具有α-蒎烯降解能力的维罗纳假单胞菌ZW及其应用

摘要

本发明提供了一种具有α-蒎烯降解能力的维罗纳假单胞菌(Pseudomonas veronii)ZW及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：M 209313，保藏日期2009年12月24日。本发明的Pseudomonasveronii ZW取自废水处理单元，能适应复杂的实际条件，该菌株降解污染物具有一定的广谱性，因而在工业废气废水的生物净化中具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一株具有α-蒎烯降解能力的维罗纳假单胞菌(Pseudomonas veronii)ZW，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC NO：M209313，保藏日期2009年12月24日。

2.如权利要求1所述的维罗纳假单胞菌ZW在降解石油工业污染物中的应用；所述石油工业污染物为下列之一或其中两种以上的混合：苯、二甲苯、乙苯、石油醚。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：将维罗纳假单胞菌ZW经培养获得的菌悬液投入到含石油工业污染物的污水中，在温度为20～40℃，pH值为4～9的条件下培养，获得处理后的污水。

4.如权利要求1所述的维罗纳假单胞菌ZW在降解α-蒎烯中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将维罗纳假单胞菌ZW经培养获得的菌悬液，加入活性污泥中，对生物滤塔进行挂膜启动，挂膜后的生物滤塔通入含α-蒎烯的废气进行处理。

说明书

具有α-蒎烯降解能力的维罗纳假单胞菌ZW及其应用

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一株具有α-蒎烯降解能力的新菌株——维罗纳假单胞菌(Pseudomonas veronii)ZW及其应用，属于环境污染物生物处理技术领域。
(二)背景技术

[0002] α-蒎烯(C10H16)是一种不易生物降解的挥发性有机化合物(VolatileOrganic Compounds，VOCs)，广泛应用于木材加工业、造纸业和制药业，是一种重要的有机合成原料。随着工业的发展，α-蒎烯被随意排放进入大气，不仅直接危害人类健康，而且会与大气中的臭氧、羟基等自由基发生反应，形成光化学烟雾并破坏臭氧层。因此研究α-蒎烯废气的净化技术就显得十分迫切和重要。

[0003] 废气生物净化技术具有去除效率高、处理费用低、二次污染小等特点，逐渐被广泛应用于VOCs的处理。采用生物技术处理含α-蒎烯废水废气的关键之一便是获得具有高效降解α-蒎烯能力的菌株。目前，国内外学者已对烷烃类化合物的生物降解进行了大量研究，但由于α-蒎烯溶解度极低、结构较为复杂，迄今分离到的α-蒎烯降解菌还比较有限，主要包括荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，诺卡式菌P18.3(Nocardia P18.3)，白色芽孢杆菌(Bacillus pallidus)等细菌，黑曲霉菌(Aspergillus niger)，灰霉菌(Botrytis cinerea)等真菌。此外，已分离到的菌株降解效率也有待于进一步提高。大量研究表明从环境中分离筛选高效的α-蒎烯降解菌，仍然是消除环境中α-蒎烯污染的重要环节。

[0004] 本发明中的假单胞菌(Pseudomonas sp.)是一种常见的杆菌，经检索专利和其他相关文献，尚未发现利用维罗纳假单胞菌(Pseudomonasveronii)降解α-蒎烯的报道。该降解菌的发现对工业废水废气中α-蒎烯等石油烃污染物的高效净化具有重要意义。(三)发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种高效、耐受能力强的具有α-蒎烯降解能力的维罗纳假单胞菌及其用途。

[0006] 本发明采用的技术方案是：

[0007] 一株具有α-蒎烯降解能力的维罗纳假单胞菌(Pseudomonas veronii)ZW，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国 武汉 武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC NO：M209313，保藏日期2009年12月24日。该降解菌的发现对工业废水废气中烷烃类污染物的高效净化具有重要意义。

[0008] 所述维罗纳假单胞菌ZW菌落特征如下：菌落呈乳白色，不透明，边缘光滑，具有黏性。透射电镜下观察该菌体的形态为稍长杆菌，具有鞭毛，革兰氏染色阴性，氧化酶阳性，淀粉水解和明胶水解阳性，接触酶阳性。

[0009] 所述维罗纳假单胞菌ZW16s rRNA基因序列(GenBank登陆号为GU357489)如下：

[0010] CAGTCATGAATCACACCGTGGTAACCGTCCCCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTT

[0011] CTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAA

[0012] CGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAG

[0013] TCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTCTGGGATTAGCTCCACC

[0014] TCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGC

[0015] CGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGG

[0016] CAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATTACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGC

[0017] GCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATG

[0018] CAGCACCTGTCTCAATGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCATT

[0019] GGATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTC

[0020] CACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTAC

[0021] TCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAGAGCTCAAGGCTCC

[0022] CAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT

[0023] TGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTC

[0024] GCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCA

[0025] CCACCCTCTACCATACTCTAGTCAGTCAGTTTTGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGC

[0026] CCGGGGATTTCACATCCAACTTAACTAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTA

[0027] ATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAG

[0028] CCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACAATCACGTATTAGGTAACTGCCCT

[0029] TCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCAT

[0030] GGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAG

[0031] GAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTT

[0032] ACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGG

[0033] CTCATCTGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATG

[0034] CGGTATTAGCGTCCGTTTCCGAACGTTATCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGG

[0035] CATTACTCACCCGTCCGCCGCTCTCAAGAGAAGCAAGCTTCTCTCTACCGCTCG。

[0036] 本发明还涉及所述的维罗纳假单胞菌ZW在降解石油工业污染物中的应用。

[0037] 优选的，所述石油工业污染物为下列之一或其中两种以上的混合：苯、二甲苯、乙苯、石油醚。

[0038] 具体的，所述应用为：将维罗纳假单胞菌ZW经培养获得的菌悬液投入到含石油工业污染物的污水中，在温度为20～40℃，pH值为4～9的条件下培养，获得处理后的污水。

[0039] 优选的，所述培养在温度30℃、pH7.2条件下进行，培养条件为好氧或兼性好氧。

[0040] 所述维罗纳假单胞菌ZW用于处理含BTEX类、石油醚类的废水时，优选的，所述废水中这类物质的初始浓度≤200mg/L，所述假单胞菌ZW在废水中培养温度为30℃、pH7.2。所述假单胞菌ZW在2d内对污水中初始浓度≤200mg/L的BTEX类、石油醚类污染物可实现不同程度的降解。

[0041] 本发明还涉及所述的维罗纳假单胞菌ZW在降解α-蒎烯中的应用。

[0042] 具体的，所述应用为：将维罗纳假单胞菌ZW经培养获得的菌悬液，加入活性污泥中，对生物滤塔进行挂膜启动，挂膜后的生物滤塔通入含α-蒎烯的废气进行处理。

[0043] 所述维罗纳假单胞菌ZW可以大大缩短生物滤塔挂膜启动的时间，生物膜形成时-3 -1间为27d左右。最大去除负荷达到43g·m ·h ，矿化率达到68％。优选的，对滤塔进行生
14 -3
物量测定，单位填料的生物量达到1.84×10 cfu·m 。

[0044] 本发明的Pseudomonas veronii ZW取自废水处理单元，能适应复杂的实际条件，该菌株降解污染物具有一定的广谱性，因而在工业废气废水的生物净化中具有广阔的应用前景。(四)附图说明

[0045] 图1为Pseudomonas veronii ZW的透射电镜照片和革兰氏染色照片；

[0046] 图2为Pseudomonas veronii ZW的系统发育树图；

[0047] 图3为不同pH下菌Pseudomonas veronii ZW对α-蒎烯的降解性能比较；

[0048] 图4为不同温度下菌Pseudomonas veronii ZW对α-蒎烯的降解性能比较；

[0049] 图5为不同供氧方式下菌Pseudomonas veronii ZW对α-蒎烯的降解性能比较；

[0050] 图6为菌Pseudomonas veronii ZW对不同有机物降解性能的比较；

[0051] 图7为处理α-蒎烯的生物滤塔去除性能的变化曲线。(五)具体实施方式

[0052] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0053] 实施例1：Pseudomonas veronii ZW的分离、纯化及其鉴定

[0054] 1.Pseudomonas veronii ZW的分离及纯化

[0055] Pseudomonas veronii ZW是从浙江宁波某炼化厂废水处理站的活性污泥中驯化、分离得到的一株革兰氏阴性菌。具体步骤如下：

[0056] 取浙江宁波某炼化厂废水处理站的活性污泥。自来水淘洗五次后，空曝48h，尽量去除残留的有机物。配制无机盐培养液(下同)，方法如下：KH2PO4 150mg，K2HPO4 600mg，NaNO3 2250mg，NH4Cl 2860mg，MgSO460mg，CaCl2 6mg，FeSO4 3mg，ZnCl2 0.44mg，MnCl20.30mg，KI 0.05mg，Na2MoO4 0.50mg和H3BO4 0.25mg，蒸馏水补足至1000mL；pH7.0～7.2。

[0057] 上述无机盐培养液加入α-蒎烯作为唯一碳源对活性污泥进行定向驯化，3d更换新鲜无机盐培养液，每天测定培养液的pH，31d～33d pH明显下降。

[0058] 按上述组成配制无机盐培养基，分装于250mL的密封玻璃瓶(50mL/个)，110℃灭菌40min。待培养基冷却后，加入α-蒎烯(50mg/L)作为唯一碳源，将驯化的污泥按体积分数为10％的量加入到培养基中，于30℃，160r/min的摇床培养。3d左右以10％的量转接到新鲜的灭菌培养基中，摇床培养。结合琼脂无机盐(上述无机盐培养液加入琼脂15g/L)平板划线分离，挑取单菌落接入无机盐培养基摇床培养，直到获得在上述培养基中生长快、菌落规则和性状稳定的可降解α-蒎烯的单菌。

[0059] 2.Pseudomonas veronii ZW的鉴定

[0060] 通过16S rRNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定ZW菌为Pseudomonas veronii。具体步骤如下：

[0061] 采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2.2，上海申能博彩生物科技有限公司)提取和纯化菌的DNA，4℃保存。选用细菌的通用引物BSF8/20和BSR1541/20对纯化的DNA进行PCR扩增，引物序列分别为：

[0062] BSF8/20：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′

[0063] BSR1541/20：5′-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3′

[0064] PCR反应程序设定为：先94℃预变性4min；然后94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。将PCR产物进行测序(上海英潍捷基)，测序结果见序列表。

[0065] 将PBT的16S rDNA序列上传到Genbank，获得Genbank的登录号GU357489，同时同Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Pseudomonas属，与Pseudomonas veronii(AF064460)同源性最高，达到97％，图2为该菌的系统发育树图。为了进一步确定鉴定结果的可靠性，经过生理生化实验，最终确定ZW属于Pseudomonas veronii。因此，将该菌命名为Pseudomonas veronii ZW。

[0066] 实施例2：Pseudomonas veronii ZW对α-蒎烯降解性能检测

[0067] 1.考察不同初始pH条件下菌Pseudomonas veronii ZW对α-蒎烯的降解特性[0068] 在不同初始pH下实施Pseudomonas veronii ZW对α-蒎烯的降解实验，发现其在pH7.2具有较高的降解α-蒎烯的能力，从实际应用角度看，pH7.2为最佳pH，此时降解率最高，具体实施步骤如下：

[0069] 分别取600mL无机盐培养液分装至30个250mL的厌氧瓶中，分成三组，每组10瓶，用1mol/L的稀盐酸和氢氧化钠调节培养液pH，分别为4、5、6、7、7.2、7.4、7.6、7.8、8、9，110℃灭菌40min。待培养液冷却后，其中两组每瓶加入生长对数期的ZW菌悬液，使初始细胞量达到2.29mg cells/L，加入α-蒎烯为唯一碳源，初始浓度为200mg/L，置于30℃的摇床中160rpm培养；另取10瓶同样培养液，不加ZW菌悬液，只加入α-蒎烯，置于30℃的摇床中同时培养，作为空白对照。培养3d后，用正己烷萃取培养液中剩余的α-蒎烯，采用气相色谱分析其中α-蒎烯浓度，同时测定菌悬液的生物量，绘制不同初始pH下α-蒎烯的降解率和菌ZW生物量。

[0070] 结果如图3所示，培养液初始pH值偏酸或是偏碱都不利于菌ZW的生长，α-蒎烯降解率都非常低；培养液pH值中性(7～8)时，菌株ZW表现出良好的生长情况，且降解率均在90％。当pH为7.2时，3d内菌株ZW能把200mg/L的α-蒎烯降解95％，且生物量达到108.56mg cells/L。

[0071] 2.考察不同培养温度下菌Pseudomonas veronii ZW对α-蒎烯的降解特性[0072] 在不同培养温度下实施Pseudomonas veronii ZW对α-蒎烯的降解实验，结果表明其最佳培养温度为30℃，具体实施方案如下：

[0073] 分别取300mL(pH7.2)无机盐培养液分装至15个250mL的厌氧瓶中，分成三组，每组5瓶，110℃灭菌40min。待培养液冷却后，其中两组每瓶加入生长对数期的ZW菌悬液，使初始细胞量达到3.58mgcells/L，加入α-蒎烯为唯一碳源，初始浓度为200mg/L，置于20℃、25℃、30℃、35℃和40℃的摇床中160rpm培养；另取5瓶同样培养液，不加ZW菌悬液，只加入α-蒎烯，置于20℃、25℃、30℃、35℃和40℃的摇床中同时培养。培养3d后，用正己烷萃取培养液中剩余的α-蒎烯，采用气相色谱分析其中α-蒎烯浓度，同时测定菌悬液的生物量，绘制不同培养温度下α-蒎烯的降解率和菌ZW生物量。

[0074] 结果如图4所示，数据表明，在20～30℃之间，随着培养温度升高，由于ZW中的降解酶活性增强，生化反应加快，生长及降解率提高；当温度继续升高到40℃，细胞中某些对温度敏感的物质(如降解酶)受到不可逆的破坏，生长受到了抑制，从而降解率也相应下降。ZW最佳培养温度选择30℃，3d内能把200mg/L的α-蒎烯降解97％，且生物量达到104.42mg cells/L。

[0075] 3.考察不同供氧方式下菌Pseudomonas veronii ZW对α-蒎烯的降解特性[0076] 在不同供氧方式下实施Pseudomonas veronii ZW对α-蒎烯的降解实验，结果表明其最佳生长条件为好氧，具体实施方案如下：

[0077] 分别取240mL(pH7.2)无机盐培养液分装至12个250mL的厌氧瓶中，分成三组，每组4瓶，110℃灭菌40min。待培养液冷却后，其中两组每瓶加入生长对数期的PBT菌悬液，7
使初始细胞量达到5.48×10cells/mL，加入α-蒎烯为唯一碳源，初始浓度为200mg/L，采用以下方式培养：(1)静置；(2)摇床转动；(3)充氧静置；(4)充氮后摇床转动；(5)充氧转动。培养2d后，用正己烷萃取培养液中剩余的α-蒎烯，采用气相色谱分析其中α-蒎烯浓度，同时测定菌悬液的生物量，绘制不同供氧方式下α-蒎烯的降解率和菌ZW生物量。

[0078] 结果如图5所示。菌ZW降解α-蒎烯的过程需要氧气的参与，但是氧气浓度过高时，反而会使菌ZW对α-蒎烯的降解能力下降。充氮转动是一个相对兼性好氧的环境，菌ZW也表现出一定的降解能力，但生物量的增长有限；此外，摇床转动培养也能促进氧气和降解底物的传质过程。因此。菌ZW对α-蒎烯的降解能力在好氧的条件下最强，兼性好氧的条件也有一定的降解能力。

[0079] 实施例3：Pseudomonas veronii ZW对苯系物、石油醚等物质降解性能检测[0080] 分别以苯、甲苯、乙苯、二甲苯和石油醚作为唯一碳源，考察菌ZW对于这些物质的降解能力。结果表明，菌ZW能降解苯、乙苯、邻二甲苯、对二甲苯、间二甲苯和石油醚，但不能降解甲苯。具体实施方案如下：

[0081] 分别取360mL(pH7.2)无机盐培养液分装至18个250mL的厌氧瓶中，分成三组，每组6瓶，110℃灭菌40min。待培养液冷却后，其中两组每瓶加入生长对数期的ZW菌悬液，使初始细胞量达到4.85mgcells/mL，分别加入α-蒎烯、苯、甲苯、乙苯、二甲苯和石油醚作为唯一碳源，初始浓度均为200mg/L，置于30℃的摇床中160rpm培养；另取6瓶相同培养液，不加ZW菌悬液，分别只加入以上各种碳源，置于30℃的摇床中同时培养，作为空白对照。培养2d后，用正己烷萃取培养液中剩余的各种有机碳源，采用气相色谱分析其浓度，同时测定菌悬液的生物量，绘制不同有机碳源的降解率和菌ZW生物量。

[0082] 结果如图6所示。菌ZW能不同程度地降解苯、乙苯、邻二甲苯、对二甲苯、间二甲苯和石油醚，但不能降解甲苯，而且在以甲苯为唯一碳源的无机盐培养基中生物量几乎没有变化。菌ZW能降解多种烃类化合物，扩大了其应用范围，特别是在石化工业的应用。

[0083] 实施例4：利用Pseudomonas veronii ZW接种生物滴滤塔，处理α-蒎烯模拟废气

[0084] 利用ZW菌液和活性污泥对生物滴滤塔进行挂膜启动，处理α-蒎烯模拟废气。生物膜形成时间为大约需27d。稳定运行期，滤塔对于α-蒎烯去除性能和矿化性能较好。具体实施方案如下：

[0085] 配制5L无机盐培养液(pH 7.2)，装于5L发酵罐，110℃灭菌40min。冷却后，接种处于生长对数期的ZW菌液，使发酵罐内生物量达到5.08mgcells/L，加入α-蒎烯作为生长碳源。在线监测发酵罐内pH和氧饱和状态，使其始终维持在pH 7.2左右和80％的氧饱和。3d后，发酵罐内生物量达到154.42mg cells/L。9000rpm离心10min获得菌体，悬浮于pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液中。与驯化后的污泥按按体积比1∶3混合后，浸泡生物载体填-3料，2d后将填料装入生物滴滤塔中。在营养液液pH6～7、α-蒎烯进口浓度386mg·m ～-3
886mg·m 、空床停留时间(EBRT)58s的条件下，采用以α-蒎烯为气相、菌悬液加驯化污泥为液相的气液相联合方法进行挂膜。

[0086] 结果如图7(a)所示。滴滤塔在挂膜启动初期(EBRT58s、进口浓度维持在-3400mg·m 左右)，去除率变化均不明显。滴滤塔从第13d开始去除率明显升高，到第17d-3
达100％。为了确定生物膜生长是否成熟，第19d提高进口浓度至600mg·m ，滴滤塔的去-3
除率逐渐升高并稳定在88％左右；当浓度再提高到860mg·m 左右时，去除率也一直维持在60％左右，这说明滤塔的挂膜启动基本完成。生物滤塔稳定运行期去除性能如图7(b)所示。当进口浓度较低时，滴滤塔对α-蒎烯的去除效率可以达到100％，去除负荷、CO2出口浓度随着进口浓度的增大而增大。进口浓度进一步提高后，去除率逐渐变小，滤塔对α-蒎烯的去除能力不再增加，而是维持在一个固定值，此时滤塔的降解性能达到最大值。
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当EBRT29s，进口浓度418mg·m 时，去除负荷达到最大值(43g·m ·h )。当EBRT为102s时，模拟废气在滤塔内有足够长的停留时间，生物膜能较为完全地降解底物，因此当α-蒎-3 -3
烯进口浓度为910mg·m 时，CO2出口浓度达到最大值2780mg·m 。