一种K2多肽合成产物及其应用

摘要

本发明涉及一种2拷贝分支肽及其应用。该分支肽的结构通式为(XA-XB-XC-XD-X1)2＞K-X3该分支肽在动物试验中显示出明显的抑制肿瘤生长和免疫增强作用，具有开发成为临床抗肿瘤药物和免疫增强剂的潜力。

权利要求

1.一种2拷贝分支肽，其特征在于，该多肽的结构通式为：（XA-XB-XC-XD）2>K，其中，XA为苏氨酸（Thr，T)，XB为赖氨酸（Lys，K)，XC为亮氨酸（Leu，L)，XD为赖氨酸（Lys，K)，其结构式表示为（TKLK）2>K。

2.一种临床用抑制肿瘤生长的药物，其特征在于，该药物包括权利要求1所述的2拷贝分支肽。

3.一种临床用免疫增强剂，其特征在于，该免疫增强剂包括权利要求1所述的2拷贝分支肽。

4.一种动物用免疫增强剂，其特征在于，该免疫增强剂包括权利要求1所述的2拷贝分支肽。

说明书

一种K2多肽合成产物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物医药领域中的多肽药物的开发，具体涉及到设计和制备一种2拷贝分支肽在临床上可抑制肿瘤生长和免疫增强剂上的应用。

背景技术

[0002] 生物体的遗传基因被存储在多聚核苷酸链上，遗传基因编码着执行生物学功能的蛋白质。生物体内的蛋白质多种多样，它们行使着各种生物学功能维持生命活动。蛋白质的种类虽然多不胜举，但它们基本上都是由20个自然界存在的天然氨基酸组成。由于氨基酸
的组成和排列顺序的差异导致了蛋白质的千差万别。一般来说，含有50个以上氨基酸的分
子被称为蛋白质，般超过10个氨基酸的肽链被称为多肽，少于10个氨基酸的肽链被称做寡
肽。目前发现最小的功能小肽只有2个氨基酸，通常较为常见的是4个以上的功能小肽。

[0003] 由于人类基因组计划的完成和人类蛋白组计划的开展，将会有越来越多的蛋白质功能片段被发现并被作为药物应用到生物医药领域中来。蛋白质的功能片段通常是指被发
现具备某种特定生物学功能的直链多肽片段，它们通常是几十个至两个氨基酸组成的肽类
片段，被鉴定和发现的蛋白质功能片段可通过人工合成的途径制备。现已开发并在临床上
得到应用的多肽药物有“催产素”、“胸腺肽α1”、“胸腺五肽”等，有在天然肽链的基础上进行人工改构制备成为用于治疗消化道出血和肢端肥大症的多肽药物“奥曲肽”和抗凝血作
用的“水蛭肽”等。蛋白质中的功能片段常常能筛选到含有几十个或小到只有二个氨基酸
组成的多肽片段，它们为人工合成多肽功能片段并将它们投入应用奠定了基础。

[0004] 在蛋白质、多肽或寡肽中，单一氨基酸的缺失、增加或被替换；氨基端(N端)或羧基端(C端)被封闭；序列中或游离端被化学基团修饰都会使得蛋白质、多肽或寡肽原有的生物活性发生不可预知的改变。设计、筛选和发现具有新的功能肽段或寻 找高效肽段是药物开发的一个重要环节。

[0005] 一段含有4个氨基酸的寡肽苏氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸(Thr-Lys-Leu-Lys，或TKLK)被发现具有和脾脏产生的生物活性小肽Tuftsin苏氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精
氨酸(Thr-Lys-Pro-Arg，或TKPR)具有相近似的生物活性作用(United StatesPatent：
5,028,593，filed：August15，1989)。实验证明Tuftsin能使脾内脾小体增多，生发中心生长活跃，增强粒细胞、单核细胞、巨噬细胞，自然杀伤细胞的趋化、游离、吞噬和产生细胞毒等作用，提高淋巴系统的细胞免疫功能。Tuftsin不仅促进单核吞噬细胞的MHC非限制性功
能，还促进其限制性的抗原递呈功能，提高细胞毒作用。

[0006] 本发明涉及设计和制备一种含有2拷贝TKLK片段的肽类分子以进一步有效提高其免疫功能及抗肿瘤活性，开发一种可在临床应用的抗肿瘤药物和免疫增强剂。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种2拷贝分支肽及其在抑制肿瘤生长的药物和免疫增强剂上的应用，所要解决的技术问题是使该2拷贝分支肽不仅保留功能寡肽的生物学活性
而且显著提高其生物学活性。

[0008] 本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。本发明提出一种2拷贝分支肽，是将具有该氨基酸序列特征组成的寡肽片段通过具有2个活化氨基可供进
行氨基酸加成缩合反应的赖氨酸(Lys，用＞K-表示)连接的桥梁链制备成4拷贝分支分
子，其结构通式为：(XA-XB-XC-XD-X1)4＞(K-X2)2＞K-X3，其中，XA代表极性不荷电氨基酸，包括丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、脯氨酸(Pro，P)、谷氨酰胺(Gln，Q)、天门冬酰胺(Asn，N)；XB和XD代表碱性氨基酸，包括组氨酸(His，H)、赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)；Xc代表非极性脂肪族氨基酸，包括甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Valine，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)。

[0009] ＞K-为具有2个活化氨基可供进行氨基酸加成缩合反应的赖氨酸；X1和X2分别代表由0-5个任意氨基酸所构成的氨基酸序列，X1和X2可以是相同氨基酸序列也可以是由
不同的氨基酸组成的序列，或可以为零不存在。

[0010]

[0011] 根据发明提出的2拷贝分支肽(XA-XB-XC-XD-X1)2＞K-X2所制备出来的TKLK分支肽(TKLK)2＞K在动物实验中显示具明显的免疫增强抑制肿瘤生长的作用。

[0012] 根据本发明提出的2拷贝分支肽设计通式制备出来的(TKLK)2＞K在动物实验中具显著的免疫增强作用。

[0013] 按照本发明设计通式制备出来的2拷贝分支肽(TKLK)2＞K克服了直链寡肽TKLK进入体内易被降解的缺点，不仅保持了TKLK片段的免疫增强活性和抗肿瘤作用，而且与
TKLK寡肽相比显著提高了其生物学活性。按照此方式制备的活性多肽开发成为药物在体内
的最终降解产物为游离氨基酸，可被机体直接吸收，没有明显的药物残留和毒副作用，作为药物具有良好的安全性，在临床应用上具有开发潜力。

具体实施方式

[0014] 本发明给出一个2拷贝分支肽的结构通式(XA-XB-XC-XD-X1)2＞K-X2，如：

[0015]

[0016] 具体给出一个2拷贝分支肽的结构为：(TKLK)4＞K2＞K，经过试验证明该多肽具有提升免疫力和抗肿瘤的作用，其结构如：

[0017]

[0018] 为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合实施例对依据本发明提出的2拷贝分支肽(TKLK)2＞K的设计方式、具体应用、实施方式、
特征及其功效做以下说明。

[0019] 1963年美国科学家R.B.Merrifield发明创立了将目的肽的羧基端氨基酸的羧基端(C端)固定在不溶性树脂上，树脂上结合的氨基酸的氨基端(N端)与有待连接的氨基
酸的羧基端进行缩合反应达到延长肽链的固相合成法。多肽合成的顺序是从多肽的羧基端
(C端)开始逐个氨基酸缩合连接向肽段的氨基端(N端)方向不断延伸。当进行氨基酸的
羧基接合反应时要将其氨基和侧链基团保护起来避免发生反应，目前常用的有叔丁氧羰基
(Boc)保护法和芴甲氧羰基(Fmoc)保护法，因此每连接上一个氨基酸就要经历一次以结合
在固相载体上的氨基酸作为氨基的脱保护基并同过量的下一个有待连接的氨基酸的活化
羧基发生缩合反应延长肽链。通过这样的步骤反复地多次地进行下去，即达到缩合-＞洗
涤-＞去保护-＞中和和洗涤-＞下一轮缩合(再接上一个氨基酸)，直至达到所需要合成
的肽链长度。

[0020] 多肽合成反应完成后采用TFA法将多肽从固相树脂上裂解下来，经过高效液相色谱(HPLC)C18反相色谱层析分离柱分离纯化后最终得到合成产物。基于以上的原理，多肽
合成可以是手工操作合成，也可以采用多肽合成仪经过输入合成序列和程序自动化合成取
得。如今固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术。本发明所述的多肽合成方式
可采用但并不局限于固相合成方式。

[0021] 这里需要说明的是2拷贝TKLK分支肽片段的合成方式是通过在赖氨酸上的2个活化氨基上同时进行氨基酸的缩合反应，并在以后的氨基酸加成缩合反应中同时得到延伸
达到同时合成多拷贝分支肽的目的。在合成直链多肽的过程中使用的是只有一个 活化氨
基的赖氨酸，其另一个氨基被保护起来所以不能发生缩合反应。当我们需要合成2拷贝分
支肽时，选用两个氨基均被活化可进行缩合反应的赖氨酸可以缩合连接上2个氨基酸，本
文中用＞K-表示。

[0022] 多肽分子是一类具有生物活性的分子，它们的氨基酸序列和结构决定了它们的生物学作用。多肽合成目前成为常用技术并已有商业化的服务公司可根据客户的需求提供合
成产物。关于多肽合成及纯化的具体细节和原理我们在此不再累叙，请参见由盛树力主编，科学技术文献出版社(1998年)出版的“多肽激素的当代理论和应用”一书。本发明合成
制备分支肽的方式可参照以上固相合成方式但并不局限于此方式。

[0023] 实施例一

[0024] Thr-Lys-Leu-Lys(TKLK)是一个具有免疫增强活性的寡肽，为达到制备出高效免疫增强活性和抗肿瘤活性的多肽产物设计和制备出一种含有2拷贝TKLK分支肽(TKLK)2＞
K。

[0025] 按照本发明所述，采用有机化学Fmoc保护的氨基酸固相合成法在多肽自动合成仪(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)合成，反应完成后得到的肽树脂采用
TFA法将多肽从树脂上裂解下来。采用Waters高效液相色谱C18反相色谱分离柱分离纯
化，收集流出峰溶液，经过冷冻干燥得到白色絮状多肽产物。

[0026] 本实施例通过人工固相合成的方式得到多肽TKLK和2拷贝分支肽(TKLK)2＞K，合成肽产物经高效液相色谱(HPLC)C18柱以流动相三氟乙酸/乙晴系统分离纯化可得到纯
度＞95.0％的合成产物。

[0027] 实验目的：

[0028] 观察比较合成产物2拷贝分支肽(TKLK)2＞K与单拷贝寡肽TKLK的对小鼠黑色素细胞瘤(B16株)移植瘤的抑瘤效果。

[0029] 药物：

[0030] 合成产物(TKLK)2＞K和TKLK为白色冻干粉剂，在-20℃避光保存。使用时用生理盐水溶解并稀释至所需浓度。

[0031] 实验动物：

[0032] C57小鼠30只，雌雄各半随机分组，体重18-22克。饲养在有层流系统及屏蔽设备的层流柜中，室温20±2℃，相对湿度40-60％。自由饮水摄食，给予实验动物标准配方料块，饮用蒸馏水。

[0033] 方法：

[0034] 每只小鼠右前肢肩胛部位皮下接种2×106/0.2ml瘤细胞。

[0035] 给药方式：

[0036] 于接种后的次日开始每3天皮下注射给药一次，连续4次。末次给药后第3天采用颈椎脱臼处死小鼠，剥取肿瘤称重，称量体重。

[0037] 表1：合成产物对小鼠移植性黑色素细胞瘤(B16)的抑瘤作用

[0038]组别 试验动物 始/终 给药剂量 试验结束动物 体重(x±SD，g) 瘤重 (x±SD，g) 抑制率 (％) P
对照组 10/10 生理盐水 10ml/kg 28.30±1.16 3.99±2.84 --
阳性组 10/10 TKLK 1ug/g体重 27.15±1.43 2.86±1.07 28.32 --
试验组 10/10 (TKLK)2＞K 1ug/g体重 27.03±1.09 1.92±1.27 51.87 ＜0.05[0039] 结果评价：

[0040] 实验过程中小鼠无死亡，体重均有增长，各组动物活动正常，药物注射部位无溃疡及红肿现象发生，提示受试药物无急性毒性作用。

[0041] 实验显示2拷贝分支肽(TKLK)2＞K不仅保留了单拷贝寡肽TKLK的生物活性，而且显示出更高的抑瘤活性。

[0042] 实施例二

[0043] 根据本发明提出的2拷贝分支肽设计通式(XA-XB-XC-XD-X1)2＞K-X2制备出(TKLK)2＞K，其结构如：

[0044]

[0045] 按照本发明所述，采用有机化学Fmoc保护的氨基酸固相合成法在多肽自动合成仪(ABI433A型)上自多肽的羧基端(C)向氨基端(N)合成，反应完成后得到的肽树脂采用
三氟乙酸TFA法将多肽从树脂上裂解下来。采用Waters高效液相色谱仪C18反相色谱柱
以流动相TFA/乙晴系统分离纯化，可得到纯度＞95.0％的合成产物，经过冷冻干燥得到白
色絮状固体多肽产物。

[0046] 本实施例通过人工固相合成的方式分别得到TKLK和2拷贝分支肽(TKLK)2＞K，纯度＞95.0％的合成产物。

[0047] 实验方法：

[0048] 新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)能够与鸡红细胞发生凝集现象，这是一种特异性的抗体中和反应，其原理是根据病毒的血凝素可凝集红细胞，但若先用特异
性抗体与病毒作用，再加入红细胞，则不出现红细胞凝集，称为血凝抑制试验(HI)，检测所用的抗血清稀释的最高倍数即是抗体的滴度。待测抗体的滴度越高说明免疫的效果越好。
HI方法具有以下优点：①敏感性强，可以检测到微量的抗体，结果也较为准确，是较敏感的血清学反应之一；②特异性强，病毒凝集红细胞只能被特异的抗体所抑制；③检测速度快，
1次HI试验只需2h左右，即可判定结果；④HI试验对环境要求不高，操作简单，1次还可检
测大量的样品。因此细胞凝集抑制试验(HI)已经成为一种常用于检测禽类动物血清抗体
的检测方法，具体细节请参见由郭鑫主编，中国农业大学出版社2007年出版的“动物免疫
学实验教程”。

[0049] 试验目的：

[0050] 应用鸡新城疫灭活疫苗与2拷贝分支肽(TKLK)2＞K联合使用并与TKLK做对照，接种SPF雏鸡检测HI抗体，观察二者是否具有免疫增强作用及差异。

[0051] 材料与方法：

[0052] 选取1月龄左右的SPF鸡分为5组，每组10只。在鸡的胸部肌肉接种鸡新城疫灭活疫苗(La Sota株)0.3ml。

[0053] 试验组：

[0054] 空白组：每只鸡胸部肌肉注射0.3ml生理盐水。

[0055] 正常组：每只鸡胸部肌肉接种疫苗0.3ml。

[0056] 试验组1：每只鸡胸部肌肉接种疫苗0.3ml，含有合成产物TKLK 1ug。

[0057] 试验组2：每只鸡胸部肌肉接种疫苗0.3ml，含有合成产物(TKLK)2＞K 1ug。

[0058] 饲养方式：各组同时饲养在隔离器内。

[0059] 采血：接种后第21天采血，分离血清进行HI试验。

[0060] 结果：

[0061] 检测结果表明疫苗中添加了合成产物TKLK或(TKLK)2＞K试验组的HI抗体滴度