水稻钾、铵双功能转运分子及应用

摘要

本发明涉及植物基因工程领域，具体地，本发明涉及水稻钾、铵双功能转运分子及应用。根据本发明的水稻钾、铵双功能转运分子，其基因序列如SEQ ID No.1所示，本发明首先从粳稻(Oryza sativa ssp.japonica)品种日本晴中克隆得到了OsKAT3基因，验证了该水稻OsKAT3基因具有高效吸收K+的功能，更令人激动的是这一基因还具有高效转运NH4+的特性。

权利要求

1.氨基酸序列如SEQ ID No.2所示蛋白质作为水稻钾、铵双功能转运分子的应用。

2.氨基酸序列如SEQ ID No.2所示蛋白质在同时提高植物N、K营养利用方面的应用。

3.一种同时提高植物N、K营养利用的方法，其特征在于，所述方法包括将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示蛋白质的基因导入植物中并表达的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID No.2所示蛋白质的基因构建到pYES2载体，得重组质粒。

说明书

水稻钾、铵双功能转运分子及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物基因工程领域，具体地，本发明涉及水稻钾、铵双功能转运分子及应用。

背景技术

[0002] N、P、K是作物生长的必要的大量元素，营养的吸收和利用是限制产量的主要因素，提高作物营养的有效利用一直是育种追求的目标，在当前富营养化土壤污染日益加剧的条件下，增加作物营养的自身利用效率，造就绿色生态农业，也是值得关注的另一个方面。土壤中的钾、氮是植物钾营养的主要来源，且土壤中的钾、氮易淋溶流失，过多地淋溶流失，会造成土壤含营养量有限，使有效营养成分利用越来越困难，另一个方面过多施用也会造成水体的富营养化和水环境的严重破坏。钾、氮是植物细胞内最重要的元素，也是影响作物产量的三大营养要素之一。钾是维持细胞内、外电化学势的主要溶质，影响着植物细胞的水势、渗透势和膨压，参与细胞的运动、生长、伸长；帮助光合电子传递，提高植物对其他营养元素的吸收和利用；钾也是酶的辅助因子，使细胞质保持着适宜的pH值，直接或间接地影响着50多种酶的活性；钾的另一重要生理作用是增强细胞对环境条件的调节作用，从而增强植物对各种不良逆境的耐受能力，如：干旱、低温、含盐量、病虫危害、倒伏等；氮是细胞的结构组分，也是蛋白质的重要组成成分，其重要性不言而喻。

[0003] 钾以离子的形式存在，不是细胞的结构组分，可从一个部位转移到另一个部位在+ -植物体内重复利用；氮大部分也是以离子的形式(NH4、NO3 等)被吸收，与其易流动、再分配的特点相适应，植物体内存在一大类与钾、氮转运有关的蛋白分子，从离子的亲和性、选择性及驱动的能量来源分为不同类型。大量的研究表明，营养的有效利用(包括钾、铵的吸收、运输、分泌等)，都是由不同类型的离子转运体的功能决定，无论是吸收、分配、再循环还是体内的有效储存，其效应都是由转运体的表达和活性调节得以实现。因此，分离、鉴别水稻钾、铵转运体分子，是从分子水平改善水稻氮、钾营养利用不可逾越的环节，也是转基因操作改善其品质的基础。

[0004] 植物中已鉴定出三个由α-亚基形成的钾选择通道家族，分别为：Shaker-type、TPK和Kir-Like，参与钾吸收、再分配和区域化，维持和产生膜的极性，也发现了以AMT1为代表的铵转运体家族。

[0005] 水稻是一年生禾本科植物，世界上近一半人口以稻米为食。水稻缺钾症状表现为：老叶叶尖及前端叶缘褐变或焦枯，同时出现褐色斑点；植株伸长受抑制而萎缩；叶色加深，呈暗绿色且无光泽；根系细弱，多褐根，老化早衰；抽穗不整齐，秕谷率增加，正常受精的谷粒也不饱满，产量和品质下降，氮缺乏会带来更严重的病理症状。除了合理施肥，提高田间管理措施等防治措施外，从水稻本身的钾、氮营养分子基础研究入手，增加作物吸收营养和体内循环利用的效率，无疑可以为应对作物营养缺陷的挑战，提供值得期待的技术和优质基因资源。

[0006] 从水稻基因组的数据分析，水稻存在已知的所有类型的植物钾离子转运体，至少有11个编码Shaker家族的钾通道的基因，分布在不同的染色体上，其中一号染色体有3个，2号有2个，4号有2个，5、6、7、9号各有1个。水稻的Shaker钾通道目前只有两个结果：OsKAT1能增加水稻胞内钾的含量，抵御盐的胁迫(Obaa et al.，2007)；OsAKT1是电压依赖的内向整流钾离子通道，但是对盐胁迫敏感(Fuchs et al.，2005)。水稻铵离子转运体的研究更是滞后于钾转运家族的研究，最近的研究表明钾、铵的转运既可互相影响、也可协同运输；增加外界钾的含量，可抑制铵的内流，铵、钾可能部分共享同一条通路，因此有必要从水稻中克隆能够提高钾、铵利用效率的相关基因并验证其功能，从而筛选出可以利用的基因资源，并进一步通过转基因等技术应用于农作物来提高其对钾、铵的有效利用能力。

发明内容

[0007] 本发明的发明人为了解决上述问题提出并完成了本发明。

[0008] 本发明的目的是提供一种水稻钾、铵双功能转运分子。

[0009] 本发明的再一目的是提供上述水稻钾、铵双功能转运分子的应用。

[0010] 根据本发明的水稻钾、铵双功能转运分子，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0011] 根据本发明的水稻钾、铵双功能转运分子基因编码上述转运分子，其序列如SEQID No.1所示。

[0012] 本发明还提供了包含上述水稻钾、铵双功能转运分子基因的真核表达载体，优选将水稻OsKAT3基因构建到pYES2载体上，得重组质粒pYES2-OsKAT3。

[0013] 本发明提供了所述水稻钾、铵双功能转运分子在同时提高植物N、K营养方面的应用。从而，本发明也提供了一种同时提高植物N、K营养利用的方法，所述方法包括将所述水稻钾、铵双功能转运分子基因导入植物中并表达的步骤。

[0014] 本发明首先从粳稻(Oryza sativa ssp.japonica)品种日本晴中克隆了OsKAT3+基因，验证了水稻OsKAT3基因具有高效吸收K 的功能，更令人激动的是这一基因还具有+
高效转运NH4 的特性，具体发明如下：首先克隆了相关基因，采用缺陷型酵母CY162(Trk1/Trk2)作为宿主菌，获得了低钾条件下生长旺盛的转化子，由此初步验证了OsKAT3的吸钾功能；进一步，利用双电极电压钳技术(TEVC)和体外异源表达系统-非洲爪蟾卵母细胞，表+
达分析了OsKAT3离子通道活性、门控特征和离子选择性，发现OsKAT3不仅可以转运K，而+
且可以有效地转运NH4，精确鉴定了OsKAT3转运能力，获得了比典型Shaker家族基因KAT1吸钾更强的内向整流钾通道分子，而且这一基因还有其他同源Shaker家族基因不可比拟+
的NH4 特异选择性，也就是说如果合理的利用这一基因，可同时提高作物对两种重要的营养元素(K、N)的利用效率，同时增加吸钾和吸铵的能力，本发明为有效利用这一基因资源打下了坚实的基础。

附图说明

[0015] 图1OsKAT3基因的克隆，

[0016] 水稻OsKAT3基因的PCR扩增产物和pEASY-T1重组质粒的酶切及PCR鉴定，其中，图1A：M为Marker III(TransGene)；lane1为OsKAT3的PCR结果；

[0017] 图1B：M为Marker III(TransGene)；lane1为OsKAT3的BamHI/XbaI酶切结果；

[0018] 图1C：M为1kb plus marker(TransGene)；lane1，8，9，10，11，13，14，15，16，17为菌落PCR检测结果。

[0019] 图2水稻OsKAT3基因表达的组织特异性。

[0020] 图3水稻OsKAT3功能验证载体的构建，

[0021] 图3A：左：lane1，2，3，4，5，6为pYES2-OsKAT3质粒PCR检测结果，lane7，8，9，10，11，12为pGEMHE-OsKAT3质粒PCR检测结果，M为Marker III(TransGene)；

[0022] 中：M为Marker III(TransGene)；lane1为pYES2-OsKAT3的BamHI/XbaI酶切结果；

[0023] 右：M为Marker III(TransGene)；lane1为pGEMHE-OsKAT3的BamHI/XbaI酶切结果。

[0024] 图3B：lane1，2，3，4，5，6，7，9，10，11，12，15为pYES2-OsKAT3质粒转化酵母CY162后的菌落PCR检测结果，M为Marker III(TransGene)。

[0025] 图4、水稻OsKAT3基因互补酵母钾转运体缺陷型突变体CY162，

[0026] 从上至下依次为：阳性对照，AtKAT1转化子；水稻OsKAT3基因转化子；阴性对照，2 3 4
pYES2转化子；从左至右依次为OD600＝1.0的菌液，10，10，10，10 倍稀释的菌液。

[0027] 图5：水稻OsKAT3钾、铵离子双功能选择和转运活性验证，

[0028] A：浴液为100mM谷氨酸钠；B：100mM谷氨酸铵；C：100mM谷氨酸钾；D：100mM氯化锂；E：I-V曲线。

[0029] 图6：水稻OsKAT3钾离子浓度依赖活性，

[0030] 水稻OsKAT3基因对钾离子转运活性的浓度依赖性结果，A：a：浴液为10mM谷氨酸钾；b：50mM谷氨酸钾；c：100mM谷氨酸钾；d：I-V曲线；B：尾电流，a：浴液为10mM谷氨酸钾；b：50mM谷氨酸钾；c：100mM谷氨酸钾；d：I-V曲线。

[0031] 图7：水稻OsKAT3铵离子浓度依赖活性，

[0032] A：a：浴液为10mM谷氨酸铵；b：50mM谷氨酸铵；c：100mM谷氨酸铵；d：I-V曲线；B：尾电流，a：浴液为10mM谷氨酸铵；b：50mM谷氨酸铵；c：100mM谷氨酸铵；d：I-V曲线。

[0033] 图8：pGEMHE载体图。

具体实施方式

[0034] 实施例1：水稻OsKAT3基因的克隆

[0035] 提取水培生长10天的水稻根和叶的总RNA并以其为模板，以Oligo dT为引物作逆转录，反应完成后取1μL逆转录产物作为模板，以特异引物K3F和K3R进行PCR扩增。结果得到约2.1kb左右的单一产物(图1A)。将此扩增条带纯化回收后，与pEASY-T1载体连接的重组质粒pTK3，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。挑取单克隆质粒进行酶切检测(图1B)及菌落PCR鉴定(图1C)后，选取阳性克隆并测序。

[0036] K3F：5′-ATGACCCAAGCTCACTCAAAATCTTGCTTCC-3′

[0037] K3R：5′-CTACATCTCAAGAAGGAATAGATGGTCGCCA-3′

[0038] OsKAT3的cDNA序列及其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示。

[0039] SEQ ID No.1：

[0040] atgacccaag ctcactcaaa atcttgcttc caccagttct gggatggact ccagatcaag 60[0041] aggagcagcg atagcttcac tgtagagcta ctgccatccc ttggtgcaac tataaaccac 120[0042] tccaacaagt tgcagaagtt catcatatcg ccttatgatc cccggtacag atcctgggag 180[0043] ctgttcctta tagtcctagt tgtttactct gcctggattt gtccgtttga actagcattc 240[0044] ctgagggact taccatctaa gcttttgcta gttgagaaca ttgtggatat attctttgcc 300[0045] attgatattg ttttgacgtt cttcgttgct tatgtcgata gcaaaacaca tcttcttgtg 360[0046] gatgaccgaa agagaattgc aatgaggtac ctatccactt ggtttatctt tgatgtatgt 420[0047] tcaacagcac catttcaacc aatcatcctt ctatttacac acaaggggaa tgacattgct 480[0048] ttcaaggtac tcaatttgct caggctgtgg cgtcttcacc gagtcagttc actatttgcc 540[0049] aggctggaga aagacatccg attcaactat ttctggacta ggtgctcaaa acttatttct 600[0050] gtgaccctct tcgcagtaca ttgtgcagga tgcttcaatt atatgattgc tgacagatat 660[0051] cccaacccag agaaaacatg gataggagct gtgatgtcaa ctttcagatc agagagctta 720[0052] tggactagat atattactgc tctttactgg tccattacaa cactgacaac aacaggatat 780[0053] ggggacctac atgctgaaaa tccaacagag atgctatttg atattgtcta tatgatgttt 840[0054] aatctgggct tgacagctta tctcattggc aacatgacca acctagttgt ccatgggacc 900[0055] agccgcacca ggaaatttag ggactcaatc caagcagcat cagagtttgc agcacgcaat 960[0056] cagctacctg agaacataaa gcagcaagtg ctatctcact tctgcctaca attcaagaca 1020[0057] gagggactca accagcaggt catgttagac tgtctaccaa aaggaatccg ctcaagcata 1080[0058] gcatacagct tattctttcc gatcatccgg caagcctatc tcttcaatgg agtatctggc 1140[0059] aatttcattg cagaactggt catggaagtg caggctgagt acttcccacc aaaggaagat 1200[0060] ataatattgc agaatgaagg agaagcagat gtttacatag tagtttcagg agcagtgaat 1260[0061] ataataacaa caatacatgg gaatgagcag gtatatgaga aaattgcaga gggagaaatg 1320[0062] tttggagagg ttggttcttt atgtaacata ccccagccat ttacttgccg cacagcggag 1380[0063] ctatcacagc ttttaagaat aagcaaaaca aggcttagag agatcattga agaaaacagg 1440[0064] gaagacagta acattctaat gaacaaccta gttcagaagc tgaagctacg agaaagttta 1500[0065] cctgacatga atcaaccaga ccgaagattc ttgagcaagt atgagctatt ccacgttcct 1560[0066] cgagaagcat ggctgctgaa aaagtcacaa ctacattaca cagagcacac aagtagggat 1620[0067] tctagtaaca acactccagt atttggaggt gacagatatt ccagacagtt acttggagaa 1680[0068] gcaacccgat cttcggcatc agaaaacgaa aatagcagta tgacagataa agaagagaac 1740[0069] catgatgaag ttcacacaaa ctgtgagatc aaaaaaagaa cggaagagca ctgtatccag 1800[0070] ataaactctg aagatagcag ctccacatac agtcagcgaa caatgaatgc aacagtgcag 1860[0071] acagggtctc cacataaaac agaagaaaac ataacaagaa gaattccaga tgagtactac 1920[0072] ataaaagaag caaacaaaag agttacaatt cacaaatatc gtcataactc aacagtctct 1980[0073] gctgcgcaaa atggaaagct tatcaagctg cctacatcat tggaggaact gttcaaaatt 2040[0074] ggcagtcaga agtttcaagg ttttcatcct agaaaggtgg tcagtagaga ttatgctgaa 2100[0075] atagatgatg tcagtgttat ccgcgatggc gaccatctat tccttcttga gatgtag 2157[0076] SEQ ID No.2：

[0077] MTQAHSKSCF HQFWDGLQIK RSSDSFTVEL LPSLGATINH SNKLQKFIIS

[0078] PYDPRYRSWE 60

[0079] LFLIVLVVYS AWICPFELAF LRDLPSKLLL VENIVDIFFA IDIVLTFFVA

[0080] YVDSKTHLLV 120

[0081] DDRKRIAMRY LSTWFIFDVC STAPFQPIIL LFTHKGNDIA FKVLNLLRLW

[0082] RLHRVSSLFA 180

[0083] RLEKDIRFNY FWTRCSKLIS VTLFAVHCAG CFNYMIADRY PNPEKTWIGA

[0084] VMSTFRSESL 240

[0085] WTRYITALYW SITTLTTTGY GDLHAENPTE MLFDIVYMMF NLGLTAYLIG

[0086] NMTNLVVHGT 300

[0087] SRTRKFRDSI QAASEFAARN QLPENIKQQV LSHFCLQFKT EGLNQQVMLD

[0088] CLPKGIRSSI 360

[0089] AYSLFFPIIR QAYLFNGVSG NFIAELVMEV QAEYFPPKED IILQNEGEAD

[0090] VYIVVSGAVN 420

[0091] IITTIHGNEQ VYEKIAEGEM FGEVGSLCNI PQPFTCRTAE LSQLLRISKT

[0092] RLREIIEENR 480

[0093] EDSNILMNNL VQKLKLRESL PDMNQPDRRF LSKYELFHVP REAWLLKKSQ

[0094] LHYTEHTSRD 540

[0095] SSNNTPVFGG DRYSRQLLGE ATRSSASENE NSSMTDKEEN HDEVHTNCEI

[0096] KKRTEEHCIQ 600

[0097] INSEDSSSTY SQRTMNATVQ TGSPHKTEEN ITRRIPDEYY IKEANKRVTI

[0098] HKYRHNSTVS 660

[0099] AAQNGKLIKL PTSLEELFKI GSQKFQGFHP RKVVSRDYAE IDDVSVIRDG

[0100] DHLFLLEM 718

[0101] 在ExPASy Proteomics tools-TMHMM

[0102] (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)对其作了跨膜域分析，显示为验证OsKAT3具有Shaker家族的特异跨膜结构。

[0103] 为了解OsKAT3基因在水稻不同组织器官中的表达情况，分别提取了水稻根、叶的总RNA，作半定量RT-PCR分析(图2)。结果显示OSKAT3基因在水稻叶片中的表达较强，而在根中的表达较弱。以上实验结果表明OsKAT3基因的表达在水稻中有明显的组织差异性，其在叶片部位的表达较为活跃。

[0104] 实施例2：水稻OsKAT3基因的真核表达载体的构建及功能互补

[0105] 1、水稻OsKAT3基因表达质粒的构建

[0106] 将水稻OsKAT3构建到pYES2载体(该载体购自Invitrogen公司)，转化大肠杆菌后，提取质粒并检测(图3A)。

[0107] 2、重组质粒pYES2-OsKAT3的功能互补实验

[0108] 将构建好的pYES2-OsKAT3载体，转化酵母CY162菌株，在10mM SD固体培养基下生长1-2天，挑取酵母克隆检测(图3B)后，在10mM SD液体培养基下培养约1天，转至0.1mM YNB+Gal固体培养基中生长，通过观察生长情况验证了水稻OsKAT3基因具有内向转运钾的活性(图4)。

[0109] 实施例3：水稻OsKAT3基因的电生理功能分析

[0110] 将水稻OsKAT3基因构建到pGEMHE载体(该载体最先由Harvard MedicalSchool的Liman等将非洲爪蟾的一个β-globin基因的3’-UTR和5’UTR引入pGEM-3Z载体改造而成，载体图如图8)，转化大肠杆菌后检测(如图3A)，以特异引物M13和M13R进行PCR扩增，将产物做Capping RNA，通过显微注射技术将其注射到Xenopus oocytes中表达约2天，再利用TEVC(Two-electrode voltage-clamp)技术对OsKAT3基因做电生理分析。

[0111] 1、水稻OsKAT1基因的钾转运功能分析

[0112] 1)配制浴液：

[0113] 钾离子浴液：100mM谷氨酸钾，2mM MgCl2，1mM CaCl2，10mM Hepes；

[0114] 甘露醇浴液：100mM甘露醇，2mM MgCl2，1mM CaCl2，10mM Hepes；

[0115] 2)设置测定程序

[0116] 电压从-130mV到50mV，以20mV递增，测定时间为4.8s。

[0117] 以100mM甘露醇做对照，以100mM谷氨酸钾做浴液进行测定，结果表明OsKAT3基因具有转钾活性(图5)。

[0118] 2、水稻OsKAT3基因的离子选择性分析

[0119] 对OsKAT3基因的离子选择性分析，以100mM谷氨酸钠，100mM谷氨酸铵，100mM氯化锂做浴液进行测定，结果表明OsKAT3基因对铵根离子具有转运活性，而对钠离子和锂离子没有转运活性(图5)。

[0120] 1)配制浴液：

[0121] 铵离子浴液：100mM谷氨酸铵，2mM MgCl2，1mM CaCl2，10mM Hepes；

[0122] 钠离子浴液：100mM谷氨酸钠，2mM MgCl2，1mM CaCl2，10mM Hepes；

[0123] 锂离子浴液：100mMLiCl，2mM MgCl2，1mM CaCl2，10mM Hepes；

[0124] 甘露醇浴液：100mM甘露醇，2mM MgCl2，1mM CaCl2，10mM Hepes；

[0125] 2)设置测定程序

[0126] 电压从-130mV到50mV，以20mV递增，测定时间为5.4s。

[0127] 3、水稻OsKAT3基因的钾离子浓度依赖性分析

[0128] 对OsKAT3基因的钾离子浓度依赖性分析，分别以10mM，50mM，100mM谷氨酸钾做浴液进行测定，结果表明OsKAT3基因对钾离子具有浓度依赖性，随着浓度的增加，转运活性也在增加(如图6)。

[0129] 1)配制浴液：

[0130] 钾离子浴液：100mM谷氨酸钾，2mM MgCl2，1mM CaCl2，10mM Hepes；取部分稀释为50mM和10mM；

[0131] 2)设置测定程序

[0132] A：电压从-130mV到50mV，以20mV递增，测定时间为4.8s；

[0133] B：尾电流测定。

[0134] 4、水稻OsKAT1基因的铵离子浓度依赖性分析

[0135] 对OsKAT3基因的钾离子浓度依赖性分析，分别以10mM，50mM，100mM谷氨酸铵做浴液进行测定，结果表明OsKAT3基因对铵根离子也具有浓度依赖性，随着浓度的增加，转运活性也在增加(如图7)。

[0136] 1)配制浴液：

[0137] 铵离子浴液：100mM谷氨酸铵，2mM MgCl2，1mM CaCl2，10mM Hepes；取部分稀释为50mM和10mM

[0138] 2)设置测定程序

[0139] A：电压从-130mV到50mV，以20mV递增，测定时间为4.8s；

[0140] B：尾电流测定。