一种宽温度适用性的酸性葡聚糖酶AGL9A及其基因和应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种宽温度适应性的酸性葡聚糖酶AGL9A及其基因和应用。本发明提供了一种来源于脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4(CGMCC No.3147)的葡聚糖酶AGL9A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述葡聚糖酶的基因Agl9A。本发明的葡聚糖酶具有以下性质：最适pH5.8，最适温度55℃；极宽范围的温度适用性，较好的热稳定性。作为一种新型的酶制剂，可广泛用于动物饲料、食品、啤酒、能源等工业。

权利要求

1.一种在35-65℃之间适用的酸性葡聚糖酶AGL9A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种酸性葡聚糖酶基因Agl9A，其特征在于，编码权利要求1所述的在35-65℃之间适用的酸性葡聚糖酶AGL9A。

3.如权利要求2所述的在35-65℃之间适用的酸性葡聚糖酶基因Agl9A，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求3所述的在35-65℃之间适用的酸性葡聚糖酶基因Agl9A的重组载体。

5.根据权利要求4所述的在35-65℃之间适用的酸性葡聚糖酶基因Agl9A的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-Agl9A。

6.包含权利要求3所述的在35-65℃之间适用的酸性葡聚糖酶基因Agl9A的重组菌株。

7.如权利要求6的重组菌株，其特征在于，所述菌株为毕赤酵母菌。

8.一种制备在35-65℃之间适用的酸性葡聚糖酶AGL9A的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组葡聚糖酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的葡聚糖酶AGL9A。

9.权利要求1所述在35-65℃之间适用的酸性葡聚糖酶AGL9A的应用。

说明书

一种宽温度适用性的酸性葡聚糖酶AGL9A及其基因和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种宽温度适用性的酸性葡聚糖酶AGL9A及其基因和应用。

背景技术

[0002] β-葡聚糖是自然合成的多聚糖，广泛存在于自然界中，属植物细胞壁中的结构性非淀粉多糖，是以右旋葡萄糖为基本单位，属于多糖类中的同多糖类，具有线型的空间结构，存在于禾谷类(大麦、燕麦、黑麦和小麦)的糊粉层和胚乳细胞壁中。依物种不同，β-葡聚糖的含量及所占比例也不同。其中在大麦和燕麦当中所含比例最高。葡聚糖酶是可将葡聚糖降解成低聚糖和葡萄糖的一类酶的总称。目前葡聚糖酶在食品(如制糖业)，饲料(如鱼类，禽类，家畜等)，啤酒(如麦芽制作)、医药(如保健食品)等领域得到了日益广泛的应用。由于大麦自身的特点，大麦主要被应用于啤酒的酿造和饲料中，因此相关的葡聚糖酶在啤酒酿造和饲料工业中得到了最为广泛的应用。大麦发芽过程中，葡聚糖的分解是不完全的，分解程度取决于大麦品种和发芽工艺等，一般仅能分解30％-70％，残留的葡聚糖使糖化醪粘度增加，过滤速率降低，原料浸出率偏低，成品啤酒保质期短，形成雾浊或早期凝胶沉淀。在麦芽制造中，加入耐高温β-葡聚糖酶可显著降低成品麦芽中β-葡聚糖含量，降低麦汁粘度，提高麦汁滤速及得率，有利于改善啤酒风味，保持成品酒的非生物稳定性。在以大麦、小麦、黑麦、燕麦为基础的畜禽饲料中含有大量的β-葡聚糖，由于单胃动物体内没有消化β-葡聚糖的酶，β-葡聚糖作为一种非淀粉粘性多糖，在肠道内具有较高的粘度，阻止肠道消化液与食糜充分接触，从而影响营养物质的吸收，降低了饲料的营养价值，成为一种抗营养因子。葡聚糖是各种麦类饲料中的抗营养因子。添加β-葡聚糖酶，可以有效消除β-葡聚糖的抗营养作用，大大提高了饲料的利用效率。

[0003] 脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)是一类嗜热耐酸菌。由于脂环酸芽孢杆菌(A.acidocaldarius)等可以引起巴氏灭菌果汁的腐败，产生难以接受的气味，加上其独特的生存能力。目前已引起全球食品工业和学术界的极大关注。

[0004] 在饲料工业中，动物胃肠道是酸性环境(如猪的胃肠道)，同时在饲料的加工过程中，有一个短时的高温过程；在啤酒的麦芽制备和糖化过程中，由于麦芽当中的内源性酶的最适pH环境是pH5.0-6.0，大多数情况下在糖化过程中将pH人为调整到pH5.6，另外，麦芽的糖化过程是一个温度逐渐升高的过程。因此，获得新型具有优良温度稳定性和适用性的酸性葡聚糖酶的研究具有重大意义。克隆和分离具有高温度稳定性和适应性的的葡聚糖酶可以更好的应用于饲料和啤酒工业，而且可以降低生产成本，都是葡聚糖酶应用于工业化生产所必需的。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种能高效应用的宽温度适用性的酸性葡聚糖酶。

[0006] 本发明的再一目的是提供编码上述宽温度适用性的酸性葡聚糖酶的基因。

[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

[0008] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

[0009] 本发明的另一目的是提供一种制备上述宽温度适用性的酸性葡聚糖酶的基因工程方法。

[0010] 本发明的另一目的提供上述宽温度适用性的酸性葡聚糖酶的应用。

[0011] 本发明从脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4，(保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCCNo.3147，保藏日期：2009年6月29号)中分离得到一种新的宽温度适用性酸性葡聚糖酶AGL9A。

[0012] 本发明提供了一种宽温度适用性的酸性葡聚糖酶AGL9A，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

[0013] SEQ ID NO.1：

[0014] MEATMQAAIHINQLGYRPQDRKRFYVSGCGGSFAVFRADGSEVFAGELQAVGDD

[0015] KATGMQVYIGDISDVIEVGTYQLTVPGIGQSVSLAIHPDVYANLHKGLQKFFYFQR

[0016] CGVELSAEHAGEFSHAACHVEKAHVYAEPSRRIDCHGGWHDAGDYGKYVVPAA

[0017] KAVADLLLAYEFYPKAFMSPVGIPESGAGLPDVLSEVRFELEWMLRMQDEQTGGV

[0018] YHKVTTYRFPPLSTMPEDDRGELVLSPISYAATATFAAALAHAARIYRAFDADFATR[0019] CLNAAARAYEWCTSHDAEPFHNPDGVATGEYGDKKLSDEHYWAAASLLQATGE

[0020] DRYHQACLQAFATGGFSLTELGWADVGGYGTIAYLRADRAVTQAQVWEHLRKA

[0021] WLTEADRLVSLGACTAFGIPLAEHDYIWGSNMVLLNRGMHLLIAYALEPSDLYVD

[0022] GALQTIHYMLGENALQQCYVSGYGRKPLLHPHHRPSVADAVEAPVPGMLAGGPN

[0023] RNLQDTVARERLQNQPAARCFLDHEESYSTNEVAVYWNSPAVFVVSHFVGV

[0024] 该酶基因编码541个氨基酸，因此葡聚糖酶AGL9A的理论分子量为59.4kDa。

[0025] 本发明的葡聚糖酶AGL9A在中性及酸性范围内均具有较高活性。本发明筛选到一种脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidumA4(CGMCCNo.3147)所产生的葡聚糖酶，其在毕赤酵母的重组酶最适pH值为5.8，在pH5.0～7.0的范围内维持75％以上的酶活性；在pH4.2～10.4的范围内37℃保温60分钟，能够保持75％以上的酶活性。最适温度为
55℃，在35℃-65℃间均具有55％以上的酶活力；在60℃保温60分钟，剩余酶活达到70％以上。这种性质的葡聚糖酶还未曾有过报道。

[0026] 本发明提供了编码上述宽温度适用性酸性葡聚糖酶AGL9A的基因。具体地，该基因的基因序列如SEQ ID NO.2所示：

[0027] SEQ ID NO.2：

[0028] ATGGAGGCGACTATGCAAGCAGCAATACATATAAACCAGTTGGGCTATCGTCCA

[0029] CAGGATCGGAAACGTTTCTATGTAAGCGGTTGCGGAGGTTCGTTTGCCGTCTTC

[0030] CGGGCGGATGGTAGCGAGGTTTTCGCTGGCGAATTGCAGGCAGTCGGAGATGA

[0031] CAAGGCAACCGGAATGCAGGTGTACATCGGCGACATCAGTGACGTCATCGAAG

[0032] TCGGCACATATCAACTCACAGTGCCGGGCATAGGACAATCGGTCTCTTTGGCCA

[0033] TTCATCCTGACGTGTATGCCAATCTGCATAAAGGCTTACAGAAGTTTTTCTACTT

[0034] TCAGCGCTGTGGCGTCGAGTTGTCTGCTGAGCACGCCGGCGAATTCTCGCATG

[0035] CCGCTTGTCACGTGGAAAAGGCACATGTGTATGCCGAACCATCGCGGCGTATCG

[0036] ACTGTCACGGCGGATGGCATGACGCTGGGGACTACGGGAAATACGTTGTGCCG

[0037] GCGGCGAAAGCGGTTGCGGATCTGTTGCTCGCCTATGAATTCTATCCGAAGGCA

[0038] TTTATGAGCCCGGTCGGTATCCCAGAGTCGGGAGCCGGCTTGCCTGACGTGCTT

[0039] AGTGAGGTTCGCTTTGAACTCGAATGGATGTTGCGTATGCAGGATGAGCAGAC

[0040] GGGAGGCGTCTATCACAAGGTCACAACTTATCGGTTCCCTCCTTTGTCAACGAT

[0041] GCCTGAGGACGATCGTGGGGAACTGGTGCTCTCGCCTATTTCATACGCAGCTAC

[0042] TGCGACATTCGCGGCTGCACTTGCCCATGCGGCTCGCATCTATCGGGCGTTTGA

[0043] TGCGGATTTTGCAACCCGATGTTTGAACGCTGCTGCGCGGGCCTACGAATGGTG

[0044] CACGAGTCATGACGCCGAACCGTTTCACAATCCGGATGGCGTAGCCACAGGCG

[0045] AGTATGGCGATAAGAAGCTGAGCGATGAACACTACTGGGCAGCGGCTTCGCTT

[0046] TTGCAAGCGACGGGAGAAGATCGCTATCATCAGGCATGCTTGCAGGCCTTCGC

[0047] AACTGGAGGGTTTTCCCTGACTGAGCTAGGCTGGGCTGACGTTGGCGGTTACG

[0048] GCACAATCGCGTATTTGCGGGCGGATCGTGCCGTTACGCAGGCGCAGGTTTGG

[0049] GAACATCTGCGCAAAGCTTGGCTGACAGAGGCGGATAGGTTGGTCAGCCTTGG

[0050] TGCATGTACGGCATTTGGCATTCCGCTCGCGGAGCACGATTACATTTGGGGAAG

[0051] CAACATGGTGTTGTTAAATCGTGGCATGCACTTGCTGATTGCATACGCACTGGA

[0052] ACCTTCCGATCTGTACGTCGACGGAGCTTTACAGACTATTCATTACATGCTGGGC

[0053] GAAAATGCCTTACAACAGTGCTACGTTTCAGGGTATGGGAGAAAGCCGCTTCTT

[0054] CATCCTCACCATCGTCCATCGGTGGCTGATGCAGTCGAGGCTCCTGTGCCAGGC

[0055] ATGTTGGCCGGCGGCCCCAATCGCAATTTGCAAGATACAGTAGCTCGCGAGCGT

[0056] CTGCAGAACCAGCCTGCAGCACGATGTTTTCTCGATCACGAAGAAAGTTATTCG

[0057] ACCAATGAAGTGGCTGTCTACTGGAACTCGCCAGCCGTCTTTGTGGTTTCTCAT

[0058] TTTGTGGGTGTCTGA

[0059] 本发明通过PCR的方法分离克隆了葡聚糖酶基因AGL9A，DNA全序列分析结果表明，葡聚糖酶AGL9A结构基因AGL9A全长1626bp，含有一个终止子TGA。葡聚糖酶AGL9A的成熟蛋白理论分子量为59.4kDa。将葡聚糖酶基因AGL9A序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对。该基因与来源于Alicyclobacillusacidocaldarius的第九家族的纤维素酶(CAC34051)氨基酸序列最高一致性为48％，说明AGL9A是一种新的葡聚糖酶。

[0060] 本发明还提供了包含上述葡聚糖酶基因的重组载体，优选为pPIC9-Agl9A。将本发明的葡聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将葡聚糖酶基因插入到质粒pPIC9上的SnaBI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-Agl9A。

[0061] 本发明还提供了包含上述葡聚糖酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/Agl9A。

[0062] 本发明还提供了一种制备酸性葡聚糖酶AGL9A的方法，包括以下步骤：

[0063] 1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

[0064] 2)培养重组菌株，诱导重组葡聚糖酶AGL9A表达；以及

[0065] 3)回收并纯化所表达的葡聚糖酶AGL9A。

[0066] 其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/Agl9A。

[0067] 本发明还提供了上述酸性葡聚糖酶AGL9A的应用。

[0068] 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料，食品特别是啤酒工业中应用新的葡聚糖酶。本发明的葡聚糖酶最适pH为5.8，在pH 5.4～6.0都有较高的酶活性(90％以上)；pH稳定性好；具有较好的耐热的能力。其较高耐热性能，可以有效降低在啤酒麦芽制作过程中酶活力的损失，降低葡聚糖酶的应用成本。较高pH适应范围提高饲料中非淀粉性多糖的转化率，降低配方成本，减少环境污染；可应用于啤酒工业，降低麦芽汁的粘度，提高过滤效率，增加麦芽汁产率；还可以用于生物能源中，如将造纸工业废料及农业废弃物中的葡聚糖转化为D-葡萄糖单体，进而被大多数微生物代谢，转化成有价值的燃料。水解产物(葡萄糖和低聚葡糖)可应用在保健食品行业；在制药工业中葡聚糖与其它物质结合使用，可以延缓药物成分的释放。

附图说明

[0069] 图1在毕赤酵母表达的重组葡聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1：低分子量蛋白质Marker；2：纯化的重组葡聚糖酶。

[0070] 图2重组葡聚糖酶的最适pH。

[0071] 图3重组葡聚糖酶的pH稳定性。

[0072] 图4重组葡聚糖酶的最适温度。

[0073] 图5重组葡聚糖酶的热稳定性。

[0074] 图6重组葡聚糖酶的各种蛋白酶抗性

[0075] 脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidumCGMCC3147，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCCNo.3147，保藏日期：2009年06月29号。

具体实施方式

[0076] 试验材料和试剂

[0077] 1、菌株及载体：脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4由本发明人分离获得，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCCNo.3147。毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

[0078] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。大麦葡聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

[0079] 3、培养基：

[0080] (1)脂环酸芽孢杆菌AlicyclobacillushesperidumA4CGMCC3147培养基组成为：

[0081] 0.2％蛋白胨、0.1％酵母提取物、0.2％葡萄糖，pH3.0.

[0082] (2)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

[0083] (3)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

[0084] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

[0085] 实施例1脂环酸芽孢杆菌AlicyclobacillushesperidumA4(CGMCCNo.3147)的分离纯化及其产酶特性

[0086] 将脂环酸芽孢杆菌AlicyclobacillushesperidumA4接种至产酶培养基平板(酵母提取物1.0g、胰蛋白胨2.0g、燕麦葡聚糖5.0g，琼脂30，刚果红0.5g，用盐酸调pH3.0)60℃培养72小时后，用0.5％的刚果红染色，根据透明圈的有无和大小初步验证其具有葡聚糖酶活性。将脂环酸芽孢杆菌AlicyclobacillushesperidumA4经产酶培养基(酵母提取物1.0g、胰蛋白胨2.0g燕麦葡聚糖5.0g，用硫酸调pH3.0)60℃培养48小时后，测定上清液的葡聚糖酶活性。证明其具有葡聚糖酶活性。

[0087] 实施例2脂环酸芽孢杆菌AlicyclobacillushesperidumA4(CGMCCNo.3147)葡聚糖酶编码基因AGL9A的克隆

[0088] 基因序列的获得

[0089] 根据第九家族葡聚糖酶基因的保守(IPESG和TGEYGD)序列设计合成了简并引物Agl9F，Agl9R如表1

[0090] 以脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus hesperidum A4(CGMCC No.3147)总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；前10个循环，94℃变性30sec，50℃-55℃touchdown(0.5℃/循环)退火30sec，72℃延伸0.5min，然后25个循环条件为后94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸1.5min。最后72℃保温10min。得到一约
354bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

[0091] 根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性嵌套引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，并将它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物)见表1。

[0092] 表1.木聚糖酶XYNA4TAIL-PCR特异性引物

[0093]

[0094] N代表A，G，C或T；H代表T，A或C；R代表A或G；Y代表C或T

[0095] 通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后测序。

[0096] 通过比较葡聚糖酶的基因组序列后发现该基因全长1626bp，编码541个氨基酸和一个终止密码子，N端没有预测的信号肽序列。所测出的基因AGL9A的氨基酸序列与GeneBank上的葡聚糖酶基因序列进行同源比较，最高一致性为48％，说明AGL9A是一种新的葡聚糖酶，表明从AlicyclobacillushesperidumA4(CGMCCNo.3147)中分离克隆得到的编码葡聚糖酶的基因为新基因。

[0097] 提取脂环酸芽孢杆菌AlicyclobacillushesperidumA4(CGMCCNo.3147)基因组DNA：

[0098] 将液体培养2天的菌液离心取菌体，加入1mL溶菌酶，37℃处理60min，再加入裂解液，65℃水浴锅裂解30min，每隔10min混匀一次，在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

[0099] 根据Agl9A序列信息设计合成了引物(Agl9AF：10GCATACGTAATGGAGGCGACTATGCAAGCAGC和Agl9AR：GAAGCGGCCGCTCAGACACCCACAAAATGAGAAACCAC)

[0100] 以脂环酸芽孢杆菌AlicyclobacillushesperidumA4(CGMCCNo.3147)总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃变性5min，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸90s，30个循环。最后72℃保温10min。

[0101] 实施例3重组葡聚糖酶的制备。

[0102] 将表达载体pPIC9进行双酶切(SnaBI和NotI)，同时将编码葡聚糖酶的基因Agl9A双酶切(SnaBI和NotI)，切出编码葡聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有葡聚糖酶基因Agl9A的重组质粒pPIC9-Agl9A并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/Agl9A。

[0103] 取含有重组质粒的GS115菌株，接种于400mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于200mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导48h后，离心收集上清。测定葡聚糖酶的活力。重组葡聚糖酶的表达量为2.14U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组葡聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。

[0104] 实施例4重组葡聚糖酶的活性分析

[0105] DNS法：具体方法如下：在pH5.8(0.1M磷酸二氢钠-柠檬酸)，55℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液和900μL(1％，w/v)底物，反应10min，加入1.5mLDNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

[0106] 实施例5重组葡聚糖酶AGL9A的性质测定

[0107] 1、重组葡聚糖酶AGL9A的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

[0108] 将实施例3纯化的重组葡聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物葡聚糖用不同pH的缓冲液(0.1M甘氨酸-盐酸pH1.2-2.6；0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠pH3.0-7.4；0.1MTris-HClpH7.8-8.6；0.1M甘氨酸-氢氧化钠pH9.0-12.0)、在60℃下进行葡聚糖酶活力测定。结果(图2)表明，AGL9A的最适pH为5.8，在pH5.0～7.0的范围内维持75％以上的酶活性。葡聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH7.0缓冲液体系中55℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明葡聚糖酶在pH4.2-10.4之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在75％以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。

[0109] 2、葡聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

[0110] 葡聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.8)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为葡聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明其最适温度为55℃。酶的热稳定性性试验表明(图5)，重组酶在60℃时稳定性非常好。60℃下保温60min，剩余酶活性为72％，所述酶在35℃-65℃间均具有55％以上的酶活力。

[0111] 3、葡聚糖酶的Km值测定方法如下：

[0112] 用不同浓度的大麦葡聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.8)缓冲液体系中，55℃下测定酶活性，计算出其在55℃下的km值。经测定，此葡聚糖酶在55℃下以-1葡聚糖为底物的km值为4.82mg ml 1.90mg/mL，最大反应速度Vmax为74.57μmol/min·mg[0113] 4、不同金属离子化学试剂对XYLA4酶活的影响测定如下：

[0114] 在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为2和20mmol/L。在55℃、pH5.8条件下测定酶活性。结果(表1)2+
表明，大多数离子和化学试剂在浓度为2mmol时重组葡聚糖酶的活力没有明显变化。Pb ，
3+ + 2+
Cr ，可以部分抑制其活力，但是Ag，Hg 和SDS几乎强烈抑制其活力。当浓度为20mmo时
3+ 2+ 2+ + 2+
Fe ，Pb ，EDTA，Cu ，Ag，Hg ，和SDS均强烈抑制其活力。β-巯基乙醇在1mmol和10mmol时能分别使重组酶活力增加到原来的1.19和1.56倍。

[0115] 表1各种化学试剂对葡聚糖酶AGL9A活力的影响

[0116]

[0117]

[0118] 实施例6重组葡聚糖酶的模拟麦芽水解实验

[0119] 具体方法如下：10g麦芽粉，溶解在90ml的pH5.6(0.1M磷酸二氢钠-柠檬酸)缓冲液中，加入1ml的酶液(20u/ml)，未加酶液作为对照。水浴下100rpm转速下按照下面程序处理：

[0120] 45℃处理30min，然后50℃处理30min，55℃处理60min，60℃处理60min最后100℃处理5min条件下，冷却到25℃，3000rpm离心5min后，取上清液(10ml)用中速滤纸测过滤速率，用毛细管粘度计测量粘度。

[0121] 结果表明：经过酶液处理的粘度比对照下降了6.12％，过滤时间缩短了26.71％。说明Agl9A可以很好应用在啤酒工业中

[0122] 序列表

[0123] <110>中国农业科学院饲料研究所

[0124] <120>一种宽温度适用性的酸性葡聚糖酶AGL9A及其基因和应用

[0125] <160>2

[0126] <210>1

[0127] <211>541

[0128] <212>PRT

[0129] <213>脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus hesperidum A4)

[0130] <400>1

[0131] MEATMQAAIH INQLGYRPQD RKRFYVSGCG GSFAVFRADG SEVFAGELQA

[0132] VGDDKATGMQ 60

[0133] VYIGDISDVI EVGTYQLTVP GIGQSVSLAI HPDVYANLHK GLQKFFYFQR

[0134] CGVELSAEHA 120

[0135] GEFSHAACHV EKAHVYAEPS RRIDCHGGWH DAGDYGKYVV PAAKAVADLL

[0136] LAYEFYPKAF 180

[0137] MSPVGIPESG AGLPDVLSEV RFELEWMLRM QDEQTGGVYH KVTTYRFPPL

[0138] STMPEDDRGE 240

[0139] LVLSPISYAA TATFAAALAH AARIYRAFDA DFATRCLNAA ARAYEWCTSH

[0140] DAEPFHNPDG 300

[0141] VATGEYGDKK LSDEHYWAAA SLLQATGEDR YHQACLQAFA TGGFSLTELG

[0142] WADVGGYGTI 360

[0143] AYLRADRAVT QAQVWEHLRK AWLTEADRLV SLGACTAFGI PLAEHDYIWG

[0144] SNMVLLNRGM 420

[0145] HLLIAYALEP SDLYVDGALQ TIHYMLGENA LQQCYVSGYG RKPLLHPHHR

[0146] PSVADAVEAP 480

[0147] VPGMLAGGPN RNLQDTVARE RLQNQPAARC FLDHEESYST NEVAVYWNSP

[0148] AVFVVSHFVG 540

[0149] V 541

[0150] <210>2

[0151] <211>1626

[0152] <212>DNA

[0153] <213>脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus hesperidum A4)

[0154] <400>2

[0155] atggaggcga ctatgcaagc agcaatacat ataaaccagt tgggctatcg tccacaggat 60[0156] cggaaacgtt tctatgtaag cggttgcgga ggttcgtttg ccgtcttccg ggcggatggt 120[0157] agcgaggttt tcgctggcga attgcaggca gtcggagatg acaaggcaac cggaatgcag 180[0158] gtgtacatcg gcgacatcag tgacgtcatc gaagtcggca catatcaact cacagtgccg 240[0159] ggcataggac aatcggtctc tttggccatt catcctgacg tgtatgccaa tctgcataaa 300[0160] ggcttacaga agtttttcta ctttcagcgc tgtggcgtcg agttgtctgc tgagcacgcc 360[0161] ggcgaattct cgcatgccgc ttgtcacgtg gaaaaggcac atgtgtatgc cgaaccatcg 420[0162] cggcgtatcg actgtcacgg cggatggcat gacgctgggg actacgggaa atacgttgtg 480[0163] ccggcggcga aagcggttgc ggatctgttg ctcgcctatg aattctatcc gaaggcattt 540[0164] atgagcccgg tcggtatccc agagtcggga gccggcttgc ctgacgtgct tagtgaggtt 600[0165] cgctttgaac tcgaatggat gttgcgtatg caggatgagc agacgggagg cgtctatcac 660[0166] aaggtcacaa cttatcggtt ccctcctttg tcaacgatgc ctgaggacga tcgtggggaa 720[0167] ctggtgctct cgcctatttc atacgcagct actgcgacat tcgcggctgc acttgcccat 780[0168] gcggctcgca tctatcgggc gtttgatgcg gattttgcaa cccgatgttt gaacgctgct 840[0169] gcgcgggcct acgaatggtg cacgagtcat gacgccgaac cgtttcacaa tccggatggc 900[0170] gtagccacag gcgagtatgg cgataagaag ctgagcgatg aacactactg ggcagcggct 960[0171] tcgcttttgc aagcgacggg agaagatcgc tatcatcagg catgcttgca ggccttcgca 1020[0172] actggagggt tttccctgac tgagctaggc tgggctgacg ttggcggtta cggcacaatc 1080[0173] gcgtatttgc gggcggatcg tgccgttacg caggcgcagg tttgggaaca tctgcgcaaa 1140[0174] gcttggctga cagaggcgga taggttggtc agccttggtg catgtacggc atttggcatt 1200[0175] ccgctcgcgg agcacgatta catttgggga agcaacatgg tgttgttaaa tcgtggcatg 1260[0176] cacttgctga ttgcatacgc actggaacct tccgatctgt acgtcgacgg agctttacag 1320[0177] actattcatt acatgctggg cgaaaatgcc ttacaacagt gctacgtttc agggtatggg 1380[0178] agaaagccgc ttcttcatcc tcaccatcgt ccatcggtgg ctgatgcagt cgaggctcct 1440[0179] gtgccaggca tgttggccgg cggccccaat cgcaatttgc aagatacagt agctcgcgag 1500[0180] cgtctgcaga accagcctgc agcacgatgt tttctcgatc acgaagaaag ttattcgacc 1560[0181] aatgaagtgg ctgtctactg gaactcgcca gccgtctttg tggtttctca ttttgtgggt 1620[0182] gtctga 1626