植物种子携带细菌性黑斑病致病菌的快速检测方法转让专利
申请号 : CN201010191521.1
文献号 : CN101838703B
文献日 : 2012-08-01
发明人 : 赵廷昌 , 王华杰 , 胡俊
申请人 : 中国农业科学院植物保护研究所
摘要 :
本发明“植物种子携带细菌性黑斑病致病菌的快速检测方法”，涉及植物病菌生物检测。步骤如下：(1)采用免疫磁珠富集待测植物种子的浸泡液中的细菌性黑斑病致病菌；(2)以第(1)所得的富集液为模板进行PCR扩增检测；所述免疫磁珠上包被的抗体为抗丁香假单胞杆菌斑点致病变种(Pseudomonas syringae pv.maculicola)的抗体；所述PCR扩增的引物如下：正向引物T1：5’TGCTTTGCACACCCGATTT 3’，反向引物T2：5’CCCCAAGCAATCTAGGT 3’扩增产物为454bp。该检测方法结合免疫磁珠吸附技术和实时荧光定量PCR，与单一的种植、选择性培养基和ELISA的检测方法比，更能够省时、省空间、特异、灵敏，尤其对植物综合防治植物细菌性黑斑病至关重要，可为安全生产、种子引进和外销提供技术保障，尤其适合于十字花科植物种子的检测。
权利要求 :
1.植物种子携带细菌性黑斑病致病菌的快速检测方法，步骤如下：(1)采用免疫磁珠富集待测植物种子浸泡液中的细菌性黑斑病致病菌；
(2)以第(1)所得的富集液为模板进行PCR扩增检测；
所述免疫磁珠上包被的抗体为抗丁香假单胞杆菌斑点致病变种(Pseudomonas syringae pv.maculicola)的抗体；
所述PCR扩增的引物如下：
正向引物T1：5’TGCTTTGCACACCCGATTT 3’，反向引物T2：5’CCCCAAGCAATCTAGGT 3’，扩增产物为454bp的单一条带。
2.根据权利要求1所述的快速检测方法，所述抗体为分离自抗丁香假单胞杆菌斑点致病变种(Pseudomonas syringae pv.maculicola)的抗血清。
3.根据权利要求1所述的快速检测方法，所述待测种子浸泡液指水浸泡或液体培养基培养液。
4.根据权利要求3所述的快速检测方法，所述液体培养基指丁香假单胞杆菌斑点致病变种的选择性培养基。
5.根据权利要求4所述的快速检测方法，所述选择性培养基为含有2.0mg/L利福平、
30mg/L氯霉素的KB培养基。
6.根据权利要求1所述的快速检测方法，所述步骤(2)之前先将所述富集液煮沸5～
15分钟。
7.根据权利要求1～6任一所述的快速检测方法，所述PCR扩增指实时定量荧光PCR。
8.根据权利要求7所述的快速检测方法，所述实时定量PCR的标记探针序列为：TGCTTTGCACACCCGATTTGG。
9.根据权利要求1所述的快速检测方法，所述植物种子指十字花科植物种子。
说明书 :
植物种子携带细菌性黑斑病致病菌的快速检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物病菌检测，特别是一种植物种子携带细菌性黑斑病菌快速检测的方法。
背景技术
[0002] 十字花科细菌性黑斑病是由丁香假单胞杆菌斑点致病变种引起(Pseudomonas syringaepv.maculicola)，属于原核生物细菌界，变形杆菌门，假单胞菌科。该菌短杆状，大小为1.3-3.0μm×0.7-0.9μm，有1-5根极生鞭毛，革兰氏染色为阴性。寄主主要是十字花科蔬菜，如白菜、花椰菜、萝卜等，同时也可为害辣椒、番茄。
[0003] Pseudomonas syringae pv.maculicola是一种特殊的变种，同其他丁香假单胞杆菌有较接近的营养需求、致病性和相似的起源，特别是与引起番茄细菌性病害的丁香假单胞菌番茄致病变种(P.syringae pv.tomato)在营养条件、致病性和遗传特征上有着相似性，寄主范围重叠，所以在研究初期很难将它们区别开，传统的细菌鉴别方法如选择性培养基筛选基本不起作用。
[0004] 目前较为常见的丁香假单胞菌斑点致病变种鉴定方法有脂肪酸分析、LOPAT测试、Biolog-GN板测试碳源氧化利用、rep-PCR基因指纹分析、RFLP技术、DNA配对分析、RAPD和AFLP技术等。脂肪酸分析表明丁香假单胞菌番茄致病变种、丁香致病变种(P.syringae pv.syringae)、大豆致病变种(P.syringae pv.glycinea)和斑点致病变种的相似系数最接近，不易鉴别。而LOPAT测试、Biolog-GN板测试碳源氧化利用和rep-PCR都可用来鉴定丁香假单胞菌斑点致病变种。碳源氧化的聚类分析得出丁香假单胞菌斑点致病变种和番茄致病变种被列入了同一组，相似性为79.5％，但通过碳源氧化GN数据无法区分这2个菌。rep-PCR遗传指纹分析有利于快速鉴定分离菌株，对丁香假单胞菌斑点变种的鉴定也较为准确。除了丁香假单胞菌番茄致病变种的DC3000菌株和OH314菌株的表型识别与斑点致病变种的相似外，番茄致病变种的其他菌株可以通过rep-PCR与斑点致病变种区分。RFLP技术也可来分析细菌种类和致病变种的亲缘关系。
[0005] 防治十字花科细菌性黑斑病最经济有效的方法之一就是播种无菌种。种子带菌检测需要快速、可靠、灵敏的检测方法。近年来人们主要应用PCR的方法来对病菌进行鉴定和检测。PCR方法敏感度高，特异性强，操作简单方便，并且PCR产物的生成以指数方式增加，能将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。所以理论上它可对单拷贝基因、单个病菌等微量标本进行分析。但在种子带菌检测方面，PCR技术也有其不可否认的局限性，如直接将样品浸泡液加入反应体系，由于种子浸泡液中含有病原细菌浓度较低，反应体系小，就有可能未使病原菌参与到PCR反应中，造成PCR反应假阴性。
[0006] 磁性免疫微球(immunomagnetic microsphere-IMMS)是近年发展起来的一类新型功能性材料，它是磁性微球(magnetic microsphere-MMS)载体表面通过化学或物理方法连接上具有一定免疫活性的物质作为配体而研制成的。由于磁性微球粒径一般很小，比表面积大，故而偶联容量较高，悬浮稳定性较好，便于各种反应高效而方便的进行；又因其具有顺磁性，在外电场的作用下固液相的分离十分简单，可省去过滤、离心等繁杂操作，并可在磁场作用下定位，方便地进行分离同配体相对应的物质。
[0007] 目前在植物病原菌检测领域所使用的Real-time PCR(实时定量PCR)主要是应用TaqMan水解探针作为荧光基质的Real-time PCR系统。在TaqMan系统中，使用一个寡核苷酸探针序列一般长度为25～30核苷酸，其5′末端有一个荧光报告集团，通常为6-羟基荧光素(6-FAM)。3′端有一个荧光淬灭集团，通常为6-羟基-4-甲基若丹明(TAMRA)。当探针完整时，由于淬灭荧光集团与报告荧光集团彼此接近，可以极大地减少后者发射出的荧光。在反应的每个循环，当没有与探针互补的目的序列存在时，探针保持游离。由于TaqDNA聚合酶的5′核酸外切酶活性是双链特异性的，游离的单链探针仍保持完整时的荧光信号不变。当有相应的扩增产物出现时，探针在PCR的变性阶段可与其杂交。当TaqDNA聚合酶引导引物向下游延伸时，TaqMan探针因5′-3′外切酶活性而被水解(切口平移效应)，荧光集团被释放，从而产生荧光，荧光信号就可以被仪器检测。
发明内容
[0008] 本发明根据上述领域存在的空白和需求，结合免疫磁珠吸附技术和实时荧光定量PCR，提供一种植物种子细菌性黑斑病菌的检测方法。与单一的种植、选择性培养基和ELISA的检测方法比，更能够省时、省空间、特异、灵敏。
[0009] 植物种子携带细菌性黑斑病致病菌的快速检测方法，步骤如下：
[0010] (1)采用免疫磁珠富集待测植物种子浸泡液中的细菌性黑斑病致病菌；
[0011] (2)以第(1)所得的富集液为模板进行PCR扩增检测；
[0012] 所述免疫磁珠上包被的抗体为抗丁香假单胞杆菌斑点致病变种(Pseudomonas syringae pv.maculicola)的抗体；
[0013] 所述PCR扩增的引物如下：
[0014] 正向引物T1：5’TGCTTTGCACACCCGATTT 3’，
[0015] 反向引物T2：5’CCCCAAGCAATCTAGGT 3’扩增产物为454bp的单一条带。
[0016] 所述抗体为分离自抗丁香假单胞杆菌斑点致病变种(Pseudomonas syringae pv.maculicola)的抗血清；
[0017] 所述待测种子浸泡液指水浸泡或液体培养基培养液。
[0018] 所述液体培养基指丁香假单胞杆菌斑点致病变种的选择性培养基。
[0019] 所述选择性培养基为含有2.0mg/L利福平、30mg/L氯霉素的KB培养基。
[0020] 所述步骤2之前先将所述富集液煮沸5～15分钟。
[0021] 所述PCR扩增指实时定量荧光PCR。
[0022] 所述实时定量PCR的标记探针序列为：TGCTTTGCACACCCGATTTGG。
[0023] 所述植物种子指十字花科植物种子。
[0024] 本发明提供植物携带细菌性黑斑病菌的检测方法，通过制备识别并结合细菌性黑斑病致病致病菌菌的抗体，将该抗体包被磁珠获得免疫磁珠；采用该免疫磁珠收集待测种子浸泡液中的靶标致病菌，在磁力作用下使其与种子初步分离并得到富集，然后再进行PCR反应，通过PCR反应步骤的特异性引物进行精确判断，这样在保证了检测速度的情况下，提高了检测的灵敏度和可靠性。本发明通过采用DNAssist 2.0对丁香假单胞属各亚种16S-23S rDNA ITS进行序列比对，运用Primer Premier5.0和Oligo 6.0软件进行引物设计，获得特异性引物(SEQID NO1)为：正向引物T1：5’TGCTTTGCACACCCGATTT 3’反向引物T2：5’CCCCAAGCAATCTAGGT 3’，实施例2检测了特异性引物的特异性，结果见图5。同时实
3
施例2、3、4的检测数据证明，本发明检测方法的菌的浓度的检出临界值是10CFU/ml。即对于1粒带菌种子/1000粒健康种子的带菌比例的检测仍呈阳性反应，结果如图13所示。
因此本发明提供的检测方法结合免疫磁珠与PCR特异性扩增技术，克服了目前检测种子带菌方面的局限性，并能够区分丁香假单胞杆菌斑点致病变种与其它细菌性黑斑病致病菌变种，具有高度灵敏度、准确性和便捷性，在细菌性黑斑病防治和种子带菌检测方面，具有很高的应用价值，与单一的种植、选择性培养基和ELISA的检测方法相比，更能够省时、省空间、准确、灵敏，对于综合防治植物细菌性黑斑病至关重要，可为安全生产、种子引进和外销提供技术保障，对其他病害的种子带菌检测具有指导、借鉴意义。
3
施例2、3、4的检测数据证明，本发明检测方法的菌的浓度的检出临界值是10CFU/ml。即对于1粒带菌种子/1000粒健康种子的带菌比例的检测仍呈阳性反应，结果如图13所示。
因此本发明提供的检测方法结合免疫磁珠与PCR特异性扩增技术，克服了目前检测种子带菌方面的局限性，并能够区分丁香假单胞杆菌斑点致病变种与其它细菌性黑斑病致病菌变种，具有高度灵敏度、准确性和便捷性，在细菌性黑斑病防治和种子带菌检测方面，具有很高的应用价值，与单一的种植、选择性培养基和ELISA的检测方法相比，更能够省时、省空间、准确、灵敏，对于综合防治植物细菌性黑斑病至关重要，可为安全生产、种子引进和外销提供技术保障，对其他病害的种子带菌检测具有指导、借鉴意义。
[0025] 本发明中，免疫磁珠的作用在于富集种子浸泡液中的致病菌，因此包被磁珠的抗体只要是能识别并结合丁香假单胞杆菌斑点致病变种即可，在抗体的特异性，纯度方面没有严格的要求，因为，本发明的检测方法还采用特异性PCR来扩增富集到的致病菌，PCR步骤起到了特异性检测致病菌的作用。因此，本发明优选采用丁香假单胞杆菌斑点致病变种作为半抗原制备的抗血清作为包被磁珠的原材料，不需要制备特异性高的单克隆抗体或多克隆抗体，因此本发明的检测方法无论具有很强的实用性，便捷性。本领域技术人员也可以采用高质量高纯度的单克隆抗体来制备磁珠。
[0026] 本发明中，检测前须将待检测种子进行浸泡处理，可直接用无菌水浸泡使种子上的致病菌脱落到水中便于磁珠收集；也可以采用目前已知的适合于丁香假单胞杆菌斑点致病变种的液体培养基对种子进行培养，使致病菌增殖，起到扩大检测模板的信号的作用。本发明例5中，采用丁香假单胞杆菌斑点致病变种的选择性液体培养基，使得千分之一带菌比例的种子都能被检测出来。
[0027] 本发明进一步优选采用实时定量PCR进行PCR扩增，并提供了特异性荧光标记探针序列。使本发明的检查方法集合了荧光定量PCR的优点，更快速，灵敏。
[0028] 本发明提供的检测方法，主要用于检测植物种子上细菌性黑斑病致病菌丁香假单胞杆菌斑点致病变种的携带情况，本发明的检测方法的靶标致病菌为丁香假单胞杆菌斑点致病变种，该菌种的主要寄主植物为十字花科植物，十字花科植物中很多种都是人们日常生活所依赖的蔬菜种类如白菜、花椰菜、萝卜等，因此本发明的检测方法对于种子检测上防治十字花科植物细菌性黑斑病的发生，对于食品安全以及农业经济都有十分重要的作用。
附图说明
[0029] 图1试管凝集法测菌体蛋白抗血清效价。
[0030] 其中，1至10管依次为1∶20～1∶10240。
[0031] 图2间接ELISA法对不同浓度丁香假单胞菌斑点致病变种抗原的检测结果。
[0032] 其中，从1到8为菌悬液浓度梯队(108到101)，9为空白对照。
[0033] 图3靶标菌与部分非靶标菌间接ELISA结果。
[0034] 其中，A1、A2都为靶标菌丁香假单胞菌斑点致病变种，从A3-A10、B1-B10和C1-C10均为非靶标菌，A5为2814，A7为Pst42，B3为ISL-4，B6为3023，B8为3183，A11、B11、C11为阴性对照。
[0035] 图4靶标菌和部分非靶标菌DNA提取及丁香假单胞菌斑点致病变种、PSL-2、SM-15ITS扩增。
[0036] 其中，M1为λDNA/Hind III，1为丁香假单胞菌斑点致病变种DNA，2至8为部分非靶标菌DNA，9为丁香假单胞菌斑点致病变种ITS，10为Psl-2ITS，11为SM-15ITS，M2为DNA Marker II。
[0037] 图5黑斑病菌引物的专一性检测结果。
[0038] 其中，M为DNA Maker II，1为丁香假单胞菌斑点致病变种，2为sm-15，3为psl-2，4-9为部分非靶标菌，10为CK。
[0039] 图6浓度梯度菌体PCR结果。
[0040] 其中，M为DNA Maker II(天为时代)，1为丁香假单胞菌斑点致病变种DNA PCR，8 1
2～9为3×10 ～3×10CFU/ml菌悬液，CK为无模板对照。
2～9为3×10 ～3×10CFU/ml菌悬液，CK为无模板对照。
[0041] 图7IMS-PCR模拟种子带菌检测结果。
[0042] 其中，M为DNA Maker II，1为3×108CFU/ml菌体PCR，2-6分别为105～101CFU/ml模拟种子带菌悬液IMS-PCR结果，7为CK。
[0043] 图8多菌株及种浸液配制的多菌株菌悬液进行IMS-PCR的检测结果。
[0044] 其中，M为DNA Maker II，1为丁香假单胞菌斑点致病变种的3×103CFU/ml菌悬液，3
为含有丁香假单胞菌斑点致病变种及非靶标菌的3×10CFU/ml菌悬液，3为仅含有非靶标
3 3
菌的3×10CFU/ml菌悬液，4为含有丁香假单胞菌斑点致病变种及非靶标菌的3×10CFU/
3
ml种子浸泡液，5为仅含有非靶标菌3×10CFU/ml种子浸泡液，6为无菌种子浸泡液。
为含有丁香假单胞菌斑点致病变种及非靶标菌的3×10CFU/ml菌悬液，3为仅含有非靶标
3 3
菌的3×10CFU/ml菌悬液，4为含有丁香假单胞菌斑点致病变种及非靶标菌的3×10CFU/
3
ml种子浸泡液，5为仅含有非靶标菌3×10CFU/ml种子浸泡液，6为无菌种子浸泡液。
[0045] 图9以丁香假单胞菌斑点致病变种DNA为模板进行Real-time PCR的荧光曲线。
[0046] 其中，蓝色曲线代表丁香假单胞菌斑点致病变种菌株，枚红色线代表CK。
[0047] 图10丁香假单胞菌斑点致病变种和非靶标菌的3×108CFU/ml菌悬液进行Real-time PCR。
[0048] 其中，蓝色曲线代表丁香假单胞菌斑点致病变种菌株，紫色线代表非靶标菌。
[0049] 图11Real-time PCR模拟种子带菌检测。
[0050] 其中，曲线由高往低排列依次代表的浓度为3×108CFU/ml、3×107CFU/ml、6 5 4 3 2 1
3×10CFU/ml、3×10CFU/ml、3×10CFU/ml、3×10CFU/ml，、3×10 ～10CFU/ml及CK。
3×10CFU/ml、3×10CFU/ml、3×10CFU/ml、3×10CFU/ml，、3×10 ～10CFU/ml及CK。
[0051] 图12IMS-PCR电泳结果。
[0052] 其中，M为DNA Maker II，1为1/1000，2为5/1000，3为10/1000，4为CK。
[0053] 图13IMS-realtime-PCR检测中的荧光曲线。
[0054] 其中，曲线由高往低排列依次代表10/1000、5/1000、1/1000、CK。具体实施方式：
[0055] 微生物来源及发放声明：表1、表2所列菌种均为目前已知菌种(来源见表1表2)，中国农业科学院植物保护研究所冰核研究组有保存，可向公众发放用于验证试验。
[0056] 实施例1.十字花科蔬菜细菌性黑斑病菌的抗血清获得
[0057] 参照《兽医微生物学及免疫学技术》和《植病研究方法》中的方法进行菌体细胞(去鞭毛)抗原的制备、菌体全蛋白抗原的制备、免疫家兔、测定血清效价和抗体专一性(试管凝集法、间接ELISA法)、间接ELISA法测定抗原的检测精度。
[0058] (1)菌体细胞(去鞭毛)抗原的制备
[0059] 将培养48h的丁香假单胞菌斑点致病变种(表1中3935)菌株用生理盐水(等渗8 9
盐水0.85％)配成终浓度3×10 ～3×10CFU/ml的菌悬液，100℃沸水煮1h。
盐水0.85％)配成终浓度3×10 ～3×10CFU/ml的菌悬液，100℃沸水煮1h。
[0060] (2)菌体全蛋白抗原的制备
[0061] 将培养48h的丁香假单胞菌斑点致病变种(表1中3935)菌株用生理盐水(等渗8 9
盐水0.85％)配成终浓度3×10 ～3×10CFU/ml的菌悬液。100℃沸水煮2h，于20000g、
4℃下离心15min，收集上清。调pH至7.0，加硫酸铵至饱和产生沉淀，4℃下过夜使之沉淀完全。再于20000g、4℃下离心15min，收集沉淀，无菌水重悬。
盐水0.85％)配成终浓度3×10 ～3×10CFU/ml的菌悬液。100℃沸水煮2h，于20000g、
4℃下离心15min，收集上清。调pH至7.0，加硫酸铵至饱和产生沉淀，4℃下过夜使之沉淀完全。再于20000g、4℃下离心15min，收集沉淀，无菌水重悬。
[0062] 将透析管剪成10～20cm的小段，于2％(w/v)NaHCO3和EDTA(pH 8.0)中煮沸10min，蒸馏水彻底清洗，再于1mmol/L的EDTA(pH 8.0)中煮沸10min，冷却后存放于4℃下，确保透析管始终浸没在溶液内。(从此时起取用透析管时总需戴手套)。使用前在透析管内装满水，然后排出并清洗干净。
[0063] 将透析袋一端打好结，装入生理盐水，以检测是否漏水。(不漏，则倒出生理盐水，挤出气泡)将所制得菌体蛋白抗原装入袋中挤压使透析袋充分与溶液接触，然后将另一端打好结，放入2000ml烧杯中(盛有1000ml以上的生理盐水)，加入小转子，置于4℃冰箱中慢慢搅拌，透析72h，期间更换透析液4次。透析完毕，将透析袋内的液体小心注入已湿热灭菌并硅烷化的4ml离心管中，置于-20℃冰箱中冻实，真空冷冻干燥后得到干燥的菌体蛋白。
[0064] 将得到的干燥的菌体蛋白配成浓度300μg/ml的蛋白溶液，即为注射用蛋白抗原。
[0065] (3)参照《植病研究方法》，采用制得的蛋白抗原免疫家兔，制备抗血清。
[0066] (4)试管凝集法测定血清效价(图1)
[0067] 步骤：把抗血清依次稀释成1∶20～1∶10240，各取1ml与丁香假单胞菌斑点8
致病变种(表1中代号3935)3×10CFU/ml菌悬液1ml充分混合，50～56℃恒温水浴2h，在室温或4℃冰箱中放置过夜记载，得到效价为1280的抗血清，凝集效果比较好，满足实验要求。
致病变种(表1中代号3935)3×10CFU/ml菌悬液1ml充分混合，50～56℃恒温水浴2h，在室温或4℃冰箱中放置过夜记载，得到效价为1280的抗血清，凝集效果比较好，满足实验要求。
[0068] (5)间接ELISA法(图2)确定合适待测菌悬液浓度和检测抗体专一性，[0069] 试剂配方：
[0070] 包被缓冲液：NaHCO32.93g，Na2CO31.59g，800ml蒸馏水。
[0071] 封闭液：0.01M PBS其中含0.1％牛血清蛋白。
[0072] 洗净缓冲液(PBST)：PBS加0.2％Tween20。
[0073] 一抗稀释液：NaCl 8.0g，KH2PO43.0g，Na2HPO4·12H2O 29.0g，KCl 2.0g，NaN30.2g，乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone-PVP)5.0或20.0g，Tween-20 0.5ml，调pH至7.4，蒸馏水定容至1L。
[0074] 二抗稀释液：0.01M TBS加0.05％Tween-20。
[0075] pNPP(对硝基苯磷酸二钠)底物溶解液：二乙醇胺(Dietanolamine)97ml，蒸馏水800ml，NaN30.2g，用HCl调pH 9.8，定容至1L。分装湿热灭菌后室温保存。步骤：
[0076] 用包被缓冲液将靶标菌和非靶标菌(表2中)配成3×108CFU/ml的菌悬液，再将8 7
靶标菌株丁香假单胞菌斑点致病变种(表1中代号3935)稀释成浓度约为3×10、3×10、
6 1
3×10……3×10CFU/ml，吸取50μl加入聚苯乙烯微量滴定板的单孔中，37℃包被30min。
在每孔中缓慢加入封闭缓冲液200μl，室温孵育30min。用洗净缓冲液冲洗3次、拍干，再加入50μl稀释过的抗血清(1∶320)轻摇30s，室温孵育30min。再用洗净缓冲液洗3次、拍干，每孔加入50μl抗-抗血清(羊抗兔IgG-AP，1∶1000稀释)，孵育30min。用洗净缓冲液洗3次、吹干，加50μl pNPP，37℃下反应30min，直到变色，加入IN HCl 50μl终止反应，用酶联读数仪于405nm波长读取数值。以CK的OD值为标准，若样品OD≥(2×ODCK)为视为阳性反应，OD＜(2×ODCK)视为阴性。
靶标菌株丁香假单胞菌斑点致病变种(表1中代号3935)稀释成浓度约为3×10、3×10、
6 1
3×10……3×10CFU/ml，吸取50μl加入聚苯乙烯微量滴定板的单孔中，37℃包被30min。
在每孔中缓慢加入封闭缓冲液200μl，室温孵育30min。用洗净缓冲液冲洗3次、拍干，再加入50μl稀释过的抗血清(1∶320)轻摇30s，室温孵育30min。再用洗净缓冲液洗3次、拍干，每孔加入50μl抗-抗血清(羊抗兔IgG-AP，1∶1000稀释)，孵育30min。用洗净缓冲液洗3次、吹干，加50μl pNPP，37℃下反应30min，直到变色，加入IN HCl 50μl终止反应，用酶联读数仪于405nm波长读取数值。以CK的OD值为标准，若样品OD≥(2×ODCK)为视为阳性反应，OD＜(2×ODCK)视为阴性。
[0077] 结果表明最小检测浓度可以达到3×105CFU/ml。血清对十字花科蔬菜细菌性黑斑病菌(Pseudomonas syringae pv.maculicola)(丁香假单胞菌斑点致病变种菌株)呈阳性反应，而对部分非靶标菌株呈假阳性反应(图3)。说明所获得的血清直接作用于病菌的检测存在着假阳性的风险，但对于本发明来说只是利用抗血清的免疫分离作用，完全可以利用所获得的抗血清。
[0078] 实施例2.十字花科蔬菜细菌性黑斑病菌的常规PCR检测
[0079] 采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取所有靶标及非靶标细菌(表1和表2)的染色体DNA，见图4，1-8为部分菌体染色体DNA。
[0080] 表1供试细菌性黑斑病(靶标)菌株
[0081]
[0082] 表2供试非靶标菌株
[0083]
[0084]
[0085]
[0086] 步骤1采用DNAssist 2.0对丁香假单胞属各亚种16S-23S rDNA ITS进行序列比对，运用Primer Premier5.0和Oligo 6.0软件进行引物设计，获得特异性引物(SEQ ID NO1)为：
[0087] 正向引物T1：5’TGCTTTGCACACCCGATTT 3’
[0088] 反向引物T2：5’CCCCAAGCAATCTAGGT 3’
[0089] 步骤2对所设计的细菌性黑斑病菌特异性引物进行专一性检测，以表1靶标菌和表2的非靶标菌的染色体DNA为模板，使用Promega公司的Taq DNA Polymerase进行扩增，采用50μl反应体系，反应条件为：预变性95℃2min、95℃1min、55℃30s、72℃40s、35循环、72℃5min。反应终止后，用1％agarose、TBE缓冲液进行电泳，EB染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。结果见图5。靶标菌丁香假单胞菌斑点致病变种呈阳性反应，扩增出ITS中的454bp(见Sequence ID No.3中第76～530bp)条带，非靶标菌均呈阴性(Psl-2成两条带，引物对其不特异)。8
[0090] 步骤3用无菌水配制黑斑病菌株丁香假单胞菌斑点致病变种的3×10 ～1
3×10CFU/ml菌悬液，吸取1ml置于1.5ml离心管中，沸水煮15min。分别取2μl作为菌体PCR的模板，进行PCR反应，采用50μl反应体系，反应条件为：预变性95℃2min、95℃1min、
55℃30s、72℃40s、35循环、72℃5min。反应结束后，用1％agarose，TBE缓冲液进行电泳，EB染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。确定以丁香假单胞菌斑点致病变种进行直接菌
4
体PCR，其反应呈阳性的最小菌浓度约为3×10CFU/ml，如图6所示。
3×10CFU/ml菌悬液，吸取1ml置于1.5ml离心管中，沸水煮15min。分别取2μl作为菌体PCR的模板，进行PCR反应，采用50μl反应体系，反应条件为：预变性95℃2min、95℃1min、
55℃30s、72℃40s、35循环、72℃5min。反应结束后，用1％agarose，TBE缓冲液进行电泳，EB染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果。确定以丁香假单胞菌斑点致病变种进行直接菌
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体PCR，其反应呈阳性的最小菌浓度约为3×10CFU/ml，如图6所示。
[0091] 实施例3.免疫吸附PCR(IMS-PCR)检测十字花科蔬菜细菌性黑斑病菌[0092] 溶液配制：
[0093] 饱和硫酸铵溶液(SAS)：在990ml H2O中加1.219g Tris，调pH 7.0，并定容终体积到1L，配制成0.01mol/L Tris·Cl溶液。称量767g(NH4)2SO4，搅拌并稍微加热将其溶于1L0.01mol/LTris·Cl，调pH至7.0，并于4℃贮存。在4℃贮存时应可见瓶底出现(NH4)2SO4晶体。
[0094] 33％(v/v)SAS溶液：33ml SAS溶液加67ml PBS，调pH7.0。
[0095] PBS(pH7.4)：NaCl 8.10g，NaH2PO40.18g，Na2HPO41.97g，蒸馏水1L，121℃高压蒸气灭菌20min，保存于室温。
[0096] 免疫磁珠(IMBs)：Dynabeads M-280 Sheep anti-Rabbit IgG(Dynal公司，2ml/瓶)。
[0097] PBS-BSA：PBS中含0.1％牛血清蛋白。
[0098] 步骤1.抗血清纯化.
[0099] 在4℃不断搅拌下，往2体积的抗血清中，逐滴加入1体积pH 7.0的SAS溶液。加完后置于4℃，不间断地搅拌此混合物2～4h以形成沉淀，12000g离心20min。用预冷的33％SAS溶液在旋涡混合器上振荡洗涤沉淀，所用溶液的体积与原抗血清等体积。12000g离心20min，尽弃上清，加入与抗血清等体积的PBS(pH7.4)，在旋涡混合器上温和振荡以将沉淀溶解。4℃透析抗体溶液48h以上，期间换3次透析缓冲液(每次换4L)。将透析管内溶物分装于1.5mleppendorf管，真空冷冻干燥获得纯化的IgG，-20℃冷冻保存备用。
[0100] 步骤2，包被磁珠
[0101] 将免疫磁珠(IMBs)充分震荡2min至磁性液体变为均一悬浊液，从中吸取7
50μl(约3.35×10 个磁珠)，放入2ml离心管。用PBS(pH 7.4)洗涤IMBs 3～4次，每次洗涤后将离心管放在磁性分离架上，待磁珠沉淀后，吸去上清液。洗涤完毕，加入2ml PBS重悬磁珠，加入步骤1获得的纯化的IgG100μg于4℃缓慢摇动孵育24h。用2ml PBS-BSA洗
7
涤IMBs 3～4次，并将IMBs重悬于2ml PBS-BSA，使包被后的磁珠的最终浓度约为1.7×10个/ml，待用。
50μl(约3.35×10 个磁珠)，放入2ml离心管。用PBS(pH 7.4)洗涤IMBs 3～4次，每次洗涤后将离心管放在磁性分离架上，待磁珠沉淀后，吸去上清液。洗涤完毕，加入2ml PBS重悬磁珠，加入步骤1获得的纯化的IgG100μg于4℃缓慢摇动孵育24h。用2ml PBS-BSA洗
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涤IMBs 3～4次，并将IMBs重悬于2ml PBS-BSA，使包被后的磁珠的最终浓度约为1.7×10个/ml，待用。
[0102] 步骤3，磁珠检测
[0103] 吸取包被过抗体的IMBs 50μl，置于含有105～101CFU/ml菌悬液的1.5ml离心管中，室温缓慢摇动孵育1h，将离心管置于磁性分离架上，静置5min，吸去上清液，用PBS-BSA洗涤2遍，无菌水洗涤1遍，用50μl无菌水重悬磁珠。将重悬液煮沸15min，取2μl用于PCR反应。PCR反应条件和反应体系与实施例2步骤3相同。反应终止后，用1％agarose、TBE缓冲液进行电泳，EB(溴化乙锭)染色后，在凝胶成像仪中检测扩增结果，由图7可知，5 3
菌的浓度从10CFU/ml到10CFU/ml都有特异性条带，带的亮度随菌的浓度增加而变亮；而
3
杂菌和空白对照都没有带(图8)，也就是说IMS-PCR的检出临界值是10CFU/ml。
菌的浓度从10CFU/ml到10CFU/ml都有特异性条带，带的亮度随菌的浓度增加而变亮；而
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杂菌和空白对照都没有带(图8)，也就是说IMS-PCR的检出临界值是10CFU/ml。
[0104] 实施例4.实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测十字花科细菌性黑斑病[0105] 依据细菌性黑斑病菌16S-23S ITS序列区如Seq ID No.3，进行探针设计(5′TGCTTTGCACACCCGATTTGG 3′)。采用丁香假单胞菌斑点致病变种的染色体DNA为模板进行Real-time PCR，采用50μl反应体系，反应条件：步骤1为95℃30s，步骤2为95℃5s，55℃30s 40个循环，每循环结束时收集荧光信号，结果如图9所示，表明荧光探针可以正常使用。以同样条件进行专一性测定，以2μl煮沸15min的丁香假单胞菌斑点致病变种菌株
8
和非靶标菌3×10CFU/ml的菌悬液为模板进行实时荧光定量PCR，结果显示，只有丁香假单胞菌斑点致病变种呈阳性反应，而各非靶标菌均呈阴性，其荧光曲线如图10所示。
8
和非靶标菌3×10CFU/ml的菌悬液为模板进行实时荧光定量PCR，结果显示，只有丁香假单胞菌斑点致病变种呈阳性反应，而各非靶标菌均呈阴性，其荧光曲线如图10所示。
[0106] 用种子的水浸泡液配制不同浓度的菌悬液，煮沸15min后，吸取2μl溶液作为3
Real-timePCR反应的模板，进行实时荧光定量PCR。其检测最小浓度约为3×10CFU/ml如图11所示。
Real-timePCR反应的模板，进行实时荧光定量PCR。其检测最小浓度约为3×10CFU/ml如图11所示。
[0107] 实施例5.哈密瓜种子带菌快速检测方法的建立
[0108] 带菌种子检测，将甘蓝种子1000粒置于50ml三角瓶，121℃灭菌20min，待用。制8
备丁香假单胞菌斑点致病变种3×10CFU/ml菌悬液，浸泡无菌种子30min，于超净台吹干。
将不同数量的种子放入三角瓶中，模拟0/1000，1/1000，5/1000，10/1000带菌种子样本。向含有不同带菌种子样本的三角瓶中加入PBS 20ml，室温摇动培养4h。吸取培养液1ml，置于10ml液体选择性培养基内(2.0mg/L利福平和30mg/L氯霉素的KB培养基)，28℃摇动培养8h。吸取1ml培养液，置于2ml EP管中。加入包被过的IMBs 50μl，室温缓慢摇动孵育
1h，将离心管置于磁性分离架上，静置5min，吸取上清液，用PBS-BSA洗涤2次，无菌水洗涤
1次，用50μl无菌水重悬磁珠。将重悬液煮沸15min，取2μl上清液用于常规PCR和实时荧光定量PCR。经过分离、培养、IMS-PCR，发现每千粒种子中含有一粒病种子仍可以检测到(见图12)。经过分离、培养、IMS-realtime-PCR，仍可以检测出每千粒种子中含有的一粒病种子，即1粒带菌种子/1000粒健康种子仍呈阳性反应，结果如图13所示。
备丁香假单胞菌斑点致病变种3×10CFU/ml菌悬液，浸泡无菌种子30min，于超净台吹干。
将不同数量的种子放入三角瓶中，模拟0/1000，1/1000，5/1000，10/1000带菌种子样本。向含有不同带菌种子样本的三角瓶中加入PBS 20ml，室温摇动培养4h。吸取培养液1ml，置于10ml液体选择性培养基内(2.0mg/L利福平和30mg/L氯霉素的KB培养基)，28℃摇动培养8h。吸取1ml培养液，置于2ml EP管中。加入包被过的IMBs 50μl，室温缓慢摇动孵育
1h，将离心管置于磁性分离架上，静置5min，吸取上清液，用PBS-BSA洗涤2次，无菌水洗涤
1次，用50μl无菌水重悬磁珠。将重悬液煮沸15min，取2μl上清液用于常规PCR和实时荧光定量PCR。经过分离、培养、IMS-PCR，发现每千粒种子中含有一粒病种子仍可以检测到(见图12)。经过分离、培养、IMS-realtime-PCR，仍可以检测出每千粒种子中含有的一粒病种子，即1粒带菌种子/1000粒健康种子仍呈阳性反应，结果如图13所示。