针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫组合物

摘要

本发明公开了一种针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫组合物，含有成分：1)血清群A脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；2)血清群W135脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；3)血清群Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；以及4)血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第二载体蛋白的偶联物；其中所述第二载体蛋白为血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性蛋白或其免疫原性片段。该免疫组合物还可进一步含有脂质体作为免疫佐剂。本发明还公开了制备上述免疫组合物的方法。

权利要求

1.一种针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫组合物，其含有下述成分：(1)血清群A脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；

(2)血清群W135脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；

(3)血清群Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；以及(4)血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第二载体蛋白的偶联物；

其中，所述第一载体蛋白选自白喉类毒素突变体、破伤风类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST以及来源于铜绿假单胞杆菌的外毒素A；

所述第二载体蛋白为血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性蛋白或其免疫原性片段；

所述血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性蛋白为外膜蛋白，并且所述外膜蛋白选自I类、II类和IV类外膜蛋白；其中I类外膜蛋白分子量为40～42KD，II类为38～40kD，IV类为33～36KD。

2.权利要求1所述的免疫组合物，其中所述第一载体蛋白为白喉类毒素突变体CRM197。

3.权利要求1所述的免疫组合物，其中每单位制剂中，所述血清群A、C、W135、Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖在所述免疫组合物中的多糖含量分别为20～50μg，所述第一载体蛋白在所述免疫组合物中的含量为5～20μg，所述第二载体蛋白在所述免疫组合物中的含量为10～20μg。

4.权利要求1所述的免疫组合物，其中进一步含有脂质体作为免疫佐剂。

5.权利要求4所述的免疫组合物，其中所述脂质体分别与下述物质混合：(1)血清群A脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；

(2)血清群W135脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；

(3)血清群Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；以及(4)血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第二载体蛋白的偶联物；

所述第二载体蛋白为血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性蛋白或其免疫原性片段，所述脂质体粒径为50～5000nm，每单位制剂中，所含的脂质体为8～12mg。

6.制备权利要求2所述的免疫组合物的方法，包括下述步骤：(1)从血清群A、C、W135和Y脑膜炎奈瑟氏球菌中分别提取和纯化荚膜多糖；

(2)从血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌中提取外膜蛋白作为免疫原性蛋白；

(3)将所述血清群A、W135和Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖分别与白喉类毒素突变体CRM197偶联，获得血清群A、W135和Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；

(4)将所述血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与步骤2)所述的免疫原性蛋白偶联，获得血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性蛋白的偶联物；

(5)混合步骤3)和4)获得的偶联物，获得所述免疫组合物。

7.权利要求6所述的方法，其中步骤3)中所述荚膜多糖与白喉类毒素突变体CRM197偶联时的重量比为1∶1，偶联后用Sepharose CL-4B柱层析与超滤浓缩的方法纯化偶联物。

8.权利要求6所述的方法，其中进一步包括制备脂质体并与步骤3)和4)获得的偶联物混合的步骤。

说明书

针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及生物预防医药领域，具体涉及针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫组合物。

背景技术

[0002] 基 于 生 物 的 荚 膜 多 糖，已 经 鉴 定 到 12种 脑 膜 炎 奈 瑟 氏 球 菌(Neisseriameningitidis，Nm)血清群(A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。血清群A是非洲萨哈拉以南地区流行性疾病最常见的病原体。血清群B和C引起美国和大多数发达国家的大多数病例。血清群W135和Y引起美国和发达国家的其它病例。

[0003] 目前，已经公开了多种针对脑膜炎奈瑟氏球菌的疫苗。基于血清群C多糖的脑膜炎球菌缀合疫苗，可引起针对血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌株系上存在的荚膜多糖的强功能抗体应答，但这种荚膜仅能够防止由血清型C细菌引起的疾病。另外，虽然国际市场上出现了针对血清群B的疫苗，但是效果并不理想；由血清群A、C、Y和W135的荚膜多糖制备的四价疫苗也有报导，但这种联合疫苗仅对青少年和成人有效，由于多糖是不依赖于T细胞的抗原，其诱导的弱免疫应答不能加强，因此它诱导的免疫应答弱、保护时间短，不能用于婴儿(Armand.J.Biol.Stand[J].1982，10：335-339；Cadoz.Vaccine[J].1985，3：340-342；MMWR.46(RR-5)[J].1997：1-10)。这种疫苗中的多糖不是偶联的(Baklaic.Infect.Immun[J].1983，42：599-604)。

[0004] CN1507916A公开了一种包含NmC寡糖和NmB外膜蛋白以及其他蛋白质或免疫原性片段的免疫组合物，该免疫组合物引发针对NmC和NmB血清群的免疫应答，其中NmC寡糖与NmB外膜蛋白是简单的物理混合。

[0005] 血清群C的偶联疫苗已批准用于人类，其中包括MenjugateTM、MeningitecTM和NeisVac-CTM。血清群A+C的偶联物(conjjugate)的混合物已有报导(Costantino.Vaccine[J].1992，10：691-698；Lieberman.JAMA[J].1996，275：1499-1503)，并且血清群A+C+W135+Y的偶联物的混合物，如 (MenACWY-CRM)、MENCEVAX(MenACWY-TT)也已经进入临床研究阶段(Rennels.Pediatr Infect Dis J[J].2002，21：978-979；Campbell.J InfectDis[J].2002，186，1848-1851)。

[0006] CN1976716A公开了用于抵御脑膜炎奈瑟氏球菌引起的疾病的组合物，包含四种脑膜炎血清型A、C、W135和Y中至少两种的偶联物，此外还公开了将上述一种或多种血清型多糖偶联至CRM197蛋白上的方法，包括利用多糖衍生物与CRM197的偶联时的比例为13∶1(即多糖过量)，使用NH4Cl中止偶联反应及使用超滤4h的方式除去为偶联的载体蛋白；整个过程总共耗时接近28小时。

[0007] 尽管脑膜炎球菌偶联物已为人熟知，但它们都还不适用于儿科免疫接种计划。若要将偶联的疫苗加入现有免疫接种计划，必须解决载体诱导的表位抑制(或者通常称为“载体抑制”)，尤其是载体初免(priming)造成的抑制。“载体抑制”是一种由于用载体蛋白预先免疫动物从而阻止随后引起针对该载体上呈递的新抗原表位的免疫应答而造成的现象(Herzenberg.Nature[J].1980，285：664-667)。给予的脑膜炎球菌偶联物为多价混合物时，载体抑制的可能性更大。

[0008] CN101163508A公开了一种免疫患者的方法，并试图采用多种载体蛋白来解决“载体抑制”的现象，该方法包括给患者施予多种脑膜炎球菌荚膜糖的偶联物，其中所述各偶联物含有破伤风类毒素载体蛋白和荚膜糖，患者首先已经用破伤风类毒素预先免疫过。总的来说，现有的基于脑膜炎球菌偶联物的免疫组合物对幼儿的用途有限，而且不能为成人提供长时间的保护，因此需要一种针对多种脑膜炎奈瑟氏球菌血清群，能够对接种疫苗的人群产生光谱、长效保护作用的联合疫苗。

发明内容

[0009] 本发明的目的是提供包含两种载体蛋白，针对多种脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫组合物，用于制备多种脑膜炎奈瑟氏球菌相关疾病的疫苗。

[0010] 本发明还提供制备上述免疫组合物的方法。

[0011] 根据本发明的一个方面，提供的免疫组合物含有以下成分：

[0012] (1)血清群A脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；

[0013] (2)血清群W135脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联及[0014] (4)血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第二载体蛋白的偶联物；

[0015] 所述第二载体蛋白为血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性蛋白或其免疫原性片段。

[0016] 所述第一载体蛋白选自白喉类毒素突变体、破伤风类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST以及来源于铜绿假单胞杆菌的外毒素A。优选地，所述第一载体蛋白为白喉类毒素突变体CRM197。在一种实施方式中，所述白喉毒素突变体可以纯化自白喉棒杆菌(Corynebacteria diphtheriae)培养物，并利用甲醛化学去毒后作为载体蛋白使用。

[0017] 所述第一载体蛋白还可以是细菌外膜蛋白，例如外膜复合体C(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素(pneumolysis)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)或肺炎球菌粘附素蛋白(PsaA)。其他蛋白质如卵清蛋白、匙孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白或纯化的结核菌素蛋白质衍生物(PPD)也可以作为载体蛋白使用。本发明的载体蛋白优选为无毒、无反应原性，并且可得到足够的量和纯度，并且易于接受标准连接程序的处理。

[0018] 所述血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性蛋白为外膜蛋白，该外膜蛋白主要为I、II、或IV类外膜蛋白，其中I类外膜蛋白分子量约为40～42KD，II类为38～40kD，IV类为33～36KD。

[0019] 所述免疫组合物的每单位制剂中，血清群A、C、W135、Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖在所述免疫组合物中的多糖含量分别为20～50ug，所述第一载体蛋白在所述免疫组合物中的含量为5～20ug，所述第二载体蛋白在所述免疫组合物中的含量为10～20ug。

[0020] 本发明的免疫组合物还可进一步含有脂质体作为免疫佐剂。

[0021] 脂质体为一种生物膜双分子层囊性微球，由水相中脂质双层疏水区的脂肪链通过疏水键相互聚集自行收缩排列而形成，在其形成过程中可包裹水溶性成分获得颗粒形态，被包裹的内容物可以受到脂质体膜的保护。水溶性抗原包被于脂质体中可借助脂质体的传递被直接送达抗原提呈细胞的胞质中，脂质体膜基质及附加的修饰成分还可以直接活化免疫细胞的信号传递系统。在脂质体膜的保护下，抗原分子可以不受体液成分的破坏，脂质体类疫苗可用于多种黏膜途径的免疫接种。通过选择脂质体膜基质组分及对脂质体膜加以修饰，还可以基质及附加的修饰成分还可以直接活化免疫细胞的信号传递系统。在脂质体膜的保护下，抗原分子可以不受体液成分的破坏，脂质体类疫苗可用于多种黏膜途径的免疫接种。通过选择脂质体膜基质组分及对脂质体膜加以修饰，还可以选择所诱导的免疫反应的类型。淋巴结树突状细胞和组织巨噬细胞都能够吞噬脂质体，在这些细胞内抗原经过加I表达于I型主要组织相容性分子(MHC功，激发免疫反应，诱导特异性T细胞和细胞毒性T细胞免疫。因而，脂质体可用作疫苗的传递载体和免疫佐剂。

[0022] 在一种实施方式中，可以将脂质体分别与下述物质混合：

[0023] (1)血清群A脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；

[0024] (2)血清群W135脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；

[0025] (3)血清群Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；以及[0026] (4)血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第二载体蛋白的偶联物；

[0027] 所述第二载体蛋白为血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性蛋白或其免疫原性片段，所述脂质体球径为50～5000nm，优选地为100～1500nm；平均粒径在300～800nm之间。每单位制剂中，所用的脂质体为8～12mg，优选为9～10mg。

[0028] 所述脂质体是由磷脂、非磷脂、固醇类及它们的衍生物和膜材组成。通常用于制备脂质体的有卵磷脂、豆磷脂，磷脂酰乙醇胺、胆固醇、脑磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇乙酰、牛胆酸钠、蛋磷脂酰胆碱、二棕榈酰-DL-a磷脂酰胆碱、磷脂酰丝胺酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鲸蜡磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、硬脂酰胺、二氧乙烯十六烷基醚和四氧乙烯十二烷基醚等，均可用于本发明。

[0029] 所述膜材包括但不限于胆固醇、十八胺、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸等。胆固醇可以调节双分子层流动性、通透性等，十八胺、磷脂酸等可以改变脂质体表面电荷性质。

[0030] 根据本发明的另一方面，提供一种制备上述针对脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫组合物的方法，包括下述步骤：

[0031] (1)从血清群A、C、W135和Y脑膜炎奈瑟氏球菌中分别提取和纯化荚膜多糖；

[0032] (2)从血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌中提取外膜蛋白作为免疫原性蛋白；

[0033] (3)将所述血清群A、W135和Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖分别与白喉类毒素突变体CRM197偶联，获得血清群A、W135和Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白的偶联物；

[0034] (4)将所述血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与步骤2)所述的免疫原性蛋白偶联，获得血清群C脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性蛋白的偶联物；

[0035] (5)混合步骤3)和4)获得的偶联物，获得所述免疫组合物。

[0036] 其中步骤3)中所述荚膜多糖与白喉类毒素突变体CRM197的偶联时的重量比为1∶1，偶联后用Sepharose CL-4B柱层析与超滤浓缩的方法纯化偶联物。

[0037] 所述方法可以进一步包括制备脂质体并与步骤3)和4)获得的偶联物混合的步骤。

[0038] 可以理解的是，脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与载体蛋白质偶联可以使用本领域常规使用的多糖和蛋白偶联技术。当脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与载体蛋白质偶联后，还可以选择利用多种技术对多糖-蛋白质偶联物进行纯化(这种纯化是就多糖-蛋白质偶联复合物的量而言)。纯化步骤的一个目的是从多糖-蛋白质偶联物中去除未结合的多糖。例如，可以参考美国专利6,146,902描述的在硫酸铵存在下进行超滤的纯化方法；或者，可以通过任意数目的标准技术从未反应的蛋白质和多糖中将缀合物纯化出来，所述标准技术包括大小排阻层析、密度梯度离心、疏水相互作用层析或硫酸铵分级分离等。

[0039] 此外，脂质体的制备工艺是本领域的技术人员所熟知的，其基本原理都是将油性材料与水性材料经过适当处理后形成油包水的制剂，但包裹物质的性质可能具有较大的差别，如化学合成物质，有机物质；生物物质如蛋白、多肽及核酸等。后者在处理过程中较易受到制备条件的影响，如温度、时间、振荡及酸碱度等因素的影响。常规的脂质体制备方法，包括薄膜法、逆相蒸发法、加压挤出法、熔融法及冻干水化法或它们的改进均可用于制备本发明的免疫组合物。

[0040] 本发明的免疫组合物可制成注射剂，例如液体溶液或混悬液，通过肌肉注射或皮下给药的方式给药。

[0041] 2、本发明的制备免疫组合物的方法中，血清群A、W135和Y脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖与第一载体蛋白偶联时重量比约为1∶1，同时使用SepharoseCL-4B柱层析与超滤浓缩的方法纯化偶联物，整个过程只需要14个小时。与现有技术如专利申请CN 1976716A公开的将一种或多种血清型脑膜炎奈瑟氏球菌多糖偶联至CRM197蛋白的方法相比，本发明的方法成本降低，并使得工作周期缩短，工作效率得到明显提高。

[0042] 3、将NmC的荚膜多糖设法与NmB的抗原蛋白进行偶联，从而使得偶联得到的蛋白多糖结合物同时具备抗NmB与NmC的能力。NmB的抗原蛋白与Nmc荚膜多糖是以共价键偶联的方式结合，比现有技术如CN1507916A、CN101163508A中记载的两种抗原的简单混合，具有更高的杀菌滴定作用，灭菌效果更强。

[0043] 4、利用脂质体作为佐剂。Stephen J等人用脂质体包裹NmB的1类外膜蛋白进行免疫小鼠，揭示脂质体膜内外的亲水性特点有利于抗原蛋白的自动折叠，以暴露出天然的抗原决定族位点，有利用抗体的产生(Micro Pathogenesis 1996；21；499-512)；而IIona Idanpaan-Heikkila等的研究则揭示脂质体作为佐剂，通过巨噬体的介导作用，有利于将抗原同时传递给T细胞及B细胞，同时启动细胞免疫及体液免疫(Vaccine，Vol.13.No.16pp1501-1508，1995)；本发明将脂质体与NmA、NmB、NmC、NmY、NmW抗原物质混合，使疫苗的免疫效果明显增强。与明矾相比，脂质体作为佐剂对NmA和NmY的免疫增强显而易见，尤其增强针对NmB的抗性作用。

具体实施方式

[0044] 为了更好地理解本发明的技术方案和有益效果，下面结合具体的实施例对本发明做进一步阐述。

[0045] 脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis，Nm)菌株购自中国医学细菌保藏中心(CMCC)，其菌株号为CMCC(B)29201A4株，CMCC(B)29205C11株，CMCC(B)29356B4株，CMCC(B)29201B15株，CMCC(B)29037W135株，CMCC(B)29028Y4株。

[0046] 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，氯化钙(CaCl2)，1.6-己二酰肼(ADH)、碳二亚胺(EDAC)、NaCl、HCl、胆固醇、蛋黄卵磷脂、购自Sigma公司；溴藏中心(CMCC)，其菌株号为CMCC(B)29201A4 株，CMCC(B)29205C11 株，CMCC(B)29356B4 株，CMCC(B)29201B15 株，CMCC(B)29037W135株，CMCC(B)29028Y4株。

[0047] 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，氯化钙(CaCl2)，1.6-己二酰肼(ADH)、碳二亚胺(EDAC)、NaCl、HCl、胆固醇、蛋黄卵磷脂、购自Sigma公司；溴化氰(CNBr)购自Fluca公司；Sepharose 4F.F(2.6cm×90.0cm)，Sepharose CL-4B(1.6cm×90.0cm)色谱柱，购自GE公司。

[0048] 实施例1A/C/W/Y菌体荚膜多糖的制备

[0049] 1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、Y群脑膜炎球菌29028菌株、W135群脑膜炎球菌29037菌株，接种于含10％羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25℃不生长。于35～37℃二氧化碳的环境中培养16～20h，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中显现均匀混悬液。染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。

[0050] 2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。

[0051] 3、将已杀菌的培养液(单批或多批混合)8000rpm离心5min后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的终浓度为1％，充分混匀，形成沉淀；8000rpm离心10min后收集沉淀物，在沉淀物中加入氯化钙(CaCl2)溶液，其其终浓度为1mol/L，使多糖CTAB解离，加入乙醇至最终浓度为25％，2～8℃静置24h，离心去除核酸沉淀，收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80％(v/v)，充分振摇，10000rpm离心10min收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次，得到的沉淀物即为粗制的多糖组分。

[0052] 4、多糖纯化及内毒素去除

[0053] 将粗制的A群、C群多糖以38000r/min的超速离心4h后收集上清，然后再以0.22um的膜除菌过滤后即为无菌多糖原液。

[0054] 将W135，Y群的粗制多糖溶液先以38000rpm超速离心4h后收集上清，经0.45um的膜澄清过滤后，进行在经过SepharoseCL-4B(1.6cm×100cm)进一步纯化。收集洗脱出的第一个峰的所有液体，后经过0.22um膜除菌过滤后即为多糖原液。

[0055] 5、分装及冷冻干燥

[0056] 将检定合格的A/C/W/Y群脑膜炎球菌多糖原液分装后迅速进行冷冻、真空干燥，于2～8℃储存待用。参照《中国药典》(2010版III部)对四种多糖进行质量检测，在对多糖的含量的测定时，对血清型A的荚膜多糖通过磷含量的测定，对血清型C、W135、Y的荚膜多糖通过唾液酸含量的测定，其结果如下表1所示。

[0057] 表1：

[0058]

[0059] 实施例2NmB免疫原性蛋白的获得

[0060] 1、菌体培养与收集

[0061] 将-70℃冻存的三株菌种分别接种于10％羊血固体斜面培养基，于35±1℃恒温、8％CO2孵育箱中培养约21h后，取样，做革兰氏染色，镜检观察菌体形态并检测有无杂菌生长，然后传代接种至10％羊血克氏瓶固体培养基中，继续培养约14h后，取样，做革兰氏染色，镜检观察菌体形态并检测有无杂菌生长，然后转种至5000ml 1％胎牛血清的胰蛋白大豆肉汤液体培养基中，35±1℃恒温培养，在培养过程中从第4h开始，每隔2h取少量菌液以目视比浊法检测细菌菌液浓度，同时用pH计监控培养基pH值变化，当pH值下降时用4M的NaOH调至pH 7.4。当细菌菌液浓度不再上升时即停止培养，收获菌液，这个培养过程的总时间约为10h。

[0062] 收集的菌液在用苯酚灭活以后，在4℃条件下以5000×g离心30min，弃上清，将沉淀用PBS缓冲液重悬浮，再在相同条件下离心，重复操作程序三次，将菌体沉淀充分洗涤后，然后加少许的缓冲液悬浮菌体沉淀，并将菌悬液存于小玻璃瓶中，密闭，-20℃冻存，备用。

[0063] 2、提取外膜蛋白

[0064] 1)准备菌体：取-20℃冻存的菌体(29356株)，于4℃条件下解冻，并在4℃、5000×g离心30min，弃上清。

[0065] 2)溶解外膜蛋白：按1g湿菌体对应10ml的0.01M、pH7.2的PBS的比例，称取适量湿菌体并加入相应体积的缓冲液，在4℃下用磁力搅拌器搅拌，转速约450rpm，搅拌15min，使菌体充分悬浮，然后在搅拌中缓慢加入sodiulndesoxycholate至菌悬液中使该物质浓度达到1.0％，再将转速调整至约300转/分，在4℃下搅拌约48h。

[0066] 3)离心：自4℃冷库中取出菌体悬液，4℃、10000rpm离心25min，收集离心后的上清液。

[0067] 4)沉淀蛋白：用80％硫酸按沉淀离心后的上清液，然后，经4℃、15000rpm离心25min，弃上清，并用少量0.01M、pH7.2的PBS缓冲液重新溶解沉淀。

[0068] 5)透析：将样品液装入透析袋中，在4℃下透析，磁力搅拌，每12h换液一次，共换液六次，透析液为0.01M、pH7.2的PBS。

[0069] 3、结果：

[0070] 提取的外膜蛋白为I、II、III类外膜蛋白复合物，其中I类外膜蛋白分子量约为41.5KD，II类为39kD，III类为34.5KD，三种蛋白占提取蛋白的95％以上，每10g湿菌体可以获得143.8mg的外膜蛋白复合物。按照《中国药典》(2010年III部)测定外膜蛋白的核酸含量、荚膜多糖残留含量、内毒素含量分别为0.639％、0.84％、2.16EU/mg蛋白。

[0071] 实施例3NmA、NmW135、NmY荚膜多糖与CRM197的偶联

[0072] 将多糖水溶液配置成5mg/ml的溶液，用NaOH调节pH至10.08，在23℃条件下按照多糖∶CNBr为1∶0.5(g/g)的比例，加入CNBr进行活化维持10min，然后用HCl调节pH值为9.0，按照多糖∶己二酰肼(ADH)为1∶3.5的比例加入ADH，再调节pH为8.5±0.2，在23±3℃反应15min，在2～8℃条件下搅拌至少12h，用生理盐水透析48h，用0.22um膜过滤，得到多糖-AH衍生物，将得到的该衍生物与CRM197等量混合，用HCl调节pH 5.7±0.2，按照多糖∶碳二亚胺(EDAC)为1∶9.5的比例加入EDAC，调节pH为5.7±0.2，在2～8℃反应120min，调节pH 6.9±0.2，得到的蛋白多糖结合物溶液用Sepharose CL-4B层析分离纯化，收集外水体积(V0)附近的洗脱组分，超滤浓缩后用0.22um膜除菌4℃保存。

[0073] CRM197是一种无毒白喉类毒素。各剂量宜为10ug寡糖对应9.5～33ugCRM197，即维持寡糖/蛋白质的比例约为0.3～1.05。更优选使用约20ugCRM197。

[0074] 对NmA、NmW135、NmY荚膜多糖分别与CRM197偶联的偶联物进行含量测量，结果如表2所示。

[0075] 表2：

[0076]多糖含量 蛋白含量 多糖/蛋白 O乙酰基
偶联物 偶联物Kd 得率
(ug/ml) (ug/ml) (g/g) (mmol/g)
MenA-CRM 358.35 494.75 0.72 2.82 0.050 50.43
MenW135-CRM 354.20 322.85 1.09 5.87 0.072 62.44
MenY-CRM 467.79 416.79 1.12 2.35 0.088 45.26

[0077] 实施例4NmC荚膜多糖与NmB免疫原性蛋白的偶联

[0078] 将C群脑膜炎球菌荚膜多糖稀释至4mg/ml，加入溴化氰(CNBr)活化多糖，20～30℃下作用1～1.5h，调节PH并维持pH为9～11，继而加入己二酰肼(ADH)，ADH与多糖的比例为2.5～5∶1，维持pH为8～10，反应30min，在2～8℃搅拌10～20h，透析去除小分子物质，取样测定CNBr残余量，ADH衍化率，合格之后，加入等量的NmB 外膜蛋白与多糖混合，加入碳二亚胺(EDAC)，EDAC与混合物的比例为15～25mg∶1ml 混合物，调节pH为5～7，在10～15℃反应1～1.5h，透析除去小分子物质，用300kD膜过滤浓缩，用Sepharose CL-4B柱层析纯化偶联化合物，除菌过滤。进行多糖，蛋白鉴别实验，内毒素含量，无菌实验等各项检测指标的实验，合格后放置于-20℃储存，作为疫苗原液待用。

[0079] 因实施例2的NmB外膜蛋白主要为I、II、IV类外膜蛋白复合物，因此NmC荚膜多糖和这些蛋白偶联后的蛋白多糖复合实际上为三种多糖蛋白偶联混合物，在进行质量检测时，由于三种复合物的没有必要分别进行各项目的检测也不影响检测结果，因此下表3的检测数据为混合物总体检测结果。

[0080] 表3：

[0081]多糖含量 蛋白含量 多糖/蛋白 O乙酰基
偶联物 偶联物Kd 总得率
(ug/ml) (ug/ml) (g/g) (mmol/g)
MenC-MenB 173.98 354.75 0.49 1.79 0.060 47.43％

[0082] 实施例5蛋白质-多糖偶联物与脂质体的混合(冻干水化法)

[0083] 1)将卵磷脂、胆固醇、硬脂胺以摩尔比7∶(1～5)∶(1～3)溶于有机溶媒(三氯甲烷)中，总质量为0.5g，置于旋转蒸发器中，除去有机溶媒，旋转蒸发形成磷脂膜；

[0084] 2)加入pH 7.2的磷酸缓冲液50ml，于40～60℃，超声10～20min，形成脂质体悬液；

[0085] 3)将脂质体悬液用高压匀浆机进行脂质体粉碎，均匀，使得脂质体颗粒粒径范围控制在300-800nm，加入冷冻保护剂，进行冷冻干燥；

[0086] 4)采用湿热法或钻照射等方法灭菌，得到冻干粉剂；

[0087] 5)将实施例3得到的A、W135、Y荚膜多糖与CRM197的偶联复合物与实施例4得到的NmC荚膜多糖与NmB免疫蛋白的复合物溶液进行混合，然后将得到的混合液与脂质体冻干粉剂混合，按照根据冻干粉剂的量，按照每10mg脂质体中加入1单位制剂所需的偶联复合物溶液；得到混合物；

[0088] 6)用水浴式超声波处理步骤5的混合物5min，得到均匀的乳白色溶液。

[0089] 7)将步骤4)获得的冻干粉针不加入免疫蛋白复合物溶液，仅仅加入pH7.2的磷酸缓冲液(脂质体浓度为10mg/ml)，用水浴式超声波处理5min，得到均匀的乳白色溶液为空白脂质体溶液。

[0090] 实施例6免疫效果的检测

[0091] 1、建立实验模型

[0092] 将105豚鼠随机分成7组，每组15只，分别接种如表4所示的各组免疫组合物，作为本发明的免疫组合物组1～7；将6只豚鼠随机分成2组，分别用上述空白脂质体，明矾接种，作为空白对照组8；对1-7组动物，每只动物接受2次i.m.注射，间隔时间为28天，分别在首次注射之前、第一次注射后21天、第2次注射后18天采集血清样品。每个剂量包括2次0.25ml i.m.注射。

[0093] 表4：各豚鼠组接种的免疫组合物

[0094]组别 成分 含量
1 NmC+NmB+明矾 10ug/20ug/1mg
2 NmC-NmB偶联物+明矾 10ug/20ug/1mg
3 NmC-NmB偶联物+脂质体 30ug/1ml
4 NmA偶联物+NmY偶联物+NmW135偶联物+明矾 10ug/10ug/10ug/1mg
5 NmA偶联物+NmY偶联物+NmW135偶联物+脂质体 10ug/10ug/10ug/1ml
6 NmA偶联物+NmY偶联物+NmW135偶联物+ 10ug/10ug/10ug/30ug/1mg
NmC-NmB偶联物+明矾
7 NmA偶联物+NmY偶联物+NmW135偶联物+ 10ug/10ug/10ug/30ug/1ml
NmC-NmB偶联物+脂质体
8 仅接种空白脂质体、或明矾

[0095] 2、测试杀菌滴定度

[0096] 用杀菌滴定度作为主要指标来分析各组样品针对各型菌体的免疫作用。杀菌滴定度的数据是由各动物血清的典型分析产生的，并以多次分析的平均值表示，测试结果如表5所示，分别显示各组免疫组合物针对相应的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群的免疫作用，其中第8组为接种脂质体或明矾的空白对照组，不含免疫蛋白，免疫后获得的血清均不存在杀菌能力，所以其杀菌滴度数据未显示出。

[0097] 杀菌滴定度：测试血清样品对MenC菌株60E和MenB菌株44/76的补体-介导的杀菌滴定度。用各组混合的血清进行杀菌滴定度试验。用人补体产生杀菌数据。

[0098] 将试验成分(即，缓冲液、抗体、补体和细菌)加到带有盖子的无菌96孔组织培养板(Nunc#167008)。在整个试验中将这些平板保持于室温。在每个孔中依次加入50ul Gey缓冲液(Giboo)(含有1％放射免疫分析级BSA(Sigma))、25ul稀释的测试抗体、25ul细菌(用Gey缓冲液含1％BSA以1∶8000稀释)。对照孔包括1)仅Gey缓冲液及1％BSA和细菌，用于确定在稀释液中生物是否存活；2)0时对照，含有75ul缓冲液、25ul热灭活(56℃，30min)的人补体和25ul细菌；3)毒性对照，测试与缓冲液和细菌一起的20％和40％补体，以验证补体源对测试菌株是无毒的。还用热灭活的补体测试所有抗体样品(用分析的最高浓度)，显示存在抗体时集落形成单位(cfu)的减少是补体依赖性的。

[0099] 在加入所有试剂后，从各对照孔取22ul样品，通过让样品从平板的顶部流到底部，将其接种到Mueller-Hinton琼脂平板上，来测定0min时孔中的cfu。然后覆盖此微量滴定板，用石蜡膜密封，并在37℃、4％ CO2培养箱中缓慢旋转1h。然后取出平板，将22ul各孔的样品接种到Mueller-Hinton琼脂上，于37℃、4％CO2条件下培育这些培养板约18h，计算集落数并确定各测试孔的存活率(％)：

[0100] 存活率％＝([第60min时样品孔的cfu]/[第0min时热灭活补体对照孔中的cfu])×100。记录的杀菌滴定度是那些存活率为50％的孔。

[0101] 3、结论

[0102] 组1-组3的结果表明，本发明的联合疫苗引发高滴定度的对NmB和NmC的血清杀菌抗体。与附录1比较可以看出，本发明以共价键偶联的方式，比两种抗原简单的混合有更高的杀菌滴定作用；而脂质体作为佐剂对增强免疫效果明显比明矾强，尤其是对于增强针对NmB的抗性作用。组4-组5的结果显示，与明矾相比，脂质体作为佐剂对NmA和NmY的免疫增强显而易见，但对于NmW135来说，并没有明显的优势。组6-组7的结果验证了组1-组5得出的上述结论。

[0103] 表5：各豚鼠组接种的杀菌滴定度结果

[0104]

[0105] 注：*第5组与第4组数据相比，p＝1.287＞0.05，**第5组与第4组数据相比，p＝0.345＞0.05。

[0106] 附录1：专利CN1507916A、CN101163508A报道的将NmC偶联物和NmB简单混合及免疫小鼠后的抗血清分别对NmC，NmB的杀菌滴度。

[0107]