种子胚乳特异表达的GhDET2基因启动子D6P1及其应用

摘要

本发明涉及一种种子特异表达的GhDET2基因启动子D6P1，它可以调控目的基因在植物种子胚乳中特异表达。本发明从陆地棉徐州142基因组中克隆了GhDET2基因及其上游调控序列，将克隆的上游序列置换pBI121载体中驱动GUS报告基因的CaMV35S启动子，构建了启动子表达特性分析植物表达载体。通过烟草和番茄的遗传转化和GUS表达部位的分析，确定了562bp的片段能够指导报告基因在种子胚乳组织中特异表达，本发明还涉及该序列的应用。

权利要求

1.一种番茄和烟草种子胚乳特异启动子D6P1，其特征在于，其为如SEQID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种含有权利要求1所述的番茄和烟草种子胚乳特异启动子的植物表达载体。

3.根据权利要求2所述的植物表达载体，其特征在于，所述载体具有如图6所示pBI121-D6P1的结构。

4.一种转化体，包含宿主及权利要求1所述的番茄和烟草种子胚乳特异启动子。

5.根据权利要求4所述的转化体，其特征在于，所述宿主为根癌农杆菌。

6.权利要求1所述的番茄和烟草种子胚乳特异启动子在制备转基因植物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述转基因植物为烟草或番茄。

8.一种含有权利要求1所述的番茄和烟草种子胚乳特异启动子的转基因植物的制备方法，包括下述步骤：(1)将番茄和烟草种子胚乳特异启动子序列可操作地插入表达载体中，构建植物表达载体；

(2)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；

(3)将所述转化体转化植物，获得转基因植物。

说明书

种子胚乳特异表达的GhDET2基因启动子D6P1及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程领域，具体地说，涉及植物种子胚乳组织的特异启动子，包含该启动子的融合基因，携带该融合基因的植物表达载体，由该植物表达载体转化的转化体，以及其制备方法。

背景技术

[0002] 油菜素类固醇物质(Brassinosteroids，BRs)是一种新型的植物激素。该激素在植物生长发育的许多生理生化过程中具有重要作用。这在植株水平上主要体现为能够促进植株营养生长、促进植株生殖发育、促进根系生长以及提高植物对生物胁迫和非生物胁迫的抗性等。而在细胞水平上主要表现为促进细胞分裂、伸长及分化，平衡植物激素，改变酶活性以及调节细胞膜性质等。

[0003] BRs参与植物生长发育的许多方面，因此BRs在植株的许多部位都有分布，如根、茎、叶、花、花粉、种子和虫瘿等器官和组织。然而BRs在植物体中的浓度很低，一般在纳克(ng)级水平，并且在不同的植物组织和器官中，BRs浓度变化很大(Sasse，1997；Yokota，1986)。对不同组织和器官的检测结果表明：正在生长的幼嫩组织中BRs含量较多，而在成熟的组织中含量较少；BRs在花粉和未成熟种子中含量最丰富，每克鲜重可高达1-100ng，而在叶和茎中含量较低，通常为每克鲜重含0.01-0.1ng。

[0004] Symons和Reid研究了BRs在植物体内的合成和运输，结果表明BRs在植物体内没有长距离运输，而主要在合成部位原位起作用(Symons和Reid，2004)。这说明在BRs含量水平较高的部位，BRs的生物合成就比较活跃，合成酶基因的表达水平和酶的活性较高。特别是BRs生物合成途径中的关键限速酶基因的表达水平与BRs的含量变化有密切关系。

[0005] 近年来从拟南芥中筛选到许多BRs缺失突变体，使BRs生物合成途径的研究取得了突破性的进展，目前已基本上掌握了BRs的生物合成途径。该合成途径涉及十几种合成酶基因。对拟南芥的研究表明：类固醇5α-还原酶(steroid 5α-reductase)(AtDWARF6/DET2)和类固醇C22-羟化酶(steroidC22-hydroxylase)(AtDWARF4)是BRs生物合成途径的限速酶。

[0006] 为了研究BRs在棉花纤维细胞生长发育中的作用和解析纤维细胞发育的分子机理，从棉花纤维中克隆了棉花类固醇5α-还原酶基因(GhDET2)。表达分析的结果证明该基因在棉花未成熟种子和纤维中的表达水平最高，其次在根中有较高水平的表达，而在子叶中的表达水平极低。说明GhDET2基因在种子纤维和根中具有明显的表达优势。

[0007] 近年来，植物组织特异性表达的研究成为植物分子生物学的一个重要研究领域，特别是在植物基因工程的实用化阶段中，为了使目的基因在特定的组织部位和特定的发育阶段优先表达，对组织特异性表达的研究更是成为热点。由于许多农作物是以种子为收获器官，种子的大小与产量有直接联系；另一方面，部分植物如一些园艺植物以果实为收获器官，因而希望培育出小核、少核或无核的果实，增加有效产量和品质。

[0008] 植物种子的发育从胚珠受精开始，存在两个受精过程，一个是精子与卵细胞结合发育成胚，另一个是精子与极核结合发育成胚乳。胚乳的发育分为两个阶段，第一阶段是精子与极核结合后开始核物质的复制和分离，此时并不进行细胞的形成；第二阶段是细胞化过程，即胚乳被细胞膜和细胞壁分开，形成许多胚乳细胞，此时种子达到它的最终大小，因此胚乳细胞的数量和大小对种子的大小具有十分重要的作用。因此，研究和筛选胚乳特异表达的启动子不仅有助于阐明基因表达调控的分子机制，而且可为植物基因工程提供有用的调控元件，有着重要的理论意义和应用价值。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于提供一种植物种子胚乳特异启动子D6P1，其是SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。该启动子是以棉花类固醇5α-还原酶基因(GhDET2)序列设计引物，经YADE法获得的上游包含562bp的核苷酸序列，其能够在转基因植物中，特别是在转基因烟草和转基因番茄的种子胚乳中的特异表达。

[0010] 本发明的又一个目的在于提供含有GhDET2基因启动子D6P1的植物表达载体。所述含有GhDET2基因启动子D6P1的植物表达载体是采用基因工程方法，将GhDET2基因启动子D6P1插入到适宜的表达载体中而获得。

[0011] 根据本发明的一方面，构建了pBI121-D6P1植物表达载体，其具有如图6(下)所示的结构。

[0012] 本发明的又一个目的在于提供含有GhDET2基因启动子序列的转化体。将上述植物表达载体转化适宜的宿主即可获得本发明的转化体。

[0013] 根据本发明的一方面，采用共转化法将含有GhDET2基因启动子D6P1的植物表达载体pBI121-D6P 1转化到根癌农杆菌LBA4404中获得转化体。

[0014] 本发明的又一个目的在于提供制备含有GhDET2基因启动子D6P1的转基因植物的方法。将本发明的GhDET2基因启动子D6P1构建植物表达载体pBI121-D6P1，将所述植物表达载体转化宿主获得含GhDET2基因启动子D6P1的转化体，以及用所述转化体转化植物获得转基因植物。

[0015] 根据本发明的一方面，所述转基因植物优选为烟草或番茄。

[0016] 本发明分离到植物种子胚乳特异表达的GhDET2基因的启动子，并证实了该启动子序列在烟草和番茄中具有胚乳表达特异性，为基因工程改良烟草、番茄，乃至水稻、玉米、小麦等种子植物品种提供了可能性和有效的途径。

附图说明

[0017] 图1示出GhDET2基因在棉花不同器官和组织中的表达，其中误差棒表示4次重复的标准差，R：根；H：下胚轴；L：叶；C：子叶；FL：开花当天的花；OF10DPA：开花后10天的种子和纤维；F10DPA：开花后10天的纤维；

[0018] 图2示出GhDET2基因在种子(含纤维)发育过程中的表达，误差棒表示6次重复的标准差，0DPA～22DPA：开花当天至开花后22天的胚珠和纤维；

[0019] 图3示出基因组步行的流程图，其中方框表示起始密码子(ATG)，虚线上为接头序列，第一次延伸的引物结合序列D6PY1-1(SEQ ID NO：2)和D6PY1-2(SEQ ID NO：3)用粗线标记，第二次延伸的引物结合序列D6PY2-1(SEQ ID NO：4)和D6PY2-2(SEQ ID NO：5)用单细线标记，第三次延伸的引物结合序列D6PY3-1(SEQ ID NO：6)和D6PY3-2(SEQ ID NO：7)用双细线标记；

[0020] 图4示出电泳检测D6P1片段的扩增的结果，1：Marker15(MBI)；2：扩增产物；

[0021] 图5示出pMD18-D6P1载体图谱；ori：原核生物复制起始位点；Ampr：氨苄青霉素抗性基因；lacZ：β-半乳糖苷酶报告基因；

[0022] 图6示出pBI121-D6P1载体图谱及其构建方案；ori：原核生物复制起始位点；r
Amp ：氨苄青霉素抗性基因；lacZ：β-半乳糖苷酶报告基因；GUS：β-葡萄糖酸苷酶基因；
NPTII：新霉素磷酸转移酶基因；Nos P：冠瘿碱合成酶基因启动子；Nos T：冠瘿碱合成酶基因终止子；35S：花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子；LB：T-DNA区段左边界；RB：T-DNA区段右边界；

[0023] 图7示出电泳验证转基因番茄的结果，1：DNA Marker15(MBI)；2：阳性对照(煮沸过的pBI121-D6P1::GUS农杆菌液)；3-6：转基因后的Kan抗性苗；7：未转基因Moneymaker番茄；8：以水为模板的扩增产物；NPTII：新霉素磷酸转移酶基因；

[0024] 图8示出电泳验证转基因烟草的结果，M15：DNA Marker15(MBI)；1：水为模板的扩增产物；2：阳性对照(煮沸过的pBI121-D6P1::GUS农杆菌液)；3：未转基因的沙姆逊烟草；4-7：转基因后的Kan抗性苗；

[0025] 图9示出转基因番茄中不同器官和组织的GUS染色情况，A-D示出番茄种子和果实维管束的GUS染色情况，其中A和C：野生型番茄横切薄片，B和D：转基因番茄横切薄片；E：单粒转基因番茄种子，示出种子表面和种子表皮毛的染色情况；F：转基因番茄种子横切面，示出种子内部胚和胚乳的染色情况；G：转基因番茄种子纵切面，示出种子内部胚和胚乳的染色情况；H：示出转基因番茄的胚的染色情况；以及

[0026] 图10示出转基因烟草种子的GUS染色情况。

具体实施方式

[0027] 以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下的描述并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

[0028] 除非另有说明，否则本发明实例中的试剂、药品、材料均为市售可得，方法均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。

[0029] 在本发明的下述实例中，所用的棉花实验材料为徐州142(Gossypiumhirsutum L.cv Xuzhou142)，烟草实验材料为普通烟草品系沙姆逊(Nicotianatobacum L.cv.S amsun)，番茄实验材料为Moneymaker(Solanum lycopersicum L.cv.Moneymaker)。

[0030] 实施例1、棉花RNA的提取

[0031] 选取约3g新鲜棉花材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50mL离心管，加入15mL 65℃预热的RNA提取液(2％(W/V)CTAB，2％(W/V)PVP，100mmol/L Tris-HCl(pH
8.0)，0.5g/L亚精胺(Spermidine)，2.0mol/L NaCl，2％巯基乙醇(V/V，使用前加入))，颠倒混匀。65℃水浴3min，期间混匀2～3次。氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次(10,000r/min，室温，5min)。取上清，加入1/4体积10mol/L的LiCl溶液，4℃放置6h，12,000r/min，
4℃离心20min，弃上清。沉淀用200μL的DEPC水溶解。以酚(pH4.5)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用200μL的DEPC水溶解。用酚(pH4.5)∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(10,000r/min，室温，5min)。加1/10体积3mol/L NaAc溶液和2.5倍体积的无水乙醇，在-70℃沉淀30min以上。12,000r/min，4℃离心20min，弃上清。沉淀用70％的酒精漂洗一次，风干。加200μL的DEPC水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA的质量。

[0032] 实施例2、cDNA第一链的合成

[0033] 取约10μg总RNA加入到DEPC-处理的扩增管中，65℃水浴10min使RNA变性后，立即冰浴3min。然后向扩增管中依次加入2μL 10×RNA ReactionBuffer，4μL 25mmol/L MgCl2，2μL 10mmol/L dNTPs，5U AMV RTase，0.5μLRNase抑制剂(20U)和1μL 2.5μmol/L Oligo-dT 3′接头，加入经DEPC处理的水至终体积20μL。反转录反应程序为：30℃，10min；50℃，45min；95℃，5min；5℃，5min。程序结束后，于-20℃冻存产物。

[0034] 实施例3、运用Quantitative Real-time PCR分析GhDET2的表达水平[0035] 用cDNA第一链合成试剂盒(MBI)合成不同器官和组织总RNA的第一链cDNA(样品包括棉花幼苗的根、下胚轴、子叶、真叶、开花当天的花、开花后10的种子和纤维、开花后10的纤维、以及从开花当天(0DPA)至开花后22天(22DPA)的种子和纤维)，操作均按试剂盒说明书进行。采用实时定量PCR试剂盒(Bio-Rad)进行PCR，在25μL的反应体系中包括12.5μL MIX缓冲液(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2)，上下游引物各
0.2μmol/L和1μL。循环参数为94℃预变性3min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，0.5min，预设循环数为35。用棉花Histone3基因作内标，Histone3的5’-上游引物是GhHIS1(SEQ ID NO：8)，3’-下游引物为GhHIS2(SEQ ID NO：9)。扩增GhDET2基因的5’-上游引物序列为D6up(SEQ ID NO：10)，3’-下游引物序列为D6PY1-1(SEQ ID NO：2)。

[0036] 实施例4、GhDET2基因在棉花不同器官和组织中的表达模式

[0037] 对按上述方法获得棉花不同器官和组织(样品包括棉花幼苗的根、下胚轴、子叶、真叶、开花当天的花、开花后10的种子和纤维、开花后10的纤维、以及从开花当天(0DPA)至开花后22天(22DPA)的种子和纤维)的总RNA进行实时定量RT-PCR分析。在运行实时定量PCR前，用相同引物和模板在相同的温度调控程序中扩增一次，通过扩增产物的电泳，确保扩增产物是单带，并弄清哪一个样品扩增产物较多。在实时定量PCR中以扩增产物较多的样品10倍稀释4级，并将此设为标样。每个样品重复4次，计算GhDET2基因的RNA与Histone3RNA的相对含量。

[0038] 如图1可见，GhDET2基因在未成熟种子(10DPA种子和纤维)、纤维(10DPA)和根中的相对表达水平最高，而且10DPA种子(含纤维)中的相对表达量比同时期纤维细胞中的相对表达量更高，说明该基因在种子早期发育过程中高量表达。GhDET2基因在下胚轴、子叶和幼嫩真叶中的相对表达水平较低，说明该基因在这些组织中表达较弱。

[0039] 实施例5、GhDET2基因在种子(含纤维)发育过程中的表达

[0040] 按上述方法提取野生型棉花种子(含纤维)不同发育时期(开花后0、3、6、10、13、15和22天)的总RNA进行实时定量RT-PCR分析。每个样品重复6次，以棉花Histone3基因为内标，计算GhDET2基因的RNA与Histone3RNA的相对含量。

[0041] 如图2可见，从开花当天到开花后22天的种子中，GhDET2基因都有表达，但不同发育时期该基因的表达水平有明显差异。进一步可见，GhDET2基因在棉花种子发育前期(主要是胚乳的发育时期)表达量较高，而在种子发育中期(胚乳的发育停止，并逐渐开始退化和萎缩)，GhDET2基因的表达量较低且急剧下降。

[0042] 实施例6、棉花基因组DNA的提取

[0043] 采用改良的CTAB法(肖月华等，2002)提取棉花基因组DNA。取0.5g棉花幼叶，在液氮中迅速研磨成粉，加入3mL 65℃预热的CTAB提取液，快速振荡混匀。65℃水浴30min，然后加入1mL 5mol/L KAc，冰浴20min后，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次(12,000r/min，4℃离心5min)，取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，静置约30min，挑出絮状沉淀，75％的乙醇反复漂洗3次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重溶于500μLTE中。加入1μL RNaseA(10mg/mL)，37℃处理1h。再用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次(12,000r/min，4℃离心5min)，取上清，加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。-20℃放置约30min，离心(12,000r/min，4℃离心
5min)，弃上清，沉淀用75％的乙醇漂洗，风干，溶于200μLTE中，-20℃保存备用。

[0044] 实施例7、GhDET2基因5’-上游调控序列的获得

[0045] 采用YADE(Y-shaped Adaptor Dependant Extension)(肖月华等，2002)法进行GhDET2基因的步行。

[0046] 酶切目标基因组DNA：将2μg DNA用10U的内切酶按说明书的条件在20μL体系中酶切过夜，70℃灭活10min。

[0047] 准备接头：向扩增管中加入2μL接头短链(100μmol/L)(接头序列与使用的内切酶酶切位点相匹配)，5U T4多聚核苷酸激酶，1μL 10mmol/L ATP，10μL体系，37℃保温30min，70℃灭活10min。加入2μL 10×退火缓冲液，2μL(100μmol/L)接头长链(SEQ ID NO：11)和6μL水，65℃保温10min，缓慢冷却到室温，使接头长链和短链退火形成接头。

[0048] 连接接头：取2μL以上方法制备的接头(10μmol/L)和5ng酶切产物，加入5U T4连接酶，16℃连接16hr。

[0049] 线性扩增：25μL体系中含1μL连接产物，1×Ex Taq Buffer(无Mg2+)，200μmol/L dNTPs，2mmol/L MgCl2，200μmol/L特异引物SP1，1U Ex Taq DNA聚合酶(在94℃预变性时加入)。循环参数为：94℃预变性5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，2min30sec，40个循环。

[0050] 指数扩增：取1μL线性扩增产物进行第二步指数扩增，除引物为接头引物(SEQ ID NO：12)和特异引物SP2外，反应体系中其他成分同线性扩增。反应扩增35个循环后，72℃延伸10min。

[0051] 如图3所示，在GhDET2基因的5′-端共进行三次连续的YADE延伸。获得670bp的GhDET2基因5’-上游调控序列。

[0052] 实施例8、克隆GhDET2基因的启动子序列(D6P1)

[0053] 利用已经获得的GhDET2基因的5’-上游调控序列，设计特异引物D6P-up(SEQ ID NO：13)和D6P-down(SEQ ID NO：14)，以徐州142基因组DNA为模板进行扩增，25μL的反应体系包含约50ng棉花DNA，2.5μL 10×PCR缓冲液，2μL 2.5mmol/L dNTPs，1.5μL25mmol/L MgCl2，5μmol/L的上下游引物各1μL，1U Taq DNA聚合酶(Progema)。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物经过电泳回收(图4)、将其连接在克隆载体pMD18(TaKaRa)上，形成pMD18-D6P1载体(图5)，该载体经过转化大肠杆菌、验证和测序，结果表明扩增片段长度为562bp，将其命名为D6P1。

[0054] 实施例9、D6P1启动子分析载体pBI121-D6P1的构建

[0055] 用HindIII和XbaI内切酶从pMD18-D6P1载体上切下D6P1片段，连接到用HindIII和XbaI双酶切的pBI121载体片段上，从而使D6P1片段置换了pBI121载体中的CaMV35S启动子，构建成植物表达载体pBI121-D6P1::GUS(图6)。

[0056] 实施例10、番茄的遗传转化

[0057] (1)受体材料准备

[0058] 将番茄种子用1％的NaClO灭菌15min，无菌水冲洗5～6次，放于番茄无菌苗培养基(MSB，pH 5.8，蔗糖浓度为3％)中，26℃光下发芽7～10天后，于加有少量无菌水的灭菌切盘内切取子叶(切去子叶叶尖和靠近叶柄的基部)。然后子叶近轴面朝下，放于铺有灭菌滤纸的共培养培养基(MSB+2.0mg/LBA+0.2mg/L IAA+50μmol/LAS，pH 5.9～6.0，蔗糖浓度为3％)上，26℃，可选地，在弱光下预培养12～24h。

[0059] (2)农杆菌准备

[0060] 挑取含重组质粒的根癌农杆菌LBA4404菌株的单菌落，接种于5mL附加50mg/L卡那霉素(Kanamycin，Kan)和125mg/L链霉素(streptomycin，Sm)的YEB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜。取1.5mL离心管于超净台上收集少许菌液以9000rpm离心
1min，去上清，加入20μl GUS染液，置于37℃温箱30min，选取染至深蓝色的菌液。农杆菌菌液按1∶50的比例转接到含相同抗生素的液体YEB培养基中，继续培养至OD600值为
0.5～0.8。分别收集并于50mL离心管中离心6000rpm，20℃，8min，用液体MSB(MS无机+B5有机培养基，蔗糖浓度为2％，添加不同浓度的AS)培养基重悬菌体至OD600值为0.3～0.4。
将菌液转入灭菌广口瓶中，于200rpm振荡培养1～2h备用。

[0061] (3)农杆菌侵染和筛选

[0062] 将预培养1d或新切取的外植体放入上述菌液中，浸泡15～20min，吸去多余菌液，子叶近轴面朝下再次置于铺有灭菌滤纸的共培养培养基上，24℃，黑暗条件下共培养48h。然后转入筛选培养基(MSB+2.0mg/L BA+0.2mg/LIAA+70mg/L Kan+250mg/L羧苄青霉素，蔗糖浓度为3％)上进行筛选。每两周选取带有绿色愈伤或绿芽的外植体进行继代。继代培养基与筛选培养基相同。

[0063] (4)生根和移栽

[0064] 待再生芽生长至1cm左右以后，于无菌切盘上将苗子切下，转入生根培养基(MSB+0.5mg/L IAA+40mg/L Kan+200mg/L羧苄青霉素或200mg/L头孢霉素)上，待长出根系发达的幼苗后，移栽入土钵中，置于温室中生长(开始3天要在塑料膜下保湿培养)。移栽成活5株Kan抗性苗。

[0065] 实施例11、烟草的遗传转化

[0066] 参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404菌株。

[0067] 通过农杆菌介导叶盘感染的方法将上述的植物表达载体导入烟草。具体方法如下：

[0068] 将烟草种子用1％的次氯酸钠消毒后，在MSB固体培养基上萌发，培养条件为25℃、16hr光照/8hr黑暗的光周期。约一个月后生长健壮的无菌苗即可用作转化外植体。

[0069] 将含植物表达载体的农杆菌菌株接种于液体YEB(0.5％(W/V)蔗糖，0.1％(W/V)细菌用酵母提取物，1％(W/V)细菌用胰化蛋白胨，0.05％(W/V)MgSO4·7H2O(pH7.0)，121℃灭菌15min)，28℃200rpm摇床培养过夜，从已摇好的菌液中重新吸取1～2ml于20～25ml液体YEB中再次活化。待菌液摇至OD600约为0.8时，取出用YEB稀释到0.05～0.2备用。

[0070] 将无菌苗健壮叶片，切成约0.5cm×0.5cm大小的叶盘，放入OD600值为0.05～0.2的农杆菌菌液中，轻轻振荡侵染5min后，立刻倾去菌液，将外植体接入表面铺有一层滤纸的共培养基上，24℃暗培养3天。

[0071] 共培养完成后，外植体接入筛选培养基中进行分化培养，每2～3周继代一次。出现再生绿芽后，将其切下转入生根培养基中生根。当抗性苗的根生长到2～3cm长时，洗净根部的琼脂，水培炼苗2～3天，移栽到营养钵，于自然条件下生长。

[0072] 表1：根癌农杆菌介导的烟草遗传转化用培养基

[0073]

[0074] MS：Murashige&Skoog，1962

[0075] B5：Gamborg，1986

[0076] 实施例12、转基因烟草和番茄的分子验证

[0077] 用简易的CTAB法或任何本领域已知的方法提取实施例10和11获得的抗性幼苗的DNA。以NPT II基因的两个引物NPT-up(SEQ ID NO：15)和NPT-down(SEQ ID NO：16)扩增抗性番茄和抗性烟草基因组DNA，预计扩增片段大小是700bp。25μL的反应体系包含约50ng基因组DNA，2.5μL 10×PCR缓冲液，2μL 2.5mmol/L dNTPs，1.5μL 25mmol/L MgCl2，5μmol/L的上下游引物各1μL，1U Taq DNA聚合酶。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

[0078] 如图7可见，从4株抗性番茄植株中扩增出了约0.7kb的NPTII基因特异带，说明外源片段已经整合到转基因番茄植株的基因组中。

[0079] 如图8可见，从4株抗性烟草植株中扩增出了约0.7kb的NPTII基因特异带，说明外源片段已经整合到转基因烟草植株的基因组中。

[0080] 实施例13、转基因植株中GUS活性的检测

[0081] (1)转基因番茄中GUS活性检测

[0082] 对4株PCR阳性的转基因番茄植株进行全面的GUS活性检测。先取开花后20天的转基因番茄果实和野生型番茄果实(果实不再膨大但还没有着色)，将果实横切成2mm厚的薄片，平放在GUS染色液中筛选GUS阳性的植株。然后取GUS阳性植株的不同组织或器官进行染色，包括选取单粒种子横切和纵切，切开的两部分都放在GUS染色液中。为检测根和幼苗的GUS活性，将GUS阳性植株的种子在生根培养基MSB5上播种，对生长正常的幼苗进行GUS染色。染色结束用50％的酒精脱色，样品用相机或立体解剖镜照相。

[0083] 如图9所示，结果表明只从2株番茄(D6P-T1和D6P-T2)的果实中检测到GUS活性，且2株转基因番茄的GUS表达特性相似。在根、茎、叶和花中未检测到GUS活性。在种子的外表皮和表皮毛中有微弱的GUS基因表达；在种子内部，GUS基因在胚乳中的表达水平最高，说明D6P1启动子具有胚乳表达特异性。

[0084] (2)转基因烟草中GUS活性的检测

[0085] 对4株PCR阳性的转基因烟草植株进行全面的GUS活性检测。取转基因植株的叶、茎、花和果实等部分进行染色。叶切成条(2mm×10mm)，茎纵切和横切成1mm厚的薄片，花的各部分(花瓣、花丝、花柱和花药)切成适当大小，烟草果实切成1mm厚的薄片。为检测根和幼苗的GUS活性，将转基因植株的种子在MSB培养基上播种，对生长正常的幼苗进行GUS染色。染色结束用50％的酒精脱色，样品用相机或立体解剖镜照相。

[0086] 如图10所示，结果表明只在4株转基因烟草植株的种子中检测到GUS活性，所有转基因烟草的根、茎、叶和花中均未检测到GUS活性，GUS在种子中的表达主要集中在胚乳中，种皮上没有GUS活性，说明D6P1启动子序列具有胚乳表达特异性。

[0087] CQ302-09P103645序列表.txt

[0088] 序列表

[0089] <110>西南大学

[0090] <120>种子胚乳特异表达的GhDET2基因启动子D6P1及其应用

[0091] <130>CQ302-09P103645

[0092] <160>16

[0093] <170>PatentIn version 3.5

[0094] <210>1

[0095] <211>652

[0096] <212>DNA

[0097] <213>棉花(Gossypium spp.)

[0098] <220>

[0099] <221>MISC_FEATURE

[0100] <222>(1)..(652)

[0101] <400>1

[0102] gtgcactttc cgaggcacgc gatttgaatt tgcttgaatc ttaaaatcgt tattgttgaa 60[0103] agttttacct gaatactacc ttgactcaaa tgtgattata ctaaaatgaa tttacaaatt 120[0104] acatttttca aaaatatttt tttcttgaaa aagcattaga aatcaaatta cagtttgtcc 180[0105] ctttgctaaa aaatgagcaa atcagtcgtt atctattaaa tcaaagagta aattagttat 240[0106] tttaattaaa aatttattca tttttactgt taaaactaac gtggataacg aaataactaa 300[0107] ttaccatata aatatataca tatcgatttt taacaataaa attagatgaa tgaaattttt 360[0108] aacaacaaaa aaatttaatt tactctttaa tcttagatgt tagagaaatc aatttactta 420[0109] aatttttaaa tgaaaaagaa tgataatact attaccgaaa aacagtatta aattgcaaag 480[0110] gttagcctta agtggatagt aattggtgta ggtagaggga caataggtaa gacagccgaa 540[0111] gtaccgcaaagttgtactcaca 562[0112] <210>2

[0113] <211>21

[0114] <212>DNA

[0115] <213>人工序列

[0116] <220>

[0117] <221>MISC_FEATURE

[0118] <222>(1)..(21)

[0119] <223>根据GhDET2基因5’端序列设计的引物

[0120] <400>2

[0121] acttcctcca agccccttat g 21[0122] <210>3

[0123] <211>21

[0124] <212>DNA

[0125] <213>人工序列

[0126] <220>

[0127] <221>MISC_FEATURE

[0128] <222>(1)..(21)

[0129] <223>根据GhDET2基因5’端序列设计的引物

[0130] <400>3

[0131] cactactgcc tcctcactct t 21[0132] <210>4

[0133] <211>20

[0134] <212>DNA

[0135] <213>人工序列

[0136] <220>

[0137] <221>MISC_FEATURE

[0138] CQ302-09P103645序列表.txt

[0139] <222>(1)..(20)

[0140] <223>根据第一次延伸获得序列设计的引物

[0141] <400>4

[0142] accgcaaagt tgtactcaca 20

[0143] <210>5

[0144] <211>20

[0145] <212>DNA

[0146] <213>人工序列

[0147] <220>

[0148] <221>MISC_FEATURE

[0149] <222>(1)..(20)

[0150] <223>根据第一次延伸获得序列设计的引物

[0151] <400>5

[0152] caataggtaa gacagccgaa 20

[0153] <210>6

[0154] <211>20

[0155] <212>DNA

[0156] <213>人工序列

[0157] <220>

[0158] <221>MISC_FEATURE

[0159] <222>(1)..(20)

[0160] <223>根据第二次延伸获得序列设计的引物

[0161] <400>6

[0162] cct gaat act accttgactc 20

[0163] <210>7

[0164] <211>20

[0165] <212>DNA

[0166] <213>人工序列

[0167] <220>

[0168] <221>MISC_FEATURE

[0169] <222>(1)..(20)

[0170] <223>根据第二次延伸获得序列设计的引物

[0171] <400>7

[0172] gtgcactttc cgaggcacgc 20

[0173] <210>8

[0174] <211>20

[0175] <212>DNA

[0176] <213>人工序列

[0177] <220>

[0178] <221>MISC_FEATURE

[0179] <222>(1)..(20)

[0180] <223>Histone3的5’-上游引物

[0181] <400>8

[0182] gaagcctcat cgataccgtc 20

[0183] <210>9

[0184] <211>19

[0185] <212>DNA

[0186] <213>人工序列

[0187] <220>

[0188] <221>MISC_FEATURE

[0189] <222>(1)..(19)

[0190] <223>Histone3的3’-下游引物

[0191] <400>9

[0192] ctaccactac catcatggc 19

[0193] <210>10

[0194] <211>21

[0195] <212>DNA

[0196] <213>人工序列

[0197] <220>

[0198] <221>MISC_FEATURE

[0199] <222>(1)..(21)

[0200] <223>GhDET2基因的5’-上游引物

[0201] <400>10

[0202] CQ302-09P103645序列表.txt

[0203] gaaaatggcc tccgatcaga c 21

[0204] <210>11

[0205] <211>28

[0206] <212>DNA

[0207] <213>人工序列

[0208] <220>

[0209] <221>MISC_FEATURE

[0210] <222>(1)..(28)

[0211] <223>接头序列

[0212] <400>11

[0213] cggtaggatc ccgcagaacg acggccag 28

[0214] <210>12

[0215] <211>19

[0216] <212>DNA

[0217] <213>人工序列

[0218] <220>

[0219] <221>MISC_FEATURE

[0220] <222>(1)..(19)

[0221] <223>接头序列

[0222] <400>12

[0223] cggtaggatc ccgcagaac 19

[0224] <210>13

[0225] <211>20

[0226] <212>DNA

[0227] <213>人工序列

[0228] <220>

[0229] <221>MISC_FEATURE

[0230] <222>(1)..(20)

[0231] <223>根据GhDET2基因的5’-上游序列设计的引物

[0232] <400>13

[0233] gtgcactttc cgaggcacgc 20

[0234] <210>14

[0235] <211>20

[0236] <212>DNA

[0237] <213>人工序列

[0238] <220>

[0239] <221>MISC_FEATURE

[0240] <222>(1)..(20)

[0241] <223>根据GhDET2基因的5’-上游序列设计的引物

[0242] <400>14

[0243] tgtgagtaca actttgcggt 20

[0244] <210>15

[0245] <211>17

[0246] <212>DNA

[0247] <213>人工序列

[0248] <220>

[0249] <221>MISC_FEATURE

[0250] <222>(1)..(17)

[0251] <223>NPT II基因的引物

[0252] <400>15

[0253] gaggctcggc tatgact 17

[0254] <210>16

[0255] <211>20

[0256] <212>DNA

[0257] <213>人工序列

[0258] <220>

[0259] <221>MISC_FEATURE

[0260] <222>(1)..(20)

[0261] <223>NPT II基因的引物

[0262] <400>16

[0263] atcgggagcg gcgataccgt 20