中由其他短
螺旋体属物种引起的疾病，所述其他短螺旋体属物种包括B.suanatina、B.intermedia、
B.alvinipulli、B.aalborgi、B.innocens、B.murdochii和毛肠短螺旋体(B.pilosicoli)。

[0002] 发明背景

[0003] 猪痢疾是澳大利亚和全世界显著的猪地方病。猪痢疾是接触传染性粘膜出血性(mucohaemorrhagic)腹泻疾病，特征为大肠上皮表面的广泛炎症和坏死。由猪痢疾引起的
经济损失主要来自于生长迟缓、药疗成本和死亡率。猪痢疾的致病因子在1971年首先被鉴
定为厌氧螺旋体(猪痢疾密螺旋体(Treponema hyodysenteriae))，近来被重新分至短螺
旋体属为猪痢疾短螺旋体。当猪痢疾在猪舍中建立后，疾病谱可以从轻微、暂时或不明显到
严重和甚至致命之间变化。对单个猪舍的药物策略可以掩蔽临床征象，并且在某些猪舍疾
病可以变得不被注意或可能仅被怀疑。无论明显疾病是否发生，猪痢疾短螺旋体都可以在
受感染猪中、或在其他储存宿主例如啮齿类动物中或在环境中持续存在。所有这些来源均
造成疾病向未感染猪群传播的可能性。商业家禽也可以被猪痢疾短螺旋体定居，尽管不清
楚这在自然条件下的发生频率如何。

[0004] 猪痢疾短螺旋体的建群将引发针对该螺旋体的强免疫应答，因此暴露于该螺旋体的间接证据可以通过测量受感染动物血液中的循环抗体滴度来获得。已报告这些抗体滴度
维持在低水平，甚至在已从猪痢疾康复的动物中。用于检测抗体的血清学试验因此具有检
测亚临床感染和康复的猪携带者的显著潜力，所述猪在其大肠中具有不能检测到的螺旋体
数量。这些试验以容易使用试剂盒形式例如酶联免疫吸附测定法，而是特别有价值的。已
开发了各种技术来检测针对猪痢疾短螺旋体的循环抗体的存在，包括间接荧光抗体试验、
血凝集试验、微量滴定凝集试验、补体固定试验和使用脂多糖或超声处理的全螺旋体作为
抗原的ELISA。所有这些试验都遇到特异性的问题，因为相关的非致病性肠道螺旋体可以诱
导交叉反应性抗体。这些试验对于检测存在明显疾病和高循环抗体滴度的猪群是有用的，
但它们对于鉴定亚临床感染的群体和单个受感染的猪是有问题的。因此，迄今为止，尚无十
分灵敏和特异的测定法可用于检测针对猪痢疾短螺旋体的抗体。缺乏合适的诊断试验已阻
碍了对猪痢疾的控制。

[0005] 许多方法被用于控制猪痢疾，从抗微生物剂的预防性使用，到受感染群体的完全转移和防止受感染的猪携带者的再进入。所有这些供选手段都是昂贵的，并且它们需要使
用复杂的诊断试验监控进程，才能完全有效。目前，在具有亚临床感染的兽群和单个健康动
物携带者中检测猪痢疾仍是主要的问题，其正在阻碍有效控制措施的执行。传统上，猪痢疾
的确诊需要从患病猪的粪便或粘膜分离和鉴定猪痢疾短螺旋体。涉及的主要问题包括这些
厌氧细菌的缓慢生长和苛刻的营养需求，以及由猪肠道正常菌群中存在的形态学相似螺旋
体造成的混淆。随着用于自粪便检测螺旋体的聚合酶链反应(PCR)测定法的开发，在受累
猪个体的诊断方面获得了显著改善。不幸的是，在实际应用中，PCRs的检测极限使得它无
法检测具有亚临床感染的动物携带者。由于这些诊断问题，存在着开发能够在群体和猪个
体水平上检测猪痢疾短螺旋体感染的简单和有效诊断工具的明确需要。

[0006] 在猪痢疾短螺旋体建群后将诱导针对该螺旋体的强免疫应答，该免疫应答可以防止自猪痢疾康复的猪再次感染。尽管如此，开发疫苗控制猪痢疾的尝试一直仅有非常有限
的成功，这是因为它们不能在群体基础上提供充足的保护，或它们太昂贵和难以生产从而
使得它们无法商业化。菌苗疫苗可以提供一定水平的保护，但它们倾向于是脂多糖血清型
特异的，这就要求使用多价菌苗。此外，因为该螺旋体的苛刻厌氧生长需求，它们的大规模
生产是困难且昂贵的。

[0007] 已进行开发减毒活疫苗用于猪痢疾的几种尝试。这种方法具有减毒株显示减少的建群和因此引起减少的免疫刺激的缺点。此外，因为回复毒力的可能性，部分生产者和兽医
不愿使用活疫苗用于猪痢疾，特别是在对猪痢疾短螺旋体的遗传调节和组构知之甚少的情
况下。

[0008] 重组亚单位疫苗的使用是吸引人的备选方法，因为该产品将是成分明确的(对于注册目的而言是必需的)，并且相对容易大规模生产。迄今为止，首个报告的猪痢疾短螺旋
体重组蛋白质作为疫苗候选物(38千道尔顿鞭毛蛋白质)的使用未能阻止猪中的建群。这
种失败可能与使用的具体重组蛋白质，以及递送系统和途径、剂量率、佐剂选择等其他更下
游的问题特别相关(Gabe，JD，Chang，RJ，Slomiany，R，Andrews，WH和McCaman，MT(1995)Isolation of extracytoplasmic proteins from Serpulinahyodysenteriae B204 and
molecular cloning of the flaB1 gene encoding a38-kilodalton flagellar protein.
Infection and Immunity 63：142-148)。首个报告的用于疫苗接种的部分保护性重组猪
痢疾短螺旋体蛋白质是29.7kDa外膜脂蛋白(Bhlp29.7，也称为BmpB和BlpA)，其与各种致
病菌的甲硫氨酸结合性脂蛋白具有同源性。用his标记的重组Bhlp29.7蛋白质接种猪，随
后用猪痢疾短螺旋体进行实验性攻击，与50-70％的未接种对照猪发病比较，导致17-40％
的疫苗接种猪发病。因为Bhlp29.7接种的猪的疾病发生率明显(P＝0.047)低于对照
猪，所以Bhlp29.7看起来具有作为猪痢疾疫苗组分的潜力(La，T，Phillips，ND，Reichel，MP和Hampson，DJ(2004).Protection of pigs from swine dysentery by vaccination
withrecombinant BmpB，a 29.7 kDa outer-membrane lipoprotein ofBrachyspira
hyodysenteriae.Veterinary Microbiology 102：97-109)。已进行了许多其他尝试以鉴定
可以用作重组疫苗组分的猪痢疾短螺旋体外包被蛋白质，但再次未能获得成功的疫苗。需
要一个更为全面得多的方法来自猪痢疾短螺旋体鉴定潜在有用的免疫原性重组蛋白质。

[0009] 迄今为止，仅报告了一例使用DNA进行疫苗接种的研究。在这项研究中，将编码推定的铁蛋白的猪痢疾短螺旋体ftnA基因克隆到大肠杆菌(E.coli)质粒内，该质粒DNA用
于包被金珠以进行生物轰击疫苗接种。使用猪痢疾的鼠类模型测定用DNA和/或重组蛋白
质接种的保护性质。用重组蛋白质接种诱导了针对铁蛋白的良好全身应答，然而，用DNA疫
苗接种仅诱导可检测的全身应答。用DNA疫苗接种后用重组蛋白质加强，仅在用蛋白质加
强后诱导了针对铁蛋白的全身免疫应答。然而，试验的疫苗接种方案无一能够给小鼠提供
对抗猪痢疾短螺旋体建群和相关损伤的保护作用。有趣的是，小鼠用DNA单独疫苗接种导
致了疾病的显著恶化(Davis，A.J.，Smith，S.C.和Moore，R.J.(2005).The Brachyspira
hyodysenteriaeftnA gene：DNA vaccination and real-time PCR quantification of
bacteriain a mouse model of disease.Current Microbiology 50：285-291)。

[0010] 发明简述

[0011] 本发明的一个目的是来自猪痢疾短螺旋体的新基因和由这些基因编码的蛋白质。本发明的进一步目的是新基因和由这些基因编码的蛋白质可以用于治疗和诊断目的。可以
将这些基因和/或蛋白质用于抗猪痢疾短螺旋体的疫苗中以及用于诊断猪痢疾短螺旋体
感染。

[0012] 本发明的一个方面是具有SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65中包含的核苷酸序列的新猪痢疾短螺旋体基因。本发明的再一方面是与SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、
17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63 和 65具有同一性的核苷酸序列，其中同一性百分比可以是至少95％、90％、85％、80％、75％和
70％(以及从100到70的每一个整数)。本发明还包括DNA疫苗或DNA免疫原性组合物，其
包含SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、
45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65的核苷酸序列，或与这些序列具有至少95％、90％、
85％、80％、75％和70％等同性(以及从100到70的每一个整数)的序列。本发明还包括
包含DNA的诊断测定法，所述DNA具有SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、
27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65的核苷酸序列，或与这些序列具有至少95％、90％、85％、80％、75％和70％同一性(以及从100到70的每一
个整数)的序列。

[0013] 本发明的再一方面是包含DNA的质粒，所述DNA具有SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65的序列；包含DNA的原核和/或真核表达载体，所述DNA具有SEQ ID NOs：1、3、5、7、
9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、
61、63和65的序列；和包含质粒的细胞，所述质粒包含具有SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、
15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63 和
65的序列的DNA。

[0014] 本发明的一个方面是具有SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列的新猪痢疾短螺旋体蛋白质。本发明的另一个方面是与SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、
16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64 和
66中包含的序列具有至少95％、90％、85％、80％、75％和70％同源性(以及从100到70的
每一个整数)的蛋白质。本发明的再一方面是包含如下蛋白质的疫苗或免疫原性组合物，
所述蛋白质具有SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、
38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、
52、54、56、58、60、62、64和66中包含的序列具有至少95％、90％、85％、80％、75％和70％同源性(以及从100到70的每一个整数)的氨基酸序列。本发明的一个进一步方面是包含
一种或多种蛋白质的诊断试剂盒，所述蛋白质具有SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、
20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64 和 66 中包含的序列，或与SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、
38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的序列具有至少95％、90％、
85％、80％、75％和70％同源性。

[0015] 本发明的另一个方面是编码具有SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列，以及编码与SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、
22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的序列具有至少95％、90％、85％、80％、75％和70％(以及从100到70的每一个整数)同
源性的氨基酸序列的核苷酸序列。本发明还涵盖包含具有如下序列的DNA的质粒、真核和
原核表达载体、和DNA疫苗，所述序列编码具有SEQID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、
22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列的蛋白质，和编码与SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、
28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的序列具有至少95％、90％、85％、80％、75％和70％同源性(以及从100到70的每一个整数)的氨基
酸序列。包含这些质粒和表达载体的细胞也包括在本发明中。

[0016] 本发明包括单克隆抗体，其与具有SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列的蛋白质结合，或与和SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、
30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66中包含的序列具有至少95％、90％、85％、80％、75％和70％同源性(以及从100到70的每一个整数)的蛋白质
结合。本发明还包括包含单克隆抗体的诊断试剂盒，所述单克隆抗体与具有SEQ ID NOs：
2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、
56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列的蛋白质结合，或与和SEQID NOs：2、4、6、8、10、
12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、
62、64和66中包含的序列具有至少95％、90％、85％、80％、75％和70％同源性(以及从100
到70的每一个整数)的蛋白质结合。这些诊断试剂盒可以检测动物中猪痢疾短螺旋体的存
在。动物优选是任何哺乳动物和鸟类；更优选地，鸡、鹅、鸭、火鸡、鹦鹉、犬、猫、仓鼠、沙鼠、兔、雪貂、马、牛、绵羊、猪、猴和人。

[0017] 本发明还考虑通过给动物施用DNA疫苗来预防或治疗动物中的猪痢疾短螺旋体感染的方法，所述DNA疫苗包含SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、
29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65中列出的一种或多种核苷酸序列，或与这些序列具有至少95％、90％、85％、80％、75％和70％同一性(以及从
100到70的每一个整数)的序列。本发明还涵盖通过给动物施用疫苗来预防或治疗动物
中的猪痢疾短螺旋体感染的方法，所述疫苗包含一种或多种蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID
NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、
52、54、56、58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列，或与这些序列至少95％、90％、85％、
80％、75％和70％同源(以及从100到70的每一个整数)的序列。动物优选是任何哺乳动
物和鸟类；更优选地，鸡、鹅、鸭、火鸡、鹦鹉、犬、猫、仓鼠、沙鼠、兔、雪貂、马、牛、绵羊、猪、猴和人。

[0018] 本发明还考虑通过给动物施用免疫原性组合物在动物中产生免疫应答的方法，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、
35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63和65中列出的一种或多种核苷酸序列，或与这些序列具有至少95％、90％、85％、80％、75％和70％同一性(以及从100到70的
每一个整数)的序列。本发明还涵盖通过给动物施用免疫原性组合物在动物中产生免疫应
答的方法，所述免疫原性组合物包含一种或多种蛋白质，所述蛋白质具有SEQ ID NOs：2、4、
6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、
58、60、62、64和66中包含的氨基酸序列，或与这些序列至少95％、90％、85％、80％、75％和
70％同源(以及从100到70的每一个整数)的序列。动物优选是任何哺乳动物和鸟类；更
优选地，鸡、鹅、鸭、火鸡、鹦鹉、犬、猫、仓鼠、沙鼠、兔、雪貂、马、牛、绵羊、猪、猴和人。

[0019] 发明详述

[0020] 冠词“a”和“an”在本文中用于指该冠词的一个或超过一个(即，至少一个)的语法对象。例如，“an元件”意指一个元件或一个以上元件。

[0021] 术语“氨基酸”意欲涵盖包括氨基官能团和酸官能团并且能够包括在天然氨基酸的聚合物中的所有分子，不论其是天然还是合成的。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；
其类似物、衍生物和同类物(congener)；具有变异侧链的氨基酸类似物；以及任何前述氨
基酸的所有立体异构体。

[0022] 动物可以是任何哺乳动物或鸟类。哺乳动物的例子包括犬、猫、仓鼠、沙鼠、兔、雪貂、马、牛、绵羊、猪、猴和人。鸟类的例子包括鸡、鹅、鸭、火鸡、鹦鹉。

[0023] 术语“保守残基”指这样的氨基酸，其为具有某些共性的一组氨基酸中的成员。术语“保守氨基酸置换”指将来自一个这种氨基酸组的氨基酸用来自相同组的不
同氨基酸置换(概念上地或其他方式)。定义单个氨基酸之间的共性的一种函数方法
是：在同源生物体的相应蛋白质之间分析氨基酸变化的标化后频率(Schulz，G.E.和
R.H.Schinner.，Principles of ProteinStructure，Springer-Verlag)。根据此种分析，
可以定义氨基酸组，其中组内的氨基酸优先彼此交换，并因此在其对总体蛋白质结构的影
响方面彼此最类似(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer，Principles of Protein Structure，
Springer-Verlag)。以这种方式定义的氨基酸组的例子包括：(i)带正电荷的组，包含Lys、
Arg和His，(ii)带负电荷的组，包含Glu和Asp，(iii)芳香族组，包含Phe、Tyr和Trp，
(iv)氮环组，包含His和Trp，(v)大脂肪族非极性组，包含Val、Leu和De、(vi)轻微极性
组，包含Met和Cys，(vii)小残基组，包含Ser、Thr、Asp、Asn、GIy、Ala、Glu、Gln和Pro，(viii)脂肪族组，包含Val、Leu、De、Met和Cys，和(ix)小的羟基组，包含Ser和Thr。

[0024] “融合蛋白”或“融合多肽”，如本领域已知的，指嵌合蛋白质，其可以使用本领域已知的方法进行构建。在融合蛋白的许多例子中，存在2种不同多肽序列，而在某些情况下，可能存在更多不同的序列。编码融合蛋白的多核苷酸序列可以在框内可操作地连接，从而
使得融合蛋白可以正确翻译。融合蛋白可以包括来自相同物种或来自不同物种的多肽序
列。在多个实施方案中，融合多肽可以包含与第一多肽连接的一个或多个氨基酸序列。在
超过一个氨基酸序列与第一多肽连接的情况下，融合序列可以是同一序列的多个拷贝，或
备选地，可以是多个不同氨基酸序列。融合多肽可以与第一多肽的N末端、C末端或N和
C末端融合。示例性融合蛋白包括包含谷胱甘肽S-转移酶标签(GST-标签)、组氨酸标签
(His-标签)、免疫球蛋白结构域或免疫球蛋白结合结构域的多肽。

[0025] 术语“分离的多肽”指这样的多肽，所述多肽在某些实施方案中由重组DNA或RNA制备、或具有合成起源或天然起源、或其某种组合，该多肽(1)不与在自然界中通常和其一
起存在的蛋白质相联系，(2)与正常存在该多肽的细胞分离，(3)不含来自相同细胞来源的
其他蛋白质，(4)由来自不同物种的细胞表达，或(5)在自然界中不存在。分离的多肽可以
以纯化多肽的形式存在，但不限定为纯化的多肽。

[0026] 术语“分离的核酸”和“分离的多核苷酸”指这样的多核苷酸，其可以是基因组DNA、cDNA、mRNA、tRNA、rRNA、iRNA，或得自细胞器(例如，线粒体和叶绿体)的多核苷酸，或合成起源的多核苷酸，该多核苷酸(1)不与天然存在该“分离核酸”的细胞相联系，或(2)与在自然界中和之不连接的多核苷酸可操作地连接。分离的多核苷酸可以以纯化的多核苷酸的
形式存在，但不限定为纯化的多核苷酸。

[0027] 术语“核酸”和“多核苷酸”指核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式)的聚合形式。该术语还应理解为包括由核苷酸类似物制备的RNA或
DNA类似物作为等价物，以及，根据对所描述的实施方案的适用性，单链(例如有义或反义)
和双链多核苷酸。

[0028] 术语“本发明的核酸”和“本发明的多核苷酸”指编码本发明的多肽的核酸。本发明的多核苷酸可以包括主题核酸序列的全部或部分；与主题核酸序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％(以及60至100之间的每一个整数)同一性的
核苷酸序列；在严格条件下与主题核酸序列杂交的核苷酸序列；编码与本发明的多肽功能
上等价的多肽的核苷酸序列；编码与主题氨基酸序列具有至少约60％、70％、80％、85％、
90％、95％、98％、99％(以及60至100之间的每一个整数)同源性或同一性的多肽的核
苷酸序列；编码具有本发明多肽的活性且与主题氨基酸序列具有至少约60％、70％、80％、
85％、90％、95％、98％、99％或更高(以及60至100之间的每一个整数)同源性或同一性
的多肽的核苷酸序列；与主题核酸序列相差1至约2、3、5、7、10、15、20、30、50、75个或更多个核苷酸置换、添加或缺失的核苷酸序列，例如等位基因变体；衍生自主题核酸序列且与主
题核酸序列进化上相关的核酸；及所有前述的和其他的本发明核酸的互补序列和由于遗传
密码简并性导致的核苷酸序列。本发明的核酸也包括主题核酸序列的同源物，例如直系同
源物和旁系同源物、以及已针对在特定生物体(例如宿主细胞)中的表达进行过密码子优
化的主题核酸序列的变体。

[0029] 当描述2个核酸区域之间的关系时，术语“可操作地连接”指并置，在该并置中这些区域处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。例如，与编码序列“可操作地连接的”
控制序列以这样的方式连接，该方式使得编码序列的表达可以在与该控制序列相容的条件
下达到，例如当合适分子(例如，诱导物和聚合酶)与该控制或调节序列(一个或多个)结
合时。

[0030] 在本文中可互换使用的术语“多肽”以及术语“蛋白质”和“肽”指氨基酸的聚合物。示例性多肽包括基因产物、天然存在的蛋白质、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段、以及前述多肽的其他等价物、变体和类似物。

[0031] 当引述参考多肽进行使用时，术语“多肽片段”或“片段”指与参考多肽本身比较，存在氨基酸残基缺失、但其余氨基酸序列通常与参考多肽中的相应位置相同的多肽。此种缺失可以在参考多肽的氨基末端或羧基末端处发生或备选地在两处发生。片段一般是至少
5、6、8或10个氨基酸长，至少14个氨基酸长，至少20、30、40或50个氨基酸长，至少75个
氨基酸长，或至少100、150、200、300、500个或更多个氨基酸长。片段可以保留参考多肽的一种或多种生物活性。在某些实施方案中，片段可以包括具有所需生物活性的结构域，和任
选地位于结构域一侧或两侧的另外氨基酸，所述另外氨基酸的数目可以从5、10、15、20、30、
40、50或直至100个或更多个残基。此外，片段可以包括特定区域的亚片段，所述亚片段保
留其来源区域的功能。在另一个实施方案中，片段可以具有免疫原性性质。

[0032] 术语“本发明的多肽”指包含主题氨基酸序列或其等价物或片段的多肽。本发明的多肽包括包含主题氨基酸序列的全部或部分的多肽；具有1至约2、3、5、7、10、15、20、30、
50、75个或更多个保守氨基酸置换的主题氨基酸序列；与主题氨基酸序列至少60％、70％、
80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％(以及60至100之间的每一个整数)同源的氨基
酸序列；及它们的功能片段。本发明的多肽还包括主题氨基酸序列的同源物，例如直系同源
物和旁系同源物。

[0033] 可以修饰本发明多肽的结构，以例如增强治疗或预防功效、或稳定性(例如，离体保存期限、体内对蛋白水解降解的抗性等)。当设计为保留天然形式蛋白质的至少一种活性
时，此种修饰多肽被视为在本文中更详细地描述的多肽的“功能等价物”。此种修饰多肽可
以例如通过氨基酸置换、缺失或添加产生，所述置换可以整体或部分地由保守氨基酸置换
组成。

[0034] 例如，可以合理地预期到，分离的保守氨基酸置换，例如用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸，将对所得到的分子的生物活性不具
有主要影响。通过评估变体多肽产生类似于野生型蛋白质的应答的能力，可以容易地确定
多肽氨基酸序列中的改变是否导致了功能同源物。以相同方式可以容易地测试其中已发生
超过一个替换的多肽。

[0035] 术语“纯化的”指目标物为存在的主要物(即，以摩尔为基础，它比组合物中的任何其他单个物都更丰富)。“纯化的级分”是其中目标物占存在的所有物的至少约50％(在
摩尔基础上)的组合物。在确定溶液或分散体中一个物的纯度时，溶解或分散该物的溶剂
或基质通常不包括在此确定中；相反，仅考虑被溶解或分散的各种物(包括目的物)。一般
地，纯化的组合物将具有一种物占组合物中存在的所有物的约80％以上，或组合物中存在
的所有物的约85％、90％、95％、99％以上或更多。目标物可以被纯化至基本同质(通过常
规检测方法不能在组合物中检测出污染物)，其中该组合物基本上是单一物。本领域技术人
员可以根据本文教导使用蛋白质纯化的标准技术纯化本发明的多肽。多肽纯度可以通过本
领域技术人员已知的许多方法进行测定，包括例如氨基末端氨基酸序列分析、凝胶电泳、质
谱分析和本文描述的方法。

[0036] 术语“重组蛋白质”或“重组多肽”指通过重组DNA技术产生的多肽。此种技术的一个例子包括将编码表达蛋白质的DNA插入合适表达载体，然后用所述表达载体转化宿主
细胞以产生由该DNA编码的蛋白质或多肽。

[0037] 术语“调节序列”是一个上位概念，在整个说明书中用于指诸如起始信号、增强子、调节子和启动子等多核苷酸序列，其是影响与之可操作地连接的编码和非编码序列表达所需的或所期望的。示例性调节序列在Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in
Enzymology，AcademicPress，San Diego，CA(1990)中描述，并且包括例如SV40的早期和晚
期启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、其表
达由T7RNA聚合酶指导的T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区、fd外壳蛋白质
的控制区、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶(例如，Pho5)的启动
子、酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多角体启动子和已知控制原核或真核细
胞或其病毒的基因表达的其他序列、及其各种组合。此类控制序列的性质和使用可以依据
宿主生物体而不同。在原核生物中，调节序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止
序列。术语“调节序列”意欲最低限度包括其存在可影响表达的组分，并且还可以包括其存
在具有有利之处的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。在某些实施方案中，多核苷
酸序列的转录处于启动子序列(或其他调节序列)的控制下，该启动子序列(或其他调节
序列)控制该多核苷酸在意欲实现表达的细胞类型中表达。还应当理解，多核苷酸可以处
于调节序列的控制下，所述调节序列与控制天然存在形式的该多核苷酸表达的那些序列可
以相同或不同。

[0038] 术语“序列同源性”指在2个核酸序列之间的碱基匹配比例或在2个氨基酸序列之间的氨基酸匹配比例。当序列同源性表示为百分比例如50％时，该百分比指期望序列与
某些其他序列比较，在序列长度上的匹配比例。允许空位(在2个序列的任一个中)以使
匹配达到最大；通常使用15个碱基或更少的空位长度，更常使用6个碱基或更少的空位长
度，甚至更常使用的是2个碱基或更少的空位长度。术语“序列同一”意指在比较窗口上序
列相同(即，对于核酸，在一个核苷酸接一个核苷酸的基础上，或对于多肽，在一个氨基酸
接一个氨基酸的基础上)。术语“序列同一性百分比”通过下述进行计算：在比较窗上比较
2个最佳比对的序列，确定两个序列出现相同氨基酸或核苷酸的位置的数目，以产生匹配位
置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数目，并且将结果乘以100，产生序列
同一性百分比。计算序列同一性的方法是本领域技术人员已知的，并且在下文更详细地描
述。

[0039] 在本文中，就本发明的多肽或其他蛋白质所使用的术语“可溶的”，意指在细胞培养物中表达后，表达的多肽或蛋白质的至少某些部分保留在细胞的细胞质级分中，并且在
裂解和裂解物离心后不与细胞碎片一起分级分离。多肽的溶解性可以通过本领域多种公知
方法增加，所述方法包括与异源氨基酸序列融合、氨基酸残基缺失、氨基酸置换(例如，使
序列富含具有亲水侧链的氨基酸残基)、和化学修饰(例如，添加亲水基团)。

[0040] 多肽溶解性可以使用本领域公知的多种技术进行测量，包括动态光散射以测定聚集状态、UV吸收、离心以使聚集物与非聚集物分离、和SDS凝胶电泳(例如，将蛋白质在可溶
级分中的量与蛋白质在可溶和不可溶级分中的量的组合相比较)。当在宿主细胞中表达时，
本发明的多肽可以是至少约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、
90％或更高可溶的，例如，细胞中表达的蛋白质的总量的至少约1％、2％、5％、10％、20％、
30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多存在于细胞质级分中。在某些实施方案中，表达本发明多肽的细胞的一升培养物将产生至少约0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50毫克或更多的可溶蛋白质。在一个示例性实施方案中，本发明的多肽是至少约10％可溶的，
并且从一升细胞培养物中将产生至少约1毫克蛋白质。

[0041] 术语“特异性杂交”指可检测的特异性核酸结合。本发明的多核苷酸、寡核苷酸和核酸在如下杂交和洗涤条件下与核酸链选择性杂交，所述杂交和洗涤条件使与非特异性核
酸的可检测结合的可感知量降到最低。严格条件可以用于达到如本领域已知和本文讨论的
选择性杂交条件。一般地，本发明的多核苷酸、寡核苷酸和核酸与目的核酸序列之间的核酸
序列同一性将是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多(以及30和100之间的每一个整数)。在某些情况下，杂交和洗涤条件根据常规杂交操
作和如本文进一步描述的在严格条件下执行。

[0042] 术语“严格条件”或“严格杂交条件”指促进2条互补多核苷酸链之间的特异性杂交以便形成双链体的条件。严格条件可以选择为比规定的离子强度和pH下给定多核苷酸
双链体的热熔点(Tm)低约5℃。互补多核苷酸链的长度及其GC含量将决定双链体的Tm，
并由此决定获得期望杂交特异性所需的杂交条件。Tm是50％的多核苷酸序列与完全匹配
的互补链发生杂交时的温度(在规定的离子强度和pH下)。在某些情况下，可能希望增加
杂交条件的严格性，以约等于特定双链体的Tm。

[0043] 用于估计Tm的多种技术是可得的。一般地，双链体中的G-C碱基对据估计对Tm贡献约3℃，而A-T碱基对据估计贡献约2℃，直至约80-100℃的理论最大限度。

[0044] 然而，可获得更复杂的Tm模型，其中考虑G-C堆叠相互作用、溶剂效应、所需的试验温度等。例如，使用如下公式，探针可以设计为具有约60℃的离解温度(Td)：Td＝
(((3x#GC)+(2x#AT))x37)-562)/#bp)-5；其中#GC、#AT和#bp分别是双链体形成中涉及到
的鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对数目、腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对数目、和总碱基对数目。

[0045] 杂交可以在5x SSC、4x SSC、3x SSC、2x SSC、1x SSC或0.2x SSC中执行至少约1小时、2小时、5小时、12小时或24小时。可以增加杂交温度以调整反应严格性，例如从约
25℃(室温)到约45℃、50℃、55℃、60℃或65℃。杂交反应还可以包括影响严格性的其它
试剂，例如在50％甲酰胺的存在下进行的杂交增加在规定温度的杂交的严格性。

[0046] 杂交反应后可以为单个洗涤步骤，或2个或更多个洗涤步骤，其可以在相同或不同盐度和温度进行。例如，可以增加洗涤温度，以调整严格性从约25℃(室温)至约45℃、
50℃、55℃、60℃、65℃或更高。洗涤步骤可以在洗涤剂例如0.1或0.2％SDS的存在下进
行。例如，杂交后可以为在2x SSC、0.1％SDS中65℃的2个洗涤步骤，每个步骤约20分钟，
以及任选地在0.2x SSC、0.1％SDS中65℃的2个额外的洗涤步骤，各步骤约20分钟。

[0047] 示例性严格杂交条件包括在包含50％甲酰胺、10x Denhardt(0.2％Ficoll、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％牛血清白蛋白)和200μg/ml变性载体DNA例如剪切鲑精DNA的溶
液中65℃过夜杂交，随后为各在2x SSC、0.1％SDS中65℃约20分钟的2个洗涤步骤，和各
在0.2x SSC、0.1％SDS中65℃约20分钟的2个洗涤步骤。

[0048] 杂交可以为2种核酸在溶液中的杂交，或在溶液中的核酸与附着在固体载体例如滤膜上的核酸的杂交。当一种核酸在固体载体上时，可以在杂交前进行预杂交步骤。预杂
交可以在与杂交溶液相同的溶液和相同的温度(无互补多核苷酸链)进行至少约1小时、3
小时或10小时。

[0049] 合适的严格条件是本领域技术人员已知的，并且可以由技术人员实验确定。参见例如，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，N.Y.(1989)，
6.3.1-12.3.6；Sambrook 等 人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，
Cold Spring Harbor Press，N.Y.；S.Agrawal(编辑)Methods in Molecular Biology，
第 20 卷；Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular
Biology-Hybridization WithNucleic Acid Probes，例如部分I第2章″Overview of
principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″，
Elsevier，NewYork；和Tibanyenda，N.等人，Eur.J.Biochem.139：19(1984)和Ebel，S.等
人，Biochem.31：12083(1992)。

[0050] 术语“载体”指能够转运已与之连接的另一核酸的核酸。可以依照本发明使用的一种载体类型是附加体，即能够在染色体外复制的核酸。其他载体包括能够自主复制和表达
与之连接的核酸的载体。能够指导与之可操作地连接的基因表达的载体在本文中称为“表
达载体”。一般而言，在重组DNA技术中具有功用的表达载体通常为“质粒”形式，所述质粒形式指环状双链DNA分子，该分子以其载体形式不与染色体结合。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意欲包括可以发挥等价功能的和将来为本领域已知的其他形式的表达载体。

[0051] 本发明的核酸可以用作诊断试剂，以检测能够与之特异性结合的靶DNA或RNA序列的存在或不存在，例如用于测定本发明核酸的表达水平。在一个方面，本发明考虑用于检
测样品中本发明核酸或其部分的存在的方法，该方法具有下述步骤：(a)提供长度至少8个
核苷酸的寡核苷酸，该寡核苷酸与本发明核酸的一部分互补；(b)在允许寡核苷酸与本发
明的核酸或其部分杂交的条件下，使寡核苷酸与包含至少一种核酸的样品接触；和(c)检
测寡核苷酸与样品中核酸的杂交，从而检测本发明的核酸或其部分在样品中的存在。在另
一个方面，本发明考虑用于检测样品中本发明核酸或其部分的存在的方法，通过(a)提供
一对单链寡核苷酸，其各自长至少8个核苷酸，与本发明核酸的序列互补，并且其中这些寡
核苷酸的互补序列间隔至少10个核苷酸；和(b)使寡核苷酸与包含至少一种核酸的样品在
杂交条件下接触；(c)扩增这2个寡核苷酸引物之间的核苷酸序列；和(d)检测扩增序列的
存在，从而检测本发明的核酸或其部分在样品中的存在。

[0052] 在本发明的另一个方面，本发明的多核苷酸在表达载体中提供，所述表达载体包括编码本发明多肽且与至少一种调节序列可操作地连接的核苷酸序列。应当理解，表达载
体的设计可以取决于多种因素，如待转化的宿主细胞的选择和/或希望表达的蛋白质的类
型。应当考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力、以及由该载体编码的任何其他蛋白质例
如抗生素标记的表达。

[0053] 包含本发明多核苷酸的表达载体随后可以用作药剂以治疗由猪痢疾短螺旋体感染的动物，或用作疫苗(也是药剂)以预防动物感染猪痢疾短螺旋体，或在动物确实受感
染时减少该疾病的症状和病程。使用表达载体作为药剂的一种方式是给处于感染危险中
的动物或被感染后的动物施用核酸疫苗。核酸疫苗技术是本领域充分描述的。某些描述
可以在美国专利6,562,376(Hooper等人)；美国专利5,589,466(Feigner，等人)；美国专
利6,673,776(Feigner，等人)；和美国专利6,710,035(Feigner，等人)中发现。核酸疫苗
可以注射到肌肉内或皮内，可以通过电穿孔进入动物(参见WO01/23537，King等人；和WO
01/68889，Malone等人)，经由脂质组合物(参见美国专利5,703,055，Feigner，等人)，或
本领域已知的其他机制。

[0054] 表达载体还可以转染到细菌内，所述细菌可以施用于靶动物，以诱导针对该表达载体所包含的本发明核苷酸编码的蛋白质的免疫应答。表达载体可以包含真核表达
序列，从而使得本发明的核苷酸在宿主动物中转录和翻译。备选地，表达载体可以在细
菌中转录，随后在宿主动物中翻译。用作表达载体的运载体的细菌应是减毒但仍具有侵
袭性的。例如，可以使用已减毒但仍具有侵袭性的志贺氏菌属物种(Shigella spp.)、沙
门氏菌属物种(Salmonella spp.)、埃希氏菌属物种(Escherichia spp.)和气单胞菌
属物种(Aeromonas spp.)。这些方法的例子可以在美国专利5,824,538(Branstrom等
人)；美国专利5,877,159(Powell，等人)；美国专利6,150,170(Powell，等人)；美国专利
6,500,419(Hone，等人)；和美国专利6,682,729(Powell，等人)中发现。

[0055] 备选地，本发明的多核苷酸可以放置在充当载体的某些病毒中。病毒载体可以在病毒表面上表达本发明的蛋白质，或将本发明的多核苷酸携带到动物细胞内，在此处
多核苷酸被转录和翻译成蛋白质。由病毒载体感染的动物可以发展针对本发明多核苷
酸所编码的蛋白质的免疫应答。由此可以在接受病毒载体的动物中减轻或预防猪痢疾
短螺旋体的感染。病毒载体的例子可以在美国专利5,283,191(Morgan等人)；美国专利
5,554,525(Sondermeijer等人)和美国专利5,712,118(Murphy)中发现。

[0056] 本发明的多核苷酸可以用于引起本发明多肽在培养繁殖的细胞中表达和超表达，例如以产生蛋白质或多肽，包括融合蛋白或多肽。

[0057] 本发明涉及转染了重组基因的宿主细胞，以便表达本发明的多肽。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本发明的多肽可以在细菌细胞例如大肠杆菌、昆虫细胞(杆
状病毒)、酵母、植物或哺乳动物细胞中表达。在宿主细胞是人细胞的情况下，它可以在或不在活体中。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。此外，宿主细胞可以补充一般
在宿主中不存在的tRNA分子，以便优化多肽表达。备选地，可以改变核苷酸序列以优化在
宿主细胞中的表达，然而，产生的蛋白质将与原始编码的蛋白质具有高同源性。适合于使多
肽表达最大化的其他方法将是本领域技术人员已知的。

[0058] 本发明进一步涉及生产本发明多肽的方法。例如，可以在合适条件下培养转染了编码本发明多肽的表达载体的宿主细胞，以允许多肽表达。可以从包含多肽的细胞和培养
基的混合物中分泌和分离多肽。备选地，多肽可以保留在细胞质中，收获、裂解细胞并分离
蛋白质。

[0059] 细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其他副产品。用于细胞培养的合适培养基是本领域众所周知的。多肽可以使用本领域已知用于纯化蛋白质的技术从细胞培养基、宿主
细胞或两者中分离，所述技术包括离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、超滤、电泳、以及用对于本发明多肽的特定表位特异的抗体进行的免疫亲和纯化。

[0060] 因此，编码本发明多肽的全部或选择的部分的核苷酸序列可以用于经由微生物或真核细胞工艺生产重组形式的蛋白质。将序列连接到多核苷酸构建体例如表达载体内，和
转化或转染到真核(酵母、禽类、昆虫或哺乳动物)或原核(细菌细胞)宿主内，是标准操
作。可以采用相似操作或其修饰形式，通过微生物方法或组织培养技术制备本发明的重组
多肽。

[0061] 用于表达本发明多肽的合适载体包括下述类型的质粒：用于在原核细胞例如大肠杆菌中表达的pTrcHis-衍生质粒、pET-衍生质粒、pBR322-衍生质粒、pEMBL-衍生质粒、
pEX-衍生质粒、pBTac-衍生质粒和pUC-衍生质粒。在质粒制备和宿主生物体转化中采用
的各种方法是本领域众所周知的。对于原核和真核细胞的其他合适表达系统，以及一般重
组操作方案，可以参见Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，由Sambrook、
Fritsch和Maniatis编辑(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)第16和17章。

[0062] 可以将目的多肽的编码序列掺入作为融合基因的部分，所述融合基因包括编码不同多肽的核苷酸序列。本发明考虑包含本发明的核酸和至少一种异源序列的分离多核苷
酸，所述异源序列编码与本发明核酸的核苷酸序列框内连接的异源肽，由此编码包含异源
多肽的融合蛋白。异源多肽可以与(a)本发明多肽的C末端、(b)本发明多肽的N末端、或
(c)本发明多肽的C末端和N末端融合。在某些情况下，异源多肽编码允许检测、分离、溶解
和/或稳定与之融合的多肽的多肽。在另外其他的实施方案中，异源序列编码多肽例如多
聚His标签、myc、HA、GST、蛋白质A、蛋白质G、钙调蛋白结合肽、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、多聚精氨酸、多聚His-Asp、FLAG、免疫球蛋白的部分和胞转肽。

[0063] 当希望产生本发明多肽的免疫原性片段时，融合表达系统可以是有用的。例如，轮状病毒的VP6衣壳蛋白质可以，以单体形式或以病毒颗粒的形式，用作免疫原性载体蛋白
质用于多肽的部分。可以将待引发抗体的本发明多肽部分的对应核酸序列掺入融合基因构
建体内，所述构建体包括痘苗病毒晚期结构蛋白质的编码序列，以产生表达融合蛋白的一
组重组病毒，其中所述融合蛋白包含本发明蛋白质的部分作为病毒粒子的一部分。乙型肝
炎表面抗原也可以以这种作用使用。类似地，可以制备编码如下融合蛋白的嵌合构建体以
增强免疫原性，所述融合蛋白包含本发明多肽的部分和脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白质(参见
例如，EP Publication NO：0259149；和Evans等人，(1989)Nature 339：385；Huang等人，(1988)J.Virol.62：3855；和Schlienger等人，(1992)J.Virol.66：2)。

[0064] 融合蛋白可以促进蛋白质的表达和/或纯化。例如，本发明的多肽可以作为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白产生。此种GST融合蛋白可以用于简化本发明多肽的纯化，
例如通过使用谷胱甘肽衍生基质(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology，
编辑Ausubel等人，(N.Y.：JohnWiley & Sons，1991))。在另一个实施方案中，在重组蛋白质的期望部分的N端编码纯化前导序列例如多聚-(His)/肠激酶切割位点序列的融合基因，
2+
可以允许通过使用Ni 金属树脂的亲和色谱法纯化表达的融合蛋白。该纯化前导序列随
后可以通过用肠激酶处理而去除，以提供纯化的蛋白质(例如，参见Hochuli等人，(1987)
J.Chromatography 411：177；和Janknecht等人，PNAS USA 88：8972)。

[0065] 用于制备融合基因的技术是众所周知的。基本上，可以依照常规技术连接编码不同多肽序列的各种DNA片段，采用平末端连接或粘性末端用于连接、限制性酶消化以提供
合适末端，适当时补平粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不希望有的连接，和酶促连接。在
另一个实施方案中，融合基因可以通过常规技术包括自动化DNA合成仪合成。备选地，可以
使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物产生在2个连续基因片段之间的互
补突出端，随后可以退火所述片段以产生嵌合基因序列(参见例如Current Protocols in
Molecular Biology，编辑Ausubel等人，JohnWiley & Sons：1992)。

[0066] 在其他实施方案中，本发明提供了固定在固体表面上的本发明核酸，所述固体表面包括平板、微量滴定板、载玻片、珠、颗粒、球、膜、线、沉淀物、凝胶、片、管、容器、毛细管、垫、切片等。本发明的核酸可以固定在芯片上作为阵列的一部分。阵列可以包含如本文描
述的本发明的一种或多种多核苷酸。在一个实施方案中，芯片包含本发明的一种或多种多
核苷酸作为与该多核苷酸来自相同致病物种的多核苷酸序列的阵列的一部分。

[0067] 在本发明的一个优选实施方案中，提供如本文描述的分离的猪痢疾短螺旋体多肽，以及编码这些多肽的多核苷酸序列。更优选地，以基本上纯化的形式提供猪痢疾短螺旋
体多肽。

[0068] 优选的本发明多肽将具有天然全长多肽的一种或多种生物学性质(例如，体内、体外或免疫学性质)。非功能多肽也包括在本发明的范围内，因为它们例如可以用作功能多
肽的拮抗剂。相对于野生型的类似物、片段或衍生物的生物学性质可以例如借助于生物学
测定法测定。

[0069] 可以合成制备多肽，包括类似物、片段和衍生物(例如，使用众所周知的固相或溶液相肽合成技术)。优选地，采用固相合成技术。备选地，本发明的多肽可以使用众所周知的基因工程技术进行制备，如下文描述的。在另外一个实施方案中，多肽可以从生物学液体中
纯化(例如，通过免疫亲和纯化)，所述生物学液体例如但不限于来自动物的血浆、粪便、血
清或尿液，所述动物包括但不限于猪、鸡、鹅、鸭、火鸡、鹦鹉、人、猴、犬、猫、马、仓鼠、沙鼠、兔、雪貂、马、牛和绵羊。动物可以是任何哺乳动物或鸟类。

[0070] 猪痢疾短螺旋体多肽类似物包括具有本发明氨基酸序列的那些多肽，其中一个或多个氨基酸由另外的氨基酸置换，所述置换基本上不改变分子的生物活性。

[0071] 根据本发明，重组或通过化学合成产生的本发明多肽，以及其片段或其他衍生物或类似物，包括融合蛋白，可以用作免疫原以产生识别多肽的抗体。

[0072] 分子具有“抗原性”，当它能够与免疫系统的抗原识别分子例如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体特异性地相互作用时。抗原性氨基酸序列包含至少约5个、且优选
至少约10个氨基酸。分子的抗原性部分可以是就抗体或T细胞受体的识别而言为免疫显
性的部分，或它可以是用于产生针对该分子的抗体的部分(通过将该抗原性部分与载体分
子缀合用于免疫)。具有抗原性的分子无需自身是免疫原性的，即无需载体能够引发免疫应
答。

[0073] “抗体”是结合特定表位的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语包含多克隆、单克隆和嵌合抗体(所提及的后者在美国专利号4,816,397和4,816,567中更详细地
描述)，以及抗体的抗原结合部分，包括Fab、F(ab′)2和F(v)(包括单链抗体)。因此，如
本文所使用的，短语“抗体分子”以其各语法形式考虑完整免疫球蛋白分子和包含抗体结合
部位的免疫球蛋白分子的免疫学活性部分。“抗体结合部位”是由特异性结合抗原的重和轻
链可变和高变区组成的抗体分子的结构部分。

[0074] 示例性抗体分子是完整免疫球蛋白分子，基本上完整的免疫球蛋白分子和包含抗原互补位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本领域已知的那些部分，如Fab、Fab′、
F(ab′)2和F(v)，所述部分对于在本文描述的治疗方法中的使用是优选的。

[0075] 抗体分子的Fab和F(ab′)2部分可以通过众所周知的方法，分别通过木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对基本上完整的抗体分子进行蛋白酶解反应而制备。参见例如，Theofilopolous
等人的美国专利号4,342,566。Fab′抗体分子部分也是众所周知的，可以由F(ab′)2部
分产生，在用巯基乙醇还原连接该2个重链部分的二硫键后，用试剂例如碘乙酰胺烷基化
所得到的蛋白质硫醇。包含完整抗体分子的抗体是本文优选的。

[0076] 短语“单克隆抗体”的各种语法形式指仅具有一种能够与特定抗原免疫反应的抗体结合部位的抗体。单克隆抗体因此一般显示出对与之免疫反应的任何抗原的单一结合亲
和性。因此，单克隆抗体可以包含具有多个抗体结合部位的抗体分子，每个抗体结合部位对
不同抗原具免疫特异性；例如双特异性(嵌合)单克隆抗体。

[0077] 术语“佐剂”指增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。佐剂可以充当组织储库以缓慢释放抗原，也可以充当淋巴系统激活物以非特异性地增强免疫应答[Hood等人，在
Immunology中，第384页，第二版，Benjamin/Cummings，Menlo Park，California(1984)]。
通常，在不存在佐剂的情况下，用抗原单独进行初次攻击将无法引发体液或细胞免疫应
答。佐剂包括但不限于，完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶例如氢氧化铝、
表面活性物质例如溶血卵磷脂、多聚醇类(pluronicpolyols)、多聚阴离子、肽、油或烃类
乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基酚和潜在有用的人佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌
(Corynebacteriumparvum)。优选地，佐剂是药学上可接受的。

[0078] 本领域已知的多种操作可以用于产生本发明多肽的多克隆抗体。对于抗体产生，可以通过用本发明多肽注射，免疫多种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。在一个实施方案中，本发明的多肽可以与免疫原性载体例如牛血清白蛋白(BSA)或钥
孔血蓝蛋白(KLH)缀合。依赖于宿主物种，可以使用多种佐剂增强免疫应答，包括但不限于
弗氏(完全和不完全)、矿物凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、多聚醇类、
多聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白、二硝基酚和潜在有用的人佐剂例如BCG(卡介苗)
和短小棒状杆菌。

[0079] 对于制备针对本发明多肽的单克隆抗体，可以使用通过培养的连续细胞系产生抗体分子的任何技术。这些包括但不限于最初由Kohler等人，(1975)Nature，256：495-497
开发的杂交瘤技术、三源杂交瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术[Kozbor等人，(1983)
Immunology Today，4：72]、和EBV-杂交瘤技术以产生人单克隆抗体[Cole等人，(1985)
in MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，第77-96页，Alan R.Liss，Inc.]。永生
的抗体生产细胞系可以通过除融合外的技术产生，例如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞、
或用EB病毒转染。参见例如，美国专利号4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；
4,451,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632；和4,493,890。

[0080] 在本发明的一个另外实施方案中，单克隆抗体可以使用最近技术在无菌动物中产生。根据本发明，可以使用鸡或猪抗体，其可以通过使用鸡或猪杂交瘤或通过用EBV病毒
在体外转化B细胞来获得。事实上，根据本发明，可以使用开发用于产生“嵌合抗体”的技
术[Morrison等人，(1984)J.Bacteriol.，159-870；Neuberger等人，(1984)Nature，312：
604-608；Takeda等人，(1985)Nature，314：452-454]，其中将来自对本发明多肽具有特异
性的小鼠抗体分子的基因与来自具有合适生物活性的抗体分子的基因剪接在一起；此种抗
体在本发明的范围内。此种嵌合抗体优选用于治疗肠道疾病或病症(下文描述)，因为该抗
体自身比异种抗体有少得多的诱导免疫应答的可能性，特别是变应性反应。

[0081] 根据本发明，可以适应性调整描述用于产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)，来产生对于本发明多肽特异的单链抗体。本发明的一个另外实施方案利用构
建Fab表达文库的技术[Huse等人，(1989)Science，246：1275-1281]，以允许快速且容易地
鉴定对于本发明多肽具有所需特异性的单克隆Fab片段。

[0082] 包含抗体分子的独特型的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，此种片段包括但不限于：可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab′)2片段；可以通过还原
F(ab′)2片段的二硫桥产生的Fab′片段，和可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分
子产生的Fab片段。

[0083] 在抗体生产中，就所需抗体的筛选可以通过本领域已知的技术完成，例如放射性免疫测定法、ELISA、“夹心”免疫测定法、免疫放射计量测定法、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定法、原位免疫测定法(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、沉淀
反应、凝集测定法(例如，凝胶凝集测定法、血凝集测定法)、补体固定测定法、免疫荧光测
定法、蛋白质A测定法、免疫电泳测定法等。在一个实施方案中，抗体结合通过检测在一抗
上的标记来进行检测。在另一个实施方案中，一抗通过检测二抗或试剂与一抗的结合来进
行检测。在一个进一步的实施方案中，二抗是标记的。用于免疫测定法中检测结合的许多
方法是本领域已知的，并且在本发明的范围内。例如，为了选择识别本发明多肽的特定表位
的抗体，可以分析产生的杂交瘤，检测与包含此种表位的本发明多肽的片段结合的产物。

[0084] 本发明还涵盖使用本发明的多肽和/或与本发明多肽结合的抗体检测猪痢疾短螺旋体的存在的诊断和预后方法，和用于猪痢疾短螺旋体感染的诊断和预后的试剂盒。

[0085] 诊断和预后方法一般使用得自动物例如鸡或猪的生物学样品进行。“样品”指怀疑包含短螺旋体属物种例如猪痢疾短螺旋体或其多核苷酸或其多肽的动物组织或液体。此种
组织或液体的例子包括但不限于血浆、血清、粪便材料、尿液、肺、心脏、骨骼肌、胃、肠和体外细胞培养物成分。

[0086] 本发明提供了用于检测样品中本发明多肽的存在的方法，具有下述步骤：(a)使怀疑包含本发明多肽的样品与能够特异性结合本发明多肽的抗体(优选与固体载体结
合)，在允许包含抗体和本发明多肽的反应复合物形成的条件下接触；和(b)检测包含抗体
和样品中的本发明多肽的反应复合物的形成，其中检测到反应复合物的形成将指示本发明
多肽在样品中的存在。

[0087] 优选地，在这种方法中使用的抗体可以来自亲和纯化的多克隆抗体，且更优选单克隆抗体。此外，优选本文使用的抗体分子为Fab、Fab′、F(ab′)2或F(v)部分或完整抗
体分子的形式。

[0088] 基于上述方法用于检测猪痢疾短螺旋体的特别优选方法包括酶联免疫吸附测定法、放射免疫测定法、免疫放射计量测定法和免疫酶学测定法，包括使用单克隆和/或多克
隆抗体的夹心测定法。

[0089] 特别有用的3种此类操作程序利用由可检测标记进行标记的本发明多肽(或其片段)、由可检测标记进行标记的Ab1抗体、或由可检测标记进行标记的Ab2抗体。程序可以
由下述公式概括，其中星号指示颗粒是标记的，并且“AA”表示本发明的多肽：

[0090] A.AA＊+Ab1＝AA＊Ab1

[0091] B.AA+Ab＊1＝AAAb1＊

[0092] C.AA+Ab1+Ab2＊＝Ab1AAAb2＊

[0093] 这些程序及其应用是本领域技术人员熟悉的并且因此可以在本发明的范围内利用。“竞争性”程序，程序A，在美国专利号3,654,090和3,850,752中描述。程序B代表众
所周知的竞争测定法技术。程序C，“夹心”操作，在美国专利号RE 31,006和4,016,043中
描述。另外其他的程序也是已知的，例如“双抗体”或“DASP”程序，并且可以使用。

[0094] 在每种情况下，本发明的多肽与一种或多种抗体或结合配偶体形成复合物，并且复合物的一个成员由可检测标记进行标记。复合物已形成的事实以及，如果期望的话，其量
可以通过可应用于标记检测的已知方法进行确定。

[0095] 由上文可见的，Ab2的特性是它将与Ab1反应。这个反应是因为在一种哺乳动物物种中产生的Ab1被用作抗原在另一个物种中产生抗体Ab2。例如，Ab2可以在山羊中使用兔
抗体作为抗原产生。Ab2因此将是在山羊中产生的抗兔抗体。为了本说明书和权利要求的
目的，Ab1将称为一抗，Ab2将称为二抗或抗Ab1抗体。

[0096] 最通常用于这些研究的标记是放射性元素、酶、当暴露于紫外线时发荧光的化学品及其他。能够用作标记的荧光材料的例子包括荧光素、罗丹明和金胺。一个特定的检测
材料是在山羊中制备的且通过异硫氰酸盐与荧光素缀合的抗兔抗体。优选同位素的例子包
3 14 32 35 36 51 57 58 59 90 125 131 186
括 H、C、P、S、Cl、Cr、Co、Co、Fe、Y、I、 I和 Re。放射性标记可以通过目前可
用的任何计数法进行检测。虽然可以使用许多酶，但优选酶的例子是过氧化物酶、β-葡糖
醛酸糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加上过氧化物酶和碱
性磷酸酶。酶可以通过与交接分子反应而与选择的颗粒缀合，所述交接分子例如碳化二亚
胺、二异氰酸盐、戊二醛等。酶标记可以通过目前利用的比色法、分光光度法、荧光分光光度法、安培定量法或气体定量技术中的任何技术进行检测。对于可选标记材料和方法，作为例
子，可以例如提及美国专利号3,654,090；3,850,752；和4,016,043的公开内容。

[0097] 本发明还提供检测生物样品中本发明多肽的抗体的方法，使用下述步骤：(a)提供本发明多肽或其片段；(b)在允许抗体-抗原复合物形成的条件下使生物样品与所述本
发明的多肽温育；和(c)测定是否形成具有本发明多肽的抗体-抗原复合物。

[0098] 在本发明的另一个实施方案中，提供了用于评估生物样品中本发明多肽的抗体的水平的体外方法，使用下述步骤：(a)根据上文所述方法检测生物样品中反应复合物的形
成；和(b)评估形成的反应复合物的量，所述反应复合物的量对应于生物样品中本发明多
肽的水平。

[0099] 此外，提供了用于监控动物宿主中猪痢疾短螺旋体相关疾病的治疗的体外方法，包括在不同时间点自历经此治疗的动物宿主获得一系列生物样品，在这些样品中如上所述
评估针对本发明多肽的抗体的水平。

[0100] 本发明进一步提供了用于检测生物样品中猪痢疾短螺旋体的存在或不存在的方法，包括：(a)在合适杂交条件下使生物样品与本发明的多核苷酸探针或多核苷酸引物接
触；和(b)检测在探针或引物和样品中核酸之间形成的任何双链体。

[0101] 根据本发明的一个实施方案，猪痢疾短螺旋体的检测可以通过下述完成：使用已知技术自生物样品直接扩增多核苷酸序列，并且随后检测具有本发明序列的多核苷酸的存
在。

[0102] 在本发明的一个形式中，通过PCR扩增靶核酸序列，并且随后使用上文提及的任何特异性方法进行检测。可以用于检测多核苷酸序列存在的其他有用的诊断技术包括但不
限于：1)等位基因特异性PCR；2)单链构象分析；3)变性梯度凝胶电泳；4)RNA酶保护测定
法；5)识别核苷酸错配的蛋白质例如大肠杆菌mutS蛋白质的使用；6)等位基因特异性寡
核苷酸；和7)荧光原位杂交。

[0103] 除上述方法外，多核苷酸序列可以使用常规探针技术进行检测。当探针用于检测期望的多核苷酸序列的存在时，需要时，可以处理待分析的生物学样品例如血液或血清以
提取核酸。样品多核苷酸序列可以以各种方法进行制备，以利于靶序列的检测；例如变性、
限制性消化、电泳或斑点印迹。样品多核苷酸序列的被靶向区域通常必须是至少部分单链
的，以便与探针的靶向序列形成杂交体。如果序列是天然单链的，那么不需要变性。然而，
如果序列是双链的，那么序列可能将需要变性。变性可以通过本领域已知的各种技术进行。

[0104] 样品多核苷酸序列和探针在如下条件下温育，所述条件将促进探针中的靶序列与样品中的推定期望多核苷酸序列形成稳定的杂交体。优选地，使用高严格条件以便阻止假
阳性。

[0105] 对所得到的杂交体的检测，如果存在的话，通常通过使用标记的探针来完成。备选地，探针可以是未标记的，但可以通过与直接或间接标记的配体的特异性结合来检测。合适
的标记物以及用于标记探针和配体的方法是本领域已知的，并且包括例如可以通过已知方
法(例如，切口平移、随机引发或激酶化(kinasing))掺入的放射性标记、生物素、荧光基
团、化学发光基团(例如，二氧杂环丁烷类化合物(dioxetanes)，特别是触发的二氧杂环丁
烷类化合物)、酶、抗体等。这个基本方案的变化形式是本领域已知的，包括促进待检测杂交体与外来物分离和/或自标记的部分扩增信号的那些变化形式。

[0106] 在本发明的范围内还考虑，本发明的核酸探针测定法可以采用能够检测期望的本发明多核苷酸序列的核酸探针混合物(cocktail)。因此，在检测细胞样品中本发明多核苷
酸序列的存在的一个例子中，采用与多核苷酸序列互补的一种以上探针，特别地不同探针
的数目可选地是2、3或5种不同核酸探针序列。

[0107] 本文描述的多核苷酸序列(优选探针形式)还可以固定于固相载体用于检测短螺旋体属物种，包括但不限于猪痢疾短螺旋体、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi、B.innocens、B.murdochii和毛肠短螺旋体。备选地，本文描述的多核苷酸序列可以构成
DNA分子文库的一部分，所述DNA分子文库可以用于同时检测来自短螺旋体属物种例如猪
痢疾短螺旋体的许多不同基因。在本发明的一个进一步备选形式中，本文描述的多核苷酸
序列连同其他多核苷酸序列(例如来自其他细菌或病毒)可以以此种方式固定在固体载体
上，该方式允许鉴定短螺旋体属物种例如猪痢疾短螺旋体的存在和/或结合在固体载体上
的任何其他多核苷酸序列。

[0108] 用于产生固定的DNA分子文库的技术已在本领域中得到描述。一般地，大多数现有技术方法描述了单链核酸分子文库的合成，其中使用例如掩蔽技术以在固体基质上的各
个离散位点构建序列的各种排列。美国专利号5,837,832描述了基于非常大规模的整合技
术产生固定在硅基质上的DNA阵列的改良方法。特别地，美国专利号5,837,832描述了称
为“tiling”的策略，以在基质上的空间限定位置处合成特定的探针组，所述策略可以用于
产生本发明的固定DNA文库。美国专利号5,837,832还提供了关于可以使用的较早技术的
参考文献。因此多核苷酸序列探针可以在基质表面上原位合成。

[0109] 备选地，单链分子可以在固体基质外合成，然后将每个预先形成的序列施加到固体基质上的离散位置。例如，多核苷酸序列可以使用配备有针或pizo电子装置的机器人装
置直接印刷在基质上。

[0110] 文库序列一般被固定在固体基质的离散区域上或中。基质可以是多孔的以允许固定在基质内，或基本上无孔的，在这种情况下文库序列一般固定在基质表面上。固体基质可
以由多肽能与之直接或间接结合的任何材料制成。合适固体基质的例子包括平玻璃、硅片、
云母、陶瓷和有机聚合物例如塑料，包括聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯。还可以使用半透性膜
例如广泛可得的硝酸纤维素或尼龙膜。可以将半透性膜装在更坚实的固体表面例如玻璃
上。表面可以任选用金属层包被，所述金属例如金、铂或其他过渡金属。

[0111] 优选地，固体基质一般是具有刚性或半刚性表面的材料。在优选实施方案中，基质的至少一个表面将是基本上平坦的，但在某些实施方案中，可能希望物理地将用于不同聚
合物的合成区与例如凸起区域或蚀刻沟槽分开。还优选固体基质适于在一般50至100μm
-2
的离散区域中施加高密度DNA序列，给出10000至40000个点/cm 的密度。

[0112] 固体基质可以方便地分区。这可以通过技术例如光蚀刻，或通过应用疏水墨例如基于特氟龙的墨(Cel-line，USA)来达到。

[0113] 文库的各不同成员所定位的不连续位置可以具有任何方便的形状，例如环状、矩形、椭圆形、楔形等。

[0114] 多核苷酸序列与基质的附着可以是共价或非共价方式。多核苷酸序列可以经由分子层与基质附着，文库序列与所述分子层结合。例如，多核苷酸序列可以用生物素进行标
记，并且基质用抗生物素蛋白和/或链霉亲和素进行包被。使用生物素化的多核苷酸序列
的一个方便特征是可以容易地测定与固体基质的偶联效率。因为多核苷酸序列可以仅与某
些固体载体有弱结合，所以通常必须在固体基质(例如，在玻璃的情况下)和核酸序列之间
提供化学界面。合适化学界面的例子包括六甘醇。另一个例子是使用聚赖氨酸包被的玻璃，
随后使用标准操作化学修饰该聚赖氨酸以引入亲和配体。通过使用偶联剂使分子与固体基
质表面附着的其他方法是本领域已知的，参见例如，WO98/49557。

[0115] 互补多核苷酸序列与固定的核酸文库的结合可以通过各种方法进行测定，例如结合的多核苷酸序列的光学特性的改变(即，通过使用溴化乙啶)，或通过使用标记的核酸例
如用荧光团标记的多肽。不需要使用标记的其他检测技术包括光学技术例如光声学、反射
计、椭圆光度法和表面等离子体共振(参见WO97/49989)。

[0116] 因此，本发明提供了在其上固定有至少一种本发明多核苷酸，优选2种或更多种不同的本发明多核苷酸序列，的固体基质。

[0117] 本发明还可以用作预防或治疗剂，这可以用于刺激动物例如鸡和猪中的体液和细胞介导的应答，从而提供对抗短螺旋体属物种建群的保护作用，所述短螺旋体属物种包
括但不限于猪痢疾短螺旋体、B.suanatina、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi、
B.innocens、B.murdochii和毛肠短螺旋体。短螺旋体属物种例如猪痢疾短螺旋体的天然
感染将诱导针对本文描述的蛋白质的循环抗体滴度。因此，本文描述的氨基酸序列或其部
分具有构成全身性或口服施用的预防或治疗剂的基础的潜力，以提供对抗肠道螺旋体病的
保护作用。

[0118] 因此，在一个实施方案中，本发明提供了以治疗有效量与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合的本文描述的氨基酸序列或其片段、或结合该氨基酸序列的抗体、或本
发明描述的多核苷酸序列。

[0119] 短语“治疗有效量”在本文中用于指这样的量，其足以使动物宿主在活动、功能和应答上的临床显著缺陷减少至少约15％、优选至少50％、更优选至少90％、并且最优选阻
止所述缺陷。备选地，治疗有效量足以在动物宿主中引起临床显著病状的改善。

[0120] 短语“药学上可接受的”指，分子实体和组合物是生理可耐受的，并且当施用于动物时，一般不引起变应性反应或类似的不利反应，例如胃部不适等。术语“载体”(carrier)指化合物与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此种药学载体可以是无菌液体，
例如水和油，包括石油、动物、蔬菜或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或盐水溶液和葡萄糖及甘油水溶液优选用作载体，特别用于可注射溶液。合适的药
物载体在Martin，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing
Co.，Easton，PA，(1990)中描述。

[0121] 在本发明的一个更具体形式中，提供了药物组合物，其包括治疗有效量的本文描述的氨基酸序列或其类似物、片段或衍生物或针对其的抗体，连同药学上可接受的稀释剂、
防腐剂、溶解剂、乳化剂、佐剂和/或载体。该组合物可以包括具有各种缓冲剂含量(例如，
Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂以及添加剂例如洗涤剂和增溶剂(例
如，Tween 80、Polysorbate 80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(例
如，硫柳汞、苯甲醇)和填充物质(例如，乳糖、甘露糖醇)。材料可以掺入聚合化合物例如
聚乳酸、聚乙醇酸等的颗粒制品或脂质体内。还可以使用透明质酸(Hylauronic acid)。该
组合物可以影响本发明蛋白质和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放率和体内清除率。参
见例如，通过引用合并入本文的Martin，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18
版(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA 18042)第1435-1712页。组合物可以以液体
形式制备，或可以为干燥粉末例如冻干形式。

[0122] 备选地，本发明的多核苷酸可以就在植物(例如，玉米)中的表达进行优化。植物可以用包含该优化的多核苷酸的质粒进行转化。随后，使植物生长，并且在植物中表达本
发明的蛋白质，或表达该植物优化版本。随后收获植物，可以将包含本发明蛋白质的植物
部分加工成动物的饲料。当动物食用时，这种动物饲料将赋予针对猪痢疾短螺旋体的免疫
性。详述这些方法的现有技术的例子可以在美国专利5,914,123(Arntzen，等人)；美国专
利6,034,298(Lam，等人)；和美国专利6,136,320(Arntzen，等人)中发现。

[0123] 应当理解，根据本发明提供的药物组合物可以通过本领域已知的任何方法进行施用。优选地，用于施用的药物组合物通过注射、口服、或通过肺或鼻途径进行施用。本文描
述的氨基酸序列或由其衍生的抗体更优选通过静脉内、动脉内、腹膜内、肌内或皮下施用途
径进行递送。备选地，适当配制的本文描述的氨基酸序列或由其衍生的抗体可以通过鼻或
口服施用进行施用。

[0124] 本发明还包括本发明多核苷酸序列、以及可与编码本发明氨基酸序列的多核苷酸序列杂交的反义和核酶多核苷酸序列的用途，用于制造调节猪痢疾短螺旋体相关疾病的药
物。

[0125] 在治疗方法中使用的编码反义构建体或核酶的多核苷酸序列可能期望以裸露核酸构建体的形式直接施用。可以通过几种已知转染技术，增强细菌细胞对裸露核酸构建体
的摄取，所述转染技术例如包括使用转染试剂。这些试剂的例子包括阳离子试剂(例如磷
酸钙和DEAE-葡聚糖)和lipofectants。一般地，核酸构建体与转染试剂混合以产生组合
物。

[0126] 备选地，反义构建体或核酶可以与药学上可接受的载体或稀释剂组合，以产生药物组合物。合适载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。组合物可以配制
用于肠胃外、肌内、静脉内、皮下、眼内、口或经皮施用。所述施用途径仅旨在作为引导，因为本领域技术人员能够容易地确定用于任何具体动物和病状的最佳施用途径和任何剂量。

[0127] 本发明还包括试剂盒，该试剂盒可以用于筛选怀疑受到短螺旋体属物种例如猪痢疾短螺旋体感染的动物、或证实动物是否被短螺旋体属物种例如猪痢疾短螺旋体感染。
在本发明的一个进一步实施方案中，可以制备适于专家使用的试剂盒，以在疑似感染动
物中确定短螺旋体属物种，包括但不限于猪痢疾短螺旋体、B.suanatina、B.intermedia、
B.alvinipulli、B.aalborgi、B.innocens、B.murdochii和毛肠短螺旋体，的存在或不存在，或定量测量短螺旋体属物种，包括但不限于猪痢疾短螺旋体、B.suanatina、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和毛肠短螺旋体感染。依照上文讨论的测试技术，此种试剂盒
可以包含至少标记形式的本文描述的氨基酸序列之一或其结合配偶体，例如特异性针对其
的抗体，以及依据所选择方法，例如“竞争”、“夹心”、“DASP”等的说明书。备选地，此种试剂盒可以包含至少与本文描述的多核苷酸序列之一的部分互补的多核苷酸序列以及其使用
说明书。试剂盒还可以包含外围试剂例如缓冲剂、稳定剂等。

[0128] 因此，用于证实短螺旋体属物种，包括但不限于猪痢疾短螺旋体、B.suanatina、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi、B.innocens、B.murdochii和毛肠短螺旋体，的存在的试验试剂盒可以包含下述：

[0129] (a)预定量的至少一种标记的免疫化学反应性组分，其通过将本文描述的氨基酸序列之一或针对其的特异性结合配偶体与可检测标记直接或间接附着而获得；

[0130] (b)其他试剂；和

[0131] (c)所述试剂盒的使用说明书。

[0132] 更具体地，诊断试验试剂盒可以包含：

[0133] (a)已知量的如上所述本文氨基酸序列之一(或结合配偶体)，其一般与固相结合以形成免疫吸附剂，或备选地，与合适标签结合，或存在多种此类终产物，等；

[0134] (b)必要时，其他试剂；和

[0135] (c)所述试验试剂盒的使用说明书。

[0136] 在一个进一步的变化形式中，试验试剂盒可以包含：

[0137] (a)通过使本文描述的氨基酸序列之一与可检测标记偶联而获得的标记的组分；

[0138] (b)一种或多种另外的免疫化学试剂，其中至少一种试剂是配体或固定化的配体，所述配体选自：

[0139] (i)能够与标记的组分(a)结合的配体；

[0140] (ii)能够与标记的组分(a)的结合配偶体结合的配体；

[0141] (iii)能够与待测定的至少一种组分结合的配体；或

[0142] (iv)能够与待测定的至少一种组分的至少一种结合配偶体结合的配体；和

[0143] (c)说明书，用于说明如何检测和/或测定本文描述的氨基酸序列之一与其特异性结合配偶体之间的免疫化学反应中的一种或多种组分。

[0144] 基因组文库的制备

[0145] 使用猪痢疾短螺旋体的澳大利亚猪野外分离株(菌株WA1)制备基因组文库。这种菌株已得到充分表征，并且在实验性攻击猪后显示是有毒力的。十六烷基三甲基溴化铵
(CTAB)方法用于制备适于基因组DNA文库制备的高质量染色体DNA。猪痢疾短螺旋体在
9
100ml厌氧胰胨豆胨肉汤培养液中生长至10 细胞/ml的细胞密度。在4,000xg进行10分
钟收获细胞，将细胞沉淀重悬浮于9.5ml TE缓冲液中。加入SDS至0.5％(w/v)的终浓度，
并且细胞在37℃用100μg蛋白酶K裂解1小时。加入NaCl至0.7M的终浓度，加入1.5ml
CTAB/NaCl溶液(10％w/v CTAB，0.7MNaCl)后，溶液在65℃温育20分钟。用等体积氯仿/
异戊醇提取裂解物，管在6,000xg离心10分钟以相分离。将水相转移至新鲜管，并且加入
0.6体积的异丙醇以沉淀高分子量DNA。使用有钩的玻璃棒收集沉淀的DNA，并且转移至包
含1ml 70％(v/v)乙醇的管。管在10,000xg离心，将沉淀的DNA重溶解于4ml TE缓冲液
中过夜。使用重溶解的DNA溶液制备包含1.05g/ml CsCl和0.5mg/ml溴化乙啶的氯化铯
梯度。将梯度转移至4ml可密封离心管，并且在70,000xg在15℃离心过夜。在紫外线下观
察分离的DNA，使用15-g针从梯度中取出高分子量DNA。通过用CsCl饱和的异丙醇顺次提
取，从DNA中去除溴化乙啶。纯化的染色体DNA相对于2升TE缓冲液进行透析，并且用异
丙醇进行沉淀。重悬浮的基因组DNA使用GeneMachines Hydroshear(Genomic Solutions，
Ann Arbor，MI)剪切，剪切的DNA使用Klenow DNA聚合酶补平以产生平末端片段。使
用CloneSmart DNA连接酶，将100ng平末端DNA片段与25ng pSMARTVC载体(Lucigen，
Meddleton，WI)连接。随后将连接DNA电穿孔到大肠杆菌电感受态细胞内。将小插入片段
(2-3kb)文库和中等插入片段(3-10kb)文库构建到低拷贝形式的pSMART VC载体内。

[0146] 基因组测序

[0147] 在获得基因组文库后，挑取包含pSMART VC载体的大肠杆菌单克隆。纯化且测序质粒DNA。对纯化的质粒实施pSMART VC载体的自动化直接测序，使用对于pSMART VC载体
特异的正向和反向引物。每个测序反应在10μl体积中执行，所述10μl体积由200ng质
TM
粒DNA、2pmol引物和4μl ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready反
应混合物(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)组成。循环条件涉及在96℃的2分
钟变性步骤，随后为包括在96℃变性10秒和在60℃4分钟合并引物复性和延伸的步骤的
25个循环。通过用包含85mM乙酸钠(pH 5.2)、3mM EDTA(pH 8)的95％(v/v)乙醇沉淀，从
测序产物中去除残留染料终止剂，真空干燥。质粒使用每种引物一式两份地进行测序。测
序产物使用ABI 373A DNA Sequencer(PE Applied Biosystems)进行分析。

[0148] 注释

[0149] 使用一系列公众域生物信息学工具，装配和注释猪痢疾短螺旋体的部分基因组序列，以分析和重分析这些序列，作为有关数据分析的质量保证程序的一部分。使用各种程
序，包括GeneMark、GLIMMER、ORPHEUS、SELFID和GetORF，预测开放读码框(ORFs)。使用
搜索工具，包括BLAST和FASTA，检查推定的ORFs与现有国际数据库的同源性(DNA和蛋白
质)。使用程序，包括PSI-BLAST、FASTA、MOTIFS、FINDP ATTERNS、PHD、SIGNALP和PSORT，分析所有预测的ORFs，以确定其细胞定位。数据库，包括Interpro、Prosite、ProDom、Pfam和Blocks，被用于预测表面相关蛋白质，例如跨膜结构域、前导肽、与已知表面蛋白质的同
源性、脂蛋白标签(signature)、外膜锚定基序和宿主细胞结合结构域。用鉴定的基因和其
他物种进行系统发生分析和其他分子进化分析，以帮助功能划分(assignment)。对部分测
序的基因组的in silico分析产生在目前获得的序列数据中存在的所有预测ORFs的一个
全面列表。就描述性信息，例如预测的分子量、等电点、疏水性和亚细胞定位，调查每个ORF，以便能够与天然基因产物的体外性质相关联。选择如下预测基因作为潜在的疫苗靶，所述
预测基因编码与其他致病细菌中的表面定位组分和/或毒力因子相似的蛋白质。

[0150] 生物信息学结果

[0151] 猪痢疾短螺旋体基因组的鸟枪法测序导致94.6％(预测的3200kb中的3028.6kb)基因组被测序。该猪痢疾短螺旋体序列包括具有10.3kb的平均重叠群大小
的294个重叠群。对于猪痢疾短螺旋体，从该294个重叠群中预测了2,593个开放读码框
(ORFs)。比较预测的ORFs与核酸和蛋白质数据库中存在的基因，表明约70％的ORFs与公
共数据库中包含的基因具有同源性。其余30％的预测ORFs不具有已知同一性。

[0152] 疫苗候选物

[0153] 为了帮助减少将作为疫苗候选物测试的ORFs的数目，选择与公共数据库中存在-15
的外表面蛋白质、分泌型蛋白质和可能的毒力因子具有合理同源性(E值小于e )的ORF
作为潜在的疫苗候选物。在基因组鸟枪法测序中获得的2,593个ORFs中，许多通过了这个
试验，但33种基因的结果在本文中呈现。表1显示选择作为潜在疫苗靶的33种基因及其
与得自SWISS-PROT数据库的其他已知氨基酸序列的相似性。可以注意到，氨基酸同一性百
分比不高过58％，而氨基酸相似性或同源性百分比仍小于71％，由此说明这些ORFs是独特
的。

[0154] 表1

[0155]具有最高同源性的 同一性 相似性
基因 登录号
蛋白质的身份 (氨基酸) (氨基酸)
猪痢疾短螺旋体的可变表面蛋白质 106/223 136/223
NAV-H54 O68157
(VspD) (47％) (60％)
问号钩端螺旋体(Leptospira 58/2133 108/213
NAV-H55 Q72SJ3
interrogans)的鞭毛蛋白质B (27％) (50％)
288/1509 609/1509
NAV-H56 肌球蛋白样主要抗原 P21249
(19％) (40％)
裂解胞壁质转糖基酶(可能外膜结合 97/318 158/318
NAV-H57 Q6F7W9
的) (25％) (41％)
苍白密螺旋体(Treponema pallidum) 57/175 90/175
NAV-H58 P96127
的外膜蛋白质 (32％) (51％)
204/1012 432/1012
NAV-H59 肌球蛋白样主要抗原 P21249
(20％) (42％)
外膜蛋白质和相关的肽聚糖结合脂 46/139 68/139
NAV-H60 COG2885
蛋白 (33％) (48％)
齿垢密螺旋体(Treponema denticola) 336/805 483/805
NAV-H61 Q73NT0
的推定脂蛋白 (41％) (60％)

[0156]猪链球菌(Streptococcus suis)的NlpA 92/269 151/269
NAV-H62 Q303L3
脂蛋白 (34％) (56％)
106/312 167/312
NAV-H63 猪链球菌的NlpA脂蛋白 (33％) (53％) Q303L3
112/337 198/337
NAV-H64 猪链球菌的NlpA脂蛋白 (33％) (58％) Q303L3
紫红链霉菌(Streptomyces 50/127 68/127
NAV-H65 Q849M9
violaceoruber)的推定的分泌蛋白质 (39％) (53％)
42/85 60/85 P69349
NAV-H66 大肠杆菌的毒素(YoeB) (58％) (76％)
80/350 171/350
NAV-H67 外膜蛋白质(TolC) (20％) (39％) Q2Z054
Dehalococcoides属物种的可能溶血 121/415 204/415
NAV-H68 Q3ZYX1
素相关蛋白质 (29％) (49％)
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的外 193/357 256/357
NAV-H69 Q4MWS0
表面蛋白质 (54％) (71％)
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的膜结合 146/417 203/417
NAV-H70 Q2SRL9
脂蛋白 (35％) (48％)
巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina 72/201 112/201
NAV-H71 Q8TJE3
barkeri)的表面层蛋白质 (36％) (49％)
裂解胞壁质转糖基酶(可能外膜结合 51/141 6/141
NAV-H72 P44049
的) (36％) (53％)
42/84 62/84 P69349
NAV-H73 大肠杆菌的毒素(YoeB) (50％) (73％)
210/833 339/833
NAV-H74 外膜蛋白质/保护性抗原 COG4775
(25％) (40％)
猪痢疾短螺旋体的可变表面蛋白质 29％ 43％
NAV-H22 AAK14803.1
(VspH) (133/454) (199/454)
蕈状支原体(Mycoplasma mycoides)的 43％ 60％
NAV-H23 AAF27178.1
膜结合脂蛋白 (114/263) (159/263)
金属还原地杆菌(Geobacter 32％ 53％
NAV-H24 ZP00300921.1
metallireducens)的外膜脂蛋白 (46/142) (76/142)
福赛斯拟杆菌(Bacteroides forsythus) 38％ 55％
NAV-H30 AAC82625.1
的表面抗原(BspA) (83/216) (120/216)
念珠藻属物种(Nostoc sp.)的溶血蛋 35％ 56％
NAV-H32 NP488469.1
白质(HlpA) (49/137) (77/137)
中间普里沃菌(Prevotella intermedia) 54％ 70％
NAV-H33 AAC05836.1
的溶血蛋白质 (64/117) (83/117)

[0157]副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 36％ 63％
NAV-H37 NP800579.1
的毒力介导蛋白质(VirC) (58/159) (101/159)
裂解胞壁质转糖基酶(包含LysM/侵 26％ 41％
NAV-H40 ZP00146104.0
袭素结构域) (120/449) (185/449)
41％ 57％ AAC82625.1
NAV-H41 福赛斯拟杆菌的表面抗原BspA (84/201) (115/201)
多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)的 35％ 56％
NAV-H43 ZP00162711.2
溶血素和相关蛋白质 (150/425) (242/425)
20％ 41％
NAV-H44 问号钩端螺旋体的外膜蛋白质 YP001419.1
(79/393) (163/393)
硫还原地杆菌(Geobacter
NAV-H45 sulfurreducens)的毒力因子(MviN)蛋 32％ 49％ NP952225.1
(153/469) (231/469)
白质

[0158] NAV-H54的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：1和2中。NAV-H55的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：3和4中。NAV-H56的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：
5和6中。NAV-H57的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：7和8中。NAV-H58的DNA和
氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：9和10中。NAV-H59的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID
NOs：11和12中。NAV-H60的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：13和14中。NAV-H61
的DNA和氨基酸序列分别在SEQ IDNOs：15和16中。NAV-H62的DNA和氨基酸序列分别在
SEQ ID NOs：17和18中。NAV-H63的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：19和20中。
NAV-H64的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：21和22中。NAV-H65的DNA和氨基酸序
列分别在SEQ ID NOs：23和24中。NAV-H66的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：25和
26中。NAV-H67的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：27和28中。NAV-H68的DNA和
氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：29和30中。NAV-H69的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID
NOs：31和32中。NAV-H70的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：33和34中。NAV-H71
的DNA和氨基酸序列分别在SEQ IDNOs：35和36中。NAV-H72的DNA和氨基酸序列分别在
SEQ ID NOs：37和38中。NAV-H73的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：39和40中。
NAV-H74的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：41和42中。

[0159] NAV-H22的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：43和44中。NAV-H23的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：45和46中。NAV-H24的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID
NOs：47和48中。NAV-H30的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：49和50中。NAV-H32
的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：51和52中。NAV-H33的DNA和氨基酸序列分别在
SEQ ID NOs：53和54中。NAV-H37的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：55和56中。
NAV-H40的DNA和氨基酸序列分别在SEQ IDNOs：57和58中。NAV-H41的DNA和氨基酸序
列分别在SEQ ID NOs：59和60中。NAV-H43的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：61
和62中。NAV-H44的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：63和64中。NAV-H45的DNA
和氨基酸序列分别在SEQ ID NOs：65和66中。

[0160] 为了进一步减少将作为疫苗候选物测试的ORFs的数目，弃去在insilico分析中被预测定位在螺旋体的细胞质或内膜中的基因产物。因此，进一步分析表1中呈现的33
种基因中的21种。这些包括NAV-H58、NAV-H60、NAV-H62、NAV-H64、NAV-H66、NAV-H67、
NAV-H69、NAV-H71、NAV-H73、NAV-H22、NAV-H23、NAV-H24、NAV-H30、NAV-H32、NAV-H33、NAV-H37、NAV-H40、NAV-H41、NAV-H43、NAV-H44和NAV-H45。

[0161] 使用聚合酶链反应(PCR)分析基因分布

[0162] 设计退火到靶基因编码区的不同区域的一个或两个引物对并且就PCR检测进行优化。使用Oligo Explorer 1.2设计单个引物，选择具有约55-60℃的计算解链温度的引
物组。这些引物组也被选择用于产生超过200bp的PCR产物。选择50℃的中等严格性引
物退火温度用于该分布分析PCR。中等严格性条件将允许在引物结合位点处有潜在的微小
错配序列(因为株系差异导致)，而不影响引物结合。对23种猪痢疾短螺旋体菌株进行该
21种猪痢疾短螺旋体靶基因的分布分析，其中所述菌株包括已证实无毒的2种菌株。PCR
分析使用Taq DNA聚合酶(Biotech International，Thurmont，MD)在25μl总体积中进
行。扩增混合物由1x PCR缓冲液(包含1.5mM MgCl2)、1U Taq DNA聚合酶、0.2mM每种
dNTP(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)、0.5μM引物对、和1μl纯化的染色
体模板DNA组成。循环条件涉及在94℃5分钟的起始模板变性步骤，随后为包括在94℃30
秒变性、在50℃15秒退火和在68℃4分钟引物延伸的35个循环。在1％(w/v)琼脂糖凝
胶中在1x TAE缓冲液(40mM Tris-乙酸盐、1mM EDTA)中对PCR产物实施电泳，用1μg/ml
溴化乙啶溶液染色并且在UV光线下观察。

[0163] 用于(21种基因中的)18种基因的引物在表2中给出。在这18种基因中，其中3种(NAV-H23、NAV-H41和NAV-H71)在试验的83％猪痢疾短螺旋体菌株中存在；其中3种
(NAV-H24、NAV-H30和NAV-H73)在试验的87％菌株中存在，其中7种(NAV-H22、NAV-H32、
NAV-H33、NAV-H37、NAV-H43、NAV-H64和NAV-H69)在试验的91％菌株中存在，并且其中3种
(NAV-H40、NAV-H44和NAV-H45)在试验的100％菌株中存在。剩余3种基因在试验的少于
80％猪痢疾短螺旋体菌株中存在。这些基因的弱分布使得它们作为疫苗亚单位较不有用。
为此，已放弃对这些基因的进一步分析。

[0164] 表2

[0165]基因 引物名称 引物序列(5’-3’)
NAV-H22 H22-F4 AAACGTTTATATTTTATTTTATC(SEQ ID NO：67)
H22-R1308 AAACTTCCAAGTGATACC(SEQ ID NO：68)
NAV-H23 H23-F4 AAATATAAACCTACAAGCAG(SEQ ID NO：69)
H23-R2366 AATATTTCAGTTAATCTAAAATC(SEQ ID NO：70)
NAV-H24 H24-F19 ACTTTAATCTTTGTATTAATTTTG(SEQ ID NO：71)
H24-R729 TTGTTTTAATTTGATAATATCAG(SEQ ID NO：72)

[0166] 表2(续)

[0167]引物
基因 引物序列(5’-3’)
名称
NAV-H30 H30-F4 AAAAAAATTATTTTATTAATATTTATATT(SEQ ID NO：73)
H30-R969 TTCTCTTATAATCTTTACAGTTG(SEQ ID NO：74)
NAV-H32 H32-F4 CATATTTCTGGTGATTCTC(SEQ ID NO：75)
H32-R564 TTTTTTGATAAATAAGTTTTTTATTTG(SEQ ID NO：76)
NAV-H33 H33-F4 TTTAATACTCCTATATTATTAATTATTT(SEQ ID NO：77)
H33-R396 AAGGAGAATCACCAGAAA(SEQ ID NO：78)
NAV-H37 H37-F4 AATGATATTATTAAAGTGATAAA(SEQ ID NO：79)
H37-R825 AAAATCTAATATAACGGATT(SEQ ID NO：80)
NAV-H40 H40-F16 AAATATGCTTCCATTATAGG(SEQ ID NO：81)
H40-R1815 ACTTTTAGGAAGAAGTTTAAC(SEQ ID NO：82)
NAV-H41 H41-F19 TATATTTTCATTATATATTTATTAG(SEQ ID NO：83)
H41-R1067 CTAGGCATAGATTTTCCA(SEQ ID NO：84)
NAV-H43 H43-F46 TTTGCCATGTCGGAAATTGCAG(SEQ ID NO：85)
H43-R1236 TATTCTAGCACCGTCCATATC(SEQ ID NO：86)
NAV-H44 H44-F43 GTATGTTTATATGCTCAGGATAC(SEQ ID NO：87)
H44-R2931 AACAGCAGCACTATCTTGTAA(SEQ ID NO：88)
H44-F80 CAGCAGCAACAAATAATACTACTG(SEQ ID NO：89)
H44-R929 TGAATATAAACACCTTCTCTCAAAG(SEQ ID NO：90)
NAV-H45 H45-F52 AAAATGTCATTGGTAACTACTGTAAG(SEQ ID NO：91)
H45-R1595 CTTGATAATCTGCCTTTAAACATAC(SEQ ID NO：92)
NAV-H62 H62-F69 ATGTGAGGAAAAAACAGAAAG(SEQ ID NO：93)
H62-R866 TCATTACCAGAAAACCATACTC(SEQ ID NO：94)
NAV-H64 H64-F69 AGGAAATAAAGCTCCTGCTGCTTCAGC(SEQ ID NO：95)
H64-R253 GCATAGCAGCAACTTCAGAAGGTCCA(SEQ ID NO：96)
NAV-H66 H66-F114 CTTATTAATTGGTATAGGAAAACC(SEQ ID NO：97)
H66-R200 AATCTATGTTCTTGATTTATTAGCC(SEQ ID NO：98)
NAV-H69 H69-F546 AGAAGCTACTTTTGGACCTTGGCCTGT(SEQ ID NO：99)
H69-R662 ACACAGTCAACACCAAGAGC(SEQ ID NO：100)
NAV-H71 H71-F568 AAACAGCAGACTAGCTGGTG(SEQ ID NO：101)
H71-R773 TGACCATTACTTACACCGGATACCCCA(SEQ ID NO：102)
H71-F37 TTAATGACTATATCGCTTTCATACACTTTC(SEQ ID NO：103)
H71-R1241 TCAATTCTTCCAGACATAAAATCAGTAAG(SEQ ID NO：104)
NAV-H73 H73-F37 TATATAGAGTGGGTATCAGAAG(SEQ ID NO：105)
H73-R254 TCATAATGGTATTTACAAGATG(SEQ ID NO：106)

[0168] pTrcHis质粒提取

[0169] 具有pTrcHis质粒(Invitrogen，Carlsbad，CA)的大肠杆菌JM 109克隆从甘油原种贮存物划线培养到补充有100mg/l氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂平板上，并且
在37℃温育16小时。单菌落用于接种补充有100mg/l氨苄青霉素的10ml LB肉汤，并且使
肉汤培养物在37℃伴随振荡温育12小时。使整个过夜培养物在5,000xg离心10分钟，并
且使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen，Doncaster VIC)提取细胞中包含的质粒。用
250μl细胞重悬浮缓冲液P1将沉淀的细胞重悬，并且随后通过添加250μl细胞裂解缓冲
液P2裂解。裂解的细胞用350μl中和缓冲液N3进行中和，并且通过在20,000xg离心10
分钟使沉淀的细胞碎片形成团块。将上清液转移至旋转柱，并且在10,000xg离心1分钟。
在弃去流出物后，将500μl洗涤缓冲液PE施加于柱，并且如前离心。弃去流出物，并且通
过在20,000xg离心3分钟使柱干燥。用100μl洗脱缓冲液EB从柱中洗脱质粒DNA。使用
Dynaquant DNA荧光计(Hoefer，San Francisco，CA)定量纯化的质粒，并且通过用TE缓冲
液稀释将DNA浓度调整至100μg/ml。纯化的pTrcHis质粒贮存于-20℃。

[0170] 载体制备

[0171] 2μg纯化的pTrcHis质粒在37℃在50μl总体积中消化1-4小时，所述50μl总体积包含在100mM Tris-HCl(pH 7.5)、50mM NaCl、10mMMgCl2、1mM DTT和100μg/ml BSA
中的5U 2种限制性酶。使用的具体限制性酶对依赖于引物序列和ORF序列；目的是使用不
切割ORFs的引物。通过1μl消化反应物在1％(w/v)琼脂糖凝胶中在1X TAE缓冲液中在
90V电泳1小时，验证限制性消化的载体。用1μg/ml溴化乙啶染色电泳的DNA，并且在紫
外(UV)线下观察。

[0172] 使用UltraClean PCR Clean-up Kit(Mo Bio Laboratories，Carlsbad，CA)纯化线性化pTrcHis载体。简言之，使限制性反应物(50μl)与250μl SpinBind缓冲液B1
混合，并且将整个体积加入旋转柱中。在8,000xg离心1分钟，弃去流出物，并且将300μl
SpinClean缓冲液B2加入柱中。柱如前离心，弃去流出物，柱以20,000xg干燥3分钟。用
50μl TE缓冲液从柱中洗脱纯化的载体。使用荧光计定量纯化的线性载体，并且通过用TE
缓冲液稀释将DNA浓度调整至50μg/ml。纯化的限制性消化质粒贮存于-20℃。

[0173] 用于插入片段制备的引物设计

[0174] 使用基因组DNA作为起始点，设计引物对以扩增尽可能多的靶基因编码区。所有引物序列包括末端限制性酶位点，以使得所得到的扩增子能够以粘性末端连接到线性化的
pTrcHis载体内。使用Amplify 1.2(University of Wisconsin，Madison，WI)检查引物，
将理论扩增子序列插入在pTrcHis载体序列中的合适位置内。使用Vector NTI version
6(InforMax)执行嵌合pTrcHis表达盒的推导翻译，以证实基因插入片段在正确读码框中。
表3还提供了基因大小、蛋白质大小、天然蛋白质的预测道尔顿分子量和蛋白质的预测pI。
注意，重组蛋白质的组氨酸-融合物在天然蛋白质的预测分子量上增加约4kDa。

[0175] 表3

[0176]基因 基因大小 蛋白质大小 天然蛋白质的
(bp) (aa) 预测MW(Da) 预测pI
NAV-H40 1815 605 97,733 9.4853
NAV-H41 1068 356 39,870 5.2168
NAV-H44 2940 980 113,722 5.1864
NAV-H62 1014 338 37642 4.3944
NAV-H64 1011 337 36468 4.4953
NAV-H66 264 88 10629 9.3027
NAV-H69 1080 360 41525 5.7123
NAV-H73 258 86 10527 9.5920

[0177] 基因插入片段的扩增

[0178] 使用基因组DNA，使用Taq DNA聚合酶(Biotech International)和Pfu DNA聚合酶(Promega，Madison，WI)在100μl总体积中通过PCR扩增所有靶基因插入片段。扩增
混合物由1x PCR缓冲液(包含1.5mMMgCl2)、1U Taq DNA聚合酶、0.01U Pfu DNA聚合酶、
0.2mM每种dNTP(Amersham Pharmacia Biotech)、0.5μM合适引物对、和1μl纯化染色体
DNA组成。染色体DNA从用于基因组测序的相同猪痢疾短螺旋体菌株制备。循环条件涉及
在94℃5分钟的起始模板变性步骤，随后为在94℃30秒变性、在50℃15秒退火和在68℃4
分钟引物延伸的35个循环。在1％(w/v)琼脂糖凝胶中在1x TAE缓冲液中对PCR产物实
施电泳，用1μg/ml溴化乙啶溶液染色并且在UV线下观察。在验证正确大小PCR产物的存
在后，使用UltraClean PCR Clean-up Kit(Mo Bio Laboratories，Carlsbad，CA)纯化PCR
反应物。使PCR反应物(100μl)与500μl SpinBind缓冲液B1混合，并且将整个体积加
入旋转柱中。在8,000xg离心1分钟，弃去流出物，并且将300μl SpinClean缓冲液B2加
入柱中。柱如前离心，弃去流出物，之后在20,000xg下3分钟干燥柱。用100μl TE缓冲
液从柱中洗脱纯化的载体。

[0179] 基因插入片段的限制性酶消化

[0180] 30μl纯化的PCR产物在50μl总体积中用每种限制性酶各1U进行消化，所述限制性酶与由克隆寡核苷酸引物确定的末端限制性核酸内切酶识别位点相容。限制性反应由
100mM Tris-HCl(pH 7.5)、50mM NaCl、10mM MgCl2、1mM DTT和100μg/ml BSA与1U每种限
制性酶在37℃1-4小时组成。使用UltraClean PCR Clean-up Ki(参见上文)纯化消化
的插入片段DNA。使用荧光计定量纯化的消化插入片段DNA，并且通过用TE缓冲液稀释将
DNA浓度调整至20μg/ml。纯化的限制性插入片段DNA立即用于载体连接。

[0181] 基因插入片段连接到pTrcHis载体内

[0182] 连接反应都在20μl总体积中执行。在包含1U T4 DNA连接酶(Promega)的30mMTris-HCl(pH 7.8)、10mM MgCl2、10mM DTT和1mM ATP中，使100ng线性化pTrcHis与20ng
限制性插入片段在16℃温育16小时。也包括不包含插入片段DNA的相同连接反应作为载
体重新环化的阴性对照。合适限制性酶用于各反应。

[0183] pTrcHis连接物转化到大肠杆菌细胞内

[0184] 感受态大肠杆菌JM 109(Promega)细胞从-80℃解冻，贮存于冰上，并且随后将50μl细胞转移到包含5μl过夜连接反应物(等价于25ngpTrcHis载体)的冰冷1.5ml离
心管内。通过在工作台上轻轻敲击每个管的底部使管混合，在冰上留置30分钟。随后通过
将管放置到42℃水浴内45秒，使细胞热休克，之后将管送回冰上2分钟。转化细胞在1ml
LB肉汤中在37℃伴随轻轻混合下复苏1小时。复苏的细胞在2,500xg 5分钟进行收获，将
细胞重悬浮于50μl新鲜LB肉汤中。使用无菌玻璃棒，将完整50μl重悬浮细胞均匀铺展
到包含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂平板上。使平板在37℃温育16小时。

[0185] 通过PCR在大肠杆菌中检测重组pTrcHis构建体

[0186] 在包含100mg/l氨苄青霉素的新鲜LB琼脂平板上划线每个构建体的12个转化单菌落，并且在37℃温育16小时。将来自每个转化事件的单菌落重悬浮于50μl TE缓冲
液中，并且煮沸1分钟。2μl煮沸细胞用作模板用于PCR。扩增混合物由1x PCR缓冲液
(包含1.5mM MgCl2)、1U TaqDNA聚合酶、0.2mM每种dNTP(Amersham Pharmacia Biotech)、
0.5μMpTrcHis-F引物(5′-CAATTTATCAGAC AATCTGTGTG-3′SEQ ID NO：107)和0.5μM
pTrcHis-R引物(5′-TGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCG-3′SEQ ID NO：108)组成。循环条件
涉及在94℃5分钟的起始模板变性步骤，随后为在94℃30秒变性、在60℃15秒退火和在
72℃1分钟引物延伸的35个循环。在1％(w/v)琼脂糖凝胶中在1x TAE缓冲液中对PCR
产物实施电泳，用1μg/ml溴化乙啶溶液染色并且在UV线下观察。不同插入片段克隆到
pTrcHis表达载体内产生不同大小的重组构建体。

[0187] 重组His标签的蛋白质的试验表达

[0188] 将大肠杆菌JM 109中重组pTrcHis构建体的5至10个分离的菌落接种到5ml管中的包含100mg/l氨苄青霉素和1mM IPTG的3ml LB肉汤内，并且在37℃伴随振荡温育16
小时。通过在5,000xg在4℃离心10分钟收获细胞。弃去上清液，用10μl Ni-NTA变性
裂解缓冲液(100mMNaH2PO4、10mM Tris-HCl，8M尿素，pH 8.0)重悬浮每个沉淀。在管涡旋
1分钟后，通过在10,000xg在4℃离心10分钟，沉淀细胞碎片。将上清液转移到新管并且
贮存于-20℃直至分析。

[0189] 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

[0190] 使用不连续Tris-甘氨酸缓冲液体系，执行蛋白质的SDS-PAGE分析。30μl蛋白质样品与10μl 4x样品处理缓冲液(250mM Tris-HCl(pH 6.0)，8％(w/v)SDS、200mM DTT、
40％(v/v)甘油和0.04％(w/v)溴酚蓝)混合。样品煮沸5分钟后立即将10μl样品装载
到凝胶孔。凝胶包括浓缩胶(125mM Tris-HCl pH 6.8、4％w/v丙烯酰胺、0.15％w/v双丙
烯酰胺和0.1％w/v SDS)和分离胶(375mM Tris-HCl ph 8.8、12％w/v丙烯酰胺、0.31％
w/v双丙烯酰胺和0.1％w/v SDS)。这些凝胶通过添加0.1％(v/v)TEMED和0.05％(w/
v)新鲜制备的硫酸铵溶液进行聚合，并且倒入mini-Protean dual slab cell(Bio-Rad，
Hercules，California)。样品在150V室温(RT)跑胶，直至溴酚蓝染料达到凝胶底部。预
染色的分子量标准与样品平行进行电泳，以便允许分子量估计。在电泳后，凝胶立即使用考
马斯亮蓝G250(Bio-Rad)进行染色，或实施电转移到硝酸纤维素膜上用于蛋白质印迹。

[0191] 蛋白质印迹分析

[0192] 分离的蛋白质从SDS-PAGE凝胶到硝酸纤维素膜的电转移使用Towbin转移缓冲液体系来进行。电泳后，凝胶在转移缓冲液(25mM Tris、192mM甘氨酸、20％v/v甲醇，pH 8.3)中平衡15分钟。使用mini-Proteantransblot仪器(Bio-Rad)在30V在4℃，将凝胶中的蛋
白质过夜电转移至硝酸纤维素膜(Protran，Schleicher and Schuell BioScience，Inc.，
Keene，NH)。包含分离蛋白质的新鲜转移的硝酸纤维素膜用包含5％(w/v)脱脂奶粉的10ml
tris-缓冲盐水(TBS)在室温封闭1小时。膜用包含0.1％(v/v)Tween 20的TBS(TBST)
洗涤，并且随后与10mL小鼠抗his抗体(用TBST稀释5,000倍)在室温温育1小时。在
用TBST洗涤5分钟3次后，使膜与在TBST中稀释5,000倍的10mL山羊抗小鼠IgG(完整
分子)-AP在RT温育1小时。膜使用Alkaline Phosphatase Substrate Kit(Bio-Rad)进
行显色。显色反应通过用蒸馏水洗涤膜而终止。随后干燥和扫描膜用于呈现。

[0193] 通过直接序列分析验证重组pTrcHis构建体的读码框

[0194] 将产生正确大小PCR产物的每个构建体的2个转化体克隆接种到包含100mg/l氨苄青霉素的10ml LB肉汤内，并且在37℃伴随振荡温育12小时。整个过夜培养物在5,000xg
离心10分钟，并且如前所述使用QIAprep Spin Miniprep Kit提取细胞中包含的质粒。纯
化的质粒使用荧光计进行定量。使用pTrcHis-F和pTrcHis-R引物对两个纯化的质粒均实
施pTrcHis表达盒的自动化直接测序。每个测序反应在10μl体积中执行，所述10μl体积
TM
由200ng质粒DNA、2pmol引物和4μl ABI PRISM BigDyeTerminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Mix(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)组成。循环条件涉及在
96℃2分钟的变性步骤，随后为包括在96℃变性10秒、和在60℃4分钟组合地进行引物退
火和延伸步骤的25个循环。通过用包含85mM乙酸钠(pH 5.2)、3mMEDTA(pH 8)的95％(v/
v)乙醇沉淀，从测序产物中去除残留染料终止剂，并且进行真空干燥。质粒使用每种引物一
式两份地进行测序。测序产物使用ABI 373A DNA Sequencer(PE Applied Biosystems)进
行分析。执行pTrcHis的核苷酸测序，以验证每个构建体中的表达盒是否处于正确读码框
中。

[0195] 重组His标签蛋白质的表达和纯化

[0196] 用大肠杆菌JM 109中重组pTrcHis构建体的单菌落接种250ml锥形瓶中的包含100mg/l氨苄青霉素的50ml LB肉汤，37℃伴随振荡温育16小时。用10ml过夜培养物接
种包含补充有100mg/l氨苄青霉素的11LB肉汤的21锥形瓶，37℃温育直至细胞在600nm
的光密度是0.5(约3-4小时)。培养物随后通过加入IPTG至1mM的终浓度进行诱导，将
细胞返回37℃同时振荡。诱导5小时后，将培养物转移至250ml离心瓶，瓶在5,000xg在
4℃离心20分钟。弃去上清液，并且用8ml Ni-NTA变性裂解缓冲液(100mM NaH2PO4、10mM
Tris-HCl、8M尿素，pH 8.0)重悬浮每个沉淀。重悬浮细胞贮存于-20℃过夜。

[0197] 从-20℃贮存物取出细胞悬浮液并且在冰上融解。细胞裂解物随后在冰上超声处理3次共30秒，其中在两次超声处理之间在冰上温育1分钟。通过在20,000xg在4℃离心
10分钟，清除裂解的细胞，上清液转移至包含0.5ml柱床体积Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)
的15ml柱中。反复颠倒混合，使重组带His6标签的蛋白质与树脂在4℃结合1小时。随后
用30mlNi-NTA变性洗涤缓冲液(100mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl、8M尿素，pH 6.3)洗涤树
脂，之后用12ml Ni-NTA变性洗脱缓冲液(100mMNaH2PO4、10mM Tris-HCl、8M尿素，pH 4.5)
洗脱。收集4个3ml洗脱物级分，贮存于4℃。每个洗脱物各30μl用10μl 4x样品处理
缓冲液处理，并且煮沸5分钟。对样品实施SDS-PAGE，并且用考马斯亮蓝G250(Bio-Rad)染
色。染色的凝胶在蒸馏水中平衡1小时，并且在2片纤维素之间在RT过夜干燥。

[0198] 以中等规模进行所选择的重组大肠杆菌克隆的表达，以产生足够的重组蛋白质用于小鼠的疫苗接种(参见下文)。

[0199] 纯化的重组His标签蛋白质的透析和冻干

[0200] 将洗脱的蛋白质合并，并且转移到具有3,500Da分子量截断值(MWCO)的水合透析管(Spectrum Laboratories，Inc.，Los Angeles，CA)内。取200μl等分试样的合并洗
脱物，并且使用商业Protein Assay(Bio-Rad)进行定量。蛋白质针对21蒸馏水在4℃伴
随搅拌进行透析。透析缓冲液以12小时间隔更换8次。透析后的蛋白质从透析管转移到
50ml离心管(40ml最大体积)内，并且将管置于-80℃过夜。将管放置到MAXI冷冻干燥器
(Heto-Holten，Allerod，Denmark)内且冻干至干燥。冻干的蛋白质随后用PBS再水合至
2mg/ml的计算浓度，并且贮存于-20℃。透析和冻干后，成功产生稳定的重组抗原。

[0201] 18种基因中的8种成功地克隆到大肠杆菌表达系统内，并且从这些克隆能够稳定地表达重组蛋白质。

[0202] 使用纯化的重组蛋白质进行血清学分析

[0203] 将20μg纯化的重组蛋白质加到7cm IEF孔内，通过10％(w/v)SDS-PAGE凝胶进行电泳，并且电转移至硝酸纤维素膜。膜用TBS脱脂乳(5％w/v)封闭，并且组装到
Multi-screen仪器(Bio-Rad)内。孔用100μl稀释的猪血清(100倍)在室温温育1小
时。猪血清得自高健康状态的猪(n＝3)、显示临床SD的实验性攻击的猪(n＝5)、自然
感染的血清转化的猪(n＝5)、和从自然感染恢复的猪(n＝4)。随后从仪器中取出膜，用
TBST(0.1％v/v)洗涤3次，与10ml山羊抗猪IgG(完整分子)-AP(5,000倍)在RT温育1
小时。用TBST洗膜3次，之后使用Alkaline PhosphataseSubstrate Kit(Bio-Rad)显色。
当显色已足够后，用自来水洗涤膜，干燥且扫描用于呈现。

[0204] 得自不同健康状态动物的猪血清的反应性显示于下表中。所有蛋白质被100％的该组血清所识别，由此说明这些基因在体内表达，并且在暴露于螺旋体后，它们能够诱导全
身性免疫应答。

[0205] 表4.8个成功表达的猪痢疾短螺旋体疫苗候选物的基因分布和血清学反应性。使用一组23种不同菌株通过PCR分析基因分布。使用来自5个不同疾病分类的19个血清样
品执行血清学分析。

[0206]基因 分布(％) 血清学(％)
NAV-H40 100 100％
NAV-H41 83 100％
NAV-H44 100 100％
NAV-H62 96 100％
NAV-H64 91 100％
NAV-H66 96 100％
NAV-H69 91 100％
NAV-H73 87 100％

[0207] 使用纯化的重组his标签蛋白质接种小鼠

[0208] 对于每一种纯化的重组his标签蛋白质，使用10只小鼠进行全身性和口服免疫，以测定重组蛋白质是否具有免疫原性。重组蛋白质用30％(v/v)油包水佐剂乳化，肌内注
射到10只小鼠(Balb/cJ：5周龄，雄性)的股四头肌内。所有小鼠接受在100μl总体积中
的100μg蛋白质。第一次疫苗接种后3周，所有小鼠接受与第一次疫苗接种相同的第二次
肌内疫苗接种。在第二次疫苗接种后2周处死所有小鼠。自死后的心脏获得血清，并且在
蛋白质印迹分析中检测针对猪痢疾短螺旋体的细胞提取物的抗体。

[0209] 蛋白质印迹分析

[0210] 将20μg纯化的重组蛋白质加到7cm IEF孔内，通过10％(w/v)SDS-PAGE凝胶进行电泳，并且电转移至硝酸纤维素膜。用TBS脱脂乳(5％w/v)封闭膜，组装到
Multi-Screen仪器(Bio-Rad)内。孔用100μl稀释的小鼠血清(100倍)在室温温育
1小时。随后从仪器中取出膜，用TBST(0.1％v/v)洗涤3次，之后与10ml山羊抗小鼠
IgG(完整分子)-AP(5,000倍)在RT温育1小时。用TBST洗涤膜3次，使用Alkaline
PhosphataseSubstrate Kit(Bio-Rad)显色。当显色已足够时，用自来水洗涤膜，干燥且扫
描用于呈现。

[0211] 蛋白质印迹分析显示在疫苗接种后小鼠中针对重组疫苗抗原具有显著增加的抗体反应性。所有小鼠都识别与考马斯蓝染色的纯化重组蛋白质具有相似分子量的重组蛋白
质。这些实验提供了证据证实，当用于给小鼠疫苗接种时这些重组蛋白质是免疫原性的，并
且采用的疫苗接种方案可以诱导针对该抗原的特异性循环抗体滴度。结果表明，这些重组
蛋白质可以用于有效疫苗中用于动物物种抵抗猪痢疾短螺旋体的建群。

[0212] 使用纯化的重组his标签蛋白质接种猪

[0213] 对于每一种纯化的重组his标签蛋白质，用在1ml疫苗体积中的1mg具体抗原肌内注射10只血清阴性的猪。抗原用等体积油包水佐剂乳化。猪在3周龄时和再在6周龄
时进行疫苗接种。具有10只血清阴性猪的第二个组用作阴性对照，并且不接种疫苗。所有
9
猪在8周龄时用100ml活跃猪痢疾短螺旋体培养物(～10 细胞/ml)进行攻击，并且在实
验(直至攻击后6周)过程中和在死亡后检查时就猪痢疾的临床体征观察猪。

[0214] 诊断试剂盒

[0215] 血清得自已知感染猪痢疾短螺旋体的猪舍中的猪、已知尚未被猪痢疾短螺旋体感染的猪、和未知猪痢疾短螺旋体感染的猪舍中的猪。将20μg纯化的重组蛋白质加到7cm
IEF孔内，通过10％(w/v)SDS-PAGE凝胶进行电泳，并且电转移至硝酸纤维素膜。膜用TBS
脱脂乳(5％w/v)封闭，并且装配到Multi-Screen仪器(Bio-Rad)内。孔用100μl稀释
的猪血清(100倍)在室温温育1小时。随后从仪器中取出膜，用TBST(0.1％v/v)洗涤3
次，之后与10ml山羊抗猪IgG(完整分子)-AP(5,000倍)在RT温育1小时。用TBST洗膜
3次，之后使用Alkaline Phosphatase SubstrateKit(Bio-Rad)显色。当显色已足够时，用
自来水洗涤膜，干燥且扫描用于呈现。通过将结果与阳性和阴性对照比较，可以确定猪是否
被猪痢疾短螺旋体感染。

[0216] 尽管本发明已就具体实施方案进行了描述，但对于本领域普通技术人员显而易见是的，可以使用这些方法和组合物的变化形式，并且预期本发明可以用如本文具体描述之
外的其他方式进行实践。因此，本发明包括涵盖在权利要求定义的本发明的精神和范围内
的所有修饰形式。