当归、红芪超滤膜提取物在制备用于抗辐射药物中的应用

摘要

本发明涉及当归、红芪超滤膜提取物用于防辐射危害保护的应用。取当归红芪饮片按重量1∶5～6∶6的比例，分别6倍量水煎煮2h，4倍量水煎煮1h，煎煮二次后，合并煎液静置，过滤，得滤液。滤液再经2～10万分子量超滤，超滤液经喷雾干燥，制成干粉。本发明采用医用直线加速器低能X射线一次性全身照射小鼠制造模型，并于照射前后分别灌胃给予当归、红芪超滤膜提取物水溶液，通过分析外周血白细胞、脾脏与胸腺指数、股骨骨髓细胞DNA含量、骨髓细胞微核数、血液中超氧化物歧化酶(SOD)活性、血清溶血素等指标的变化，表明当归、红芪超滤膜提取物具有对辐射危害的保护功能。

权利要求

1.一种抗辐射当归、红芪超滤膜提取物，其特征是当归与红芪重量比为1∶5～6∶6。

2.如权利要求1所述的一种抗辐射当归、红芪超滤膜提取物的制备方法，其步骤是：取当归、红芪饮片按一定比例加水煎煮二次，第一次加当归和红芪饮片重量6倍量水煎煮2h，第二次加当归和红芪饮片重量4倍量水煎煮1h，合并两次煎液静置过夜，过滤煎液，得滤液，滤液再经超滤膜超滤，超滤压力≤0.4Mpa，温度≤40℃，超滤液经喷雾干燥，制成干粉。

3.如权利要求2所述的一种抗辐射当归、红芪超滤膜提取物的制备方法，其特征是上述的超滤膜为10-2万分子量超滤膜，膜材料为聚醚砚；10万分子量膜孔径为0.05μm，5万分子量膜孔径为0.25μm，2万分子量膜孔径为0.01μm。

4.权利要求1所述的一种抗辐射当归、红芪超滤膜提取物在制备用于防辐射危害保护的药物中的应用。

说明书

当归、红芪超滤膜提取物在制备用于抗辐射药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种当归、红芪超滤膜提取物及其用于抗辐射的应用。 背景技术

[0002] 随着国民经济的发展和人民生活水平的提高，辐射与人们的工作和生活越来越密切，由于临床上对癌症患者进行放疗、化疗的的广泛开展，以及由于核能和核技术在农业生产、医疗卫生、科学研究及国防装备中的大量应用，职业性受照人员的辐射性损害日益得到重视，受辐射的人员越来越多，损害越来越严重。然而目前已知的一些具有辐射防护作用的药物，多数毒性比较大，所以人们从天然的药物入手以期待开发毒性小、适用于临床的防治放射损伤的药物。中国传统中草药及一些有效组分已成为研究的热点，并且取得了较大进展。

[0003] 中药抗辐射方面的研究目前主要在单味补气补血药的层面上，比如人参、黄芪、当归、枸杞等药材均有抗辐射作用的研究报道。国外研究报道，在体、离体实验结果均显示，人参具有抗辐射作用。中药复方制剂的研究主要是基于经典复方或自行组方，比如四物汤，六味地黄丸等。我们用于实验的组方是在传统组方当归补血汤的基础上改良而成，即为当归、红芪(1∶5)超滤膜提取物，经动物实验证明具有抗辐射作用。

发明内容

[0004] 本发明是在研究古方的基础上，发挥中药成分丰富、毒性低等优点，经筛选和系统试验研究，提供一种当归、红芪超滤膜提取物。

[0005] 本发明的另一目的在于提供当归、红芪超滤膜提取物的方法。 [0006] 本发明的再一目的在于当归、红芪超滤膜提取物用于防辐射危害保护的应 用。 [0007] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

[0008] 一种当归、红芪超滤膜提取物，其特征是当归与红芪组份比例为1∶5～6∶6。 [0009] 当归、红芪超滤膜提取物的方法，其步骤是：

[0010] 取当归红芪饮片按一定比例加水煎煮二次，第一次加当归和红芪饮片质量6倍量水煎煮2h，第二次加当归和红芪饮片质量4倍量水煎煮1h，合并两次煎液静置过夜，过滤煎液，得滤液；滤液再经超滤膜超滤，超滤压力≤0.4Mpa，温度≤40℃，超滤液经喷雾干燥，制成干粉。

[0011] 上述的超滤膜为10-2万分子量超滤膜，膜材料为聚醚砜(PES)，10万分子量膜孔径为0.05μm，5万分子量超滤膜孔径为0.25μm，2万分子量超滤膜孔径为0.01μm。 [0012] 当归、红芪超滤膜提取物理化性质：

[0013] 1.本品为淡黄色粉末，易溶于水，不溶于乙醇，甲醇。易吸潮，PH值5-6。本品水溶液在365nm紫外灯下显紫色。

[0014] 2.本品水溶液加入10％的α-萘酚乙醇溶液3滴，摇匀后将试管倾斜，沿试管壁加入浓硫酸出现紫红色环。

[0015] 本发明的优点和产生的有益效果：

[0016] 1、本发明旨在发挥当归具有补血活血，调经止痛，润肠通便功能和红芪补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌功能及两味中药毒性低等优点，并从化学与药理学指标为切入点来研究当归补血汤配伍比例及其效用，组成小复方，其功效主要为补血以及提高机体免疫功能，解决机体接受辐照后机体免疫力下降以及血象偏低的问题。

[0017] 2、将该复方采用超滤膜分离技术进行提取分离，最大程度的保留了多糖等有效组分，祛除了其他无用成分，提高了原药物的生物利用度，最大限度的保留了原方的疗效。 [0018] 3、本发明超滤膜提取物在提取有效部位的基础上，采用现代制剂技术制备成胶囊剂，为使用者服用提供方便，。

[0019] 4、当归、红芪为我省的大宗道地药材，资源丰富，质量优质，本发明动物实验研究表明，当归、红芪超滤膜提取物对辐射具有确切的保护功能，将该药制备成对辐射具有保护功能的保健品，能够促成我省中药材资源优势向经济优势转化。

具体实施方式

[0020] 下面结合实施例，对本发明技术方案再作进一步的说明：

[0021] 实施例1

[0022] 本发明采用的中药材来自甘肃省岷县，当归购自岷县生产基地、红芪均购自岷县药材站。

[0023] 取当归红芪饮片按1∶5的比例加水煎煮二次，第一次加当归红芪饮片质量6倍量水煎煮2h，第二次加当归红芪饮片质量4倍量水煎煮1h，合并两次煎液静置过夜，过滤煎液，得滤液；滤液再经10万分子量(截留分子量为10万)超滤膜——聚醚砜(PES)膜超滤，超滤压力为0.3Mpa，温度为35℃，超滤液经喷雾干燥，制成干粉。 [0024] 实施例2

[0025] 为了表明本发明对防辐射危害保护的效果，本发明对动物进行了外周血白细胞计数实验、骨髓细胞DNA含量测定实验、小鼠骨髓细胞微核实验、血中超氧化物歧化酶(SOD)活性实验、血清溶血素实验。

[0026] 1.实验材料

[0027] 1.1动物

[0028] KM小鼠，SPF级，雄性，体重20±2g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，质量合格证号：SCXK(甘)2004-0006，实验设施使用证号：SYXK(甘)2004-0006。动物分笼饲养，食固体饲料，饲料由北京科澳协力实验动物饲料有限公司提供， 食水自由，室温20～25℃，相对湿度45％～52％。

[0029] 1.2药物及配制

[0030] 当归红芪超滤膜提取物分别为当归红芪(1∶5)超滤膜提取物组、当归红芪(2∶4)超滤膜提取物组、当归红芪(3∶3)超滤膜提取物组，每克生药合提取物干燥粉0.109g(0.109g/g)，由甘肃中医学院科研实验中心提供，当归补血汤成人每日用量36g生药，成人体重按60kg计算，则人的一日用量为0.6g生药/kg(0.0656g药粉/kg)。按照人与动物临床公斤体重剂量倍数直接换算法，取小鼠的等效剂量为人体推荐量的5倍(3g生药/kg，0.328药粉/kg)作为小剂量，10倍(6g/kg，0.656药粉/kg)作为中剂量，20倍(12g/kg，1.312药粉/kg)作为大剂量，灌胃的给药的量为0.2ml/10gbw。

[0031] 1.3主要仪器及试剂

[0032] 全自动血球计数仪(美国雅培，型号：CD1200)；医用直线加速器(北京医疗器械研究所，型号BD-6M)；流式细胞仪(美国Couter，型号EPICS XL)；电子天平(北京Sartorius，型号：BL121SS)；双目光学显微镜(日本，Olympus公司)；图像分析系统(北京伟力新世纪发展有限公司，型号WL-9000)；离心沉淀机(上海医用分析仪器产品)；紫外分光光度计(日本岛京，型号：UV-2401PC)。溶血素(美国雅培CD1200，批号6260312)；稀释液(三和医疗设备有限公司，批号：0612001)；甲醇(天津市德恩化学试剂有限公司，批号：20070712)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：071005)；Giemsa染液(pH6.8PBS配制，由甘肃中医学院基础部生物实验室提供)；SOD试剂盒；Hank’s液(北京鼎国生物技术有限责任公司，批号：87P00138)；戊巴比妥钠(中国医药集团上海化学试剂公司，批号：20030816)；EDTA-K2抗凝剂(天津市科密欧化学试剂开发中心，批号：20080218) [0033] 2.实验方法

[0034] 2.1模型制备

[0035] 采用医用直线加速器(北京医疗器械研究所，型号BD-6M)低能X射线一次 性全身照射小鼠制造模型，皮源距100cm，其中外周血白细胞计数实验、骨髓细胞DNA含量测定实验、小鼠骨髓细胞微核实验，设定辐射剂量为5.0Gy/min；血中超氧化物歧化酶(SOD)活性实验设定辐射剂量为8.0Gy/min；血清溶血素实验设定辐射剂量为3.0Gy/min。 [0036] 2.2动物分组

[0037] 2.21外周血白细胞计数实验随机分为四组，15只/组，分别为模型组、模型组+当归红芪(1∶5)组、模型组+当归红芪(2∶4)组、模型组+当归红芪(3∶3)组(不设空白组，将每组辐射前的指标作为空白对照)。

[0038] 2.22骨髓细胞DNA含量测定实验、小鼠骨髓细胞微核实验、血中超氧化物歧化酶(SOD)活性实验、血清溶血素实验均随机分为五组，15只/组，模型组+当归红芪(1∶5)组、模型组+当归红芪(2∶4)组、模型组+当归红芪(3∶3)组

[0039] 空白组只给生理盐水，模型组只造模不给药，药物组每天灌服相应剂量药物，具体给药时间见具体实验方法。

[0040] 2.3实验结果统计方法

[0041] 计量资料，采用方差分析，方差分析之前按照方差分析的程序先进行方差齐性检验，对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。2
对于计数资料，采用X 检验。

[0042] 2.4实验步骤及结果

[0043] 2.4.1外周白细胞计数(包括体重变化、相关脏器指数及病理学损害) [0044] 除模型组只造模不给药外，其它给药组连续灌胃给药30天，照射后继续口服灌胃至第45天。分别于照射前、照射后第3天、第7天及第14天四次采末梢血20μL，加入稀释液(三和医疗设备有限公司，批号：0612001)至40ul，用全自动血球分析仪(美国雅培，型号：CD1200)检测血常规，最后一天称重后颈椎脱臼处死小白鼠，取脾脏、胸腺进行称重并计算脏器指数，实验结果见 表1和表2。

[0045] 表1对直线加速器低能X射线照射小鼠白细胞的影响(x±SD)

[0046]

[0047] 注：与模型组比较※P＜0.05※※P＜0.01※※※P＜0.001

[0048] 表2对直线加速器低能X射线照射小鼠肝脏、胸腺及脾脏指数的影响(x±SD) [0049]

[0050] 注：与模型组比较※P＜0.05※※P＜0.01※※※P＜0.001

[0051] 从表1可以看出：照射后第3d、第7d、第14d，辐射模型对照组的白细胞计数与照射前比较，差异均有统计学意义(P＜0.001)，说明辐射损伤模型成立。照射后第3d，第7d，第14当归红芪各比例组白细胞计数明显高于辐射模型对照组，其中当归红芪(1∶5)组与模型组比较，统计学意义显著(P＜0.001)；第7d，第14d当归红芪(2∶4)组与模型组比较也具有显著向差异；第7d，第14d，3∶3与空白组比较也具有统计学意义(P＜0.05)。在辐照后第7天及第14d受试物各比例组小鼠外周血白细胞的数量与辐照后第3d比较有增高趋势，提示受试物对辐射引发的外周血白细胞减少有防护作用，并能促进其数量恢复。 [0052] 表2结果表明，辐照后小鼠的脾脏和胸腺指数较空白组均下降(P＜0.001)，其中当归红芪(1∶5)组能够较为显著的提高两脏器的指数，与模型组比较具 有显著性差异(P＜0.05)。

[0053] 2.4.2对骨髓细胞DNA含量的影响

[0054] 除模型组只造模不给药，空白组给与生理盐水外，其它给药组连续灌胃给药30天，照射后继续口服灌胃至第33天，在照射后第3天即第33天给药后约2h，颈椎脱臼处死小白鼠，剥离出股骨，用1mL注射器(5号针头)吸取一定体积的Hank’s液(北京鼎国生物技术有限责任公司，批号：87P00138)，冲出股骨中的全部骨髓细胞；最后，让细胞悬液通过4号针头的注射器，使细胞在悬液中充分分散。用流式细胞仪(美国Couter，型号EPICS XL)检测DNA含量(碘化吡啶法)，结果见表3。

[0055] 表3对直线加速器低能X射线照射小鼠骨髓细胞DNA含量的影响(x±SD) [0056]

[0057] 注：与模型组比较※P＜0.05※※P＜0.01※※※P＜0.001；

[0058] 从表3得知：辐照后小鼠骨髓细胞DNA含量较空白组均下降(P＜0.001)，其中当归红芪(1∶5)能够较为显著的提高其含量，与模型组比较具有显著性差异(P＜0.05)。 [0059] 2.4.3小鼠骨髓细胞微核数的影响

[0060] 除模型组只造模不给药，空白组给与生理盐水外，其它给药组连续灌胃给药30天，照射后继续口服灌胃至第33天，在照射后第3天即第33天给药后约2h，颈椎脱臼处死小白鼠，取胸骨或股骨，用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀，常规涂片。或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片，涂片自然干燥后，放入甲醇(天津市德恩化学试剂有限公司，批号：20070712)中固定5-10min，放入Giemsa应用液中(Giemsa染液，pH6.8PBS配制，由甘 肃中医学院基础部生物实验室提供)，染色10-15min，立即用磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗，晾干。镜检，每只动物计数1000个嗜多染红细胞中微核细胞数，并计算微核率，结果见表4。

[0061] 表4对直线加速器低能X射线照射小鼠骨髓有核细胞计数的影响(n＝15，x±SD) [0062]※ ※※ ※※※

[0063] 注：与模型组比较 P＜0.05 P＜0.01 P＜0.001；

[0064] 从表4可以看出：照射后第3天，小鼠骨髓有核细胞数明显增加(P＜0.001)，其中当归红芪(1∶5)组、当归红芪(2∶4)组、当归红芪(3∶3)组均能对抗该效应，与模型组比较均具有统计学意义((P＜0.001，P＜0.01，P＜0.01)。

[0065] 2.4.4对中超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响

[0066] 除模型组只造模不给药，空白组给与生理盐水外，其它给药组连续灌胃给药30天，照射后继续口服灌胃至第37天，在照射后第7天，用紫外分光光度计(日本岛京，型号：UV-2401PC)进行SOD检测，结果见表5。

[0067] 表5对直线加速器低能X射线照射小鼠血清中SOD的影响(x±SD)

[0068]

[0069] 注：与模型组比较※P＜0.05※※P＜0.01※※※P＜0.001；

[0070] 从表5可以看出：照射后第7天，小鼠血清中SOD含量明显下降(P＜0.001)，其中当归红芪(1∶5)组、当归红芪(2∶4)组均能对抗该效应，与模型组比较均具有统计学意义((P＜0.01，P＜0.05)。

[0071] 2.4.5对血清溶血素的影响(血凝法)

[0072] 除模型组只造模不给药，空白组给与生理盐水外，其它给药组连续灌胃给药30天，照射后继续口服灌胃至第45天，在照射后第15天，进行血清溶血素的测定。 [0073] 免疫动物及血清分离：取羊血，免疫动物及血清分离取羊血红细胞(SRBC)，用生理盐水洗涤3次，每次离心2000r/min共10min。将压积SRBC用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。 [0074] 凝集反应用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μL，再加入100μL 0.5％(v/v)的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。

[0075] 血清凝集程度一般分为5级(0-IV)记录，按下式计算抗体积数， [0076] 抗体水平＝(S1+2S2+3S3……nSn)

[0077] 式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。

[0078] 0级红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清皙。 [0079] I级红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。 [0080] II级凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。 [0081] III级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。 [0082] IV级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。 [0083] 实验结果见表6.

[0084] 表6对直线加速器低能X射线照射小鼠血清溶血素的影响(x±SD) [0085]

[0086] 注：与模型组比较※P＜0.05※※P＜0.01※※※P＜0.001；

[0087] 与空白组比较◇P＜0.05◇◇P＜0.01◇◇◇P＜0.001.

[0088] 从表6可以看出：照射后第15天，小鼠血清溶血素抗体水平明显下降(P＜0.01)，其中当归红芪(1∶5)组、当归红芪(2∶4)组、当归红芪(3∶3)组均能对抗该效应，与模型组比较均具有统计学意义((P＜0.0001)。

[0089] 综上所述，机体受到辐射后，射线会直接作用于骨髓造血干细胞，导致骨髓幼稚造血细胞受损，细胞增殖分裂能力下降，外周血中成熟细胞再生来源中断。外周血白细胞寿命短，更新快，如果髓造血功能受到抑制，成熟白细胞不能及时得到更新，则白细胞数量迅速下降。因此，白细胞是反映辐射损伤的最直接、最经典的指标。资料表明，辐照后白细胞数的变化有明显的时相性，表现为初期下降时相和暂时回升时相相等。小鼠辐照后初期下降致最低值的时间是发生在辐照后3～13d，暂时性回升时相的开始时间是14d。本实验选定了辐照后第3d、第7天及第14d三个时间点，观察受试物对辐照后小鼠血液系统的影响。在辐照后第3d观察到辐射对小鼠外周血白细胞产生了显著影响，白细胞数量大量地减少，说明辐照对小鼠机体造成了一定的损伤。在辐照后第7天及第14d受试物低、中、高剂量组小鼠外周血白细胞的数量与辐照后第3d比较有增高趋势，提示受试物对辐射引发的外周血白细胞减少有防护作用，并能促进其数量恢复。

[0090] 电离辐射作用于机体后，可直接作用于DNA、蛋白质及酶类，引起电离和化学键断裂，使分子变性和细胞结构破坏，发生微核变化；辐射诱发大量的自由基， 导致全身的过氧化反应。超氧化物歧化酶SOD是防御机体由于氧代谢接受电子不足形成的超氧自由基损害的主要防御性酶，与机体的衰老、肿瘤、炎症、免疫性疾病、心血管疾病以及辐射的防护有关。SOD对氧化与抗氧化之间的平衡有非常重要的作用，能清除过氧化阴离子，在辐射伤害中保护细胞。SOD的活力间接影响清除自由基的能力，所以可以作为抗辐射损伤的一个客观生化指标。本实验说明了受试物能增强辐射后小鼠机体的超氧化物歧化酶(SOD)活性，从而也验证了当归、红芪提取物能修复辐射对抗氧化系统的损伤。

[0091] 辐射会使机体发生复杂的反应，从而在体内产生大量的内源性自由基，引起过氧化反应，对机体的免疫系统会造成一定的损伤。体液免疫由B淋巴细胞产生的抗体介导，外来抗原进入机体后，在外周淋巴组织(脾脏、淋巴结等)中与特异性B淋巴细胞上的膜受体(mLg)结合，从而开始B淋巴细胞活化，刺激不同类型的抗体产生。SRBC进入机体后与B细胞表面受体结合，活化的B淋巴细胞进一步分化并分泌抗SRBC抗体，即溶血素。所以血清溶血素的含量反映了B淋巴细胞产生抗体的能力，也可作为综合反映和评价机体免疫功能的客观指标，进而成为抗辐射损伤的生化指标。本实验证明当归红芪超滤膜提取物对免疫