一种肝素十二糖、其制法及其抗血管平滑肌细胞增殖的用途

摘要

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种肝素寡糖十二聚体、其制法及其抗血管平滑肌细胞增殖的用途。本发明的肝素寡糖十二聚体结构式(I)如下。

权利要求

1.一种结构式(I)的肝素寡糖十二聚体的制备方法，包括：

取低分子肝素采用Bio-Gel P6凝胶色谱柱分离，分离液再进行电泳分离，电泳得到肝素寡糖的分子量分五个级别，将肝素寡糖中第二组分浓缩，经Sephadex G15脱盐后，采用Bio-Gel P4凝胶色谱柱进行分离，即得，Bio-Gel P6凝胶色谱柱分离的流动相为0.2M氯化钠溶液，Bio-Gel P4凝胶色谱柱分离的流动相为0.4M氯化钠溶液，电泳的分离胶的浓度为

15-25％w/v，上样浓度为2mg/ml。

说明书

一种肝素十二糖、其制法及其抗血管平滑肌细胞增殖的用

途

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种肝素寡糖十二聚体，它具有抗血管平滑肌细胞增殖的作用。

背景技术

[0002] 肝素是由糖醛酸和己糖胺组成的具有不同链长的黏多糖类混合物，其分子量为3000-30000。它不仅具有抗凝、抗血栓、抗炎、抗过敏、抗病毒和降血脂等多种生物功能，同时也是一种防治深部静脉血栓、肺栓塞或其它血栓的有效药物。但是肝素在临床应用时常伴有出血、血小板减少、骨质疏松等副作用，有时甚至可引起致死性颅内出血，据报道由肝素导致的出血率高达35％。

[0003] 低分子肝素平均分子量5kD，它是由普通肝素解聚而得。与普通肝素相比，低分子肝素具有抗FXa作用强、抗FIIa作用弱、生物利用度高、血浆半衰期长、较低的出血倾向及较少的血小板减少症等优点，可以应用于防治深部静脉血栓、肺栓塞、播散性血管内凝血等疾病。

[0004] 但是低分子肝素是混合物，由不同聚合度的肝素寡糖组成，目前尚未发现具体是哪个聚合度的肝素寡糖能够作用于血管平滑肌细胞，故本研究对肝素寡糖进行纯化，并对其抑制血管平滑肌细胞增殖活性进行研究，此研究符合我国药物现代化的发展方向，在基础研究领域和应用研究领域内具有重要的社会意义和潜在的经济效益。

发明内容

[0005] 本发明公开了一种肝素寡糖十二聚体，其结构式如下：

[0006]

[0007] 本发明的肝素寡糖十二聚体，可以用下述方法制备：

[0008] 先制备小分子肝素，可以利用文献报道的方法，也可以用下列方法制备：使用反应缓冲液(25mM NaAc-10mM CaAc2，pH7.0)溶解肝素钠，30℃酶法制备低分子肝素，超滤得到平均分子量在4kD的小分子肝素。

[0009] 取上述分子量小于10kD的低分子肝素的冻干粉，使用流动相溶解，0.45μm微孔过滤，采用Bio-Gel P6凝胶色谱柱分离，分离液再进行电泳检测，电泳得到肝素寡糖的分子量由低到高分五个级别，将第二级别的肝素寡糖合并浓缩，经Sephadex G15脱盐后，采用Bio-Gel P4凝胶色谱柱进行分离，并使用梯度电泳验证，即得。

[0010] 其中Bio-Gel P6凝胶色谱柱分离的流动相优选0.2M氯化钠溶液。

[0011] 其中Bio-Gel P4凝胶色谱柱分离的流动相优选0.4M氯化钠溶液。

[0012] 流速均优选1mL/4min。

[0013] 其中梯度电泳的分离胶的浓度为15-25％(w/v)，上样浓度为2mg/ml。

[0014] 本发明的肝素寡糖十二聚体可以添加注射用水制备成注射液或冻干针剂，或添加药学上可接受的辅料成份制备成药学上常用的剂型用于临床，如肝素寡糖十二聚体注射液或肝素寡糖十二聚体冻干针剂等。

[0015] 体外活性实验证明本发明的肝素寡糖十二聚体抗血管平滑肌细胞增殖的效果优异。在用含20％小牛血清的DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium)诱导平滑肌增生的模型中，以0.01、01、1μmol/L的肝素寡糖十二聚体培养24小时后，其对含20％血清DMEM诱导的细胞增生抑制作用明显。而其他肝素寡糖组分对含血清DMEM诱导的平滑肌细胞增殖的影响作用没有确切结论。

[0016] 下面是部分药理学试验及结果：

[0017] 一、原代动脉平滑肌的培养

[0018] 取新生小牛颈主动脉，用含高浓度抗生素的Hanks液，D-Hanks平衡盐溶液清洗后，以弯镊剥除内膜，露出中层平滑肌。将平滑肌剪成小块，接种于培养瓶中，加6～7mL含20％新生牛血清的DMEM，将培养瓶瓶底朝上放入37℃，5％CO2孵箱培养4h，待组织块牢固黏附于瓶壁，翻转培养瓶，使组织块完全浸没于培养液，继续培养，每3天换一次培养液。当瓶底大部分区域细胞接近融合形成明显的“峰-谷”交错的形态即可传代。实验采用3～
5代VSMC。

[0019] 二、体外抗平滑肌细胞增殖试验

[0020] 将样品根据浓度各分三组(0.01，0.1，1μmol/L)，每组设12个复孔，采用四氮唑蓝(MTT)法检测。将细胞分为空白组(不含血清的DMEM)、对照组(含20％新生牛血清的DMEM)、加药组(含20％新生牛血清的DMEM)，每组设12个复孔，空白组、对照组加入相应量的PBS，加药组分别加入0.01、0.1、1μmol/L的肝素十二糖，继续培养24小时。每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μL，37℃培养4h。吸出培养液，每孔加入DMSO 150μL，振荡混匀后于
490nm处测定吸光度。所有数据统计学差异采用Student’s t-test进行分析。P＜0.01为有极显著性差异。检测结果见表1。

[0021] 表1肝素十二糖对平滑肌细胞增殖的影响( n＝12)

[0022]

[0023] ##与空白组比较t＜0.01，**与对照组比较t＜0.01

附图说明

[0024] 图1是232nm处洗脱液的紫外吸收曲线。

[0025] 图2是本发明制备的低分子肝素经Bio-Gel P6初步分离的电泳结果。

[0026] 图3是本发明制备的肝素十二糖聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式

[0027] 实施例1

[0028] 1)酶法制备低分子量肝素

[0029] 取肝素钠50mg，使用反应缓冲液(25mM NaAc-10mM CaAc2，pH7.0)进行溶解，30℃恒温水浴10min，加入购自Sigma公司的肝素酶I 26125mU(肝素钠∶肝素酶I＝
1∶522.5)进行恒温酶解反应。在反应8、16、24小时各补加等量的肝素酶I一次，共补加三次，以防止反应中的酶损耗。控制反应在32小时左右，于100℃的沸水中煮沸4分钟，灭活肝素酶I终止反应，得到肝素寡糖的反应液。取上述反应液，用10kD MWCO的超滤离心管于冷冻离心机离心(5000r/min×30min)进行超滤，离心管外管液吸出，内管加双蒸水，重复离心两次，合并管外小于10kD的组分，使用0.45μm的滤膜进行过滤，50℃真空旋蒸，冷冻干燥，得到抗平滑肌细胞增殖的活性相对较强的低分子肝素。

[0030] 2)肝素寡糖的初步分离纯化

[0031] 取上述冻干粉，用流动相溶解，采用凝胶色谱柱(Bio-Gel P6，1.0cm×100cm)进行分离，流动相为0.2mol/L NaCl，流速为1mL/4min，每管收集2mL。经232nm处紫外检测，紫外吸收曲线图见图1。

[0032] 3)聚丙烯酰胺凝胶电泳

[0033] 取上述紫外吸收曲线的各个吸收峰处的收集液10μL(上样浓度约为2mg/ml)，与等体积的40％蔗糖溶液混匀，以溴酚蓝作指示剂进行电泳。电泳胶的浓度采用15％-25％的梯度分离胶，5％的浓缩胶。150V电泳1小时后，调节电压至200V，当溴酚蓝迁移距离为分离胶的二分之一时停止电泳。置0.25％(w/v)阿利新兰染色液中染色30min，用1％(v/v)醋酸脱至背景无色。电泳结果显示肝素寡糖的分子量由低到高分五个级别，见图2。

[0034] 4)肝素十二糖的分离纯化

[0035] 将第二级别的肝素寡糖合并浓缩，经Sephadex G15脱盐后，采用凝胶色谱柱(Bio-Gel P4，1.0cm×100cm)进行分离，流动相为0.4mol/LNaCl，流速为1mL/4min，每管收集1mL。SephadexG15脱盐，冻干。由于第二组分含有两种寡糖，分别是肝素十二糖和肝素十四糖，其中肝素十四糖的分子量大于4000D，而Bio-Gel P4的分离范围在1000-4000，所以肝素十四糖基本不会进入凝胶介质的空隙，直接被洗脱下来，而肝素十二糖分子量较小，能够进入Bio-Gel P4的空隙，根据此原理，从而实现对两种寡糖的分离。由15-25％聚丙烯酰胺凝胶电泳确定肝素十二糖。见图3。