水稻抗稻瘟病基因Pi25编码区及其应用转让专利
申请号 : CN200910155266.2
文献号 : CN101824418B
文献日 : 2011-12-21
发明人 : 吴建利 , 陈洁 , 庄杰云 , 施勇烽
申请人 : 中国水稻研究所
摘要 :
本发明涉及水稻稻瘟病抗性基因Pi 25编码区的分离克隆与应用。本发明公开了水稻抗稻瘟病基因Pi 25编码区的核苷酸序列SEQ ID NO.1，及其编码的蛋白质氨基酸序列SEQID NO.2。将Pi 25基因编码区转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用杂交和转化方法在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中连锁累赘问题，并且可以缩短育种时间，提高品种选育效率；抗病基因的克隆是解决传统育种中种间基因转移存在障碍的基础。本发明还提供了用于扩增水稻抗稻瘟病基因Pi25的引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，其中SEQ ID NO：3的核苷酸序列为GGGGTACCCCATCGGCAGTGTAGCGTTTTT，SEQ ID NO：4的核苷酸序列为GCTCTAGAGCGCAATCGTGGAACAGGAAT。本发明还提供了含有水稻稻瘟病抗性基因Pi 25的编码区的载体。
权利要求 :
1.水稻抗稻瘟病基因Pi 25编码区，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.由SEQ ID NO.1编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.获得权利要求1所述水稻抗稻瘟病基因Pi 25的引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：
4，其特征在于：SEQ ID NO：3核苷酸序列为GGGGTACCCCATCGGCAGTGTAGCGTTTTT，SEQ ID NO：
4的核苷酸序列为GCTCTAGAGCGCAATCGTGGAACAGGAAT。
说明书 :
水稻抗稻瘟病基因Pi25编码区及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因Pi25编码区的分离克隆与应用。
背景技术
[0002] 水稻是我国重要的粮食作物，担负着全国95％以上人口的口粮。然而水稻在种植过程中，经常会受病害的危害，造成严重减产。稻瘟病是由子囊菌Magaporthe oryzea引起的水稻重要病害，已在85个国家中发现此病害。据统计，在1975-1990年间，由稻瘟病菌引起的粮食损失占全球总产量的11-30％，约157亿吨。从1980到2002年的22年间，我国四川省年均发生稻瘟病280万亩，年均损失稻谷6000万公斤。2005年黑龙江省稻瘟病发生面2
积超过66.67万hm，占该省水稻播种面积的1/3。目前，稻瘟病的防治主要采用化学防治和抗病新品种培育两种途径。化学防治通常成本高、效果差而且污染环境；而新品种往往由于病菌小种致病力的快速演变，抗病性无法长期稳定维持，因此，发掘稻瘟病广谱、持久抗性新基因，培育持久高抗品种，是最经济有效的病害控制措施。
积超过66.67万hm，占该省水稻播种面积的1/3。目前，稻瘟病的防治主要采用化学防治和抗病新品种培育两种途径。化学防治通常成本高、效果差而且污染环境；而新品种往往由于病菌小种致病力的快速演变，抗病性无法长期稳定维持，因此，发掘稻瘟病广谱、持久抗性新基因，培育持久高抗品种，是最经济有效的病害控制措施。
[0003] 开展抗瘟育种，阐明寄主的抗性机制是解决如何培育广谱，持久性抗性品种的关键问题之一，而发掘、鉴定和克隆抗病基因是抗瘟育种应用的前提。迄今，国内外已至少鉴定了67个稻瘟病抗性等位基因，座落于水稻基因组的58个位点上，只有第3染色体上尚未定位到抗性基因。其中第6、11和12染色体上定位到的基因最多，且成簇分布。到目前为止，已经克隆的稻瘟病抗性等位基因有9个：Pi b、Pi ta、Pi2、Pi z-t、Pi 9、Pid2、Pi36、Pi37和pi21，分别定位于第2、12、6、6、6、6、8、1和4染色体，其中Pi 2、Pi z-t和Pi9为同一座位上的基因，但从物理位置上不是同一座位上的基因；除Pid2是编码一个受体类激酶外，pi21编码一个富含脯氨酸的蛋白且具水平抗性，其余7个基因均编码NBS-LRR蛋白。
[0004] Pib是第一个被克隆的稻瘟病抗性基因，位于第二染色体长臂末端，该基因大小为3753个碱基，具有4个内含子，属于NBS-LRR类型的抗性基因，其编码的蛋白可能与无毒基因产物在细胞质中识别，从而诱发水稻的防卫反应。正常情况下，Pib少量表达，当病原菌存在时，表达量增高，当温度改变或没有光照时，该基因的表达量也增加。Pib基因属于小家族成员之一，起源于东南亚籼稻，在日本得到广泛应用，对日本绝大多数小种表现高抗，不过，目前尚未证明它是一个广谱稻瘟病抗性基因。Pi ta来源于菲律宾籼稻Tadukan，该基因是一个单拷贝基因，编码一个含928个氨基酸残基的细胞质受体，该基因在抗病品种和感病品种918位置上仅仅存在一个氨基酸的差异，但他们都是低量组成性表达。Pita也属于NBS-LRR类型的抗性基因，不过其C末端虽然富含亮氨酸，但不属于典型的LRR结构。
[0005] Pi9，Pi2和Piz-t三个稻瘟病抗性基因均位于第6染色体上，都属于NBS-LRR类基因，具有较广的抗谱。Pi 2与Piz-t高度同源，两种之间仅有八个氨基酸不同，分布在三个保守的LRR结构区内。此外，不同于大部分NBS-LRR基因的NBS区激酶2N端包含一个内含子，这三个基因的内含子不在NBS区内，而分别位于NBS区之前与LRR区之后，有可能表明Pi2/Pi 9/Pi z-t基因家族的进化独立于其他NBS-LRR基因。
[0006] Pid2基因来源与我国水稻品种地谷，与以往所克隆的NBS-LRR类抗稻瘟病基因不同，该基因编码一个类受体激酶蛋白，同时具有一个胞外域(B-lectin)和胞内丝氨酸/苏氨酸激酶域。Pid2是一个组成性表达的单拷贝基因，同时抗感两个等位基因仅在第441氨基酸位置上有差异。Pid2包含一个细胞外的凝集素域可能是作为受体在细胞外与更多的配体结合，反应了该基因可能存在不同的抗性机制，包括克隆更多类似的基因。
[0007] Pi36是一个单拷贝基因，位于第8染色体上的一个17Kb的区间内，是一个典型的NBS-LRR基因，编码由1056个氨基酸残基组成的蛋白质，在抗性品种中组成性表达，其抗感品种的等位基因仅在第590氨基酸位置上有差异。
[0008] Pi37基因位于第1染色体上，亦属于NBS-LRR结构基因，编码一个1290氨基酸残基组成的蛋白质，是一个组成性表达的基因，该基因在NBS中的第239和247氨基酸位置上有差异导致了抗感的差别，瞬时表达显示Pi37蛋白位于细胞质内。
[0009] pi21基因位于第4染色体上，属于一个新型的稻瘟病抗性基因，编码一个富含脯氨酸的蛋白，也是第一个克隆的稻瘟病抗性QTL，具有非小种特异性抗性，具有广阔的育种应用前景。
[0010] 随着水稻基因组测序的完成，利用图位法和生物信息学方法克隆植物基因，已经取得快速进展，这为稻瘟病抗性机理的阐明以及抗性基因在水稻育种中的应用奠定了很好的基础。迄今为止，除pi21基因外，克隆的稻瘟病抗性基因都是主基因，然而主基因主导的抗性往往不稳定，相对而言，具有广谱抗性的主基因具有较大的应用前景。Pi25来源于籼稻品种谷梅2号，该品种是一个广谱、兼抗叶瘟和穗瘟的稻瘟病抗性稳定持久的品种，克隆来源于谷梅2号的稻瘟病抗性基因，可为进一步理解水稻抗病分子机制，以及阐明穗瘟抗性机理提供理论依据，也为抗性基因的育种应用打下物质基础。
发明内容
[0011] 本发明的目的是分离克隆水稻品种谷梅2号中携带的一个有生物学功能的抗稻瘟病基因Pi25编码区。
[0012] 本发明的另一个目的是提供上述抗稻瘟病基因所编码的蛋白质氨基酸序列。
[0013] 本发明的另一个目的是提供用于扩增上述抗稻瘟病基因的特异性引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，其核苷酸序列分别为GGGGTACCCCATCGGCAGTGTAGCGTTTTT和GCTCTAGAGCGCAATCGTGGAACAGGAAT。
[0014] 本发明的另一个目的是提供上述含有上述抗稻瘟病基因的载体p1300-3.3，其在修饰后的质粒pCAMBIA1300中包含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。
[0015] 本发明涉及分离和应用一种包含Pi25基因编码区的DNA片段，该片段由引物1(SEQ ID NO：3)和引物2(SEQ ID NO：4)通过PCR扩增得到。该片段赋予植物对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea)所引起的病害产生特异性(专化性)的抗病反应。这一发明适用于对所有对该病原菌敏感的植物。这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。该DNA序列编码一种NBS-LRR类蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所列，结构如图6所示。
[0016] 本发明所分离、克隆的Pi25抗性基因编码NBS-LRR蛋白。这种蛋白包含两个主要的结构域：NBS和LRR区域，其中NBS结构域含有保守的激酶1a(kinase 1a)：GMGGIGKT，激酶2(kinase 2)：YLENKRYVLVLDDVW和激酶3a(kinase 3a)：GRIILTSRNYDV。而该蛋白的C-末端为5个典型LRR重复，其亮氨酸含量为19.2％。
[0017] 根据本发明提供的Pi25基因编码区序列信息(SEQ ID NO：1)，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与Pi25等同的基因：(1)通过数据库检索获得；(2)以Pi25基因编码区片段为探针筛选水稻或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据Pi25基因编码区序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在Pi25基因编码区序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。
[0018] 本发明提供的稻瘟病抗性基因Pi25具有重要的应用价值。将所述的Pi25基因编码区序列连接到烟草花叶病毒35S启动子下，用农杆菌转化方法将Pi25抗病基因导入粳稻品种日本晴，可获得表达所述基因的转基因抗病品种，从而应用于生产。
[0019] 本发明具有如下有益效果：将Pi25基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用杂交和转化方法在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中连锁累赘问题，并且可以缩短育种时间，提高品种选育效率；抗病基因的克隆是解决传统育种中种间基因转移存在障碍的基础。
附图说明
[0020] 图1为水稻抗稻瘟病基因Pi25的遗传和物理图谱；
[0021] 图2为Pi25引物从抗感亲本DNA里扩增出的目的片段琼脂糖凝胶电泳图；
[0022] 其中：M1：500ng 1kb plus DNA ladder(Invitrogen)，
[0023] M2：300ng DL2,000DNA marker(Takara)。
[0024] 图3为p1300-3.3载体结构图；
[0025] 图4为水稻稻瘟病抗性基因Pi25的部分转化体的选择标记潮霉素基因的PCR验证图；
[0026] 其中，M：100bp分子量标记(Toyobo，Lot No：53240A3)，200ng；
[0027] 1：谷梅2号；2：日本晴；3-21分别表示19个以粳稻品种日本晴为背景的转基因单株。(潮霉素基因分子标记的扩增片段为760bp。)
[0028] 图5为水稻稻瘟病抗性基因Pi25转化植株的稻瘟病抗性鉴定图；
[0029] 其中，1：日本晴；2：丽江新团黑谷；3：谷梅2号；4-22分别表示19个以日本晴为背景的转基因单株。R代表抗病，S代表感病。
[0030] 图6为水稻稻瘟病抗性基因Pi 25编码的氨基酸序列结构图；
[0031] 其中，带单下划线字母为组成推定NBS的3个保守区域；带双下划线字母反映了Pi25抗感等位基因间蛋白序列的差别，第259，815，856，894和896个位置的氨基酸残基在抗病等位基因里为Val，Phe，His，Val和Arg，而在感病等位基因分别为Ile，Tyr，Asp，Ile和Gln；下部分独立列出的氨基酸残基为C-末端LRR区域。
具体实施方式
[0032] 实施例1：水稻稻瘟病抗性基因Pi25的遗传分析及初步定位
[0033] 首先，为了发掘和鉴定稻瘟病新抗性基因，对籼稻抗病品种谷梅2号与籼稻感病品种中156配制杂交组合，采用单粒传法构建了304个单株组成的重组自交系，利用该重组自交系群体对谷梅2号的稻瘟病抗性遗传进行了深入的研究，鉴定和定位了Pi24，Pi25，gmPi26和Pib 四个稻瘟病抗性主基因和十多个QTL。Pi25是一个苗叶瘟和穗瘟兼抗的基因，位于水稻第6染色体上。(如图1所示)
[0034] 实施例2：稻瘟病新抗性基因Pi25的精细定位
[0035] 本发明利用了图位克隆和生物信息学方法克隆抗性基因Pi25的编码区。为精细定位该主效基因，从中156/谷梅2号重组自交系群体中挑选两个株系G19(抗病)和G153(感病)构建了一个新的重组自交系(含1384个株系)对Pi25进行精细定位，确定Pi25定位于标记RG456和A7之间。利用生物信息学方法得知RG456和A7之间存在8个重叠细菌人工染色体(BAC)克隆，共有132个候选基因，其中1个具NB-ARC结构抗性相关基因位于BAC克隆AP004325上，因此将位于AP004325上该抗性相关基因确定为候选基因。(图1)
[0036] 实施例3：稻瘟病新抗性基因Pi25候选基因编码区的分离及序列分析[0037] 为了分离出Pi25的候选基因，利用日本晴的参考序列，通过PRIME3(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)在线引物设计软件设计候选基因特异性引物，通过高保真Taq酶(Invitrogen)用PCR方法将候选基因分离出；PCR扩增产物经纯化后连接到pGEM-Teasy载体(Promega，CA：A1380)，并转化入大肠杆菌JM109(Promega，CA：A1380)中保存；连接产物经酶切验证的阳性质粒送往英俊公司(Invitrogen)测序。序列经基因预测软件GENSCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)对目的基因区域进行了基因预测及注释分析，初步确定了Pi25是一个编码NBS-LRR类抗病蛋白的抗病基因。Pi25通过基因功能互补实验确认其功能。
[0038] 一、PCR扩增：
[0039] 为了分离出Pi25的候选基因，利用日本晴的参考序列，通过PRIME3(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)在线引物设计软件设计候选基因特异性引物，其中引物序列为：
[0040] Pi25F：5’-ggggtaccccatcggcagtgtagcgttttt-3’(SEQ ID NO：3)；
[0041] Pi25R：5’-gctctagagcgcaatcgtggaacaggaatc-3’(SEQ ID NO：4)。
[0042] 通过高保真Taq酶用PCR方法以抗病亲本谷梅2号DNA为模板扩增了一个含Pi25候选基因编码区的3.3kb的片段，PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。
[0043] 1反应体系如下：
[0044] 5μl 10×PCR 缓 冲 液 (Invitrogen，CA11304-011)/50μl；10μM dNTP( 鼎国 DH114-3)/50μl；2μl 50mM MgSO4(Invitrogen，CA11304-011)/50μl；1μl10μM Pi25F/50μl；1μl10μM Pi25R/50μl；1单 位 Taq DNA聚 合 酶 (Invitrogen，CA11304-011)/10μl；2μl DNA/50μl。
[0045] 2温度循环条件如下：
[0046] 反应条件：94℃2分钟；94℃30秒、55℃30秒、68℃7分钟，39个循环；68℃15分钟；4℃10分钟。
[0047] 二、PCR产物回收与纯化：
[0048] PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TBE，当电泳指示剂溴酚蓝TM迁移至足够分离DNA片段时(100V，60min)，关闭电源。取下凝胶，用2×Gel red (Biotium，cat：41003-0.5ml)染色30分钟后，应用凝胶图象分析系统Bio-red Universal Hood II(Bio-red，Cat：76S/08184)记录结果，电泳图如图2所示。在紫外灯下割取含目的片段凝胶，用胶回收试剂盒回收DNA片段(QIAGEN，CA28704)。
[0049] 三、候选基因连接转化：
[0050] 纯化后的DNA片段以T4连接酶连接到pGEM-Teasy(Promega，CA：A1380)上，转化到大肠杆菌JM109(Promega，CA：A1380)。
[0051] 四、酶切验证与测序：
[0052] 转化后阳性克隆质粒经限制性内切酶EcoRI酶切验证后，该质粒送往Invitrogen公司测序。
[0053] 实施例4：稻瘟病新抗性基因Pi25的转化与转化体的抗性鉴定
[0054] 取用于测序的相同质粒和修饰后的pCAMBIA1300载体以限制性内切酶KpnI和XbaI(Takara)酶切4小时，再以T4连接酶将3.3kb的候选基因片段连接到克隆载体上，形成含Pi25基因编码区的新载体p1300-3.3(如图3)；转化到农杆菌EHA105，以农杆菌介导法转化日本晴植株。所得To代转基因植株，以潮霉素分子标记检测。PCR检测方法同上，其中潮霉素分子标记引物序列为：
[0055] hygF：5’-GGAGCATATACGCCCGGAGT-3’(SEQ ID NO：5)，
[0056] hygR：5’-GTTTATCGGCACTTTGCATCG-3’(SEQ ID NO：6)。
[0057] 反应体系为：5μl10×PCR缓冲液(鼎国DH332-1)/10μl；10μM上游引物/50μl；10μM下游引物/50μl；0.5单位Taq DNA聚合酶(鼎国DH332-1)/10μl；1μl DNA/10μl。反应条件：94℃2分钟；94℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；4℃10分钟。接通电极，在100V恒定电压下电泳，当溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段TM时(60min)，关闭电源。取下凝胶，用2×Gel red (Biotium，cat：41003-0.5ml)染色30分钟后，应用凝胶图象分析系统Bio-red Universal Hood II(Bio-red，Cat：76S/08184)记录结果，如图4所示。
[0058] 同时，对19个转基因植株和抗病亲本谷梅2号，转基因空白对照日本晴进行稻瘟病抗性表型鉴定。用稻瘟病小种js001-20-1-1进行苗期注射接种，以丽江新团黑谷为感病对照，接种7天后调查转基因植株的稻瘟病发病情况。抗性鉴定结果显示抗性基因Pi25在感病品种日本晴遗传背景下表现了与抗性亲本谷梅2号相同的抗性，表明抗性基因Pi25编码区具备生物学功能，表现为对稻瘟病抗性。(如图5所示)。
[0059] 实施例5：Pi25基因的结构
[0060] Pi25基因编码区DNA长度为2775kb，编码区不含内含子，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
[0061] 实施例6：Pi 25抗性蛋白的结构
[0062] Pi 25基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其结构如图6所示。抗性基因Pi25编码1个由924个氨基酸残基组成的蛋白多肽，分子量为150KD，等电点为
8.79。利用COIL分析表明该蛋白多肽的第123and 137个氨基酸残基为CC(coil-coil)结构域。Pi 25蛋白属于NBS-LRR蛋白，NBS结构域中保守的kinase 1a(GMGGIGKT)位于该多肽的第202-209个氨基酸残基；kinase 2(YLENKRYVLVLDDVW)位于该多肽的第276-290个氨基酸残基；kinase 3a(GRIILTSRNYDV)位于该多肽的第308-319个氨基酸残基。而该蛋白的C-末端的580-876个氨基酸残基为5个LRR重复，其亮氨酸含量为19.2％。
8.79。利用COIL分析表明该蛋白多肽的第123and 137个氨基酸残基为CC(coil-coil)结构域。Pi 25蛋白属于NBS-LRR蛋白，NBS结构域中保守的kinase 1a(GMGGIGKT)位于该多肽的第202-209个氨基酸残基；kinase 2(YLENKRYVLVLDDVW)位于该多肽的第276-290个氨基酸残基；kinase 3a(GRIILTSRNYDV)位于该多肽的第308-319个氨基酸残基。而该蛋白的C-末端的580-876个氨基酸残基为5个LRR重复，其亮氨酸含量为19.2％。
[0063] 数据库比较分析发现编码Pi25蛋白的核苷酸序列与其它水稻稻瘟病抗性基因hPi2，Pi9，Pi z-t，Pi-ta，Pi b，Pi-k，Pi36和Pi 37不同源。
[0064] 实施例7：转化Pi25基因产生的抗性品种的应用
[0065] 将含Pi25基因编码区的载体p1300-3.3导入农杆菌菌株EHA105中，用于转化感病的水稻品种日本晴，获得了13株具稻瘟病抗性的转化植株。利用这些抗性植株可以直接筛选含该基因并抗稻瘟病的改良日本晴种质，也可以利用有性杂交转移抗性转化体中的Pi25基因来改良其他优良但抗性不佳的粳稻品种；还可以利用有性杂交改良优质早籼稻的稻瘟病抗性。