一株细黄链霉菌在苜蓿病害防治中的应用

摘要

本发明公开了及一株细黄链霉菌在苜蓿病害防治中的应用。该应用具体是细黄链霉菌NMG2-4-8 CGMCC No.3442在生物防治苜蓿病害中的应用。本发明首次从苜蓿根际土壤中分离筛选到的一株细黄链霉菌实验证明，该细黄链霉菌有显著拮抗作用，抗菌谱广。该细黄链霉菌对苜蓿霜霉病等农作物病原菌有很强的抑制作用，如对苜蓿霜霉病、白粉病、褐斑病、匍柄霉叶斑病、根腐病等显示出很好的防病效果，说明该菌株在苜蓿病害的生物防治领域将有广阔的应用前景。

权利要求

1.细黄链霉菌 NMG2-4-8 CGMCC No.3442在生物防治苜蓿病害中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述苜蓿病害是苜蓿霜霉病、苜蓿白粉病、苜蓿褐斑病、苜蓿匍柄霉叶斑病或苜蓿根腐病。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述苜蓿霜霉病是由苜蓿霜霉菌引起的，所述苜蓿白粉病是由苜蓿白粉菌 引起的，所述苜蓿褐斑病是由苜蓿假盘菌 引起的，所述苜蓿匍柄霉叶斑病是由苜蓿匍柄霉 引起的，所述苜蓿根腐病是由苜蓿茄镰孢菌引起的。

4.一种用于生物防治苜蓿病害的菌剂，其活性成分为细黄链霉菌NMG2-4-8 CGMCC No.3442或发酵细黄链霉菌NMG2-4-8 CGMCC No.3442得到的发酵液。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述苜蓿病害是苜蓿霜霉病、苜蓿白粉病、苜蓿褐斑病、苜蓿匍柄霉叶斑病或苜蓿根腐病。

6.根据权利要求4或5所述的菌剂，其特征在于：所述苜蓿霜霉病是由苜蓿霜霉菌引起的，所述苜蓿白粉病是由苜蓿白粉菌 引起的，所述苜蓿褐斑病是由苜蓿假盘菌 引起的，所述苜蓿匍柄霉叶斑病是由苜蓿匍柄霉 引起的，所述苜蓿根腐病是由苜蓿茄镰孢菌引起的。

7.细黄链霉菌 NMG2-4-8 CGMCC No.3442在制备用于生物防治苜蓿病害的菌剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述苜蓿病害是苜蓿霜霉病、苜蓿白粉病、苜蓿褐斑病、苜蓿匍柄霉叶斑病或苜蓿根腐病。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述苜蓿霜霉病是由苜蓿霜霉菌引起的，所述苜蓿白粉病是由苜蓿白粉菌 引起的，所述苜蓿褐斑病是由苜蓿假盘菌 引起的，所述苜蓿匍柄霉叶斑病是由苜蓿匍柄霉 引起的，所述苜蓿根腐病是由苜蓿茄镰孢菌引起的。

说明书

一株细黄链霉菌在苜蓿病害防治中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株细黄链霉菌在苜蓿病害防治中的应用。

背景技术

[0002] 植物病害生物防治强调生态系统的良性循环和环境保护，可以有效地避免化学农药所带来的一系列问题，由于其社会效益、生态效益、长远利益显著而愈来愈引起人们的重视。随着人们对生态平衡和绿色健康概念越来越重视，生物防治措施在农业生产中得到了前所未有的关注。进入21世纪以来，各国政府和民众更加重视生物农药的开发和应用，生物农药在整个农药市场的份额正在逐年上升。放线菌是最早应用到生产中的生防微生物，其重要经济价值是由于它们所产生的抗生素能有效地防治人类和动物的传染性病害，特别是细菌性的病害以及农作物的某些病害，其在植物病害生物防治中发挥了巨大的作用。目前从微生物中发现的大约8000种生物活性物质中，有近70％是放线菌产生的。在环境污染日益严重的今天，生物防治是农业发展的必由之路，利用放线菌的次生代谢产物-抗生素制备的新农药，由于其具有无污染、无残留、可再生、易于产业化、成本低等特点已成为无公害农药的主体和未来农药的发展方向。

[0003] 苜蓿是最重要的豆科牧草，被誉为“牧草之王”，目前我国的苜蓿种植面积居各种牧草之首。近几年来，随着我国草地畜牧业的发展和农业产业结构调整，苜蓿的种植面积进一步扩大，病害问题日益突出。病害使苜蓿产量大辐度减少，牧草营养成分降低，严重影响苜蓿的产量和饲用价值。苜蓿霜霉病、白粉病、褐斑病等是当前苜蓿生产上危害较大的几种病害，导致苜蓿减产严重时甚至绝收。当前国内外从抗病育种、化学防治和农业措施等方面做了大量工作，防病效果不甚理想。并且由于苜蓿作为饲草的特殊性及经济、环境和食品安全等因素，在其生育期使用化学农药有着严格的限制。生物防治在苜蓿病害的可持续发管理中同样具有非常广阔的应用前景，因此开发利用拮抗菌是有效控制苜蓿病害最具发展潜力的防治措施之一。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的是提供细黄链霉菌 NMG2-4-8的用途。

[0005] 本发明所提供的用途为细黄链霉菌 NMG2-4-8CGMCCNo.3442在生物防治苜蓿病害中的应用。

[0006] 上述应用中，所述苜蓿病害是苜蓿霜霉病、苜蓿白粉病、苜蓿褐斑病、苜蓿匍柄霉叶斑病或苜蓿根腐病。

[0007] 上述应用中，所述苜蓿霜霉病是由苜蓿霜霉菌 引起的，所述苜蓿白粉病是由苜蓿白粉菌 引起的，所述苜蓿褐斑病是由苜
蓿假盘菌 引起的，所述苜蓿匍柄霉叶斑病是由苜蓿匍柄霉
引起的，所述苜蓿根腐病是由苜蓿茄镰孢菌 引
起的。

[0008] 本发明的另一个目的是提供一种用于生物防治苜蓿病害的菌剂。

[0009] 本发明所提供的用于生物防治苜蓿病害的菌剂，其活性成分为细黄链霉菌 NMG2-4-8CGMCC No.3442或 发 酵 细 黄 链 霉 菌NMG2-4-8CGMCC No.3442得到的发酵液。

[0010] 上述菌剂中，所述苜蓿病害是苜蓿霜霉病、苜蓿白粉病、苜蓿褐斑病、苜蓿匍柄霉叶斑病或苜蓿根腐病。

[0011] 上述菌剂中，所述苜蓿霜霉病是由苜蓿霜霉菌 引起的，所述苜蓿白粉病是由苜蓿白粉菌 引起的，所述苜蓿褐斑病是由苜
蓿假盘菌 引起的，所述苜蓿匍柄霉叶斑病是由苜蓿匍柄霉
引起的，所述苜蓿根腐病是由苜蓿茄镰孢菌 引
起的。

[0012] 细黄链霉菌 NMG2-4-8CGMCC No.3442在制备用于生物防治苜蓿病害的菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。

[0013] 上述应用中，所述苜蓿病害是苜蓿霜霉病、苜蓿白粉病、苜蓿褐斑病、苜蓿匍柄霉叶斑病或苜蓿根腐病。

[0014] 上述应用中，所述苜蓿霜霉病是由苜蓿霜霉菌 引起的，所述苜蓿白粉病是由苜蓿白粉菌 引起的，所述苜蓿褐斑病是由苜
蓿假盘菌 引起的，所述苜蓿匍柄霉叶斑病是由苜蓿匍柄霉
引起的，所述苜蓿根腐病是由苜蓿茄镰孢菌
引起的。

[0015] 本发明首次从苜蓿健株根际土壤中分离筛选到的一株细黄链霉菌实验证明，该细黄链霉菌 有显著拮抗作用，抗菌谱
广。该细黄链霉菌 对苜蓿霜霉病等农作物病原菌有很强的抑制
作用，如对苜蓿霜霉病、白粉病、褐斑病、匍柄霉叶斑病、根腐病等显示出很好的防病效果，说明该菌株在苜蓿病害的生物防治领域将有广阔的应用前景。

附图说明

[0016] 图1为NMG2-4-8气生菌丝形态(光学显微镜下200×)。

[0017] 图2为菌株NMG2-4-8孢子形态(扫描电镜下5000×)。

[0018] 图3为菌株NMG2-4-8孢子丝形态(扫描电镜下10000×)。

[0019] 图4为依据16S rDNA基因序列构建的菌株NMG2-4-8的系统发育树。

具体实施方式

[0020] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0021] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0022] 实施例1、菌株的分离及鉴定

[0023] 一、分离

[0024] 供试土样：采自内蒙古通辽地区2-3年生苜蓿健株根际土壤。

[0025] 供试菌株：由中国农业科学院草原研究所牧草病害防治组提供；

[0026] 培养基：①种子培养基：每升水含5g蛋白胨，3g酵母膏，2g葡萄糖，1g牛肉膏，PH7.0～7.2；②基础发酵培养基：每升水含25g大豆粉，40g淀粉，0.8g(NH4)2SO4，3g CaCO3，2g NaCl，PH 7.0～7.2。

[0027] 土壤样品稀释液制备：土壤样品采自内蒙古通辽地区2-3年生苜蓿健株根际土壤。采样时，除去地表植物残体，用自制土壤采样器采集1～15cm处的土壤样品，放入灭菌的特制铝制皿内。土样经自然风干，过筛，称重，称取土样10g，放入100mL无菌水中，于120r/min摇床上震荡30min。静置取上清液100μL加入900μL无菌水，系列梯度稀释，制-1 -2 -3 -4 -5 -6
备成不同浓度(10 、10 、10 、10 、10 、10 )的土壤样品稀释液。

[0028] 菌株的分离、纯化：采用稀释平板分离法分离得到放线菌菌株。用移液器吸取不同浓度的稀释液均匀涂布接种于高氏一号培养基(可溶性淀粉20g、琼脂20g、KNO31g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、蒸馏水1000mL、pH 7.2～7.4)平板表面，每浓度3次重复，置于28℃的培养箱中培养5～10d，观察菌落生长情况。
挑取单菌落进行稀释划线分离培养、纯化。经纯化后的放线菌按常规方法在高氏一号培养基上繁殖保存。

[0029] 将分离到的放线菌接种于高氏一号琼脂平板内，28℃下培养5d后待用。将9种细菌和18种植物病原真菌(见表8)接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH 7.2)、PDA琼脂培养基(马铃薯(去皮)200g、蔗糖(或葡萄糖)20g、蒸馏水1000mL、pH自然)平板表面，真菌25℃培养3-5d，细菌28℃培养2d待用。

[0030] 采用平板对峙法对供试放线菌进行菌体抑菌活性的初筛。将培养好的放线菌用灭菌打孔器取直径5mm的的菌碟置于PDA平板中间，3d后将同样大小苜蓿匍柄霉菌菌饼对峙接于放线菌周边，25℃下培养5d，定期观察、记录抑菌结果，并测量抑(溶)菌圈的直径。根据抑(溶)菌圈直径的大小从中筛选出具有最大抑菌活性的强拮抗菌株。

[0031] 结果共得到15株对苜蓿匍柄霉菌 抑菌作用较强的拮抗放线菌菌株，其中一株名称为NMG2-4-8的菌株抑菌效果最好，其抑菌圈直径为35.52mm。

[0032] 二、鉴定

[0033] (一)菌株培养特征

[0034] 形态特征观察：将待鉴定的菌株NMG2-4-8作插片培养，将所观察到的形态结果显微照相。

[0035] 培养特征观察：将待鉴定的菌株，分别接种在高氏一号、察氏、葡萄糖-天冬素、克氏一号、马铃薯浸汁、葡萄糖酵母膏琼脂斜面上及马铃薯块培养基上，置于28℃培养，分别在7、14及28d观察其培养特征和颜色变化。取稳定成熟的颜色特征作为其培养特征，作为鉴定种的依据。观察记载气生菌丝的颜色、基质丝体的颜色和可溶性色素的颜色。结果记入鉴定表。此外，观察菌株的生长状况，如生长好坏，气生菌丝呈现何等外貌-绒状、粉状或絮状等作为参考特征。

[0036] (二)菌种生理生化特性

[0037] 明胶液化能力测定：将菌株接种于柱形明胶培养基表面，22℃下恒温培养，分别在5、10、20、及30d，各观察一次液化程度。观察前应将菌种管冷冻20～30min。如明胶不液化仍是固体状态，若呈现液体即为液化。

[0038] 牛奶凝固与胨化测定：将待测定菌株接种于脱脂牛奶中，28℃恒温培养，分别在第3、6、10、20、及30d各观察1次。

[0039] 淀粉水解测定：将培养基溶化后，冷却至50℃倒成平板，凝固后将菌种点种于平板上，适温培养2-4d，形成菌苔后在平板上滴加路哥氏碘液，以铺满菌落周围为宜，平板呈蓝色，而菌落周围有无透明圈出现说明淀粉是否被水解，透明圈的大小能够说明水解淀粉能力的大小。

[0040] 纤维素水解试验：配制适合放线菌生长而不含碳源的合成基础培养液，分装试管后，以新华一号滤纸作纤维素(碳源)，把它切成宽1cm、长6cm滤纸条，加入试管中，一半浸在液内，一半露在液外，将鉴定菌株接种在液外一段滤纸条上，置28℃恒温培养30d后观察。若该菌能将滤纸条分解成一团松散的纤维，或使之折断，碎裂成质状者为阳性，说明该菌株产生纤维素酶使之水解。反之，滤纸无变化者为阴性。

[0041] 硫化氢产生试验：将待测菌株接种到含柠檬酸铁的有机斜面上，置28℃培养10d左右(视菌苔生长成熟为宜)观察结果。若培养基中出现黑褐色沉淀，表示实验为阳性。反之，不变色者为阴性。

[0042] 碳源利用试验：将待鉴定菌株的孢子悬浮液1～2滴，接种在无碳源培养基上，用无菌涂布棒涂布均匀，然后划线挖沟，以沟为界，把平板培养基分成若干小区，每小区分别加入一种碳源。常用的碳源有9种：阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、果糖、蔗糖、山梨糖、甘露醇和肌醇等。每皿需设无糖对照区。置28℃恒温培养7、14d后，分别观察记载生长利用情况。

[0043] (三)菌种细胞壁化学组分的鉴定

[0044] 纸层层析法细胞壁氨基酸分析根据G+细菌细胞壁肽聚糖分子中第3位氨基酸的种类，将放线菌划分为九个类群如表1。

[0045] 表1放线菌细胞壁的主要类型

[0046]

[0047] 注：LL-DAP：外消旋二氨基酸基庚二酸；meso-DAP：内消旋二氨基庚二酸；DAB：1，4-二羟基丁酸。

[0048] 主要步骤为：

[0049] (1)菌体制备：刮取培养好的菌株放入1.5mL的离心管中；

[0050] (2)菌体水解：在用于全细胞氨基酸分析的菌体中加入6mol/L的HCl 100μL，放入灭菌锅中120℃15min；

[0051] (3)点样：取4μL用于氨基酸分析的水解液于新华1号滤纸上点样，再分别取标准氨基酸样品二氨基庚二酸DAP(含有LL-DAP，Meso-DAP和DD-DAP)、赖氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸各1μL依次在滤纸上间隔点样。

[0052] (4)展层：用于全细胞氨基酸水解液分析的展层系统为甲醇∶水∶HCl(6N)∶吡啶＝16∶5.2∶0.8∶2，展层2次；

[0053] (5)显色：氨基酸分析用0.4％茚三酮丙酮溶液，100-110℃加热2～3min，观察。

[0054] 纸层层析法全细胞壁糖分分析根据放线菌细胞壁的化学组分和全细胞水解液糖型，将放线菌划分为4个糖型见表2。

[0055] 表2放线菌全细胞的主要糖型

[0056]

[0057] 主要步骤为：

[0058] (1)菌体制备：刮取培养好的菌株放入1.5mL的离心管中；

[0059] (2)菌体水解：菌体中加入0.25mol/L的HCl 100μL，放入灭菌锅中120℃15min；

[0060] (3)点样：取4μL用于氨基酸分析的水解液于新华1号滤纸上点样，再分别取标准糖样品：木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、核糖各1μL依次在滤纸上间隔点样。

[0061] (4)展层：用于全细胞氨基酸水解液分析的展层系统为正丁醇∶水∶吡啶∶甲醇＝10∶6∶6∶1，展层2次；

[0062] (5)显色：显色剂∶邻苯二甲酸∶苯胺∶水饱和的正丁醇(3.25∶2∶100)，120℃加热3min。

[0063] (四)菌株16S rDNA基因序列及系统发育学分析

[0064] DNA膜板的制备

[0065] DNA提取：

[0066] 纯化后的拮抗放线菌株NMG2-4-8接种于高氏一号培养皿中，28℃培养至生长中期，备用。

[0067] 提取的主要步骤如下：

[0068] (1)皿内刮取少量菌体，加60μL 2×CATB缓冲液，冰浴研钵中研磨至浆液，移入1.5mL离心管中(每菌做3管)。

[0069] (2)加500μL溶菌酶处理液(溶菌酶2mg/mL，RNase溶液50μg/mL，蔗糖0.3M，Tris-HCl 1M，pH 8.0)置于37℃保温2h。

[0070] (3)加入250μL 20％SDS溶液，震荡混合。

[0071] (4)55℃保温60min。

[0072] (5)加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)充分摇匀，4℃Tris-HCl 1M，pH8.0下离心(8000r/min，5min)。

[0073] (6)取上清液移至另一离心管中，加10％NaAC液，2.5倍体积冰冻乙醇沉淀。

[0074] (7)4℃离心(10,000r/min，5min)，弃上清液。

[0075] (8)重复步骤(5)～(7)1次。

[0076] (9)用70％乙醇洗2～3次，晾干，加TE缓冲液60μL，充分溶解后取3μL检测并-20℃下保存。

[0077] PCR扩增16S rDNA：

[0078] (1)PCR仪：型号：ALD-1244、rev、C.B

[0079] (2) 扩 增 引 物：16S rDNA 通 用 引 物 (50μM) 正 向 Pf 为5 ′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′ (对 应 于 E.coli8～ 27位 碱 基 )，反 向Pr 为
5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′(对应于E.coli1492～1514位碱基)，由中国科学院微生物研究所基因工程中心合成。

[0080] (3)扩增体系：

[0081] 表316S rDNA PCR扩增体系

[0082]

[0083] 注：25μL体系

[0084] PCR扩增参数及程序：

[0085] 按扩增体系(表3)依次加入各组分，瞬时离心混匀，加入Taq酶后瞬时离心混匀。95℃预变性5min，进入循环：94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min。35个循环后，
72℃延伸10min。扩增产物-20℃储存。

[0086] PCR扩增产物的电泳检查：

[0087] 电泳条件为0.8％的琼脂糖凝胶(含EB 0.5μg/mL)，1×TAE电泳缓冲液，80V电压电泳40min，PCR产物上样量为4μL，与2μL上样缓冲液混匀后点样。

[0088] 在254nm紫外下观察结果，以TaKaRa公司DNA Marker[DL2000]为核酸标准分子量参照物，确定扩增片段长度。扩增产物带应在标准物1500bp左右位置上。

[0089] 16S rDNA PCR产物全序列测定：

[0090] PCR产物的纯化与序列测定由上海英骏生物技术有限公司进行。测序时以扩增引物作为正反向引物，由上海英骏生物技术有限公司用计算机引物设计软件，根据所测出的样品的序列搜索设计出中间引物并合成。

[0091] 系统进化树的构建：

[0092] 将所测的16S rDNA序列与GenBank基因库中已测定的原核生物的16S rDNA序列进行比较，调出与其序列同源性较高的菌株的16S rDNA序列。采用CLUSTAL X 1.8软件对所测定的同源序列进行多匹配排列，通过Treeview软件进行系统进化树的构建。

[0093] 结果：

[0094] (一)形态特征

[0095] 菌株NMG2-4-8菌落呈灰色绒粉状，干燥，基丝暗黄，经插片培养在光学显微镜下观察到：NMG2-4-8的气生菌丝较长，多分枝，见图1；孢子卵圆形至柱形，孢子直或弯曲或呈螺旋形螺旋形，见图2、图3，有典型的链霉菌属的特征。

[0096] (二)培养特征

[0097] NMG2-4-8在各种培养基上的特征如表4，可见该菌在不同的培养基上的培养性状明显不同：在高氏一号琼脂上气生菌丝为瓜瓢粉，基丝暗黄，无可溶性色素；克氏一号琼脂上气生菌丝为落英粉，基丝瓜瓢粉；察氏琼脂气生菌丝为灰白，基丝灰白；葡萄糖天门冬素琼脂上气生菌丝为豆汁黄，基丝北瓜黄；葡萄糖酵母膏琼脂上气生菌丝为蛋壳黄，基丝浅芒果棕；马铃薯浸汁琼脂气生菌丝为落英粉，基丝鹿角棕；马铃薯块气生菌丝为落英粉。NMG2-4-8在以上所有供试培养基上均不产生可溶性色素。

[0098] 表4菌株NMG2-4-8的培养特征

[0099]

[0100] (三)生理生化特征

[0101] 菌株NMG2-4-8液化明胶能力差，10d能使牛奶凝固，不能使其胨化，能使淀粉水解，纤维素上不生长(不利用纤维素)，不产生H2S，能利用阿拉伯糖、果糖、蔗糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖、甘露醇和肌醇。

[0102] (四)菌株细胞壁化学组分分析

[0103] 1、纸层层析法细胞壁氨基酸分析结果

[0104] 对菌株NMG2-4-8进行纸层层析法细胞壁氨基酸分析，结果见下表：

[0105] 表5菌株NMG2-4-8全细胞氨基酸分析结果

[0106]

[0107] 2、纸层层析法全细胞壁糖分分析结果

[0108] 对菌株NMG2-4-8进行纸层层析法全细胞壁糖分分析，结果见下表：

[0109] 表6菌株NMG2-4-8全细胞壁糖份分析结果

[0110]

[0111] 综合表5、表6结果可知：菌株NMG2-4-8细胞中含有氨基酸的种类为：LL-DAP、甘氨酸和谷氨酸，对照文中表1可知该菌株细胞壁属于I型，属于链霉菌属；菌株NMG2-4-8细胞中除含有葡萄糖外不含有表2中其它糖的种类，该菌株糖型为C型。

[0112] (五)16S rDNA系统进化分析

[0113] 16S rDNA碱基序列测定结果如序列表中序列1所示，共测定菌株NMG2-4-8的16SrDNA 1422个有效碱基。

[0114] 系统发育树构建：选取11株模式菌株进行系统发育分析，所用链霉菌属菌株的16S rDNA序列登陆号列于表7，构建的系统发育树见图4所示。

[0115] 表7构建系统发育树所用的 16S rDNA GenBank登陆号

[0116]

[0117] 由表7可以看出与供试菌株同源性较高的菌株均为链霉菌属，并且多数都为细黄链霉菌 可得知菌株NMG2-4-8属于链霉菌属 另外该菌株在系统发育树上与细黄链霉菌 EU570571为独立一分支，亲缘关系最近，相似性达
99.9％。

[0118] 由于供试菌株与细黄链霉菌的生理生化特征(在高氏一号琼脂上孢子丝规则螺旋形，气生菌丝粉红微紫，基丝暗黄，无可溶性色素，抑制阳性或阴性细菌以及酵母和丝状真菌，明胶液化快，淀粉水解，纤维素上生长不稳定)比较相似。因此，结合分子生物学鉴定结果，将菌株NMG2-4-8鉴定为细黄链霉菌

[0119] 该菌株已于2009年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.3442。该菌株的分类命名为细黄链霉菌菌株名称为NMG2-4-8。

[0120] 三、培养

[0121] 高氏一号琼脂培养基：琼脂15g，可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，KNO3 lg，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4。

[0122] 种子培养基：蛋白胨5g、酵母膏3g、葡萄糖2g、牛肉膏1g、蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2；

[0123] 发酵培养基：黄豆粉20g、淀粉5g、葡萄糖20g、蛋白胨2g、酵母膏5g、NaCl5g、K2HPO40.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCO32g、蒸馏水1000mL，pH7.5。

[0124] 蛋白胨购自内蒙古鸿之惠商贸有限公司，产品目录号为SH0010；酵母膏购自内蒙古鸿之惠商贸有限公司，产品目录号为SH0348；黄豆粉购自超市。

[0125] 将菌株NMG2-4-8接种于高氏一号斜面上，在28℃培养5-6d；从生长好的放线菌斜面用无菌接种环挑取2～3环接种于100mL种子培养基中，28℃、220r/min摇床振荡培养48h，得到种子培养液；按10％(v/v)的接种量将种子培养液接种于发酵培养基中，装液量为三角瓶容积的1/5，220r/min、28℃振荡培养120h，得到发酵液，此时菌株已在发酵液中产生高浓度的抑菌活性代谢产物；将得到的发酵液5000r/min离心10min，取上清液置于4℃备用，将此上清液记作无菌发酵滤液。

[0126] 实施例2、菌株的抗菌谱测定

[0127] 采用杯碟法对菌株NMG2-4-8进行抗菌谱测定。将灭菌牛津杯放入混好靶标菌的PDA平板中央(平板制备方法：将1mL无菌水加入各靶标菌培养试管中，用接种环将菌落、菌丝体或孢子刮下制成菌悬液与PDA培养基10mL混合后倒入9cm的培养皿中制成平板)，杯中加入200μL无菌发酵滤液，分别置25℃培养4-5d(真菌)、28℃培养2d(细菌)，至靶标菌长满培养皿为止。采用十字交叉法测量抑菌(溶菌)圈的直径。每种靶标菌重复3次，结果取平均值。

[0128] PDA琼脂培养基：马铃薯(去皮)200g、蔗糖(或葡萄糖)20g、蒸馏水1000mL、pH自然。

[0129] 结果如表8，菌株NMG2-4-8对马铃薯环腐棒杆菌、金黄色葡萄球菌等4种革兰氏阳性细菌，胡萝卜软腐欧文氏菌、青枯雷尔氏菌等5种革兰氏阴性细菌及油菜菌核病菌、黄瓜枯萎病菌、苜蓿茄镰孢菌、苜蓿匍柄霉、禾顶囊壳、稻瘟病菌、番茄灰霉菌、假丝酵母番、扩展青霉等18种真菌具有明显的抑制作用。证明菌株NMG2-4-8的抑菌谱广。

[0130] 表8-1菌株NMG2-4-8的抗菌谱测定结果

[0131]

[0132]

[0133] 表8-2各菌株来源

[0134]

[0135] 苜蓿黄单胞杆菌Xa (侯天爵.我国苜蓿病害发生现状及防治对策[J].内蒙古草业，1994，3：4-8.)(由中国农业科学院草原研究所提供)

[0136] 苜蓿壳针孢叶斑病菌 (侯天爵.我国苜蓿病害发生现状及防治对策[J].内蒙古草业，1994，3：4-8.)(由中国农业科学院草原研究所提供)[0137] 苜蓿匍柄霉 (侯天爵.我国苜蓿病害发生现状及防治
对策[J].内蒙古草业，1994，3：4-8.)(由中国农业科学院草原研究所提供)

[0138] 苜蓿尖镰孢菌 (曹丽霞，赵存虎，白全江，等.内蒙古中部地区苜蓿根腐病病原研究(英文)[J].华北农学报，2008，23(6)：105-107.)(由中国农业科学院草原研究所提供)。

[0139] 苜蓿茄镰孢菌 (曹丽霞，赵存虎，白全江，等.内蒙古中部地区苜蓿根腐病病原研究(英文)[J].华北农学报，2008，23(6)：105-107.)(由中国农业科学院草原研究所提供)

[0140] 实施例3、菌株NMG2-4-8的温室生物防治植物病害实验

[0141] (中苜1号)种子购自国家种质牧草中期库，产品目录号为00068。

[0142] 苜蓿霜霉菌 (侯天爵.我国北方草地病害调查及主要病害防治[J].中国草地，1993，3：56-60.)(由中国农业科学院草原研究所提供)[0143] 苜蓿白粉菌 (侯天爵.我国苜蓿病害发生现状及防治对策
[J].内蒙古草业，1994，3：4-8.)(由中国农业科学院草原研究所提供)

[0144] 苜蓿假盘菌 (侯天爵.我国北方草地病害调查及主要病害防治[J].中国草地，1993，3：56-60.)(由中国农业科学院草原研究所提供)[0145] 苜蓿匍柄霉 (侯天爵.我国苜蓿病害发生现状及防治
对策[J].内蒙古草业，1994，3：4-8.)(由中国农业科学院草原研究所提供)

[0146] 苜蓿茄镰孢菌 (徐林波，狄彩霞，王兰英；等.十种药剂对苜蓿茄镰孢菌的室内毒力测定[A].成卓敏.粮食安全与植保科技创新.粮食安全与植保科技创新-中国植物保护学会2009年学术年会论文集[C].北京：中国农业科学技术出版社，
2009，804-807.)(由中国农业科学院草原研究所提供)

[0147] 下述实验中所用的NMG2-4-8发酵液均是按照实施例1中实验三中方法制备得到。

[0148] 一、对苜蓿霜霉病的防治效果

[0149] 采用室内苗期喷雾接种法对NMG2-4-8进行霜霉病防治试验。苜蓿霜霉病是由苜蓿霜霉菌 引发的，采自中国农业科学院草原研究所沙尔沁试验站感病苜蓿植株。

[0150] (一)保护作用

[0151] 培育苜蓿种子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗的4片真叶充分展开时进行喷药处理，正常管理48h，再接病原菌，接菌后黑暗保湿24h，进入常规管理。常规管理7-10d后，调查发病情祝、分级记载、计算病情指数和保护效果。

[0152] (二)治疗作用：

[0153] 培育苜蓿种子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗的4片真叶充分展开时接病原菌，接菌后黑暗保湿24h，以诱导孢子囊产生，然后喷施药剂处理，再保湿24h后，进入常规管理。常规管理7-10d后，调查发病情祝、分级记载、计算病情指数和治疗效果。

[0154] (三)具体操作

[0155] 1、盆栽育苗播种基质为土壤(经高温干热灭菌)、草炭和蛭石的混合物(体积比为1∶1∶1)。供试苜蓿种子经0.1％新洁尔灭溶液消毒3min后，用清水冲洗干净，放入垫有纱布的培养皿中，然后置于25℃的培养箱中发芽，待胚根长到0.5cm时，将其播于装有上述基质的育苗盆内(育苗盆事先经0.1％的甲醛溶液密封熏蒸消毒)。18-20℃温室内育苗，每盆保留4株苜蓿幼苗。

[0156] 2、接种方法取感染蓿霜霉病菌 的苜蓿植株的枝条，在室内先将病叶背面的霉层用毛笔轻轻刷去后，置于18-20℃、相对湿度≥97％条件下黑暗保湿培养24h，待长出新鲜孢子囊后，将其刷入蒸馏水中，制备成孢子囊悬浮液，浓度以在低倍显微镜下检查平均每视野内有20～30个孢子囊为宜。用小型手持喷雾器进行喷雾接种，接种部位为叶片，接种量：将菌液均匀喷施于苜蓿叶片正反两向，以叶面湿润而不滴为度。

[0157] 3、施药方法试验设NMG2-4-8发酵液20、10、5倍稀释液3个处理，以2％农抗-120水剂200倍稀释液为农药对照(均用清水进行稀释)，以清水为空白对照，每处理重复5次。使用手持型喷雾器将药液均匀喷施于苜蓿叶片正反两向，以叶面湿润而不滴为度。

[0158] 4、黑暗处理：用牛皮纸袋罩上盆栽苜蓿苗。

[0159] 5、保湿处理：用塑料封口袋罩上盆栽苜蓿苗。

[0160] 病情分级标准：

[0161] 0级：无病斑；

[0162] 1级：每个叶片中病斑总面积小于叶片总面积的1/3；

[0163] 2级：每个叶片中病斑总面积占叶面积的1/3～2/3；

[0164] 3级：每个叶片中病斑总面积大于叶片总面积的2/3。

[0165]

[0166]

[0167]

[0168]

[0169] 病情指数中，各级代表级值指0、1、2、3；最高代表级值指3。

[0170] 实验结果如表9所示。结果：NMG2-4-83个浓度梯度的发酵液对苜蓿霜霉病的保护效果都很明显。其中5倍稀释液的保护效果为88.69％，优于农抗120的效果86.97％，10倍、20倍稀释液的保护效果分别为77.00％、63.06％；治疗作用效果亦显著，但均低于农抗-120的防效。

[0171] 表9NMG2-4-8发酵液对苜蓿霜霉病的防治效果

[0172]

[0173] 二、对苜蓿白粉病的防治效果

[0174] 采用室内苗期喷雾接种法对NMG2-4-8进行防治苜蓿白粉病试验。苜蓿白粉病是由苜蓿白粉菌 引起的。

[0175] (一)保护作用

[0176] 培育苜蓿种子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗培养3-4周时进行喷药处理，正常管理24h，再接病原菌，接菌后黑暗保湿24h，进入常规管理。常规管理7-10d后，调查发病情祝、分级记载、计算病情指数和保护效果。

[0177] (二)治疗作用：

[0178] 培育苜蓿种子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗培养3-4周时接种病原菌，接菌后黑暗保湿24h，然后喷施药剂处理，再保湿24h后，进入常规管理。常规管理7-10d后，调查发病情祝、分级记载、计算病情指数和治疗效果。

[0179] (三)具体操作

[0180] 1、盆栽育苗：方法与实验一中所述相同。

[0181] 2、接种方法采用传统的抖粉法接种苜蓿白粉病菌(方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998：366-368.)。将已感染苜蓿白粉病菌 并发病的苜蓿叶片上的白粉菌分生孢子轻轻地抖落在被接种的苜蓿幼苗叶片上。

[0182] 3、施药方法试验设NMG2-4-8发酵液20、10、5倍稀释液、2％农抗-120水剂200倍稀释液以及清水对照共5个处理，每处理重复5次。使用手持型喷雾器将药液均匀喷施于苜蓿叶片正反两向，以叶面湿润而不滴为度。

[0183] 4、黑暗处理：用牛皮纸袋罩上盆栽苜蓿苗。

[0184] 5、保湿处理：用塑料封口袋罩上盆栽苜蓿苗。

[0185] 病情分级标准：

[0186] 0级：无病症；

[0187] 1级：每个叶片中病斑总面积占叶面积的1/3以下，白粉模糊不清；

[0188] 2级：每个叶片中病斑总面积占叶面积的1/3～2/3，白粉较为明显；

[0189] 3级：每个叶片中病斑总面积占叶面积的2/3以上，白粉层较厚、连片。

[0190] 病情指数、病指增长率、防治效果的计算公式如实验一所述。

[0191] 实验结果如表10所示。结果：不同浓度的NMG2-4-8发酵液对苜蓿白粉病有较好的保护效果，使用5倍稀释液，保护效果达90.81％，显著优于2％农抗-120水剂200倍液对苜蓿白粉病的保护效果。使用10倍稀释液，保护效果达80.44％，与2％农抗-120水剂200倍液的防效相当。NMG2-4-8发酵液对苜蓿白粉病的治疗作用较好，使用浓度为5倍时，治疗效果为69.69％，优于农抗-120的防效61.36％。

[0192] 表10NMG2-4-8发酵液对苜蓿白粉病的盆栽试验效果

[0193]

[0194] 三、对苜蓿褐斑病的防治效果

[0195] 采用室内苗期喷雾接种法对NMG2-4-8进行防治苜蓿褐斑病试验。苜蓿褐斑病是由苜蓿假盘菌 引起的。

[0196] (一)保护作用

[0197] 培育苜蓿种子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗培养3-4周时进行喷药处理，正常管理24h，再接病原菌，接菌后黑暗保湿24h，进入常规管理。常规管理10-15d后，调查发病情祝、分级记载、计算病情指数和保护效果。

[0198] (二)治疗作用：

[0199] 培育苜蓿种子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗培养3-4周时接种病原菌，接菌后黑暗保湿24h，然后喷施药剂处理，再保湿24h后，进入常规管理。常规管理10-15d后，调查发病情祝、分级记载、计算病情指数和治疗效果。

[0200] (三)具体操作

[0201] 1、盆栽育苗方法与实验一中所述相同。

[0202] 2、接种方法用Tween-20洗去苜蓿假盘菌 子囊孢子，将子囊孢子制成悬浮液，浓度为105～106个子囊孢子/mL。将配制好的孢子悬浮液用喉头喷雾器均匀地喷洒在苜蓿植株上，以叶面湿润而不滴为度。接种后用塑料罩将供试材料密封，保持相对湿度100％，温度20-25℃。保湿48h后撤掉塑料罩，在温室内进行常规管理。

[0203] 3、施药方法试验设NMG2-4-8发酵液20、10、5倍稀释液3个处理，以2％农抗-120水剂200倍稀释液为农药对照(均用清水进行稀释)，以清水为空白对照，每处理重复5次。使用手持型喷雾器将药液均匀喷施于苜蓿叶片正反两向，以叶面湿润而不滴为度。

[0204] 4、黑暗处理：用牛皮纸袋罩上盆栽苜蓿苗。

[0205] 5、保湿处理：用塑料封口袋罩上盆栽苜蓿苗。

[0206] 病情分级标准：根据病斑覆盖叶面积的百分率进行分级：

[0207] 0级：无症状表现；

[0208] 1：每个叶片中病斑总面积为叶面积的5％或以下；

[0209] 2：每个叶片中病斑总面积为叶面积的6％～15％，病斑部位褪绿；

[0210] 3：每个叶片中病斑总面积为叶面积的16％～35％，3/4叶片开始褪绿；

[0211] 4：每个叶片中病斑总面积为叶面积的36％～50％，叶片几乎全部变黄；

[0212] 5：每个叶片中病斑总面积为叶面积的51％～70％，叶片全部褪绿；

[0213] 6：每个叶片中病斑总面积为叶面积的70％以上或全部枯死。

[0214] 病情指数、病指增长率、防治效果的计算公式如实验一所述。

[0215] 实验结果如表11所示。结果：不同浓度的NMG2-4-8发酵液对苜蓿褐斑病有较好的保护效果，使用5倍稀释液，保护效果达80.22％，与2％农抗-120水剂200倍液对苜蓿褐斑病的保护效果81.99％接近。使用10倍稀释液，保护效果为66.47％，使用20倍稀释液，保护效果为43.15％，均低于2％农抗-120水剂200倍液的保护效果。NMG2-4-8发酵液对苜蓿褐斑病的治疗作用不明显，使用浓度为5倍稀释液时，防效仅为58.88％。

[0216] 表11、NMG2-4-8发酵液对苜蓿褐斑病的盆栽试验效果

[0217]

[0218] 注：＊表示效果很差或无效果。

[0219] 四、对苜蓿匍柄霉叶斑病的防治效果

[0220] 采用室内苗期喷雾接种法对NMG2-4-8进行防治苜蓿匍柄霉叶斑病试验。苜蓿匍柄霉叶斑病是由苜蓿匍柄霉 引起的。

[0221] (一)保护作用

[0222] 培育苜蓿种子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗培养3-4周时进行喷药处理，24h后再接病原菌，接菌后黑暗保湿24h，进入常规管理。常规管理10～12d后，调查发病情祝、分级记载、计算病情指数和保护效果。

[0223] (二)治疗作用：

[0224] 培育苜蓿种子得到苜蓿幼苗，待苜蓿幼苗培养3-4周时接种病原菌，接菌后黑暗保湿24h，然后喷施药剂处理，再保湿24h后，进入常规管理。常规管理10～12d后，调查发病情祝、分级记载、计算病情指数和治疗效果。

[0225] (三)具体操作

[0226] 1、盆栽育苗方法与实验一中所述相同。

[0227] 2、接种方法用Tween-20洗去苜蓿匍柄霉 的分生孢子，将分生孢子用于制备悬浮液，浓度为105～106cfu/mL。采用叶片喷雾的方法通过手持型喷雾器进行接种，以叶面湿润而不滴为度。接种后用塑料罩将供试材料密封，保持相对湿度
100％，温度20-23℃、保湿48h后撤掉塑料罩，将植株移入背光处，让叶片自然风干。在温室内进行常规管理。

[0228] 3、施药方法试验设NMG2-4-8发酵液20、10、5倍稀释液3个处理，以2％农抗-120水剂200倍稀释液为农药对照(均用清水进行稀释)，以清水为空白对照，每处理重复5次。使用手持型喷雾器将药液均匀喷施于苜蓿叶片正反两向，以叶面湿润而不滴为度。

[0229] 4、黑暗处理：用牛皮纸袋罩上盆栽苜蓿苗。

[0230] 5、保湿处理：用塑料封口袋罩上盆栽苜蓿苗。

[0231] 病情分级标准：

[0232] 0级：植株健康，无病斑出现。

[0233] 1级：每个叶片1个病斑、病斑总面积占叶面积5％以下。

[0234] 2级：每个叶片1-3个病斑、病斑总面积占叶面积6％-20％且叶片开始褪绿。

[0235] 3级：每个叶片3-10个病斑、病斑总面积占叶面积21％-50％、病斑坏死且叶片发黄。

[0236] 4级：每个叶片10个以上病斑、病斑总面积占叶面积50％以上且叶片发黄脱落。

[0237] 病情指数、病指增长率、防治效果的计算公式如实验一所述。

[0238] 实验结果如表12所示。结果：不同浓度NMG2-4-8发酵液对苜蓿匍柄霉叶斑病兼有良好的保护和治疗作用。使用5倍稀释液，保护效果达80.35％，略低于2％农抗-120水剂200倍液对苜蓿匍柄霉叶斑病的保护效果85.32％。使用10、20倍倍稀释液，保护效果分别为72.00％、59.96％。且NMG2-4-8发酵液的治疗效果较好，明显优于上述3种病害，使用浓度为5倍稀释液时，防效达73.02％。

[0239] 表12NMG2-4-8发酵液对苜蓿匍柄霉叶斑病的盆栽试验效果

[0240]

[0241] 五、对苜蓿根腐病的防治效果

[0242] 采用室内苗期灌根接种法对NMG2-4-8进行防治苜蓿根腐病试验。苜蓿根腐病是由苜蓿茄镰孢菌 引起的。

[0243] (一)保护作用

[0244] 培育苜蓿种子得到苜蓿幼苗，取定植后3周的盆栽苜蓿苗，先灌根接种菌株NMG2-4-8不同浓度发酵液和2％农抗-120水剂200倍稀释液(农药对照)，以接种清水为空白对照；施药3d后，再灌根接种苜蓿茄镰孢根腐病菌。常规管理20d后，调查发病情祝、分级记载，计算病情指数和治疗效果。

[0245] (二)具体操作

[0246] 1、盆栽育苗：方法与实验一中所述相同。

[0247] 2、接种方法采将指示菌株苜蓿茄镰孢菌 用燕麦片培养基于28℃恒温培养箱中培养5-6d，菌丝长满培养基后，光-暗交替培养7d，用无菌水洗下分生孢
6
子，加入0.02％Tween-20，经细菌过滤器无菌过滤除去菌丝，制成浓度为10cfu/mL的孢子悬浮液。灌根接种，每株苜蓿苗接种10mL孢子悬浮液。

[0248] 3、施药方法试验设NMG2-4-8发酵液20、10、5倍稀释液3个处理，以2％农抗-120水剂200倍稀释液为农药对照(均用清水进行稀释)，以清水为空白对照，每处理重复5次。将不同浓度菌株NMG2-4-8的发酵滤液灌于苜蓿幼苗根部，每株10mL。3d后将苜蓿茄镰孢根腐病菌灌根接种，每株苜蓿苗接种10mL孢子悬浮液。

[0249] 病情分级标准：

[0250] 0级-健株，表观无症状；

[0251] 1级-根茎或主根局部有病斑，但不连片；

[0252] 2级-主根、侧根及根茎部有病斑且连片，但不超过1/3；

[0253] 3级-1/3～1/2根及根茎部被侵染变色，且侧根明显减少；

[0254] 4级-根及根茎部变色、局部腐烂、维管束明显变褐、植株生长受抑制且矮小枯黄；

[0255] 5级-根部腐烂、维管束变黑且植株萎蔫死亡。

[0256]

[0257]

[0258] 实验结果(表13)表明，供试拮抗菌NMG2-4-8的发酵液可以显著降低苜蓿根腐病的发病，使用5倍稀释液，相对防效达90.80％，略高于2％农抗-120水剂200倍液的处理防效87.75％。处理后苜蓿植株长势明显优于对照，拮抗菌NMG2-4-8表现出的促生作用在一定程度上对病害的危害有补偿作用。在盆栽试验中，拮抗菌能够有效减轻病情，显示出较为理想的应用潜力。

[0259] 表13、NMG2-4-8发酵液对苜蓿根腐病的盆栽试验效果

[0260]