排风藤生物碱提取物及其制备方法和用途

摘要

本发明提供了排风藤生物碱提取物，它是由排风藤弱碱性生物碱、排风藤叔胺生物碱、排风藤水溶性生物碱中的一种或其混合而成。本发明还提供了该提取物的制备方法和用途。本发明还提供了一种从排风藤生物碱中分离的化合物的用途。本发明药物药效明确，可控性强，具有明显的抗炎、保肝作用。

权利要求

1.一种排风藤弱碱性生物碱，其特征在于：它是由下述方法制备而成：干燥的排风藤全草，粉碎，加入2％H2SO4或4％盐酸浸提，浸提液过滤；滤液用氯仿萃取，氯仿层浓缩得弱碱性生物碱。

2.根据权利要求1所述的排风藤弱碱性生物碱，其特征在于：所述的排风藤弱碱性生物碱在2％H2SO4，2％酒石酸或4％盐酸的酸性条件下呈游离状态。

3.根据权利要求1或2所述的排风藤弱碱性生物碱，其特征在于：所述的排风藤来源于茄科植物千年不烂心Solanum cathayanum Wu et Huang的干燥全草。

4.一种制备权利要求1所述的排风藤弱碱性生物碱的方法，其特征在于：包括如下步骤：干燥的排风藤全草，粉碎，加入2％H2SO4或4％盐酸浸提，浸提液过滤；滤液用氯仿萃取，氯仿层浓缩得弱碱性生物碱。

5.权利要求1-3任意一项所述的排风藤生物碱在制备抗炎药物中的用途。

6.权利要求1-3任意一项所述的排风藤生物碱在制备保肝的药物中用途。

7.一种排风藤叔胺生物碱，其特征在于：它是由下述方法制备而成：干燥的排风藤全草，粉碎，加入2％H2SO4或4％盐酸浸提，浸提液过滤；滤液用氯仿萃取，酸水层用氨水调节pH9-10，继续以氯仿萃取，氯仿层浓缩得叔胺生物碱。

8.根据权利要求7所述的排风藤叔胺生物碱，其特征在于：排风藤叔胺生物碱在pH9-10条件下呈游离状态。

9.根据权利要求7或8所述的排风藤叔胺生物碱，其特征在于：所述的排风藤来源于茄科植物千年不烂心Solanum cathayanum Wu et Huang的干燥全草。

10.一种制备权利要求7-9任意一项所述的排风藤叔胺生物碱的方法，包括如下步骤：干燥的排风藤全草，粉碎，加入2％H2SO4或4％盐酸浸提，浸提液过滤；滤液用氯仿萃取，酸水层用氨水调节pH9-10，继续以氯仿萃取，氯仿层浓缩得叔胺生物碱。

11.权利要求7-9任意一项所述的排风藤生物碱在制备抗炎药物中的用途。

12.权利要求7-9任意一项所述的排风藤生物碱在制备保肝的药物中用途。

13.一种排风藤水溶性生物碱，其特征在于：它是由下述方法制备而成：干燥的排风藤全草，粉碎，加入2％H2SO4或4％盐酸浸提，浸提液过滤；滤液用氯仿萃取，得氯仿层和酸水层；酸水层用氨水调节pH9-10，继续以氯仿萃取，得氯仿层和碱水层；碱水层加氢氧化钠调节pH＞12，以正丁醇萃取，正丁醇层浓缩得水溶性生物碱。

14.根据权利要求13所述的排风藤水溶性生物碱，其特征在于：排风藤水溶性生物碱在pH＞12条件下呈游离状态。

15.根据权利要求13或14所述的排风藤水溶性生物碱，其特征在于：所述的排风藤来源于茄科植物千年不烂心Solanum cathayanum Wu et Huang的干燥全草。

16.一种制备权利要求13-15任意一项所述的排风藤水溶性生物碱的方法，其特征在于：它包括如下步骤：干燥的排风藤全草，粉碎，加入2％H2SO4或4％盐酸浸提，浸提液过滤；滤液用氯仿萃取，得氯仿层和酸水层；酸水层用氨水调节pH9-10，继续以氯仿萃取，得氯仿层和碱水层；碱水层加氢氧化钠调节pH＞12，以正丁醇萃取，正丁醇层浓缩得水溶性生物碱。

17.权利要求13-15任意一项所述的排风藤生物碱在制备抗炎药物中的用途。

18.权利要求13-15任意一项所述的排风藤生物碱在制备保肝的药物中用途。

19.排风藤叔胺生物碱化合物SCE-1在制备保肝的药物中的用途，所述的化合物是SCE-1，其结构式为：

20.根据权利要求19所述的用途，其特征在于：化合物SCE-1的提取纯化工艺如下：a、取排风藤，粉碎，酸水浸提，过滤，得滤液；

b、将滤液经氯仿萃取，取酸水层，加氨水调pH值9-10，再经氯仿萃取，取氯仿层，挥干，得生物碱粗膏；

c、将b步骤制备的生物碱粗膏经正相硅胶柱层析，以石油醚-丙酮梯度洗脱、Sephadex LH-20氯仿-甲醇柱层析分离以及HPLC纯化，乙腈-水洗脱，得到化合物SCE-1。

21.一种具有保肝作用的药物组合物，其特征在于：以权利要求1-3任一项所述的排风藤弱碱性生物碱、权利要求7-9任一项所述的排风藤叔胺生物碱或权利要求13-15任一项所述的排风藤水溶性生物碱为活性成分，并含有药学上可接受的辅料或辅助性成分。

22.根据权利要求21所述的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物的药剂是口服制剂或注射制剂。

说明书

排风藤生物碱提取物及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及排风藤生物碱提取物及其制备方法和用途，属药物领域。

背景技术

[0002] 排风藤Solanum cathayanum为茄科茄属植物，草本藤木，多分枝，长0.5～3m。茎、叶各部密被多节长柔毛。叶互生，多数为心脏形，叶色淡绿，背青黄，叶多数全缘不裂，少数3裂，浆果成熟时红色，花果期6-9月。生长于海拔200～1400m处山坡阴湿处及灌木丛中，产于三峡地区的巴东、长阳、秭归、兴山以及神农架，全国大部分地区均有分布(见中国科学院武汉植物研究所.湖北植物志[M].武汉：湖北科学技术出版社，2002：3.)。排风藤亦为长江三峡库区民间广为使用的民间中草药，药用全草，具有清热利湿、解毒消肿之功效。排风藤与红枣的混合煎剂对小鼠艾利虚腹水癌及梭形细胞肉瘤的实体形及腹水有抑制作用，醇提取物对小鼠肉瘤180有抑制作用(江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科技出版社，1977)。

[0003] 目前对排风藤的研究较少，如：排风藤化学成分研究/谢明霞周媛邹坤程凡刘蓉；三峡大学化学与生命科学学院天然产物研究与利用湖北省重点实验室//中药材.-2008，(9).排风藤中脂肪酸成分的气相色谱-质谱联用分析/庄朴伟邓林胜秦双玖宋发友逯平杰周媛；三峡大学化学与生命科学学院三峡大学化学与生命科学学院天然产物研究与利用湖北省重点实验室//时珍国医国药.-2008，(8)，只对其中的成分进行了相关的报道。

[0004] 目前尚无针对排风藤生物碱的相关报道。

发明内容

[0005] 本发明的技术方案是提供了排风藤生物碱提取物，本发明的另一技术方案是提供了该排风藤生物碱提取物的制备方法和用途。

[0006] 本发明提供了一种排风藤生物碱提取物，它是由排风藤弱碱性生物碱、排风藤叔胺生物碱、排风藤水溶性生物碱中的一种或两种以上混合，其重量配比为：

[0007] 排风藤弱碱性生物碱0-10份、排风藤叔胺生物碱0-10份、排风藤水溶性生物碱0-10份，其中排风藤弱碱性生物碱、排风藤叔胺生物碱、排风藤水溶性生物碱的重量不能同时为0。

[0008] 其中，所述的排风藤弱碱性生物碱在2％H2SO4，2％酒石酸或4％盐酸的酸性条件下呈游离状态、排风藤叔胺生物碱在pH9-10条件下呈游离状态、排风藤水溶性生物碱在pH＞12条件下呈游离状态。

[0009] 其中，所述的排风藤生物碱提取物的制备方法为：取排风藤，粉碎，酸水浸提，过滤，滤液，干燥，得排风藤生物碱。

[0010] 其中，所述的弱碱性生物碱是由上述的滤液经氯仿萃取，取氯仿层，挥干氯仿，得弱碱性生物碱；由氯仿萃取后的酸水层，加氨水调pH值9-10，再经氯仿萃取，取氯仿层，挥干，得叔胺生物碱；碱水层加NaOH调pH大于12，再用正丁醇萃取，取正丁醇层，萃取液挥干，得水溶性生物碱。

[0011] 所述的排风藤来源于茄科植物千年不烂心Solanum cathayanum Wu etHuang的干燥全草。

[0012] 其中，本发明还提供了一种制备所述的排风藤生物碱提取物的方法，包括如下步骤：

[0013] a、取排风藤，粉碎，酸水浸提，过滤，滤液，干燥，得排风藤生物碱；

[0014] b、将a步骤的滤液经氯仿萃取，取氯仿层，挥干氯仿，得弱碱性生物碱；由氯仿萃取后的酸水层，加氨水调pH值9-10，再经氯仿萃取，取氯仿层，挥干，得叔胺生物碱；碱水层加NaOH调pH大于12，再用正丁醇萃取，取正丁醇层，萃取液挥干，得水溶性生物碱。

[0015] 本发明提供了排风藤生物碱提取物在制备抗炎药物中的用途。

[0016] 本发明提供了排风藤生物碱提取物在制备保肝的药物中用途。

[0017] 本发明还提供了如式I所示的排风藤生物碱化合物在制备抗炎、保肝的药物中的用途，

[0018]

[0019] 式1

[0020] 其中R1为OH；R为：CH3、CH2CH3Ar、C5H11O6、CH2CH2OCH3。

[0021] 进一步优选地，所述的化合物是SCE-1，其结构式为：

[0022]

[0023] 其中，化合物SCE-1的提取纯化工艺如下：

[0024] a、取排风藤，粉碎，酸水浸提，过滤，得滤液；

[0025] b、将滤液经氯仿萃取，取酸水层，加氨水调pH值9-10，再经氯仿萃取，取氯仿层，挥干，得生物碱粗膏；

[0026] c、将b步骤制备的生物碱粗膏经正相硅胶柱层析，以石油醚-丙酮梯度洗脱、Sephadex LH-20(氯仿-甲醇)柱层析分离以及半制备HPLC纯化(乙腈-水)，得到化合物SCE-1。

[0027] 本发明还提供了一种具有保肝或抗炎的药物组合物，它是由有效量的上述化合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。

[0028] 其中，所述的制剂是口服制剂或注射制剂。

[0029] 化合物SCE-1为白色结晶性粉末，熔点202-203.8℃，UVλnmMeOH：205.4，228.8，1 13
297.2和345.8。分子式为C9H8N2O3，化学结构通过 H、C NMR和2D NMR(HSQC和HMBC)确证。该化合物通过对其成药性的预测可知该化合物其成药可能性为82.5％，可能的靶标为钾离子通道、NO合成酶、鸟苷酸环化酶。其ADMET预测结果为：水溶性：logSw＝-0.336(可溶)，肝毒性概率：0.37(无毒)，CYP450酶系2D6模型抑制可能概率：0.029(不抑制)，基于原子计算的脂水分配系数logP：-0.628，血浆蛋白结合水平：等级为2(较低)，RT3模型计算的大鼠口服LD50：5.5g/kg，95％置信区间下限：808.1mg/kg，95％置信区间上限：10g/kg，毒性非常小。初步药理实验结果也显示出了该化合物能显著抑制脂多糖刺激腹腔巨噬细胞产生NO作用，具有细胞保护作用，采用酶法测定其IC50为60μg/ml。并且该化合物还能显著降低离体培养中染毒肝细胞中的ALT水平，对四氯化碳诱导的肝细胞损伤具有与联苯双酯相当的保护作用。

[0030] 本发明排风藤生物碱提取物药效明确，可控性强，具有明显的抗炎、保肝作用，三类生物碱中，尤以排风藤叔胺生物碱的药效最佳。

附图说明

[0031] 图1本发明排风藤提取物的制备工艺流程图

[0032] 图2最大吸收波谱扫描图

[0033] 图3化合物SCE-1的提取分离工艺

[0034] 图4排风藤水溶性生物碱、叔胺生物碱、弱碱性生物碱对LPS刺激后巨噬细胞COX2表达的影响(其中，图4A阴性对照；图4B模型对照；图4C水溶性生物碱：浓度250μg/ml；图4D水溶性生物碱：浓度125μg/ml；图4G弱碱性生物碱：浓度250μg/ml；图4F弱碱性生物碱：浓度125μg/ml；图4I叔胺生物碱：浓度250μg/ml；图4J叔胺生物碱：浓度125μg/ml；图4M阿司匹林：浓度250μg/ml；图4N阿司匹林：浓度125μg/ml)

具体实施方式

[0035] 实施例1本发明排风藤弱碱性生物碱、叔胺生物碱、水溶性生物碱的制备方法及质量控制方法。

[0036] 1)制备方法

[0037] 干燥的排风藤全草，粉碎，加入2％H2SO4或4％盐酸浸提，浸提液过滤；滤液用氯仿萃取，氯仿层浓缩得弱碱性生物碱；酸水层用氨水调节pH9-10，继续以氯仿萃取，氯仿层浓缩得叔胺生物碱；碱水层加氢氧化钠调节pH＞12，以正丁醇萃取，正丁醇层浓缩得水溶性生物碱。制备工艺流程见图1。

[0038] 2)排风藤药材的质量检测方法

[0039] 以下面质量检测方法测定排风藤药材中生物碱(以化合物SCE-1计)质量占生药的百分比，应不少于0.25％。

[0040] 对照品溶液的制备准确称取化合物SCE-150.0mg，以无水乙醇溶解定容至10mL，制成每毫升含5mg SCE-1的溶液，作为对照品溶液。

[0041] 供试品溶液的制备准确称取干燥的排风藤全草粉末(过80目筛)10g，加100mL2％盐酸，于60℃超声1.5h，抽滤得提取液，重复三次，提取液合并，以氨水调节pH 9-10，加
200ml氯仿在40℃水浴超声30min萃取三次，萃取液合并，减压浓缩，所得浸膏用无水乙醇溶解转移至10ml容量瓶中定容，作为供试品溶液。

[0042] 溴甲酚绿试剂的配制

[0043] 称取溴甲酚绿0.125g，用12.5mL 0.2mol·L-1的NaOH溶解，加入2.55g邻苯二甲酸氢钾，以少量蒸馏水溶解，转移至250ml容量瓶中定容，备用。

[0044] 标准曲线的绘制与线性关系

[0045] 精密吸取对照品溶液0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8ml，，置已加入10ml氯仿的分液漏斗中，加2ml溴甲酚绿缓冲液，振摇1min，静置60min，分取氯仿相，于410nm波长处测定吸光度，随行空白。以吸光度值y对对照品溶液浓度C作图，绘制标准曲线，并进行线性回归，得回归方程为y＝0.009+1.5718c，相关系数r＝0.9990。结果表明，对照品浓度在-10.05～0.40mg·mL 范围内与吸光度呈良好的线性关系。

[0046] 样品测定方法

[0047] 精密称取排风藤干燥粉末10g 6份，照供试品溶液制备方法制备。分别量取各供试品溶液1.0ml，置入已放入10ml氯仿的分液漏斗中，再精密加入2ml溴甲酚绿缓冲液，震荡1min，静置60min至氯仿溶液澄清，分液取氯仿层(如不澄清加少量无水硫酸钠去除水分)，以溴甲酚绿缓冲液饱和的氯仿液为空白，在410nm波长处测定吸光度，计算含量。测定结果见表1。

[0048] 表1样品中叔胺生物碱含量测定结果(n＝6)

[0049]

[0050] 测定方法

[0051] 精密吸取供试品溶液1.0ml，置已加入10ml氯仿的分液漏斗中，加2ml溴甲酚绿缓冲液，振摇1min，静置60min，分取氯仿相(如不澄清加少量无水硫酸钠去除水分)，以溴甲酚绿缓冲液饱和的氯仿液为空白，于410nm波长处测定吸光度。将吸光度数值代入上述回归方程计算，并换算成占生药的百分比，应不少于0.25％

[0052] 3)方法学验证

[0053] 测定波长的选择

[0054] 精密吸取对照品溶液0.5ml和供试品溶液1.0ml，分别置于加入10ml氯仿的分液漏斗中，各加入溴甲酚绿缓冲液2ml，振摇1min，静置60min，分取氯仿层，以氯仿加溴甲酚绿缓冲液为空白，在200～800nm波长范围内进行扫描，两者在410nm波长处均有最大吸收(见图2)。故选择410nm作为测定波长。

[0055] 精密度试验及重现性试验

[0056] 精密吸取对照品溶液0.50ml，共6份，按2.4.项下方法测定，吸光度值的RSD为0.94％，表明该方法具有高的精密度。

[0057] 准确称取干燥排风藤全草粉末6份，每份10g，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液各1.0ml，按2.4项下方法测定吸光度值，计算供试品溶液含量，其RSD为2.43％，表明方法具有良好的重现性。结果见表2。

[0058] 表2重现性试验结果

[0059]

[0060] 稳定性试验

[0061] 精密吸取对照品溶液0.50ml和供试品溶液1.0ml，分别按2.4.项下方法分取有机相在室温下避光放置，每隔10-20min测定吸光度值，至120min。结果表明在120min内两者吸光度值无明显变化，RSD分别为1.03％和1.32％。

[0062] 加标回收率试验

[0063] 精密称取5g已知含量的干燥排风藤粉末9份，分成3组，各组样分别加入1.00、-12.00、3.00ml对照品溶液(5mg.ml )，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取
1.0ml，按2.4项下方法测定，试验结果见表3。结果表明，平均加标回收率为99.28％，RSD值为1.5％，表明该方法的准确度好。

[0064] 表3加标回收率测定结果(n＝9)

[0065]

[0066] 2、化合物的制备方法及表征化合物结构的数据。

[0067] 1)制备方法(见图3)

[0068] 干燥的排风藤全草，粉碎，加入2％H2SO4或4％盐酸浸提，浸提液过滤，滤液用氯仿萃取，氯仿层浓缩得弱碱性生物碱；酸水层用氨水调节pH9-10，继续以氯仿萃取，氯仿层浓缩得叔胺生物碱；碱水层加氢氧化钠调节pH＞12，以正丁醇萃取，正丁醇层浓缩得水溶性生物碱。制备工艺流程见图1。将制备的叔胺生物碱相膏经正相硅胶柱层析，以石油醚-丙酮梯度洗脱、SephadexLH-20(氯仿-甲醇)柱层析分离以及半制备HPLC纯化(乙腈-水)，得到化合物SCE-1。

[0069] 2)化合物结构确证

[0070] 化合物SCE-1白色结晶性粉末，熔点202-203.8℃，与生物碱试剂呈正反应。MeOH +
UVλnm ：204，227，296和343。HR-ESIMS显示[M-H] 的m/z为191.0533，可确定其分子
1 13
式为C9H8N2O3，化学结构通过 H、C NMR和2D NMR(HSQC和HMBC)图谱解析，鉴定为8-羟基-3-甲氧基-5H.吡啶[2，1-c]并吡嗪-5-酮。化合物SCE-1的化学结构见图1，HMBC相关见图2，NMR数据归属见表3

[0071]

[0072] 式1：化合物SCE-1的结构 式2：化合物SCE-1的HMBC

[0073] 化合物SCE-1的不饱和度为7，1H和13C的NMR数据(表4)表明分子中有三个不饱和双建(包括一个羰基和两个烯基)，根据饱和度的数据提示化合物SCE-1是一个双环结1 13
构的分子。H和 C的NMR数据(表4)提示化合物SCE-1有一个甲氧基信号(δH＝3.90，s；δC＝56.8，q)，四个亚甲基信号，包括两个成对的(δH＝7.84，d，J＝9.5Hz；δC＝
146.2，d；δH＝6.17，d，J＝9.5Hz；δC＝112.3，d)和两个不成对(δH＝6.75，s；δC＝
104.1，d；δH＝7.09，s；δC＝109.9，d)，四个季碳信号(δC＝147.4，s；151.7，s；153.7，s；164.2，s)。此外，从NMR数据的特征吸收(δH＝7.84，d，J＝9.5Hz；δC＝146.2，d；
δH＝6.17，d，J＝9.5Hz；δC＝112.3，d；δC＝164.2，s；151.7，s；153.7，s)提示化合物SCE-1有一个αβ-不饱和内酰胺吡啶环，并通过从H-6到C-5，C-7和H-7到C-5，C-8，C-8a的HMBC谱对其进行了验证。吡啶环上并有一个吡嗪环(δH＝6.75，s；7.09，s；δC＝104.1，d；147.4，s；109.9，s；153.7，s)，如图1所示，同时通过H-4/C-3，H-4/C-5，H-4/C-8a，H-1/C-3，H-1/C-7，H-1/C-8，H-1/C-8a(图2)HMBC相关谱对其进行了验证。通过以上数据，化合物SCE-1鉴定为一种吡啶并[2，1-c]吡嗪生物碱。从化合物SCE-1分子式可以推断在C-8(δC＝151.7，s)位上存在一个羟基，在HMBC相关谱上甲氧基上质子(δH＝
3.90，s)与C-3(δC＝147.4，s)有关联，提示甲氧基连在C-3位。故化合物SCE-1的结构鉴定为8-羟基-3-甲氧基-5H-吡啶[2，1-c]吡嗪-5-酮。化合物SCE-1的NMR数据归属见表4。

[0074] 表41H(500MHz)and13C NMR(125MHz)Data for Compound SCE-1in Methanol-d4[0075]

[0076] 实施例2本发明药物组合物的制备

[0077] 取排风藤弱碱性生物碱10g，加入药学上常用辅料，制备成胶囊剂。

[0078] 实施例3本发明药物组合物的制备

[0079] 取排风藤叔胺生物碱10g，加入药学上常用辅料，制备成片剂。

[0080] 实施例4本发明药物组合物的制备

[0081] 取排风藤水溶性生物碱10g，加入药学上常用辅料，制备成颗粒剂。

[0082] 实施例5本发明药物组合物的制备

[0083] 取排风藤弱碱性生物碱10g、排风藤叔胺生物碱10g、排风藤水溶性生物碱10g，加入药学上常用辅料，制备成胶囊剂。

[0084] 以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。

[0085] 试验例1本发明药物抗炎活性试验

[0086] (1)体外筛选

[0087] 采用Griess试剂法和免疫细胞化学方法研究排风藤水溶性生物碱(弱碱性、水溶性)及单体化合物SCE-1对LPS刺激后巨噬细胞生成NO的影响以及对COX2表达的影响。

[0088] Griess反应

[0089] 以蒸馏水配制0.2％萘乙烯二胺，以10％磷酸配制2％磺胺，4℃避光保存，待用时1∶1混合成为Griess反应试剂。

[0090] 绘制亚硝酸钠标曲线：

[0091] 配置0.08mol/L即(5.52mg/mL)亚硝酸钠溶液，确定最大吸收波长。按照二倍稀释法分别配置0.08，0.04，0.02，0.01，0.005mol/L亚硝酸钠溶液，于最大吸收波长处测吸光度，绘制亚硝酸钠标曲线。

[0092] 取小鼠腹腔注射1％的淀粉和1％的羧甲基纤维素钠的1∶1混合液，每只1毫升，三天后断头处死，用70％乙醇浸泡15-20分钟，无菌条件下腹腔注射PBS液，洗出腹腔细胞，1000r/min。离心8分钟。细胞用PBS洗一次，做细胞计数。用含10％小牛血清的培养液调
6
细胞浓度至3×10cell/ml.将细胞接种于96孔板，每孔100μL，37℃，5％CO2。培养箱内培养24h，加入不同药物100μL继续培养24h，然后加LPS刺激，(终浓度为800ng/ml)培养24h，取上清100μL到另一96孔板中，加入100μL Griess反应试剂，室温放置10min，在酶标仪530nm处测其OD值。以NaNO2为对照品作标准曲线，根据标准曲线方程计算NO含量。

[0093] 免疫细胞化学方法

[0094] 4％多聚甲醛的配制：

[0095] 按照多聚甲醛浓度为4％，用电子天平准确称取多聚甲醛颗粒熔入小烧杯中的PBS液中，搅拌均匀，置于70℃以上水浴中，以充分溶解。

[0096] 含0.3％TritonX-100的PBS的配制：

[0097] 按照TritonX-100浓度为0.3％，用微量取样枪吸出一定量的TritonX-100，将其融于PBS液中，吹打数次使其混合均匀，或者置于数控超声波清洗仪中超声几分钟使其溶解混合均匀。

[0098] 2)实验结果

[0099] 对LPS刺激后巨噬细胞生成NO的影响

[0100] 排风藤水溶性生物碱、叔胺生物碱、弱碱性生物碱及单体化合物SCE-1对巨噬细胞生成NO的影响，结果见表5、6。

[0101] 表5排风藤各提取部位对LPS刺激巨噬细胞生成NO的影响( ±s，n＝6)[0102]

[0103] 与模型组比较*p＜0.05，**p＜0.01

[0104] 表6化合物SCE-1对LPS刺激巨噬细胞生成NO的影响( ±s，n＝4)

[0105]

[0106] 与模型组比较*p＜0.05，**p＜0.01

[0107] 由表5、6可知，经LPS刺激后，模型组的OD值明显比空白组的高，说明LPS能够诱导小鼠腹腔巨噬细胞合成一氧化氮。而加入排风藤水溶性生物碱、叔胺生物碱、弱碱性生物碱及单体化合物SCE-1后，OD值较模型组降低，说明排风藤水溶性生物碱、叔胺生物碱、弱碱性生物碱对LPS刺激后巨噬细胞生成NO均有抑制作用。排风藤单体SCE-1浓度在40μg/ml，60μg/ml、80μg/ml时对LPS刺激巨噬细胞引起的NO浓度升高有抑制作用，浓度在60μg/ml、80μg/ml时对LPS刺激巨噬细胞引起的NO浓度与模型组比较差异有显著性。

[0108] 排风藤水溶性生物碱、叔胺生物碱、弱碱性生物碱对LPS刺激后巨噬细胞COX-2表达的影响

[0109] 排风藤水溶性生物碱、叔胺生物碱、弱碱性生物碱对LPS刺激后巨噬细胞COX-2表达的影响见下图4：

[0110] 由模型组和空白组的图像相比可知，经LPS刺激后，COX-2表达明显增强。而加入排风藤各部位提取物后，COX-2的表达受抑制，特别是排风藤叔胺生物碱对COX-2表达有很强的抑制作用。排风藤水溶性生物碱在高剂量的时候对COX-2表达有较强的抑制作用，排风藤弱碱性生物碱对COX-2表达也有较强的抑制作用。排风藤水溶性生物碱、叔胺生物碱、弱碱性生物碱对LPS刺激后小鼠腹腔巨噬细胞COX-2的表达均有抑制作用。

[0111] (2)体内筛选

[0112] 1)实验方法

[0113] 排风藤醇提取物的体内抗炎活性筛选，应用角叉菜胶致炎，以其肿胀抑制率为评价指标，观察药物对急性炎症的影响。应用佐剂性关节炎小鼠模型，以阿司匹林为阳性对照，蒸馏水为空白对照，观察足肿胀和炎性介质变化即致炎组织中的PGE2和血清中NO含量。

[0114] 对角叉菜胶所致小鼠足肿胀的影响角叉菜胶性足肿胀是众多筛选抗炎药物的方法中，应用最多的方法之一。

[0115] a药物制备

[0116] 排风藤叔胺生物碱提取物配制浓度为0.344g/ml和0.172g/ml，水溶性生物碱提取物配制浓度为0.344g/ml和0.172g/ml，弱碱性生物碱提取物配制浓度为0.056g/ml和0.028g/ml，以上提取物均用单蒸水溶解，并根据各自得率折算成原生药量，4℃冰箱保存；
阿司匹林单蒸水溶解，配制浓度为0.011g/ml，4℃冰箱保存。

[0117] 角叉菜胶(carrageenin)：在超净工作台避光条件下，用无菌生理盐水配成浓度为0.5％后，装于EP青霉素瓶中，保存于4℃冰箱。

[0118] b动物分组给药及方法

[0119] 取昆明雄性小鼠110只，随机分为11组，每组10只；

[0120] 空白对照组i.g.单蒸水；模型组i.g.单蒸水；阳性对照组i.g.阿司匹林0.011g/kg；排风藤叔胺生物碱高剂量组i.g.80g/kg；排风藤叔胺生物碱低剂量组i.g.40g/kg；排风藤水溶性生物碱高剂量组i.g.80g/kg；排风藤水溶性生物碱低剂量组i.g.40g/kg；
排风藤弱碱性生物碱提取物高剂量组i.g.80g/kg；排风藤碱性生物碱提取物低剂量组i.g.40g/kg。

[0121] 以上各组动物均每日灌胃给药一次，连续3天，末次给药后0.5h，将0.5％角叉菜胶混悬液20ul注入每只小鼠右后足趾皮下致炎，用自制小鼠足容积测定仪分别测定致炎前及致炎后0.5、2、4、的足容积，计算各组的肿胀度。

[0122] c测定指标

[0123] 以左、右两侧体积肿胀的差值作为肿胀度。

[0124] 肿胀率％＝(致炎后右后足容积/左后足容积-1)×100％

[0125] d资料统计分析方法

[0126] 实验数据用均数±标准差( ±s)表示，应用SPSS11.0软件进行统计学处理，各组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性意义。

[0127] 对小鼠佐剂性关节炎的影响佐剂性关节炎小鼠模型是RA的经典实验动物模型。此模型是细菌学家Freund于1950年代创立，多采用小鼠。用卡介苗佐剂在小鼠左足拓部皮下注射，原发病变主要表现为致炎局部的炎症反应，继发病变主要表现为对侧后足的继发性肿胀，一般于致炎后10-20天左右出现，病理改变为滑膜下组织炎症，滑膜血管增生，软骨破坏。佐剂性关节炎小鼠的关节组织病理学与人RA相似。

[0128] a.药物制备

[0129] 排风藤叔胺生物碱单蒸水溶解，配制浓度为0.0064g/ml、0.0096g/ml和0.128g/ml；排风藤水溶性生物碱单蒸水溶解，配制浓度为0.0075g/ml和0.015g/ml；排风藤弱碱性生物碱单蒸水溶解，配制浓度为0.00562g/ml(根据得率折算成原生药量)，4℃冰箱保存；

[0130] 双氯芬酸钠肠溶片溶液：无菌生理盐水稀释至0.25mg/ml后装于青霉素瓶中于4℃冰箱保存；

[0131] 卡介苗溶液：将同一批号的卡介苗80℃水浴灭活1h用无菌液体石蜡配成5mg/ml的乳剂，充分研磨混匀即成FCA；

[0132] 10％磷酸的配制：将85％的磷酸稀释至10％；

[0133] Griess试剂的配制：以蒸馏水配制0.2％萘乙二胺盐酸盐，以10％磷酸配制2％对氨基苯磺酰胺各10ml，待用时二者以1∶1等体积混合，4℃冰箱避光保存；

[0134] 30％硫酸锌溶液的配制：以蒸馏水配制浓度为30％的硫酸锌20ml，4℃冰箱保存。

[0135] b.动物模型的制作

[0136] 致炎前用容积测定仪测定小鼠左、右后踝关节以下容积(ml)，然后除正常组外各鼠左后足趾皮内注射20μl FAC致炎。

[0137] c.动物分组给药及方法

[0138] 选有用昆明小鼠88只，雄性，6～8周龄。随机分成11组：空白对照组，模型组，双氯芬酸钠阳性药物组；排风藤叔胺生物碱40、60、80g/kg组；排风藤水溶性生物碱40、80g/kg组；排风藤弱碱性生物碱40g/kg组，每组8只。

[0139] 致炎前用容积测定仪测定小鼠左、右后踝关节以下容积(ml)，然后除正常组外各鼠左右后足趾皮内注射20μlFAC致炎。致炎前3天开始灌胃给药，连续28天，并检测致炎侧身(左侧)、非致炎侧(右侧)足肿胀，每8天次，以致炎前后足容积差为肿胀度。于造模后第28天摘眼取血处死小鼠，检测小鼠血液中NO及致炎组织中PGE2、NO的含量。

[0140] 血浆中NO的测定方法：对小鼠进行眼球取血装于EP管中，1500r/min离心5min，取上清液0.3ml于新EP管中，加入0.9ml蒸馏水，再加入0.06ml30％硫酸锌溶液，离心(4000r/min，15min)，用移液枪向96孔板中加入上清液和试剂各100μl，室温放置10min，用酶标仪在524nm下测其吸光光度值。

[0141] 组织中NO的测定方法：剪下致炎组织并剪碎后用生理盐水3ml浸泡，2小时后取出，3000r/min离心浸泡液5min；取上清液0.5ml于新EP管中，加入0.5ml蒸馏水，再加入50μl30％硫酸锌溶液，离心(5000r/min，15min)向96孔板中加入上清液和Griess试剂各
100μl，室温放置10min，用酶标仪测其吸光度值；

[0142] 组织中PGE2的测定方法：取上清液0.2ml于新EP管中，加0.5ml/LKOH-甲醇溶液0.2ml，50℃水浴异构化20min后，加甲醇1.6ml稀释，用移液枪取100μl于紫外板中，于
278nm波长处测定吸光度值。

[0143] d.测定指标

[0144] 致炎前用容积测定仪测定小鼠左、右后踝关节以下容积(ml)，，以致炎前后足容积差为肿胀度。于造模后第28天摘眼取血处死小鼠，检测小鼠血液中NO及致炎组织中PGE2、NO的含量。

[0145] e.资料统计分析方法

[0146] 方法同上

[0147] 2)实验结果

[0148] 对角叉菜胶所致小鼠足肿胀的影响排风藤弱碱性生物碱、水溶性生物碱、叔胺生物碱萃取物对角叉菜胶所致小鼠足肿胀的影响结果见表7。

[0149] 表7排风藤生物碱碱提取物对角叉菜胶致炎小鼠足肿胀度的影响( ±s，n＝10)[0150]

[0151] 与模型组比较*p＜0.05，**p＜0.01

[0152] 排风藤叔胺生物碱提取物高、低剂量组，排风藤水溶性生物碱提取物高、低剂量组均对小鼠足肿胀有抑制作用，其抑制肿胀率0.5h时分别为67％、15％，61％、49％；2h时分别为69％、53％，56％、26％；4h时分别为35％、31％，35％、9％。

[0153] 对小鼠佐剂性关节炎的影响小鼠肿胀率在第21天时达到峰值，排风藤叔胺生物碱组均能降低关节处的肿胀率；结果见表8、9、10。

[0154] 对致炎组织中的PGE2和血清中NO含量的影响排风藤叔胺生物碱、水溶性生物碱、弱碱性生物碱都能降低致炎组织中的PGE2和血清中的NO的含量，其中叔胺生物碱有较好的效果。结果见表11、表12。

[0155] 表8排风藤提取物对小鼠佐剂性关节炎肿胀率的影响(％)( ±s，n＝8)[0156]

[0157] 表9排风藤提取物对小鼠佐剂性关节炎肿胀率的影响(％)( ±s，n＝8)[0158]

[0159] 表10排风藤提取物对小鼠佐剂性关节炎重量的影响( ±s，n＝8)

[0160]

[0161] 表11小鼠致炎组织中PGE2和NO吸光度值( ±s，n＝8)

[0162]

[0163] 表12血清中NO的吸光度值( ±s，n＝8)

[0164]

[0165] 与模型组比较**＜0.01＜*＜0.05

[0166] 与空白组比较**＜0.01＜*＜0.05

[0167] 试验例2本发明药物保肝活性的试验

[0168] 1)体内实验方法及实验结果

[0169] 体内实验方法

[0170] a药物制备排风藤叔胺生物碱单蒸水溶解，配制浓度为0.0064g/ml和0.0128g/ml，排风藤水溶性生物碱配制浓度为0.0258g/ml和0.0344g/ml。(根据得率折算成原生药量)，4℃冰箱保存；

[0171] 联苯双酯BDP阳性药：在超净工作台避光条件下，无菌生理盐水稀释至0.255mg/ml后装于青霉素瓶中于4℃冰箱。

[0172] b.动物模型的制作

[0173] 给药4天后腹腔注射0.2ml四氯化碳-玉米油以建立小鼠急性肝炎模型。

[0174] c.动物分组及给药方法

[0175] 选有用昆明小鼠56只，雄性，6～8周龄。随机分成7组：空白对照组，模型组，BDP阳性药物组，排风藤叔胺生物碱40、80g/kg组，排风藤水溶性生物碱60、80g/kg组，每组8只。

[0176] 从第一天开始灌胃给药，连续四天，第四天灌胃给药后，除空白对照组外，其它各小组给药4天后腹腔注射0.2ml四氯化碳-玉米油以建立小鼠急性肝炎模型。小鼠禁食不禁水饥饿过夜16个小时。第五天灌胃给药半小时后，取眼球血于EP管中离心，并将小鼠断颈处死。开始离心时的转速为1000r/min离心10min，后用3000r/min离心10min。用注射器吸取上层血清于新EP管中，送到三峡大学二门诊测其总胆红素(TBILI)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)的含量。

[0177] d.测定指标

[0178] 检测血清中的胆红素(TBILI)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)的含量。

[0179] e.资料统计分析方法

[0180] 方法同上

[0181] 体内实验结果

[0182] 实验动物数量分析，纳入56鼠，均进入结果分析，无脱失值。

[0183] 肝功能

[0184] 结果表明，排风藤叔胺生物碱提取物能显著降低谷丙转氨酶、谷草转氨酶和总胆红素具有肝保护作用。

[0185] 排风藤叔胺生物碱提取物对四氯化碳诱导的急性肝损伤小鼠具有一定的保肝活性。排风藤叔胺生物碱对小鼠体重没有明显影响，降低四氯化碳所致小鼠肝损伤后谷丙转氨酶、谷草转氨酶和总胆红素和活性的升高，提示排风藤叔胺生物碱萃取物对四氯化碳诱导的急性肝损伤小鼠具有一定的保护作用。实验结果见表13。

[0186] 表13血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶和总胆红素的含量( ±s，n＝8)[0187]

[0188] 与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05；叔胺生物碱和水溶性生物碱的药量根据得率折算成原生药量分别为40、80g/kg。

[0189] 与正常组比较，模型组小鼠肝脏指数呈现升高的趋势，但无统计学意义，排风藤各剂量组与模型组比较呈现降低趋势。与正常组比较，模型组小鼠血清ALT和AST水平显著升高，排风藤各剂量组呈现一定降低趋势，其中叔胺生物碱，水溶性生物碱均能降低谷丙转氨酶、谷草转氨酶和总胆红素的含量，并且叔胺生物碱的效果比水溶性生物碱萃取部位的更好。

[0190] 2)体外实验方法及实验结果

[0191] 体外实验方法

[0192] a药物制备

[0193] 排风藤叔胺生物碱配制浓度为300μg/ml，番茄碱、脲基甲酸乙酯配制浓度为200μg/ml，京尼平苷配制浓度为100μg/ml，用无菌PBS对倍稀释成相应的5个浓度，SCE-1、BDP阳性药配制浓度为75μg/ml，装于青霉素瓶中于4℃冰箱。

[0194] b模型的制作

[0195] 选取新生小鼠，禁食24h后，断头取血，无菌分离肝脏，置PBS液中，冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成1mm左右的组织快，并用尼农网碾磨，1000r/min离心5min，去上清，加入培养液，用枪头轻吹成肝细胞悬液。取上述肝细胞悬液，接种于96孔板中，设正常对照组，CCl4模型组(浓度为1.6ul/ml)，不同剂量给药组，每组设6个复孔，37℃孵育3个小时后，2000r/min冷冻离心5min，收集肝细胞上清。

[0196] c测定指标

[0197] 按赖氏法测定肝细胞中谷丙转氨酶(ALT)的活性。

[0198] d资料统计分析方法

[0199] 方法同上

[0200] 体外实验结果

[0201] 排风藤提取物和生物碱化合物SCE-1抗体外CCl4所致急性肝损伤的作用，试验结果见表14及表15。

[0202] 表14肝细胞中谷丙转氨酶的活性( ±s，n＝6)

[0203]

[0204] 与模型组比较**P＜0.01，*P＜0.05；

[0205] 表15肝细胞中谷丙转氨酶的活性( ±s，n＝6)

[0206]

[0207] 与 模 型 组 比 较 **P＜0.01，*P ＜0.05；SCE-1：8-hydroxy-3-methoxy-5H.pyrido[2，1-c]pyrazin-5-one为新化合物

[0208] 与正常组比较，模型组小鼠肝细胞中ALT水平显著升高，叔胺生物碱、水溶性生物碱与模型组比较呈现降低趋势且降低的效果呈剂量依赖性；从叔胺生物碱中得到的8-羟基-3-甲氧基-5H.吡啶[2，1-c]并吡嗪-5-酮、脲基甲酸乙酯对小鼠肝细胞中ALT水平表现出良好的降低作用。

[0209] 排风藤叔胺生物碱、水溶性生物碱、单体化合物SCE-1与谷丙转氨酶(ALT)结合，使得小鼠的谷丙转氨酶活力下降。谷丙转氨酶(ALT)经常地被用作判定肝损伤程度的重要指标。说明排风藤叔胺生物碱和水溶性生物碱具有肝保护作用，单体化合物SCE-1肝保护作用好，其降低ALT水平与联苯双酯相当。