促进外源蛋白在CHO细胞中高效表达的核苷酸序列片段

摘要

促进外源蛋白在CHO细胞中高效表达的核苷酸序列片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明将KH序列克隆到不同的表达载体的转录本两侧或者一侧，然后再克隆如相应的外源基因，将采用表达不同外源基因的表达载体分别转染CHO-K1，CHO/dhfr-，DG44等细胞，经检查相应的单克隆细胞形成率、单克隆细胞传代稳定性、外源基因表达水平等，数据显示加了KH序列的载体能够提高外源基因的表达水平以及提高外源基因的传代稳定性。

权利要求

1.促进外源蛋白在CHO细胞中高效表达的核苷酸序列片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含有权利要求1所述核苷酸序列片段的重组质粒表达载体。

3.由权利要求2所述重组质粒表达载体而得的重组微生物。

说明书

促进外源蛋白在CHO细胞中高效表达的核苷酸序列片段

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术应用领域，主要涉及一种来源于CHO细胞的核苷酸序列。

背景技术

[0002] 按照宿主细胞的类型来分，基因表达系统大致可以分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其他系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而，表达产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。

[0003] 在过去的十年间，利用哺乳动物细胞表达系统高效表达重组蛋白的研究取得了令人瞩目的进展。目前，哺乳动物细胞表达系统不仅已经成为多种基因工程药物的生产平台，而且在新基因功能的发现、蛋白质的结构和功能研究中也起了极为重要的作用。

[0004] 常用的用于表达重组蛋白的动物细胞有CHO细胞、骨髓瘤细胞(如Sp2/0和J558L)、COS细胞、293细胞等。CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)。其中CHO和NSO细胞是目前应用最多的哺乳动物细胞表达系统细胞。不同的细胞对重组蛋白的修饰可能会稍有差别，如CHO细胞表达的人白血病抑制因子和人组织因子旁路抑制剂分别存在N端和C端氨基酸的缺失，而这些改变在另外的一些细胞株中并未出现。

[0005] 真核细胞中，CHO细胞体系是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。因为与其他表达系统相比，它具有许多优点：①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有目的产物胞外分泌功能，便于下游的分离纯化；③具有重组基因的高效扩增和表达能力；④具有贴壁生长特性，又可以进行悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，而且表达水平较高；⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的后分离。但缺点是CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染。目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达。

[0006] 外源基因在哺乳动物细胞有两种不同的表达方式，一种称为瞬时表达，另一种称为稳定表达。瞬时表达完全由导入的质粒来执行，质粒并没有插入到细胞的染色体DNA中，不存在因为重排和染色体不同部位对导入基因表达的影响。外源基因导入到哺乳动物细胞后1-4天，就可以检测到基因的表达情况，这种表达是这是由于一部分导入的DNA进入细胞核后被转录成mRNA，再进入胞质被翻译的缘故；由于这一方法比较简单易行，通过选择好的表达载体和转染方法，蛋白表达量能达到较高的程度，是研究蛋白结构功能的常用蛋白表达方法。瞬时表达是暂时的，由于绝大多数转入的外源基因没有整合到细胞染色体上而被降解或随细胞分裂丢失，因此数天后，在转染的细胞群中将无法再检测到外源基因的表达；也有外源基因在受体细胞中的复制和表达最终导致细胞的裂解而无法得到永久表达(如具有SV40复制起始区的表达质粒在COS细胞中)。因为瞬时表达是由转染效率、质粒DNA的质量(瞬时转染所用的质粒DNA通常是超螺旋的环状质粒)以及表达水平的不稳定性引起的，所以在具体的实验中需要很好地控制实验的条件来缩小实验批次间的差异。

[0007] 在稳定表达中，要使得导入的基因能永久表达，需要导入的DNA能随细胞的分裂而复制，这要求被导入的基因DNA整合到细胞的染色体DNA中，因此需要通过大量筛选来富集这类细胞，这通常是利用同时导入外源基因和筛选标记基因来完成的。这些筛选基因提供细胞一种药物的抗性，故可以用相应的药物来筛选和富集外源基因整合的细胞系。在稳定表达中，由于外源基因整合到细胞的染色体上这一过程通常涉及DNA重排，以及受到插入位点周边序列的影响，故外源基因在不同的细胞克隆中表达水平差异很大，需要对多个克隆细胞进行表达量的鉴定。建立永久表达系主要是用于长期制备或利用某个蛋白。稳定表达有时也能利用一些病毒能长期以附加体形式存在于细胞中的特性来实现，如EB病毒和牛乳头瘤病毒。另外，由于逆转录病毒和腺病毒相关病毒可以高效完整地将病毒基因组DNA插入细胞染色体上也被被用于建立永久的表达细胞系。

[0008] 哺乳动物细胞大规模培养是药用蛋白生产中一个非常重要的平台。然而，该平台的生产还存在着一些缺点，包括蛋白生产的可预见性差、长期表达的表达量不稳定和表达量不足等。与传统的小分子药物的生产相比，治疗用蛋白的生产成本非常昂贵，因此，一个能改善蛋白生产可预见性、产量和稳定性的方法，对哺乳动物细胞大规模表达外源蛋白是非常有价值的。

[0009] 导致以上各种问题的一个主要的原因是与染色质有关。染色质在基因表达过程中有着重要的影响。如果导入细胞的外源基因随机整合进或靠近非亲和染色质(异染色质)的时候，这个外源基因的表达会被沉默掉。一个解决的办法是把一些基因组边界元件加在外源基因的两侧，来消除异染色质的阻遏作用。

[0010] 迄今为止，已经发现的边界元件主要有如下几种：核骨架结合区(matrix attachment regions，MARs)或称为染色体支架区(scaffoldattachment regions，SARs)，座位控制区(locus control region，LCR)，隔离子(insulator)和抗阻遏子元件(anti-repressor elements)等。这些元件为大小几十到几千个碱基组成的核苷酸序列，对目的基因的表达提高和抵抗沉默方面有积极的意义。

[0011] 在实际操作过程中，为促进外源基因在动物细胞中高效表达，又不影响目的外源基因的正常表达，这些边界元件都被构建在质粒载体中外源目的基因转录本的外侧，例如增强子，经常位于转录本的一侧，而抗阻隔子元件则被构建到转录本的两侧。

[0012] 另外，为了筛选得到最佳的边界元件用于动物细胞大规模生产，对获得的侯选元件进行筛选评估，例如抗阻隔子元件的发现者Kwaks对采用鸟枪法获得的来源于人骨肉瘤细胞U2OS的基因组中的几十条候选序列进行研究分析，最后得到能显著促进外源基因表达的若干条抗阻遏子元件，大小不超过2100bp，并证明这些元件在鼠与人中有高度同源性，能促进外源基因在人源和鼠源的细胞中高效表达。

发明内容

[0013] 本发明的目的是公开了一种促进外源蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中高效表达的核苷酸序列，该核苷酸序列见序列表SEQ ID NO.1。

[0014] 本发明公开的这种促进外源蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中高效表达的核苷酸序列，自行命名为KH序列。

[0015] KH序列也是一种边界元件，被应用在构建入质粒载体中外源目的基因表达转录本的一侧或两侧，为首次公开的来源于CHO基因组的能应用于促进外源基因表达的边界元件。

[0016] 该序列是采用如下方法获得：首先设计的特异性上下游引物：

[0017] KHF：5’＞TGCTTTGAATGTTCAAGTAG＜3

[0018] 和KHR：5’＞GATCTAATGTACATCATGAG＜3’；

[0019] 取培养的CHO-dhfr-细胞约1×107个，采用基因组抽提试剂盒获得CHO基因组，然后以基因组DNA为模板，采用如下PCR反应体系：CHO基因组DNA 2ul，dNTP2ul，KHF2ul，KHR2ul，LA-taq0.5ul，10×LA-taq Buffer 2ul，H2O 9.5ul，总体积20ul；以及如下PCR反应程序：94℃10min之后，94℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，共32个循环，最后是72℃10min等扩增而获得的。

[0020] 本发明所公开的核苷酸序列KH，可以在构建含外源基因的重组表达质粒时，加在外源基因转录本的任一侧或两侧；含有该KH序列的重组真核表达质粒，可以转染任何来源于中国仓鼠的贴壁或悬浮型细胞株，如CHO-K1，CHO/dhfr-，DG44等，并有促进外源基因高效表达的作用。

[0021] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0022] 本发明将KH序列克隆到不同的表达载体的转录本两侧或者一侧，然后再克隆入相应的外源基因，将采用表达不同外源基因的表达载体分别转染CHO-K1，CHO/dhfr-，DG44等来源于中国仓鼠卵巢细胞的细胞株，经检查相应的单克隆细胞形成率、单克隆细胞传代稳定性、外源基因表达水平等，数据显示加了KH序列能够提高外源基因的表达水平以及提高外源基因的传代稳定性。

[0023] 以下采用具体的实施例对本发明进一步的详细说明。

附图说明

[0024] 图1为从CHO细胞基因组中PCR扩增获得KH序列；第1列：PCR产物；第2列：DNA分子量标准；

[0025] 图2为重组质粒载体构建图；

[0026] 图3为不同质量的重组质粒分别转染DG44细胞分泌表达FGF2比较；

[0027] 图4为不同重组质粒转染CHO-K1后各单克隆细胞表达外源sPDGFRα-Fc的Q-PCR结果示意图；

[0028] 图5为重组质粒pINKH-sPDGFR α-Fc转染CHO-K1后部分单克隆细胞表达外源sPDGF-Fc的免疫印迹结果。

具体实施方式

[0029] 以下所述的实施例，其限制性酶切酶购买自大连Takara公司和美国NEB公司，质粒小提试剂盒、DNA切胶回收试剂盒、细胞基因组DNA抽提试剂盒购自广州OMEGA公司，去内毒素的质粒大抽试剂盒购自上海碧云天生物技术公司，RNA提取试剂盒及相关试剂、One-step RT-PCR试剂盒购自美国QIAGEN公司；细胞培养用的培养基DMEM/F12和新生牛血清、G418均购自美国Gibco公司，FGF2标准品、抗FGF2抗体和抗FC购自美国R&D公司，Dual-LuciferaseReporter Assay System的荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司；转染试剂Lipofectamine2000购自美国invitrogen公司。

[0030] 质粒pIRESneo3购买自美国Clotech公司，pcDNA3.1购买自美国invitrogen公司，pMD 19-T购自大连宝生物公司；细胞株CHO/dhfr-和CHO-K1购自美国ATCC，细胞株DG44及其无血清培养基购自美国invitrogen公司。

[0031] 其他常用化学试剂均为国产分析纯。

[0032] 实施例1：KH序列的获得和序列鉴定

[0033] 取培养的CHO细胞约1×107个，采用基因组抽提试剂盒获得CHO基因组，然后设计特异性的上游引物KHF：5’＞TGCTTTGAATGTTCAAGTAG＜3’；和下游引物KHR：5’＞GATCTAATGTACATCATGAG＜3’；

[0034] PCR反应体系为：CHO基因组DNA 2ul，dNTP2ul，KHF2ul，KHR2ul，LA-taq 0.5ul，10×LA-taq Buffer 2ul，H2O 9.5ul，总体积20ul；

[0035] PCR反应程序为：94℃10min之后，94℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，共32个循环，最后是72℃10min。PCR反应结果见图1。

[0036] 将获得的PCR产物直接装入pMD 19-T载体中，进行测序鉴定。测序结果见SEQ ID NO.1。

[0037] 实施例2：应用KH序列使荧光素酶在CHO/dhfr-细胞中高效表达

[0038] 取pIRESneo3质粒，将该核苷酸序列插入到外源基因转录本的上下游和上游，构建出两个不同的载体，分别命名为pIN-KH和pIN-2KH；然后再将荧光素酶插入到多克隆位点构建为重组表达载体分别命名为pIN-KH-Luc和pIN-2KH-Luc，如图2。另外，再构建对照质粒pIN-Luc。

[0039] 采用脂质体转染法，将pIRESneo3、pIN-Luc、pIN-KH-Luc和pIN-2KH-Luc分别转染CHO/dhfr-细胞，同时按1/10的量转染一内参质粒pRL-TK转染在24孔细胞培养板上进行，采用不同的脂质体用量和DNA用量，操作方法见美国invitrogen公司提供的Lipofectamine2000脂质体试剂说明书。转染后2天加入G418筛选，每2天更换培养基，培养2~3周，至肉眼可见单克隆细胞形成的白色聚集物即可，同时计算克隆形成数。从结果可以看出，加入了该序列后，获得的单克隆数明显增加，结果见表1。

[0040] 表1.抗生素筛选后克隆数目统计表

[0041]

[0042] 将1000μg/mlG418筛选的各组的单克隆细胞随机挑选20个，分别于96孔培养板中培养，每孔一个单克隆细胞，完全培养基中加入G418的浓度调整为300ug/ml；长满后转移至24孔板；待长满后传代至另一24孔板，再次长满后，取一板仍继续传代，另一板则采用Dual-Luciferase Reporter Assay System检测试剂盒对荧光素酶活性进行检测，具体检测和计算方法见该试剂盒的说明书，统计各组的表达情况，计算平均值。传代的24孔板培养至第10代时，再次采用试剂盒检测。从结果可知，加入该序列后，外源基因荧光素酶的表达是未加该序列的6倍以上，而且有较好的传代稳定性。结果见表2.

[0043] 表2荧光素酶活性检测结果(平均信)

[0044]

[0045] *备注：数据处理1：为pIN-Luc、pIN-KH-Luc以及pIN-2KH-Luc分别与pIRESneo3的原始数据的比值；数据处理2：为pIN-KH-Luc以及pIN-2KH-Luc分别与pIN-Luc的数据处理1所得的数据的比值；

[0046] 实施例3：应用KH序列使FGF2在CHO/DG44中高效表达

[0047] 2.1重组表达载体的构建、鉴定与大规模制备

[0048] 以成纤维细胞生长因子2(Fibroblast Growth Factor2，FGF2)的核苷酸序列为模板，PCR扩增FGF2，Nhe I和HindIII双酶切，取真核表达载体pcDNA3.1和pcDNA3.1-KH，采用Nhe I和HindIII双酶切，二者采用T4连接酶连接并转化感受态大肠杆菌DH5α后，涂布LB-AMP+平板，37℃16～18h，筛选挑取3～5个单菌落，于5ml的LB-AMP+中扩培，抽提质粒，采用酶切鉴定和PCR扩增目的序列两种方法鉴定重组子，并测序鉴定获得正确的重组表达载体，分别命名为pcDNA3.1-FGF2和pcDNA3.1-KH-FGF2。将重组菌株扩增培养于100ml的LB-AMP+培养液中37℃过夜，收集菌体，采用去内毒素的质粒大抽试剂盒制备获得
200ug左右的重组质粒

[0049] 2.2重组子转染CHO/DG44细胞

[0050] 悬浮培养CHO/DG44细胞，细胞存活率＞90％，离心收集细胞，调整细胞密度至7
1×10/ml；选用4mm的电击杯，含细胞400μL，将去内毒素化的重组表达载体按5、10、15、
20、25、30、35和40μg分别加入各个电击杯，每次电击电压为280V，电击时间为20ms，室温操作，电击后将电击杯置至于冰上5min，之后补加1.5mL培养基于37℃的5％FBS培养基贴壁24h后，换液去死细胞，继续培养至细胞融合率达到80~90％左右，胰酶消化细胞，再重
6
新悬浮培养于20ml的无血清培养基中，至细胞密度达到7.5×10/ml左右，细胞活力达到
95％左右，收集上清。

[0051] 2.3ELISA鉴定外源FGF2的表达

[0052] 以R&D公司的FGF2作为标准品，将其稀释为2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml，250ng/ml，125ng/ml，62.5ng/ml，31.3ng/ml的各100μ□依次加入一排7孔中，另1孔只加样品稀释液的作为零孔，再另一孔留空不加作为TMB空白显色孔，每个样设3个复孔；另取2.2中各组的细胞培养上清，离心2000转30min，收集上清，取100μ□/孔直接加入酶标板，每个样设3个复孔。→酶标板加上盖，置于湿盒中，37℃反应90分钟或者4℃过夜→甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下，0.1％Tween20-PBS洗3次→加入1％BSA的PBS室温封闭1h，之后0.1％Tween20-PBS洗3次→加入效价为1∶5000的抗Fc抗体，工作液按每孔0.1ml依次加入，(TMB空白显色孔除外)，37℃反应2h，之后0.1％Tween20-PBS洗
3~5次→按每孔100ul依次加入TMB显色液，室温慢摇至显色，加入2M的H2SO4终止液终止反应→用酶标仪在450nm波长测定O.D.值。

[0053] 通过标准蛋白的已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出FGF2的含量。

[0054] 表3.DG44培养基上清中分泌表达的FGF2含量(ng/ml)

[0055]

[0056] 实施例4：应用KH序列使PDGFR-□融合蛋白在CHO-K1中高效表达[0057] 3.1重组表达载体的构建与鉴定

[0058] 以可溶性血小板衍生因子膜外区并融合了人Fc蛋白(sPDGFRα-Fc)的核苷酸序列为模板，PCR扩增sPDGFR α-Fc，Nhe I和BglII双酶切，取真核表达载体pIRES-Neo3和pIN-KH，采用Nhe I和BamHI(与BglII同为同尾酶)双酶切，二者连接转化感受态大肠杆菌DH5α后，涂布LB-AMP+平板，37℃16～18h，筛选挑取3～5个单菌落，于5ml的LB-AMP+中扩培，抽提质粒，采用酶切鉴定和PCR扩增目的序列两种方法鉴定重组子，并测序鉴定获得正确的重组表达载体，分别命名为pIN-sPDGFRα-Fc和pIN-KH-sPDGFRα-Fc。

[0059] 3.2重组子转染CHO-K1细胞

[0060] 将CHO-K1细胞铺板培养于6孔板(完全培养基为含10％小牛血清的DF12)，当细胞汇合度为70％时，将去内毒素化的重组表达载体按每孔8ugDNA/8ul阳离子脂质体(Lipofectamine TM 2000)转染细胞，于不加血清的培养基中培养24h后，更换成完全培养基，再24h~48h后加筛选抗生素G418(700ug·ml-1)，2周后可见到明显单克隆细胞团，逐个挑取到96孔板培养，此时，将G418浓度降为500ug·ml-1，待细胞长满后，依次放大到24孔板和细胞培养瓶中培养。

[0061] 3.3总RNA的提取与RT-PCR鉴定阳性单克隆细胞

[0062] Trizol法提取总RNA。逆转录反应条件为：65℃5min，30℃10min，42℃60min，72℃10min。PCR反应条件为预变性95℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃20s，32个循环；
72℃延伸10min。0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带。

[0063] 3.4Real-Time PCR检测各阳性单克隆细胞表达目的基因的差异

[0064] 反应体系为：模板cDNA 2ul，上游引物(10pmol·L-1)0.8ul，下游引物(10pmol·L-1)0.8ul，Real-Time PCR MIX 10ul，双蒸水6.4ul。反应条件为：95℃10min；95℃10s，60℃20s，72℃30s，32个循环。溶解曲线分析：温度55℃-95℃，每分钟读一次，每个样设置3个复孔，取均值，数值越低，则表示表达量越高。不同重组质粒转染CHO-K1后各单克隆细胞表达外源sPDGFRα-Fc的Q-PCR结果如图4所示。

[0065] 表4不同重组质粒转染CHO-K1后各单克隆细胞表达外源sPDGFRα-Fc的Q-PCR结果

[0066]

[0067] *备注：数据处理采用□CT＝CT值(sPDGFR α-Fc)-CT值(18S rRNA)，18SrRNA内参校正cDNA加样量的误差。

[0068] 3.5Western blot鉴定pINKH-sPDGF-Fc转染获得的重组单克隆细胞株的目的蛋白表达

[0069] 去编号B1至B5的单克隆细胞培养，细胞密度到100％后，裂解细胞，收集裂解液，并对其进行蛋白定量。12％SDS-PAGE电泳，湿法转至PVDF膜，封闭，分别用抗Fc的单克隆抗体(1∶10000)及β-actin(1∶10000)抗体4℃孵育过夜，相应二抗为羊抗鼠-HRP抗体(1∶1000)，加入ECL化学试剂于暗盒中X光胶片曝光检测。

[0070] 结果显示，B2的sPDGF-Fc表达最高，B5的最低，其结果与3.4中Realtime PCR的结果相符，也同时说明Realtime PCR的结果能够反映外源基因的蛋白表达量的情况，故结合图4和表4结果可知，应用pINKH-sPDGF-Fc转染获得的重组单克隆细胞株较pIN-sPDGF-Fc转染获得的重组单克隆细胞株从整体评估可知表达量较高，故该序列能够有效提高外源sPDGF-Fc的表达。重组质粒pINKH-sPDGFRα-Fc转染CHO-K1后部分单克隆细胞表达外源sPDGF-Fc的免疫印迹结果如图5所示。

[0071] Untitled_ST25

[0072] SEQUENCE LISTING

[0073] <110>暨南大学

[0074] <120>促进外源蛋白在CHO细胞中高效表达的核苷酸序列片段

[0075] <130>

[0076] <160>1

[0077] <170>PatentIn version 3.5

[0078] <210>1

[0079] <211>532

[0080] <212>DNA

[0081] <213>CHO细胞

[0082] <400>1

[0083] taaaggcaaa caaggattcc ttgtataagg taaaggtctt gtgtgtctgt gtttatagac 60[0084] agcatcacat ggatttgtaa tatttttagt tattatggca ctagagttca aacccagtgc 120[0085] tttgcatatg ttaagtaagt gctctacctc tgaggtaacc aaccttgtaa tgtcttactt 180[0086] atgacttgta ttttcaagta taaagtctga tggtaaattc aatttgcaca gttgtatatt 240[0087] tgtttgctgt tttggagaag gaatacaaaa atagtggcag tggttttctc agaattggaa 300[0088] atgaagttaa aacattttgt aaaatcatag tattttattt gagaattact aatgacattg 360[0089] tgagatatgg atttggcaag gtggttacat actgtgggtg aagcagatga gcgtttctgc 420[0090] catttcaacc cctcactcaa aaatctactt aaaaaatccc agacacaaga cattaatata 480[0091] aattacagtt cttttctctg ggtattgtct cactcagcct gcatttctgc ca 532