再生性生物功能胶原生物基质用于治疗内脏或腔壁缺损的应用

摘要

用于治疗内脏的或腔壁的膜或组织缺损的技术包括将胶原生物基质应用于该缺损，以便修复或者再生内脏的或腔壁的膜，比如在遭受组织缺损或者经受内脏或腔壁外科手术治疗的病人身上的应用。这种方法避免了持续的组织渗漏以及它们的后果例如液体渗漏和空气渗漏。通过利用可选择地与血纤蛋白密封剂、抗粘连剂或两者结合一起的胶原生物基质，可以将遭受组织缺损的受损害病人或者经受外科手术例如内脏或腔壁切除术及其他手术的个体身上的组织渗漏或者液体渗漏减到最少。

权利要求

1.生物功能的无孔的多层胶原箔生物基质在制备药物中的应用，所述药物用于治疗病人身上表征为内脏或腔壁的膜缺损的紊乱，所述治疗包括如下步骤：将生物功能的无孔的多层胶原箔生物基质给药于所述缺损处，所述生物基质引导细胞在多层胶原箔生物基质的间隙中生长，其中多层胶原箔生物基质指的是天然的胶原纤维的生物基质，其已被处理以便去掉非胶原成分并且和形成微观水平上多层层状结构的胶原纤维薄片，并且胶原层之间具有间隙。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多层胶原箔生物基质在内脏或腔壁的缺损处与相邻的组织之间形成基本上不透液也不透气的层。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述给药步骤包括选自下组的一种或多种方法：用血纤蛋白密封剂将所述多层胶原箔生物基质附着在内脏或腔壁的缺损上，用外科手术密封剂将所述多层胶原箔生物基质附着在内脏或腔壁的缺损上，用外科手术缝合线将所述多层胶原箔生物基质附着在内脏的或腔壁的缺损上，运用压力封装技术，以及运用在所述多层胶原箔生物基质与内脏或腔壁的缺损之间的自然粘合性。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，使用血纤蛋白密封剂将所述多层胶原箔生物基质附着于病人内脏或腔壁的缺损上。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将所述多层胶原箔生物基质与包含聚乙二醇的物质相连接。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，在所述多层胶原箔生物基质的间隙内细胞生长之后，所述生物基质并不会促进与相邻组织之间的粘连。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多层胶原箔生物基质引导多层胶原箔生物基质外表面上的细胞生长。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多层胶原箔生物基质包含选自下组的赋形剂：抗生素、防腐剂、生长因子、以及促进多层胶原箔生物基质的柔韧性和弹性的添加剂。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多层胶原箔生物基质包含来源于选自下组来源的胶原：牛的来源、猪的来源、马的来源、羊的来源、灵长类动物的来源、啮齿类动物的来源。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述灵长类动物是人。

11.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多层胶原箔生物基质包含来源于腱组织的胶原。

12.包含非天然产生的胶原纤维多层生物基质的胶原箔在制备药物中的应用，所述药物用于在哺乳动物中再生内脏或腔壁的膜，所述再生包括：使内脏或腔壁的膜的缺损与包含非天然产生的胶原纤维多层生物基质的胶原箔相接触，所述胶原纤维未通过化学法或辐射法交联，其中所述生物基质基本上是无孔的，其中多层胶原箔生物基质指的是天然的胶原纤维的生物基质，其已被处理以便去掉非胶原成分并且和形成微观水平上多层层状结构的胶原纤维薄片，非天然产生的生物基质指的是被产生的具有天然胶原纤维的基质或者结构，非天然产生的生物基质的形成是通过下述条件：(i)在天然界中存在的物质，其以这样一种方式被加工或者被处理：其中包含在天然原料中的胶原纤维已经在天然原料的胶原结构中从它们的天然产生成的排列中移动或改变位置；或者(ii)在天然界中不存在的物质，其被加工或处理以便操控胶原纤维排列，并且胶原层之间具有间隙。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述多层胶原箔生物基质在内脏或腔壁的膜与相邻的组织之间形成基本上不透液也不透气的层。

14.如权利要求12所述的应用，其特征在于，使用血纤蛋白密封剂将所述多层胶原箔生物基质附着于病人内脏或腔壁的缺损上。

15.如权利要求12所述的应用，其特征在于，将所述多层胶原箔生物基质与包含聚乙二醇的物质相连接。

16.如权利要求12所述的应用，其特征在于，在多层胶原箔生物基质的间隙内细胞生长之后，所述生物基质并不会促进与相邻组织之间的粘连。

17.无孔的微观多层的胶原箔生物基质在制备药物中的应用，所述药物用于内脏或腔壁的膜的经引导的细胞向内生长和经控制的组织再生、以便防止哺乳动物术后或者创伤后组织表面上的粘连和纤维化形成，所述组织再生包括：将组织与无孔的微观多层的胶原箔生物基质相接触，其中多层的胶原箔生物基质指的是天然的胶原纤维的生物基质，其已被处理以便去掉非胶原成分并且和形成微观水平上多层层状结构的胶原纤维薄片，并且胶原层之间具有间隙。

18.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述多层的胶原箔生物基质在内脏或腔壁的膜的缺损处与相邻的组织之间形成基本上不透液也不透气的层。

19.如权利要求17所述的应用，其特征在于，使用血纤蛋白密封剂将所述多层的胶原箔生物基质附着于病人内脏或腔壁的膜的缺损上。

20.如权利要求17所述的应用，其特征在于，将所述多层的胶原箔生物基质与包含聚乙二醇的物质相连接。

21.如权利要求17所述的应用，其特征在于，在多层的胶原箔生物基质的间隙内细胞生长之后，所述生物基质不会促进与相邻组织之间的粘连。

22.一种组合物在制备用于哺乳动物内脏的或腔壁的缺损修复的药物中的应用，所述组合物包含微观多层的胶原箔生物基质，所述多层的胶原箔生物基质引导细胞在生物基质胶原层之间的间隙中生长，其中多层的胶原箔生物基质指的是天然的胶原纤维的生物基质，其已被处理以便去掉非胶原成分并且和形成微观水平上多层层状结构的胶原纤维薄片，并且胶原层之间具有间隙。

23.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述多层的胶原箔生物基质在器官表面与相邻的体腔或者组织之间形成基本上不透液也不透气的层。

24.如权利要求22所述的应用，其特征在于，使用血纤蛋白密封剂将所述多层的胶原箔生物基质附着于病人内脏的或腔壁的膜上。

25.如权利要求22所述的应用，其特征在于，将所述多层的胶原箔生物基质与包含聚乙二醇的物质相连接。

26.如权利要求22所述的应用，其特征在于，在多层的胶原箔生物基质的间隙内细胞生长之后，所述生物基质不会促进与相邻组织之间的粘连。

27.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述多层的胶原箔生物基质是平滑的和基本上无孔的。

28.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述多层的胶原箔生物基质是平滑的和无孔的。

29.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述多层的胶原箔生物基质是可被再吸收并被重塑入天然组织。

30.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述组合物可以以试剂盒的形式得到。

31.一种用于抑制内脏或腔壁的组织中术后渗漏的胶原生物基质，其中该胶原生物基质是在内脏或腔壁的组织切除术之后被术后应用，以便防止组织渗漏或空气渗漏，其中胶原生物基质指的是天然的胶原纤维的生物基质，其已被处理以便去掉非胶原成分并且和形成微观水平上多层层状结构的胶原纤维薄片，并且胶原层之间具有间隙。

32.如权利要求31所述的胶原生物基质，其特征在于，所述胶原生物基质补充纤维原细胞及其他组织再生性细胞。

33.如权利要求31所述的胶原生物基质，其特征在于，所述胶原生物基质包含的胶原生物基质在胶原层之间具有间隙，以便允许层间的细胞生长。

34.如权利要求31所述的胶原生物基质，其特征在于，将所述胶原生物基质与血纤蛋白密封剂结合使用。

35.如权利要求34所述的胶原生物基质，其特征在于，所述胶原生物基质结合血纤蛋白粘合剂可在肺脏手术之后防止空气渗漏直到28天。

36.如权利要求34所述的胶原生物基质，其特征在于，所述血纤蛋白密封剂被与胶原生物基质一同应用在缺损上，所述胶原生物基质被施加在血纤蛋白密封剂上或与其结合一起。

37.如权利要求34所述的胶原生物基质，其特征在于，覆盖有胶原生物基质的组织的区域的再生快于覆盖有血纤蛋白密封剂的组织的区域的再生。

说明书

再生性生物功能胶原生物基质用于治疗内脏或腔壁缺损的

应用

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本专利不是临时性的专利申请，并要求在2007年10月30日申请的美国临时专利申请No.60/983,776的优先权，将其并入本文以供参考。

背景技术

[0003] 本发明的实施方式包括：生物功能的、再生性的、再造的、与或不与血纤蛋白密封剂、聚乙二醇或其他物质结合一起的胶原生物基质用于治疗内脏的或腔壁的膜缺损的应用，例如防止术后组织渗漏和空气渗漏。

[0004] 长时间的术后组织渗漏和空气渗漏是肺部切除术和其他类型的内脏或腔壁的膜的外科手术之后发病的主要原因，并且导致长时间的伴随着疼痛和不能行动的引流。这些并发症使得病人处于发展成感染性出血、粘连、气胸、支气管胸膜瘘的增加的风险中，以及因此延长住院时间，增加医疗花费。解决这个问题的外科手术技术包括缝合或者纤维包扎装置的使用，伴随着或不伴随着手术封闭剂的使用，但这些已经被证明是不够的，并且不能消除肺部手术期间的组织渗漏或者空气渗漏。

[0005] 许多补充的天然的和合成的物质已经被尝试，并具有在肺切除术中克服组织渗漏或者空气渗漏的综合结果。这些物质包括血纤维蛋白密封剂和合成胶。在一些情况中，封闭剂被用于加强缝合或者纤维包扎线。但是，它们的功效也受到限制，不能代替准确和精确的外科手术技术。此外，内脏的或腔壁的膜手术之后内部的疤痕、纤维化和粘连都是这些手术为人所熟知的和不好的副作用。

[0006] 因此，对于改进系统和技术存在着强烈的需求，用于经可引导的和经可控制的组织再生以便治疗或防止术后或创伤后的组织渗漏、液体渗漏(例如血、浆液、胆汁)、或者肺部组织的空气渗漏，并且促进手术和创伤损伤后组织愈合和再生过程。同样也需要不吸收血、促进重新塑造、再生和伤口愈合过程、引导细胞生长和向内生长的基质。此外，还需要涉及被切除内脏比如覆盖肺部的胸膜的取代和再生的技术。

[0007] 本发明的实施方式提供了解决这些需求的方案。本发明的方面包括生物功能的胶原生物基质的应用，其可选择地与血纤蛋白密封剂一起，用于手术治疗切除术后内脏的或腔壁的膜和组织缺损，和治疗肺部组织缺损或者内脏膜比如肺切除术后的肺胸膜缺损。这些技术的有效性可以通过动物实验使用胶原生物基质用于内脏缺损的修复和再生来证明。这种胶原生物基质提供了一种具有特殊层结构的基质，并且包括纯的自然交联的来源于马的胶原。这种生物基质可以作为切除的内脏或者内脏膜替代品，并且在以后的愈合过程中可以作为再生性的生物基质用于细胞向内生长和比如内脏的新胸膜的形成。生物基质可以作为有效的对抗液体渗漏的封闭剂，这是特别有利的，因为在内脏膜没有液体渗漏时肺部或器官的功能会得到很大的提高。相关地，实施方式包括胶原生物基质的应用，用于预防肺切除术或者其他肺部手术后液体渗漏，或者用于治疗内脏膜比如胸膜缺损。

发明内容

[0008] 本发明的实施方式包括新的生物功能的可选择地与血纤蛋白密封剂结合一起的胶原生物基质，以及其用于内脏的或腔壁的膜修复的应用，例如用于经受肺脏手术的病人胸膜的修复和组织再生性，同时避免或者抑制持续的组织渗漏、空气渗漏、液体渗漏等等。外科手术封闭剂的单独使用或者作为包扎纤维或缝合的支持物通常不能有效地减少AALs(肺泡气渗漏)和PAALs(持续性肺泡气渗漏)的发生率。相反地，本发明的实施方式包括胶原箔可选择地与血纤蛋白密封剂一起应用在组织缺损上的用途，例如应用在被吹气的受损害的肺脏上，以便实现临时即刻的和延伸的气滞(aerostasis)和可选择的止血。用于这个目的的胶原生物基质箔配方可以提高呼吸期间的肺功能。胶原生物基质的胶原纤维可以提供用于替换和再生的支持基质，并且便于纤维原细胞的迁移和修复细胞。在一些情况中，胶原生物基质可以用于引导细胞向内成长，以及用于胞外基质的重新形成而用于内脏的和腔壁的膜的再生，例如用于治疗肺皮质剥除术后肺内脏膜的缺损。

[0009] 实施方式包括当由于受伤、肿瘤、外科手术等而使组织受损害时使用基本上无孔的胶原箔以便修复和再生哺乳动物的内脏或腔壁组织例如胸膜组织的方法。无孔的胶原箔包括胶原纤维，其可以提供弹性的、不透液体的、不透气体的、并且具有高抗张强度的替代膜组合物。此外，无孔的胶原箔是可以被再吸收的，并且可以提供生物基质，其中大概在几周之内新内脏的或者新腔壁的膜例如新胸膜快速形成，与自身的膜例如自身胸膜变得不可区别。制作胶原质箔的过程可以减小疾病传染的可能性。

[0010] 实施方式包括治疗或者预防术后或者创伤后在组织表面例如胸膜上细胞的粘连，或者创面和相邻的解剖部位例如肺脏表面和胸壁之间细胞的粘连。方法可以包括用多层生物活性和生物功能性的胶原生物基质箔覆盖组织，并且引导细胞生长和组织修复。方法同样也可以包括通过用多层胶原箔生物基质覆盖组织来治疗哺乳动物体内紊乱。方法可以通过提供生物功能的基质来引导细胞的向内生长和控制组织再生，从而用于抑制或者防止粘连和疤痕组织的形成。实施方式进一步包括用于治疗或抑制AALs(肺泡气渗漏)或PAALs(持续性肺泡气渗漏)的方法。

[0011] 在一方面，本发明的实施方式包括治疗表征为内脏或腔壁膜缺损的病人体内紊乱的方法。方法可以包括将生物功能的无孔的多层胶原箔生物基质给药于该缺损部位，引导在多层胶原箔生物基质间隙中的细胞生长。在一些情况中，多层胶原箔生物基质在内脏的或腔壁的缺损与相邻的组织之间形成基本上不透液体的和不透气的层。在一些情况中，给药步骤包括：运用压力封装(pressure fitting)技术，或者运用多层胶原箔生物基质和内脏的或腔壁的缺损之间的自然粘连性，用血纤蛋白密封剂将多层胶原箔生物基质附着在内脏的或腔壁的缺损上，用外科手术封闭剂将多层胶原箔生物基质附着在内脏的或腔壁的缺损上，用外科缝合线将多层胶原箔生物基质附着在内脏的或腔壁的缺损上。可选择地，使用血纤蛋白密封剂将多层胶原箔生物基质附着于病人内脏的或腔壁的缺损上。在有些情况下，多层胶原箔生物基质与包含聚乙二醇的物质相连接或被其覆盖。在有些情况下，在多层胶原箔生物基质的间隙内细胞生长之后，生物基质不会促进与相邻组织之间的粘连。多层胶原箔生物基质可以引导多层胶原箔生物基质外表面的细胞生长。多层胶原箔生物基质可以包含赋形剂例如抗生素、防腐剂、生长因子、以及有助于多层胶原箔生物基质柔韧性和弹性的添加剂。在一些情况中，多层胶原箔生物基质包含来源于下组的胶原：例如牛的来源、猪的来源、马的来源、羊的来源、灵长类动物的来源、啮齿类动物的来源或者人的来源。多层胶原箔生物基质可以包含来源于腱组织的胶原。

[0012] 在另一方面，本发明的实施方式包括用于哺乳动物中再生内脏的或腔壁的膜的方法。方法可以包括将内脏的或腔壁的膜的缺损处与胶原箔相接触。箔可以包括非天然产生的多层胶原纤维生物基质，该生物基质不通过化学法或辐射法交联。生物基质可以是基本上无孔的。在一些情况中，多层胶原箔生物基质在内脏的或腔壁的膜与相邻的组织之间形成基本上不透液体的和不透气的层。可以使用血纤蛋白密封剂将多层胶原箔生物基质附着于病人内脏或腔壁的缺损上。多层胶原箔生物基质可以与包含聚乙二醇的物质相连接或被其覆盖。在一些情况中，在多层胶原箔生物基质的间隙内细胞生长之后，生物基质不会促进与相邻组织之间的粘连。

[0013] 在另一方面，本发明的实施方式包括用于被引导的细胞向内生长和被控制的内脏的或腔壁的膜组织再生的方法，以便防止哺乳动物术后或者创伤后组织表面上的粘连和纤维化形成。方法可以包括将组织与无孔的微观多层的胶原箔生物基质相接触。多层胶原箔生物基质在内脏的或腔壁的膜缺损与相邻的组织之间可以形成基本上不透液体的和不透气的层。使用血纤蛋白密封剂可以将多层胶原箔生物基质附着于病人内脏的或腔壁的膜的缺损上。在一些情况中，将多层胶原箔生物基质与物质比如聚乙二醇相连接。在一些情况中，在多层胶原箔生物基质的间隙内细胞生长之后，生物基质不会促进与相邻组织之间的粘连。

[0014] 在另一方面，本发明的实施方式包括组合物在药物制造中的应用，用于修复哺乳动物中内脏或腔壁的缺损。该组合物可以包括微观多层的胶原箔生物基质，该生物基质引导生物基质胶原层之间的间隙中细胞的生长。多层胶原箔生物基质可以在器官表面与相邻的腔室或者组织之间形成基本上不透液体的和不透气的层。可以使用血纤蛋白密封剂将多层胶原箔生物基质附着于病人内脏的或腔壁的膜上。可选择地，多层胶原箔生物基质可以与包含聚乙二醇的物质相连接。在一些情况中，在多层胶原箔生物基质的间隙内细胞生长之后，生物基质不会促进与相邻组织之间的粘连。多层胶原箔生物基质可以是平滑的和基本上无孔的。可选择地，多层胶原箔生物基质可以是平滑的和无孔的。在一些情况中，多层胶原箔生物基质是被再吸收并被重塑成自然组织。组合物可以以试剂盒的形式被提供或得到。

[0015] 在另一方面，本发明的实施方式包括用于抑制内脏或腔壁组织中的术后渗漏的胶原生物基质。该胶原生物基质可以是应用在内脏或腔壁组织切除术的术后，以便防止或者抑制组织渗漏或空气渗漏。胶原生物基质补充纤维原细胞及其他组织再生性细胞。在一些情况中，胶原生物基质包含在胶原层之间带有间隙、以便允许层之间的细胞生长的胶原生物基质。该胶原生物基质可以与血纤蛋白密封剂结合一起使用。与血纤蛋白密封剂结合一起的胶原生物基质在肺脏手术之后可以防止或者抑制空气渗漏直到28天。血纤蛋白密封剂可以与胶原生物基质一同被应用于缺损上，该胶原生物基质被施加在血纤蛋白密封剂上或者同血纤蛋白密封剂结合在一起。在一些情况中，覆盖着胶原生物基质的肺组织的区域的再生远远快于覆盖着血纤蛋白密封剂的肺组织的区域的再生。

[0016] 在一方面，本发明的实施方式包括治疗病人身上被表征为肺胸膜缺损的紊乱的方法。方法可以包括将生物功能的无孔的多层胶原箔生物基质给药于该缺损处的步骤，此生物基质引导在多层胶原箔生物基质间隙中的细胞生长。多层胶原箔生物基质可以在肺脏外表面与胸膜腔之间形成基本上不透液体的和不透气的层。给药步骤可以包括：运用压力封装(pressure fitting)技术、或者运用多层胶原箔生物基质和肺胸膜之间的自然粘连，用血纤蛋白密封剂将多层胶原箔生物基质附着在肺胸膜上，用外科手术封闭剂将多层胶原箔生物基质附着在肺胸膜上，用外科缝合线将多层胶原箔生物基质附着在肺胸膜上。在一些情况中，使用血纤蛋白密封剂将多层胶原箔生物基质附着于病人的肺胸膜上。在一些情况中，多层胶原箔生物基质与包括聚乙二醇的物质相连接。在一些情况中，在多层胶原箔生物基质的间隙内细胞生长之后，生物基质不会促进与腔壁胸膜之间的粘连。多层胶原箔生物基质可以引导多层胶原箔生物基质外表面的细胞生长。多层胶原箔生物基质可以包含赋形剂例如防腐剂、生长因子、以及有助于多层胶原箔生物基质柔韧性和弹性的添加剂。多层胶原箔生物基质可以包含来源于下组的胶原：例如牛的来源、猪的来源、马的来源、羊的来源、灵长类动物的来源、啮齿类动物的来源或者人的来源。在一些情况中，多层胶原箔生物基质包含来源于腱组织的胶原。在另一方面，本发明的实施方式包括用于哺乳动物中再生肺胸膜的方法。方法可以包括将肺胸膜与含有非天然产生的胶原纤维多层生物基质的胶原箔相接触，此胶原纤维不通过化学法或者辐射法交联。生物基质可以是基本上无孔的。多层胶原箔生物基质可以在肺脏外表面与胸膜腔之间形成基本上不透液体的和不透气的层。可以使用血纤蛋白密封剂将多层胶原箔生物基质附着于病人肺胸膜上。多层胶原箔生物基质可以与抗粘连物质如聚乙二醇相连接。在一些情况中，在多层胶原箔生物基质的间隙内细胞生长之后，生物基质不会促进与腔壁胸膜之间的粘连。

[0017] 在另一方面，本发明的实施方式包括引导细胞向内生长和控制组织再生、以便防止或者抑制哺乳动物术后或者创伤后肺组织表面上的粘连和纤维化形成的方法。方法可以包括将肺组织与无孔的微观多层的胶原箔生物基质相接触。多层胶原箔生物基质可以在肺脏外表面与胸膜腔之间形成基本上不透液体的和不透气的层。可以使用血纤蛋白密封剂将多层胶原箔生物基质附着于病人肺胸膜上。在一些情况中，多层胶原箔生物基质与包括聚乙二醇的物质相连接或被其覆盖。在一些情况中，在多层胶原箔生物基质的间隙内细胞生长之后，生物基质不会促进与腔壁胸膜之间的粘连。

[0018] 在另一方面，本发明的实施方式包括组合物在用于修复哺乳动物中肺胸膜缺损的药物制造中的应用。该组合物可以包括微观多层的胶原箔生物基质。多层胶原箔生物基质可以引导生物基质胶原层之间的间隙中细胞的生长。在一些情况中，多层胶原箔生物基质在肺脏外表面与胸膜腔之间形成基本上不透液体的和不透气的层。可以使用血纤蛋白密封剂将多层胶原箔生物基质附着于病人肺胸膜上。在一些情况中，多层胶原箔生物基质与包括聚乙二醇的物质相连接。可选择地，在多层胶原箔生物基质的间隙内细胞生长之后，生物基质可能不会促进与腔壁胸膜之间的粘连。在一些情况中，多层胶原箔生物基质是平滑的和基本上无孔的。在一些情况中，多层胶原箔生物基质是平滑的和无孔的。多层胶原箔生物基质可以被再吸收并被重塑成天然组织。在一些情况中，组合物可以以试剂盒的形式得到。

[0019] 在某些方面，本发明的实施方式包括用于抑制肺的术后空气渗漏的胶原生物基质。该胶原生物基质可以应用于肺切除或者其它肺脏手术之后以便防止空气渗漏。在一些情况中，胶原生物基质补充有纤维原细胞及其他组织再生性细胞。在一些情况中，胶原生物基质包含在胶原层之间带有间隙、以便允许层之间的细胞生长的胶原生物基质。可选择地，胶原生物基质可以与血纤蛋白密封剂结合一起使用。在一些情况中，与血纤蛋白密封剂结合一起的胶原生物基质可在外科手术之后防止空气渗漏直到28天。在一些情况中，血纤蛋白密封剂与胶原生物基质一同被应用在缺损上，该胶原生物基质被施加在血纤蛋白密封剂上、或者与血纤蛋白粘合剂结合一起。在一些情况中，覆盖着胶原生物基质的肺组织的区域的再生远远快于覆盖着血纤蛋白密封剂的肺组织的区域的再生。

[0020] 为了充分理解本发明的实质和优点，应参照下面的详细说明书连同附图。

附图说明

[0021] 图1显示了被选择的病人胸部解剖面。

[0022] 图2显示了被选择的病人胸部解剖面和内脏膜以及组织缺损面。

[0023] 图2A显示了被选择的病人胸部解剖面和内脏膜以及组织缺损面。

[0024] 图3显示了根据本发明的实施方式用于肺胸膜和肺部组织缺损的治疗技术方面。

[0025] 图4显示了根据本发明的实施方式用于肺胸膜和肺部组织缺损的治疗技术方面。

[0026] 图5显示了根据本发明的实施方式用于肺胸膜和肺部组织缺损的治疗技术方面。

[0027] 图6显示了根据本发明的实施方式用于肺胸膜和肺部组织缺损的治疗技术方面。

[0028] 图6A显示了根据本发明的实施方式用于胸膜缺损的治疗技术方面。

[0029] 图6B显示了根据本发明的实施方式胶原生物基质用于治疗内脏膜缺损的方面。

[0030] 图7是SEM(扫描电子显微镜)图片，显示了根据本发明实施方式的生物功能的胶原箔生物基质的基本上无孔的(poreless)或者无孔的不透液体的和不透空气的表面。

[0031] 图8A和8B是在ESEM(环境扫描电子显微技术)条件下拍的图片，指的是在微湿空气中接近自然条件下，显示了从根据本发明实施方式的生物功能的胶原箔生物基质的一侧观察的上表面。

[0032] 图9A和9B是在ESEM条件下拍的图片，显示了根据本发明实施方式的生物功能的胶原箔生物基质的下表面。

[0033] 图10是SEM图片，显示了根据本发明实施方式的水合生物功能的胶原箔生物基质的表面。

[0034] 图11A、11B和11C是在ESEM条件(潮湿空气)下拍的图片，显示了根据本发明实施方式的生物功能的胶原箔生物基质的横截面。

[0035] 图12A和12B是在SEM图片，显示了根据本发明实施方式的干的生物功能的胶原箔生物基质的横截面。

[0036] 图13显示在肺胸膜切除术之后具有组织缺损或渗漏和空气渗漏的肺组织。

[0037] 图14显示了根据本发明实施方式的胶原箔在创面上的应用。

[0038] 图15显示了根据本发明的实施方式，应用后的肺在水下(气水压力实验(hydropneumatic test))的组织渗漏或者空气渗漏评估。

[0039] 图16显示了根据本发明实施方式的覆盖肺组织并提供不透液体的和不透空气的封闭、同时保护组织细胞构成的胶原箔。

[0040] 图17显示了根据本发明的实施方式用被血纤蛋白密封剂固定的胶原箔生物基质封闭的肺组织缺损的组织切片。

[0041] 图18显示了根据本发明的实施方式用显示细胞高亲合力的血纤蛋白密封剂封闭的肺组织的组织切片。

[0042] 图19显示了根据本发明的实施方式用可封闭组织缺损的胶原生物基质(切片的下半部分)的组织切片。

[0043] 图20显示了根据本发明的实施方式被补充的并在胶原生物基质的间隙内生长的纤维原细胞。

[0044] 图21描述了肺组织表面上胸膜的内脏膜的正常组织图。

[0045] 图22显示了根据本发明的实施方式在植入后四个星期重塑的胶原生物基质和再生内脏的膜。

具体实施方式

[0046] 与身体各种器官相关的浆膜典型地包括脏层和壁层。浆膜腔包括包围心脏的心包腔、包围肺脏的胸膜腔和包围许多腹部器官的腹膜腔。本发明的实施方式包括胶原生物基质用于治疗组织和内脏的或腔壁的膜缺损或者渗漏的应用，例如用于那些可能在器官如肺中发现的缺损或者渗漏。肺脏被肺胸膜包围，该膜是薄的细软的浆液组织。对肺胸膜以及肺组织的破坏，例如连同不同程度的切除术(肺脏切除术外科手术)，可以导致威胁病人生命的并发症。手术后的组织渗漏以及空气渗漏是针对肺癌或者其它病变如纤维化以及肺气肿的肺切除之后的肺组织中时常发生的并发症。空气渗漏可以引起严重的并发症，例如积脓，或者延长胸腔管以及住院的需要。已知在肺脏手术之后的空气渗漏(如从肺脏切除术的缝合处或者封缝表面)消极地影响发病和死亡。

[0047] 典型的内脏的膜包括内脏腹膜、肺胸膜以及心包脏层或者心外膜。如上所建议，内脏的膜可以包围器官例如心脏、肺脏、肝脏、脾脏、胆囊等等。典型的腔壁的膜包括壁腹膜、壁胸膜以及心壁层。这种内脏的或腔壁的膜缺损可以导致不期望有的液体渗漏。肺脏、肝脏、肾脏、脾脏以及胸部的和腹腔的内脏的或腔壁的膜对于伤害、切除术、损害等等有相同的或者相似的伤口愈合反应机制，包括止血、形成血纤维蛋白、受伤组织的血纤维蛋白以及胶原作为导轨(guide rail)用于伤口愈合以及修复细胞，纤维原细胞以及修复细胞的浸入、细胞外基质/胶原结构的重建以及形成血管(vascularisation)。此处揭示的纤维原细胞以及修复细胞对生物功能的胶原生物基质的反应可能是基于与许多内脏的或腔壁的膜缺损的相同或者相似的原理，比如通过以某种方法运用生物基质的特性，例如通过纤维原细胞以及修复细胞被引导的向内生长以及调整。本发明的实施方式包括用于治疗内脏的或腔壁的膜或者组织缺损的技术，包括用于治疗壁的以及内脏的膜缺损或者肺脏渗漏的技术。典型地，内脏膜作为组织或者器官的一部分具有上皮/间皮细胞层及其他的层，并且与身体内发现的其他类型组织有很大的不同。根据本发明的一些实施方式，多层生物活性胶原的生物基质能被用于引导内脏的膜再生和修复，比如肺胸膜再生中的细胞向内生长以及胞外基质的重新形成。

[0048] 胶原生物基质在病人上的应用

[0049] 现在转向附图，图1显示了病人胸部的解剖的相关图。病人肺脏110与肺胸膜120相邻并且被其覆盖。肺胸膜的膜被直接附着在肺上，被外侧的壁胸膜140包围，外侧的壁胸膜140与胸壁150相邻并划出胸腔的内侧。如图所示，胸壁150包括肋骨152以及肋间肌154。

[0050] 内脏膜120和腔壁膜140一起组成间皮。胸膜腔130，在一些情况中被称为胸膜内的或腔壁间的间隔，是肺胸膜120和壁胸膜140之间的空腔或者间隔。壁层140分泌胸膜液至胸膜腔130，并且胸膜液通过脏层120被再吸收。

[0051] 因为肺脏伸长的弹性状态，肺胸膜120以及壁胸膜140连续不断地趋向于相互离开，并且胸膜腔130内胸内压的维持对于肺换气是很重要的。例如，在吸气期间胸膜腔130内是负压，以及在呼气期间胸膜腔130内是正压。如果胸膜遭受损害，空气可以被吸入胸膜腔130，这将分开两个胸膜层并导致肺虚脱。因此，肺胸膜120以及壁胸膜140在呼吸中起重要作用，并且膜和肺组织中空气渗漏或者缺损可以带给病人很大的风险。

[0052] 相关地，胸膜腔130内胸膜液的维持对于病人的呼吸机能是同样重要的。液体润滑平整的侧膜表面并且帮助肺脏相对于胸壁容易地移动，例如当呼吸期间肺脏膨胀和收缩时减少肺脏和胸壁内表面之间的摩擦。如果肺胸膜120或者壁胸膜140受到损害以及流体界面被破坏，可能出现气胸。

[0053] 某些肺部的外科手术技术或者受伤可能导致病人肺脏中的组织、空气或者液体渗漏。例如，肺胸膜120可能变得受损害。如上所述，胸膜的完整在呼吸机制中扮演一个重要因素。此处描述的胶原生物基质实施方式，会促使或者引导细胞向内生长至它的多层平面结构，是很适合防止或者治疗这种渗漏或者肺脏缺损、以及用于维持或者修复肺脏平面液体以及不透气体的表面。由于胶原生物基质的弹性，当病人呼吸时可以容易地调节肺组织的移动。

[0054] 图2提供了病人胸腔另一观察角度。如这里所述，肺组织210被肺胸膜220包围，肺胸膜220反过来被壁胸膜240包围。肺胸膜包含几个组织层。第一层包括间皮细胞的单层，第二层包括疏松结缔组织的下间皮层，第三层是表面的弹性薄层的弹性层，第四层是包含淋巴管、大毛细管以及胶原的间隙的或疏松的结缔组织层，第五层包括内部的弹性薄层的弹性纤维以及接触肺脏的纤维性组织。内脏的膜覆盖着肺脏薄壁组织或组织以及小叶间的裂痕。胸壁250包括肋骨252以及肌肉254。图2同样描述了肺脏切除术区域或者缺损201，凭此肺泡或者肺组织210被暴露，这样导致肺部的空气渗漏202。这种缺损可能是在肺脏手术期间产生的，例如通过外科医生手术刀或者由于受伤产生。当肺胸膜220被去除或者被损害，肺组织210和胸膜腔230之间的流体交流被建立。当肺泡破裂或者暴露于胸膜腔，肺胸膜的去除可以导致渗漏。在一些情况中，受损害的细支气管也同样可以暴露于胸膜腔。本发明的实施方式包括用于封闭或者减少这种流体交流的技术。例如，液体渗漏202可以通过使用胶原生物基质而被封闭或者被覆盖。

[0055] 图2A仍然提供了病人胸腔另一视野。如这里所述，肺组织210a被肺胸膜220a包围，肺胸膜220a反过来被壁胸膜240a包围。肺胸膜包含几个组织层。第一层包括间皮细胞的单层，第二层包括疏松结缔组织的下间皮层，第三层是表面的弹性薄层的弹性层，第四层是包含淋巴管、大的毛细管以及胶原的间隙的或疏松的结缔组织层，第五层包括内部的弹性薄层的弹性纤维以及接触肺脏的纤维性组织。肺胸膜覆盖着肺脏薄壁组织或组织以及小叶间的裂痕。胸壁250a包括肋骨252a以及肌肉254a。图2A同样描述了肺脏切除术区域或者缺损201a，凭此肺泡或者肺组织210a被暴露，这样导致肺部的空气渗漏202a。这种缺损可能是在肺脏手术期间产生的，例如通过外科医生手术刀或者由于受伤产生。当肺胸膜220a被去除或者被损害，肺组织210a和胸膜腔230a之间流体交流被建立。当肺泡破裂或者暴露于胸膜腔，肺胸膜的去除可以导致渗漏。在一些情况中，受损害的细支气管也同样可以暴露于胸膜腔。本发明的实施方式包括用于封闭或者减少这种流体交流的技术。例如，液体渗漏202a可以通过使用胶原生物基质而被封闭或者被覆盖。

[0056] 图3显示了内脏膜320中的缺损305。肺组织310暴露于胸膜腔330以及壁胸膜340。如这里所示，胸壁350包括肋骨352以及肌肉354。液体渗漏302存在于肺组织310和胸膜腔330之间。例如，在被暴露或者被损害的肺泡或者细支气管和胸膜腔之间可能有流体交流。本发明的实施方式包括封闭或减少这样的流体交流的方法。例如，液体或空气渗漏302可以用胶原生物基质来封闭或覆盖。

[0057] 如图4所描绘，可以将胶原箔生物基质460附着于病人的肺胸膜420、表面肺组织410或者两者之上。胶原生物基质轻微地叠加在它附着的病人内脏薄膜的开口上。生物基质460提供了肺表面410和胸膜腔430或腔壁膜440之间的阻挡层，生物基质460与胸壁
450相邻。在一些情况中，胶原箔生物基质和内脏膜或肺表面组织之间的自然吸附可被用于将胶原箔生物基质附着内脏膜或肺表面组织，无需使用任何封闭剂、胶、缝合线或者压力封装(pressure fitting)技术。在一些情况中，生物基质是预水合的(pre-hydrated)，因此一旦水合，胶原箔可以被切割得比病人的内脏膜上外科手术的开口稍大。从而胶原箔可以轻微地叠加在它附着的病人的内脏薄膜的开口上。在一个实施方式中，水合的胶原箔与内脏膜叠加的大小是从大约0.5厘米到大约1厘米。叠加的大小可以随着外科医生的选择和技能而变化。

[0058] 如图5所描绘，可以使用血纤维蛋白封闭剂570将胶原箔生物基质560附着于病人的内脏膜520、表面肺组织510或者两者之上。获得批准用于外科使用的例子包括TM TMTISSUCOL 和TISSEEL 血纤维蛋白封闭剂(巴克斯特AG，维也纳，奥地利)。作为另一种选择，获得批准的外科封闭剂也同样可以被使用。血纤维蛋白封闭剂或外科封闭剂可以围绕着叠加在内脏膜上的胶原箔部分呈一连线，被用于形成不透液体的和不透空气的封闭。胶原箔生物基质可以轻微地叠加在它附着的病人内脏薄膜的开口上。生物基质560，可选择地与血纤维蛋白封闭剂570结合一起，提供肺表面510和胸膜腔530或腔壁膜540之间的阻挡层，生物基质560与胸壁550相邻。如这里所描绘的，生物基质位于肺组织的表面上或附近，并且封闭剂被更深地置于肺组织内部。封闭剂可以有助于封闭缺损处，例如有助于作为肺泡或细支气管和胸膜腔之间的阻挡层。

[0059] 在有些情况下、胶原箔生物基质可以连同其他产品一起使用。例如，在将胶原箔生物基质应用到组织上并用这里描述的任何方法来固定后，抗粘连产品可以被应用在胶原箔生物基质的上表面或下表面，或者应用在邻近的组织上。图6显示了用胶原箔或生物基质660治疗在内脏膜620上的缺损605的修复技术。可选择地，胶原生物基质660可以被处理或与抗粘连物质680如聚乙二醇(PEG)相结合。例如，PEG可以被用于、被合并至、被结合至、被覆盖在生物基质的表面，并且可以作为在生物基质660和外围组织之间的分离层。当生物基质被用于病人时，有PEG的表面可以被放置得面向胸壁650。来自于肺表面的纤维原细胞可以迁移至生物基质，并且PEG可以防止或抑制在肺表面和胸膜壁层640或胸壁之间形成粘连。因此，基于PEG的产品可以被应用在胶原箔生物基质的上表面或下表面或两者之上、或者应用在邻近的组织上。在一些情况中，预涂PEG的胶原生物基质能被使用。由于胶原箔生物基质通过直接的组织再生而不是通过产生“平滑的”表面来防止粘连，可以通过使用可暂时产生细胞不会粘附于其的“平滑的”表面的产品来补充它的作用。在另一个实施方式中，可以使用备用的胶原箔生物基质，该生物基质已经被基于PEG的产品覆盖在一个表面或两个表面上。可选择地，生物基质660可以通过使用血纤维蛋白封闭剂670而被附着于病人的肺胸膜620、表面肺组织610、或两者之上。生物基质660，可选择地连同血纤维蛋白封闭剂670一起，提供肺表面610和胸膜腔630或壁胸膜640之间的阻挡层，生物基质660与胸壁650相邻。PEG层可以提供面对腔壁膜的分离层，并且也可以提供允许胸膜运动的滑动面。PEG层也可以很快地被溶解和被再吸收。胶原生物基质可以提供多层生物活性再生性物质，引导细胞向内成长和提高层状内脏膜的再生性。封闭剂，可选择地包括纤维蛋白原和凝血酶，可以允许固定，填充小间隙，并且在大约数天或者数周内支持伤口愈合和细胞附着及向内生长。如这里所述，封闭剂面向受伤的组织。

[0060] 在有些情况下，可以将抗粘连产品应用于胶原箔生物基质的上表面和下表面。图6A显示了用这种胶原箔或者生物基质660a治疗肺胸膜620a中缺损605a的修复技术。胸壁650a包括肋骨652a和肌肉654a。如这里所描述的，在生物基质的一个面上，胶原生物基质660a被处理或者结合抗粘连物质680a例如聚乙二醇(PEG)，而在生物基质的另一面上，胶原生物基质660a同样被处理或者结合抗粘连物质680b例如聚乙二醇(PEG)。抗粘连物质680a、680b可以在生物基质660a和周围组织之间提供分离层。当生物基质被应用于病人身上时，一个具有PEG的表面可以被放置得面向胸壁膜640a或者胸腔壁650a，并且另一个有PEG的表面可以被放置得面向肺组织610a。在一些实施方式中，覆盖680a的平滑的外面的PEG可以增强呼吸期间肺胸膜和壁胸膜的无干扰的移动，并且也可以有助于提供伤口暂时的闭合以及粘性的分离层。胶原生物基质660a可以用于引导细胞向内成长和增强完好、正常组织的再生和重建比如完全恢复。覆盖680a的里面的PEG可以被放置得面向有空气渗漏的肺组织。覆盖680a的里面的PEG可以填充肺组织610a中的小间隙，并且可以被快速地比如在数小时之内水解以及被再吸收，并且比如在数天以及数周内允许无干扰的生理的伤口愈合。这种被PEG双面覆盖的生物基质可以提供简单的控制，因为生物基质可以被应用在正面朝上或朝下。图6B显示了典型的多层胶原生物基质660b，其具有外科手术的网状661b，可以用于提高生物基质的稳定性和缝合性。外科手术的网状661b可以包括各种外科手术织物或带子中的任何一种，以及可以包括比如聚丙烯、聚脂、聚四氟乙烯等物质。

[0061] 在使用前，干的胶原箔可以被水合，比如在生理盐水中水合。在一个实施方式中，生理盐水包括0.9％氯化钠溶液。在另一个实施方式中，胶原箔在含有赋形剂或药物的溶液中被水合。水合胶原箔所需要的时间长度可能与箔的厚度有关。胶原箔可以被水合直到在它的全部面积上厚度是一致的。胶原箔生物基质可能对于水中或者生理盐溶液中的崩解是有耐性的。在一个实施方式中，胶原箔在生理盐水中在大约1秒和大约1小时之间被水合。在另一个实施方式中，胶原箔在生理盐水中在大约1秒和大约30分钟之间被水合。在另一个实施方式中，胶原箔在生理盐水中在大约1秒和大约20分钟之间被水合。在另一个实施方式中，胶原箔在生理盐水中在大约1秒和大约10分钟之间被水合。仍然在另一个实施方式中，胶原箔在生理盐水中在大约1秒和大约6分钟之间被水合。在另一个实施方式中，胶原箔被浸在生理盐水中并且立即被移去。这种半水合可以导致提高对组织的附着性。在另一个实施方式中，胶原箔在生理盐水中大约5分钟被水合。在另一个实施方式中，胶原箔在植入前没有被水合，在应用于组织和原位水合时可以提供立即的附着。

[0062] 本发明的实施方式包括多层胶原箔生物基质的使用、制造或者应用，例如那些在WO2004/108179或者WO 2007/137839中所描述的方法，将其内容并入本文以供参考。如上所述，生物基质可以是与血纤蛋白密封剂一起使用的。在一些情况中，在生物基质应用之前可以将血纤蛋白密封剂应用于治疗位置或部位。在一些情况中，血纤蛋白密封剂和生物基质可以一起被应用。血纤蛋白密封剂典型地包括两个主要活性成分：纤维蛋白原和凝血酶。凝血酶有助于纤维蛋白原转变为纤维蛋白单体，这些纤维蛋白单体可以交联形成血纤维蛋白基质，血纤维蛋白基质可以连接至受伤的组织如肺部组织，并连接至胶原生物基质的自身的胶原纤维。血纤维蛋白胶可以包括来源于病人自己血清的自身的血纤蛋白密封剂，在一些例子中，胶原生物基质与纤维蛋白原一起被应用，随后是凝血酶的应用。在一些情况中，纤维蛋白原被应用，继之以胶原生物基质与凝血酶一起被应用。在一些情况中，胶原生物基质与纤维蛋白原和凝血酶结合一起被应用。血纤蛋白密封剂可以被施加在生物基质的表面，例如当将生物基质应用在病人身上时，血纤蛋白密封剂施加在生物基质一侧面，该侧面然后面向肺脏表面。血纤蛋白密封剂可以帮助生物基质固定或附着在病人的肺组织上。在一些情况中，血纤蛋白密封剂可以至少局部地填补肺组织粗糙面和生物基质之间的间隙。因此，封闭剂可以有利于生物基质和肺脏表面之间的紧密接触和维持细胞附着以及细胞生长。血纤蛋白密封剂可以以薄层方式应用于胶原生物基质上。血纤蛋白密封剂同样可以提供屏障性能，例如抗液体和气体。可选择地，胶原生物基质或者与生物基质相关联的组成部分例如PEG层或者血纤蛋白密封剂层，可以被着色剂处理或包括着色剂，以便允许个体可以辨别生物基质的一面与另一面。例如，包括用于固定血纤蛋白密封剂的生物基质的一个面可以具有着色剂或染料例如亚甲蓝。这种直观标记可以帮助外科医生确定如何将生物基质应用在病人身上。在上述的实施例中，外科医生可以应用生物基质以便蓝色侧面朝向肺脏表面。

[0063] 作为外科手术步骤的一部分，外科医生或者其它保健职业的人员可以冲洗生物基质。例如，在将生物基质应用于病人组织之前，外科医生可以用盐溶液水合生物基质。紧接着应用至病人身上后，在肺脏和胸壁之间的内生液体可以给生物基质提供水合作用。在一些情况中，外科医生可以在病人身上应用生物基质，并且根据需要可以剥离和复位生物基质。这种技术可以有利于生物基质充分地水合。当生物基质已经在位置上时，可以通过溶液进行水合。在另一个实施方式中，在有或者没有血纤蛋白密封剂或外科手术封闭剂连线的情况下，当胶原箔附着于自身的肺胸膜或者肺脏表面时，胶原箔产生不透液体和不透空气的封闭。在另一个实施方式中，叠加在肺胸膜或者肺脏表面上的胶原箔与将其附着在肺胸膜或者肺脏表面的血纤蛋白密封剂或外科手术封闭剂一起被散布。不透液体的封闭固定可能是有利的，因为它避免与带有出血的相邻组织接触相关的并发症，比如通过未受控制的出血和血纤维蛋白分泌而诱导粘连形成。在另一个实施例中，当胶原箔用血纤蛋白密封剂或外科手术封闭剂连线被附着于组织时，胶原箔生物基质产生不透液体和不透空气的封闭。在更进一步的实施例中，叠加于组织的胶原箔生物基质与将其附着于组织的血纤蛋白密封剂或外科手术封闭剂一起被散布。仍然在另一个实施例中，一旦胶原箔生物基质处于理想的接触位置时，通过外科手术将其缝合使得胶原箔附着在组织上。如果胶原箔生物基质待被缝合，张力缝合技术可用于防止撕破胶原箔。也许希望例如利用血纤蛋白密封剂来封闭缝合线。在另一个实施例中，根据已知的压力封装(pressure fitting)技术将胶原箔生物基质定位和植入。在一些技术中，胶原箔生物基质被定位在理想的植入位置并且通过周围组织使其保持在原位。因此，无需使用外科缝合线、血纤蛋白密封剂或者外科手术的封闭胶就可将植入物保持原位。在另一个实施例中，无需使用任何封闭剂、胶、缝合线或者压力封装(pressure fitting)技术就可将胶原箔生物基质定位和植入。在这个技术中，胶原箔生物基质被定位在理想的植入位置，并且通过胶原箔生物基质和哺乳动物组织之间产生的内在吸引力和粘附性使其保持在原位。在另一个实施例中，生物基质的半水合可以提高对受损害的湿润组织的附着。在另一个实施例中，胶原箔生物基质可以通过此处描述的任何一种方法施加于组织和附加物上，然后另一个胶原箔生物基质可以施加于相邻的组织，并且可以通过此处描述的任何一种方法被施加，这样产生胶原箔生物基质相邻的片层。

[0064] 在另一个实施方式中，一旦它被定位在理想的植入位置，胶原箔就通过外科手术缝合而被附着于受伤的组织上，如肺胸膜。可以使用这种实施方式将胶原箔附着于病人自身的肺胸膜上。如果胶原箔生物基质待被缝合，张力缝合技术可用于防止撕破胶原箔。可以例如利用血纤蛋白密封剂来封闭缝合线。

[0065] 在另一个实施方式中，根据压力封装(pressure fitting)技术将胶原箔定位和植入。在这个技术中，胶原箔生物基质被定位在理想的植入位置，并且通过各自的解剖存在的内生的内压力使其保持在原位。因此，无需使用外科缝合线、血纤蛋白密封剂或者组织胶，就可使植入物保持在原位。

[0066] 在另一个实施方式中，无需使用任何封闭剂、胶、缝合线或者压力封装(pressure fitting)技术，就可将胶原箔定位和植入。在这个技术中，胶原箔被定位在理想的植入位置，并且通过胶原箔和受伤的组织之间产生的内生吸引力或附着性使其保持在原位。

[0067] 胶原箔可以作为暂时的代替内脏膜植入物而被应用，以便修复人的内脏组织如肺胸膜组织，用于由于先天的条件、出生缺陷、疾病、受伤、肿瘤去除或者其它破坏或者穿透病人内脏的膜外科手术操作，或者任何其它可以受益于内脏膜如肺胸膜的修复的状况。胶原箔同样可以被应用于修复任何各种哺乳动物的内脏膜组织，包括，但不限于羊、猴、马、大鼠、小鼠、人、或其它哺乳动物。本发明的实施方式更进一步地提供试剂盒，试剂盒含有胶原箔和用于其准备以及作为替代内脏膜的说明书。

[0068] 用多层生物功能的胶原箔生物基质覆盖组织的方法可以在任何创伤或者内脏膜缺损的治疗期间进行。在一些情况中，将基质应用在病人身上的步骤可以在肺脏手术期间或作为肺脏手术的一部分来进行。在一些情况中，多层胶原箔生物基质可以吸附细胞例如修复细胞和再生性细胞，并且引导它们沿着多重生物活性层并穿过及在箔生物基质上向内生长。多层胶原箔生物基质通过细胞向内生长可以被再吸收并被重塑成天然组织。层状结构的胶原箔生物基质可以作为生物活性物质和生物功能的支持物用于体内的细胞向内生长，并且在再生和修复期间被带有层状结构胶原的哺乳动物组织所代替。胶原箔生物基质可以被它所植入的哺乳动物再吸收。这个特性可以通过自然的交联的胶原纤维和胶原箔生物基质的多层结构的生物功能而被提高，如图11A-C和12A-B所示。

[0069] 根据一些实施方式，词语“用多层胶原箔生物基质覆盖组织”一般指的是将组织与多层胶原箔生物基质直接接触。在一些实施方式中，组织和多层胶原箔生物基质的接触导致箔的植入。多层胶原箔生物基质的位置的例子在图3-6和14中被显示。根据一些实施方式，胶原生物基质被应用在缺损(叠加)处上方。根据一些实施方式，胶原生物基质被应用在缺损下方(衬垫物)。

[0070] 胶原生物基质产物提供许多有效成分。，其中它们参与的趋化现象交互作用可促进内皮细胞和纤维原细胞的快速渗滤，反过来产生和堆积新的呈层状的胶原自身纤维；包围组织中伴随的受限的淋巴细胞炎症反应促进了胶原生物基质的吸收。胶原同样拥有止血的特性，可以用于治病。血小板在胶原结构上堆积自身、分解并且这时释放凝血因子，凝血因子和血浆因子一起促进血纤维蛋白形成。

[0071] 胶原生物基质

[0072] 根据一些实施方式，词语“多层胶原箔生物基质”或者“胶原生物基质”或者“胶原箔”指的是天然的胶原纤维的生物基质(如生物相容的和生物功能的材料的基质)，其已被处理以便去掉非胶原成分并且和形成微观水平上多层层状结构的胶原纤维薄片。多层胶原箔可以来自任何来源，例如牛的、羊的、猪的、马的或者人的来源，其被处理以便除去非胶原成分并且形成有相同物理特性的胶原纤维的薄片。根据一些实施方式，胶原箔生物基质是基本上无孔的，例如通过扫描电子显微技术所确定的无孔。根据一些实施方式，在上下文中使用的生物功能的多层箔生物基质中的术语“生物功能的”指的是由天然的胶原纤维组成的生物基质，天然的胶原纤维通过动物的细胞以类似动物天然胶原纤维的方式被确认和应用。例如，非限制性地，这种功能可以包括修复和再生性细胞沿着生物功能的胶原纤维以及多层结构迁移、以及通过包括或者替代的细胞、生物功能胶原纤维的新的胞外基质的沉积。

[0073] 根据一些实施方式，此处使用的词语“非天然产生的生物基质”指的是被产生的具有天然胶原纤维的基质或者结构，“非天然产生的生物基质”的形成是通过下述条件：(i)在天然界中存在的物质(即天然原料)，其以这样一种方式被加工或者被处理：其中包含在天然原料中的胶原纤维已经在天然原料的胶原结构中从它们的天然产生成的排列中移动或改变位置；或者(ii)在天然界中不存在的物质(即非天然的、人造材料如重组体物质)，其被加工或处理以便操控胶原纤维排列。例如，非天然产生的生物基质可以由包括已经被机械或化学法处理(如碾磨、剁碎等)的胶原的起始物料形成，。以保持天然产生的胶原骨架结构的方式经加工或处理而由起始物料形成的胶原生物基质不是非天然产生的生物基质(例如，被加工以便除去细胞组分同时保持天然的胶原结构的表皮组织)。

[0074] 在一些实施方式中，胶原箔生物基质包括具有胶原纤维的结缔组织蛋白。例如，胶原箔生物基质可以包括含有I型胶原纤维的结缔组织蛋白。除了具有胶原纤维外，胶原箔生物基质还可以包含赋形剂、防腐剂、生长因子、或者有助于最终产品柔韧性和弹性的添加剂。每层胶原纤维可以基本上无孔的。根据一些实施方式，词语“基本上无孔的”指的是：由于胶原纤维的沉淀形成胶原薄片，存在于胶原箔生物基质上的任何孔是基本上互相分离的，并且小孔不是以穿过胶原箔厚度的方式相互连接的。在胶原箔生物基质上产生孔的机械穿孔不是孔。在一些情况中，材料似乎基本上无孔，但当使用扫描电子显微镜在1500X放大倍率时是可见的。在图7、8A-B、9A-B和10中扫描电子显微镜图显示了胶原箔生物基质的本质。

[0075] 根据一些实施方式，胶原箔可以被它所植入的哺乳动物再吸收。不受特定的理论所束缚，据认为这种特性可以通过胶原质胶原箔的结构来得到提高。被用于生产马的胶原箔的过程可形成胶原纤维的堆叠层。每层之间有间隙，病人的细胞和血管系统可以迁移至其间隙中，并且形成内脏的或腔壁的膜组织例如新胸膜组织。每层胶原纤维可以基本上无孔的。少数可能存在的小孔一般地互相分离，并且不通过胶原纤维多层相互连接。本发明的多层结构提高了胶原箔不透液体和不透空气的特性。

[0076] 胶原箔生物基质的实施方式可以包括具有多方向缠绕的胶原纤维层的非天然产生的多层胶原膜。因此，胶原纤维可以在平面上以多方向形式排列，并且这些平面形成薄层，产生多层结构。在图7的显微照片(SEM扫描电子显微镜)中可以看见干的胶原箔生物基质的显示情况，显示了其中胶原纤维被埋入的胶原箔生物基质的表面。在ESEM(环境扫描电子显微技术)条件下，其中微湿空气提供接近天然的条件，在胶原箔生物基质的上表面照片的表面上，胶原纤维是可见的。如在图8A-B中所示，该表面看起来平滑并且基本上无孔。胶原箔生物基质下表面的照片(ESEM)显示胶原箔生物基质基本上无孔，如在图9A-B中所描述的。胶原纤维是证据。

[0077] 多层中天然胶原纤维在二维方向上的单一定向对于不透液体性和不透空气性起主要作用，即使例如在高静水压下，并且提供了高弹性的较大强度。由于胶原箔生物基质中很多平行定位的薄的胶原纤维层，该材料在覆盖后适用于在封闭缺损处暂时代替身体中自身的内脏的或腔壁的膜，并且提供生物功能的生物基质支持，用于细胞的向内生长以便形成新的组织和胶原结构。该多层结构可以提高胶原箔生物基质的不透液体和不透空气的特性。

[0078] 在使用胶原箔来修复哺乳动物内脏膜组织之前，干的胶原箔物质可以被水合。图10是SEM图片，显示了水合胶原箔，其中清楚地显示了胶原纤维。从图片上看表面基本上无孔。

[0079] 根据一些实施方式，胶原箔生物基质是基本上无孔的，并且胶原纤维层之间存在间隙。胶原箔生物基质可以类似于许多页，其中每页基本上是平滑和无孔的，在每页间具有空隙。当处于干型时，间隙可以更加明显。当胶原箔生物基质在微湿空气的接近天然条件下观察时，间隙变得缩小。在潮湿空气中胶原箔生物基质横截面的图片图11A-C中显示了胶原箔生物基质间隙的缩小情况和层的特性。湿润的ESEM条件可以接近天然条件。材料显示的结构类似被非常紧密捆扎在一起的许多片层。胶原纤维层之间的间隙是明显的。相比较地，图12A-B是显示干的胶原箔的ESEM照片。胶原的多层和胶原之间的间隙是明显的。除了促进不透液体和不透空气的特性之外，胶原箔生物基质中很多平行定位的薄的胶原纤维层同时还用作生物等效的生物功能的支持物，用于细胞向内生长用于身体自身组织的重新构建。

[0080] 在一些情况中，当水合时，胶原箔生物基质的体积变化是小的或者可以忽略的。胶原箔生物基质在水合时基本上保持它的大小与形状，即使在水合之后也具有出色的形状稳定性，并且在与组织接触后不会引起胀大或者收缩的问题。一旦水合和植入，胶原箔生物基质的实施方式在面积或厚度上可以不显著膨胀或紧缩进而撕破外科缝合线、或者使血纤维蛋白或其它生物相容的胶封闭处分裂开来，从而在病人组织中保持胶原箔生物基质。

[0081] 在一些情况中，当完全地水合时，干的胶原箔生物基质的收缩或者胀大可以有大约-5％至大约20％的差异。在一些情况中，当完全地水合时，干的胶原箔生物基质面积可以有大约-5％至大约10％的差异。可选择地，当完全地水合时，干的胶原箔生物基质面积可以有大约-5％至大约5％的差异。例如，当完全地水合时，干的胶原箔生物基质面积可以增加至多大约4％。

[0082] 在一些情况中，当完全水合时，胶原箔生物基质增加直到它的干的厚度的大约6倍。在一些情况中，当完全水合时，胶原箔生物基质增加直到它的干的厚度的大约3倍。在一些情况中，当完全水合时，胶原箔生物基质增加至它的干的厚度的大约2倍。

[0083] 胶原箔生物基质厚度的变化可以取决于特定的应用。改变被用来产生特定大小胶原箔生物基质的起始物料数量可以控制胶原箔生物基质的厚度。在一些情况中，胶原箔生物基质，当处于干型时，具有大约0.01毫米至大约3.0毫米之间的厚度。在另一个实施例中，胶原箔生物基质具有大约0.02毫米至大约2.0毫米之间的厚度。在更进一步的实施例中，胶原箔生物基质具有大约0.03毫米至大约1.5毫米的厚度。在另一个实施例中，胶原箔生物基质具有大约0.05毫米至大约1毫米之间的厚度。仍然在另一个实施例中，胶原箔生物基质具有大约1.0毫米以下的厚度。

[0084] 胶原箔生物基质干重可能取决于它所想要的厚度。在一个实施例中，胶原箔生物2 2
基质的干重是在大约1mg/cm 至大约50mg/cm 之间。在另一个实施例中，胶原箔生物基质
2 2
的干重是在大约1.5mg/cm 至大约30mg/cm 之间。仍然在另一个实施例中，胶原箔生物基
2 2
质的干重是在大约2mg/cm 至大约20mg/cm 之间。在更进一步地实施例中，胶原箔生物基
2 2
质的干重是在大约2.5mg/cm 至大约15mg/cm 之间。例如，胶原箔生物基质的干重是在大
2 2
约3mg/cm 至大约10mg/cm 之间。

[0085] 在一些情况中，紧接着水合后，胶原箔生物基质的重量增加直到它的干重的大约15倍。在另一个实施例中，紧接着水合后，胶原箔生物基质的重量增加直到它的干重的大约10倍。在另一个实施例中，紧接着水合后，胶原箔生物基质的重量增加直到它的干重的大约7倍。仍然在另一个实施例中，从它干燥状态紧接着水合后，胶原箔生物基质的重量增加直到它的干重的大约5倍。根据一些实施方式，胶原箔生物基质有利地具有高抗张强度，这可提高和维持胶原箔生物基质的控制，例如在它的外科手术应用期间；并且可提供增加的机械稳定性，例如在它的植入之后。另外，增加胶原箔生物基质厚度可以显著地增加抗张强度。

[0086] 胶原箔生物基质材料在作用压力之下撕破的倾向可以被测量，作为它的“最终张力载荷”或者“最终张力”，以下简称“最终张力”。胶原箔生物基质最终张力可以通过对具有特定宽度胶原箔生物基质条带施加压力、并测定导致胶原箔生物基质失败(例如撕破或者破裂)的被施加的压力的数值来确定。最终张力可以使用以下等式来定量：“最终张力”＝施加力/胶原箔生物基质条带的宽度＝牛顿/cm-条带。

[0087] 在一些情况中，胶原箔生物基质具有的最终张力在大约1和大约30牛顿/cm-条带之间。在一些情况中，胶原箔生物基质具有的最终张力在大约1.5和大约15牛顿/cm-条带之间。在一些情况中，胶原箔生物基质具有的最终张力在大约2和大约10牛顿/cm-条带之间。在一些情况中，胶原箔生物基质具有的最终张力在大约3和大约6牛顿/cm-条带之间。在一些情况中，有外科手术网状的胶原箔生物基质，例如在图6B中显示的类型，可以具有大于30牛顿/cm-条带的最终张力。

[0088] 胶原箔生物基质的实施方式可以具有高的拉伸强度，当水合时仍然保持弹性和灵活。这个特点允许胶原箔生物基质最优化地适合于在接触部位出现的解剖条件(如曲线)。

[0089] 当处于它的水合状态时，胶原箔生物基质可以在周围容易地移动。例如，生物基质可以在外科手术位置周围移动，并且被最优地塑造，以及适用于内脏的或腔壁的膜缺损形状和位置，比如在被植入的位置。一旦植入，胶原箔生物基质植入保持变平滑，并且如必要的话或者可以按照所希望的那样被改变位置。随着时间的过去，细胞和血管系统迁移被指向贯穿多层胶原箔生物基质的多个层，最终用新的组织和自身的胶原结构代替多层胶原箔生物基质。当在胶原箔生物基质内细胞迁移和形成血管系统时，组织以被引导的方式呈现胶原箔生物基质的形式。在用新形成的结缔组织对胶原箔生物基质进行细胞组织之后，可以将对相邻组织如壁胸膜或者胸壁的粘连减到最少。

[0090] 在生产胶原箔生物基质中使用的胶原可以从任何合适的来源中获得。例如，不限制地，胶原可以来源于牛、羊、猪、马或者人。胶原可以从天然产生的组织例如腱、真皮，或者其它胶原丰富的组织中获得，或者可以通过重组体遗传方法来生成。如下所述，本发明一个典型的实施方式利用了来源于跟腱的马胶原。根据一些实施方式，胶原生物基质包括天然的马的胶原纤维(主要是I型胶原)，其从纯化的切碎的马的跟腱中沉淀而来。灵活的形式稳定的和弹性的生物基质可以具有无孔的不透液体的和不透空气的多层结构。在干的状态下，生物基质厚度可以是大约0.1毫米，并且在湿的状态下，膜厚度可以是大约0.3mm。

[0091] 根据本发明的实施方式，多层胶原箔生物基质可以包括胶原的天然交联的微观多层的生物基质，该生物基质具有多层基本上无孔的薄膜，该薄膜包括胶原纤维。这种非天然产生的生物基质的实施方式在国际专利申请WO 04/108179和WO 07/137839中被描述，它们公开的内容全部并入此处以供参考。根据本发明的实施方式可以被使用的胶原箔一般地是生物功能的、生物活性的、机械稳定的、弹性的、无孔的、不透空气的和不透液体的、尤其是不透血和细胞的胶原箔，并且可以提供暂时的屏障防备不受控制的出血、纤维蛋白原、坏死的物质和被损害的组织的分布。因此被限定的在内脏组织和相邻解剖结构之间的生物活性分离层最初保护了被治疗的组织。多层胶原箔生物基质可以作为止血剂和抑制不受控制的血纤维蛋白区域形成和分配以及血肿，这些是主要的引起在解剖区域被定位在内脏膜旁边或者接近内脏膜例如肺脏表面的纤维化和粘连形成的原因。

[0092] 机械稳定的、弹性的、无孔的、并且不透液体的和不透气体的胶原的生物基质可以被应用于内脏膜缺损处。胶原生物基质可以作为人工的上皮/间皮，并且覆盖和保护内脏的或腔壁的表面。这导致器官表面的液体渗漏和空气渗漏的初步的封闭。优选地，胶原生物基质的应用可以提供立即的机械的封闭剂，作为液体或者空气的屏障。由于生物基质的成层构造，纤维原细胞或者伤口愈合细胞例如淋巴细胞或者巨噬细胞可以沿着生物基质而被导引或者被允许迁移，导致生成内源的胶原。因此，病人自己的内脏的或腔壁的膜可以再生或者增强，例如当伤口愈合细胞最终被正常的内脏膜代替时。这样，生物基质可以被重塑成身体自己的内脏膜。这在很少有或者没有附着或结合的情况下可以被实现，特别在内脏组织和相邻区域之间，如在肺脏表面和胸壁之间。

[0093] 根据一些实施方式，利用胶原生物基质的内脏膜再生可以代替或者扩充某些标准外科手术技术。例如，可以进行胸膜再生而不是进行肺脏封闭、血凝固技术、缝合技术和其它“生物材料”的植入。生物功能的胶原的生物基质能被使用于引导细胞向内长并且增强胞外基质的重新形成，用于内脏膜的再生过程。胶原生物基质最初始通过附着力可以附着在创面上。生物基质的天然胶原纤维可以激活血凝固和血纤维蛋白局部形成，另外维持渗漏封闭和胶原膜的附着。生物活性胶原可以吸附修复细胞，特别是纤维原细胞。这可以通过血纤维蛋白(如生理的血纤蛋白密封剂)局部出现而另外被支持。结构多层生物基质中平行的层可以引导纤维原细胞和修复细胞沿着层向内生长。沿着胶原基质平行的层向内生长一般地比穿过层向内生长快。胞外基质与内源胶原一起的重新形成也是通过细胞(纤维原细胞)排列而被引导的。这个过程引导生物基质重塑成活组织，并且封闭内脏的缺损，例如在外伤的破裂、外科手术切割、切除术或者皮质剥除术之后。在皮质剥除术的过程中，肺脏的表面层膜被除去。

[0094] 由此可见，本发明实施方式包括用于形成来自于胶原箔的胶原结构的多层胞外基质的技术。引导胶原生物基质可提供用于引导细胞向内生长以用于内脏的和腔壁的膜再生。这种引导组织再生是很适合封闭或者减少胸膜的组织中的渗漏，例如延长术后的肺部空气渗漏。事实上，动物研究已经证明了胶原生物基质在防止延长的肺部外科手术术后空气渗漏中的效力、以及在通过引导的细胞的向内生长而被引导的内脏膜再生中的效力。根据一些实施方式，本发明的胶原生物基质是防渗材料，用于封闭以及在胶原和决定血小板凝集的血细胞之间的接触。与胶原生物基质的相互作用可诱导凝血因子的释放和血纤维蛋白的形成。胶原生物基质可以按照所需要的和适合内脏的缺损来切割。本发明胶原生物基质实施方式在植入结合的目视状况中、以及在结并过程中的组织和结缔组织结构评估中证明是成功中的，防止了外科手术之后个体中无论何时的空气渗漏，对相邻的组织结构没有损害反应(发炎，粘连，纤维化，坏死)。多层胶原质箔生物基质实施方式可以吸附细胞例如修复细胞和再生性细胞。生物基质物质可以引导细胞生长直达生物基质表面，并且提供修复和再生细胞的向内生长。在向内生长之后，生物基质物质可以重新塑造成天然的组织并且可以被再吸收。

[0095] 标准的基于胶原的组合物通常被寄主认为是外来的并经常被包封进内部。因此，重新细胞化和重新塑造成各自的解剖组织不会发生或者是不可能的，没有被引导的细胞向内生长和再生过程的控制，并且胶原近乎不被容忍是“生物相容的”植入物。相反，根据本发明实施方式，多层胶原箔生物基质具有膜(如肺胸膜)功能，作为在多层胶原箔生物基质内和胶原箔生物基质表面上引导细胞生长的生物活性的暂时的层。并非仅仅作为抑制细胞生长的屏障，如同大多数的抗粘连组合物那样，多层胶原箔生物基质可以具有最大程度的生物活性并支持组织的重新塑造。例如，在植入后的几周内，多层胶原箔生物基质可以很好地整合进内脏膜组织中被修复的解剖结构。更进一步地，在外科手术期间和之后，无孔的、不透液体(如血、液体、空气、气体、胆汁等等)的胶原膜的多层结构能够防止血液(例如纤维蛋白原/血纤维蛋白)和来自于胸膜创口区域的坏死物质的不受控制的分布，这些物质有可能要对在外科手术后初始时间粘连形成的维持病况负责(相比有孔的组合物)。胶原生物基质也可以防止在内脏表面和相邻组织之间例如肺脏表面和壁胸膜或胸壁之间一瘢痕形成和纤维化的主要区域的直接接触。这也有助于被控制的解剖结构的重新塑造，并防止不受控制的粘连和瘢痕形成、以及胸膜的纤维化，并将其减到最小程度。这种技术可被用于任何哺乳动物，包括，但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠等等。

[0096] 除促进不透液体和不透空气的特性之外，胶原箔中很多平行定位的薄的胶原纤维层同时用作细胞向内生长的生物基质支承物，用于身体自己的内脏膜的重新构建。意外地发现，胶原箔的无孔的、层状构造促进了细胞向内生长、血管结构、以及与胶原箔相交叉的和在多层之间存在的间隙中新胶原结构形成，在植入的几周内形成具有天然胸膜的典型层状结构的新胸膜。如本文其它地方所述，细胞向内生长、血管结构和新胶原结构是如此明显，以致于在术后的几周内，新胸膜变得与病人以前存在的肺胸膜组织难以区别。因此，最终植入物向内生长可以变得完全机体化。

[0097] 根据本发明一些实施方式，使用胶原箔的显著的益处是基本上很低风险地将疾病传染给被植入的病人。生产过程中胶原纤维用酸(如盐酸、醋酸等)和碱例如氢氧化钠来处理来生成胶原箔，有利于灭活或者减少可能存在的细菌、病毒和朊病毒的传染性水平。用盐酸、氢氧化钠、环氧乙烷(ETO)等等处理生物材料被政府机构确认为是在药物和生物材料中控制灭活朊病毒和病毒的准许方法。在一些调节措施下，这种处理方法可以减少批次间基础上测试胶原箔的规章要求。因此，在生产过程中，胶原纤维的处理提高了产品安全性，并且减少了将疾病传染给病人的风险。

[0098] 经过此处描述的生产过程处理的胶原材料已知不会将任何病原体传染给病人。因此，除生产过程外，利用马的胶原更进一步地避免了以前与人尸体代替品相关的海绵形脑炎传染的风险。使用来源于马的胶原比如来源于马跟腱的胶原，可避免传染可传染的已知是狂牛病(BSE)或痒病的海绵样脑病(TSE)的风险。这种疾病的传染与使用来源于反刍动物来源的生物材料(如来源于家牛、山羊、绵羊等的生物材料)有关。

[0099] 当水合时，胶原箔的体积变化是小的或者可以忽略的。与有孔的代替产品相比，胶原箔生物基质在刚水合时基本上保持它的大小与形状，具有出色的形状稳定性，即使在水合之后仍保持生物稳定性，并且在植入后在身体内不会引起胀大或者收缩的问题。一旦水合并植入，胶原箔在面积或厚度上不会显著地膨胀或者紧缩进而撕破外科缝合线、或者使血纤维蛋白胶封闭分裂开来，在病人组织中仍保持胶原箔。

[0100] 胶原箔厚度可以通过改变被用来产生特定大小胶原箔的起始物料数量而受到控制。胶原箔可以用环氧乙烷(ETO)或类似的杀菌气体进行气体杀菌或者通过幅射杀菌。

[0101] 胶原生物基质的生产

[0102] 根据一些实施方式，胶原箔是胶原纤维经处理除去细胞组分并且形成胶原纤维薄片的生物基质。在生产过程期间，如在WO 04/108179或者WO 07/137839中所描述的那样，当原纤维从溶液中沉淀出来形成胶原箔时，胶原纤维变成自然地交联。不像用化学法或者辐射法(如离子化或者紫外线辐射)进行的胶原纤维交联那样，使胶原纤维自然交联可以确保它们的生物功能，促进加速再生。并且一旦胶原箔生物基质与组织相接触，可以减少吸收时间。用化学法或者辐射法交联的胶原纤维可能导致增加的吸收时间，以至不吸收、包裹和瘢痕形成。在一些实施方式中被应用的胶原箔生物基质中的原纤维的自然交联通过自然的、生理的类似方法进行。基本上地，这种自然交联是通过非共价作用(如范德瓦尔斯或者偶极-偶极相互作用)或者通过胶原分子氨基酸侧链之间的容易离解的Schiff碱键的形成而进行的。胶原分子间的交联对于物理和化学稳定性起主要作用。胶原交联的关键步骤取决于赖氨酸或羟基赖氨酸残基的酶致转化，并且生成乙醛、醛赖氨酸和羟醛赖氨酸。这些醛基自发地与反应性的氨基反应，导致包含带有不稳定的醛亚胺联接物(比如类似-CH＝N-)的不稳定醛醇缩合产物的Schiff-碱成分的形成。因此，产物中的原纤维通过用如弱酸处理可以被溶解。通过利用化学交联剂产生的交联可以从存在稳定的共价交联的交联部分而被检测。通常，通过下述方法来实现：使用Schiff-碱试剂(比如戊二醛)形成Schiff-碱反应产物，然后通过Amadori重排或还原条件来稳定键。另外，胶原可以通过各种双功能的碳二亚胺试剂进行交联。通过利用辐射发生的交联可以通过检测胶原纤维之间稳定的共价键的存在而被检测，该共价键起因于辐射期间产生的自由基部分的反应。另一方面，生物基质产品中的原纤维是基本上不与任何稳定的共价键交联的，并且没有用化学的或者辐射的方法处理。因此，生物基质产物中纤维间的任何联接基本上是非共价的或者是容易可逆的，并且不是稳定的联接。化合物例如氨基氰、戊二醛、甲醛、丙烯酰胺、碳二亚胺二酮(carbodiimide diones)、二酰亚胺盐(diimidates)、双丙烯酰胺等等在过去被运用在化学方法交联的胶原纤维上。然而，使用这种化合物，可以导致与不慎将胶原箔生物基质中残留的化学品接触内脏组织相关的毒性风险。因此沉淀过程避免了与用化学法或者辐射法交联胶原纤维相关的交联化合物的毒性和长时间的吸收。

[0103] 在一些情况中，生成的干的、被沉淀出的胶原成分形成胶原箔生物基质，其具有高分子量的多层胶原膜，该膜包括很多层二维多向的自然缠绕的胶原纤维。胶原箔生物基质可以主要包含中间型I型胶原。胶原箔生物基质可以基本上是无孔的并且可以主要是不透液体和不透空气的。可以在产物上进行免疫扩散试验(Immune diffusion tests)以保证没有异种蛋白。胶原箔生物基质可以用环氧乙烷(ETO)或类似的杀菌气体进行气体杀菌或者通过幅射杀菌。

[0104] 使用胶原箔生物基质的显著益处是基本上很低风险地将疾病传染给与上述胶原箔接触的病人。生产过程中胶原纤维是用酸(如盐酸、醋酸等)和碱例如氢氧化钠来处理的以生成胶原箔，有利于灭活或者降低可能存在的细菌、病毒和朊病毒的传染性水平。用盐酸、氢氧化钠、环氧乙烷(ETO)等处理生物材料被确认为是在药物和生物材料中控制灭活朊病毒和病毒的准许方法。在一些调节措施下，这种处理可以减少批次间基础上测试胶原箔的规章要求。因此，在生产过程中，胶原纤维的处理提高了产品安全性并且减少了将疾病传染给病人的风险。

[0105] 另外，实施方式包括多层胶原箔生物基质在药物即药学用材料的制造中的应用，用于治疗紊乱比如在哺乳动物中被表征为内脏膜或周围组织缺损的受伤、外科手术或者基于病原体的疾病。

[0106] 根据一些实施方式，通过可控的干燥过程，可以由高分子量胶原纤维悬浮液产生胶原箔。胶原纤维悬浮液的分级沉淀反应来自于水分蒸发和同时的pH调高。可控的干燥过程产生可以被外科医生植入的多层结构的胶原箔。多层胶原箔构建提供了许多特性，这些特性是有益于胸膜的替代品以及作为用于再生活的胸膜组织。

[0107] 在一个实施方式中，生成胶原箔的过程去除了可生成主要包括非细胞组成部分的胶原纤维的胶原箔的全部细胞组分。

[0108] 使用胶原化学的规定程序，包含胶原的组织可以被用作为制备胶原质箔的起始物料。在一个实施方式中，腱，例如跟腱，被用作起始物料。在更进一步的一个实施方式中，马的跟腱被用作是起始物料。根据一些实施方式，胶原可以获得于任何各种动物，包括，但不限于羊、猴、牛、马、大鼠、小鼠、人或者实验动物。因此，胶原可以来源于下组：比如牛的来源、猪的来源、马的来源、羊的来源、灵长类动物的来源、啮齿类动物的来源或者人的来源。

[0109] 在一个实施方式中，起始物料如马的跟腱是第一基料，并用1N氢氧化钠加工至少一个小时，然后用盐酸中和。胶原起始物料是在酸性条件下pH 2时被加工的。应用的酸可以是盐酸、乙酸等。随后，存在于起始物料中的非胶原的蛋白质和分子间交联键用胃蛋白酶进行酶法降解，形成胶原的悬浮液。悬浮液然后被中和。在一个实施方式中，悬浮液被中和至大约pH 6.5和大约pH 8.0之间。在另一个实施方式中，悬浮液被中和至大约pH 6.9和大约pH 7.5之间。在另一个实施方式中，悬浮液被中和至大约pH 7。离心胶原悬浮液，去除上清液，将沉淀物再悬浮在大约pH 2-4.5的乙酸中。借此将非胶原的蛋白质成功地从胶原的悬浮液中去除。可以按照需要重复上述步骤来去除存在于沉淀中的残留的非胶原性蛋白质。

[0110] 在马的胶原箔生产过程中意外地得到的结果是，醋酸中胶原悬浮液被控制的pH的提高是由于通过长时间比如24小时的蒸发去除了额定的水而完成的。特定的pH的升高引起二维方向层的多向缠绕胶原纤维的沉淀，形成马的胶原箔的多层结构。在一个实施方式中，处理过程是在干燥箱中温度是大约20℃至大约55℃时进行的，用设备除去蒸汽和同时的乙酸中和蒸汽。在另一个实施方式中，处理过程是在干燥箱中温度是大约30℃至大约45℃时进行的。

[0111] 来自于此生产过程的马的胶原箔，当没有检测出更进一步的水分消失或可以忽略时，可以认为是干型的。马的胶原箔“干型”的含水量按重量计算一般是在大约2％至大约18％之间。存在于马的胶原箔“干型”中相对较高的残留水含量可防止或者抑制包含马的胶原箔的胶原分子变性。

[0112] 上述处理过程对于从悬浮液中沉淀出胶原纤维起主要作用，因为在处理过程起初在低pH升高时低溶解度的成分沉淀出来。在水蒸发和同时pH升高期间，这个技术导致胶原纤维的沉淀反应。

[0113] 被运用于生产胶原箔生物基质的方法能够形成胶原纤维的堆叠层。每层胶原纤维之间是间隙，病人的细胞和血管结构可以迁移至该间隙中，并且形成新的胶原结构和天然的构象组织。一些实施方式中有益的特性是，胶原箔生物基质的生物功能的天然的胶原纤维和无孔的层状结构可促进细胞的向内生长、血管结构以及与胶原箔生物基质相交叉并在多层之间存在的间隙中新的胶原结构的形成。与在创口或缺损上任意的、无导向的、不受控制的细胞向内生长相比，根据方法实施方式被引导的向内生长和再生可以抑制或者防止粘连和纤维化的形成。因此，可以避免与粘连和纤维化相关的痛苦和并发症。

[0114] 根据一些实施方式，用于生产马的胶原箔的纯化工艺开始时是对腱类起始物料进行至少一个小时的氢氧化钠溶液处理，继之以盐酸中和。然后胃蛋白酶被用于降解腱。这样生成的胶质的胶原被沉淀为原纤维。然后干燥和气体灭菌，然后产生每平方厘米有5.6mg天然胶原纤维的马的胶原箔。没有添加其他物质，并且没有进行人工的方法用于交联(即，涉及化合物或者辐射)。免疫扩散试验确证没有异种蛋白存在。马的胶原箔可以由天然的马的胶原纤维(主要是中间型I型胶原)制成。一个平方厘米的材料可以包含5.6毫克没TM有细胞组分的胶原纤维。血纤维蛋白胶，例如Tissucol Duo S(巴克斯特)，可用于将植入物附着于内脏膜或者伤口外表面。这个生物双成分胶试剂盒包括含有人血浆蛋白、纤维蛋白原、凝血因子XIII、血浆纤维结合素和抑肽酶的预填充的注射器，和包含凝血酶和氯化钙的预填充的注射器。

[0115] 实验动物

[0116] 下列实施例显示了猪的实验结果，用来评估胶原箔作为用于修复肺胸膜缺损的肺胸膜替代品、以及作为用于肺胸膜再生的生物基质的适合性。使用5只重量大约35千克的兰德瑞斯(Landrace)猪用于实验。在意大利天主教大学的伦理委员会当局的正式批准后进行动物的研究项目。选择这个物种和重量是由于猪的肺部薄壁组织与人类组织相似。动物的大小允许我们使用通常用于人的外科手术仪器并且作为人类个体的理想动物模型。在外科手术前，动物在“圣心大学(罗马)实验动物场”准备了5天时间。参与实验那天动物按照如下步骤被全身麻醉：

[0117] 麻醉：

[0118] 经肌肉注射的前驱麻醉：阿托品0.02mg/Kg+氯胺酮15mg/Kg+地西泮(Diazepan)0.1mg/Kg；利用O2和异氟烷2％气体用于面具诱导麻醉；用O2和异荧烷1.5％气体经气管插管并维持；用溴化双哌雄双酯(0.1mg/Kg当量)使肌肉松弛。

[0119] 外科手术步骤：

[0120] 在麻醉诱导后，动物维持侧卧，并且在第四肋间隙进行侧面胸廓切开术。如图13所示，使肺胸膜受损害而出血并空气渗漏。如图14所示，接着将一片胶原生物基质(尺寸3.5×2.5cm)切割到应有的尺寸并浸没在无菌的0.9％盐水中5分钟，并且被应用在被损害的肺胸膜上。为了封闭缺损，植入物被缩拢在胸膜的整个边沿周围下方，并且用血纤蛋白密封剂封闭以便保持它在原位，并确保不透水或不透液体的封闭。胶原生物基质包括由切
2 TM
碎的马跟腱提纯得到的天然的马胶原纤维(5.6mg/cm)，而血纤蛋白密封剂包括Tissucol Duo S(巴克斯特)。

[0121] 如图15所示，为了检测任何应用后的空气渗漏，胶原生物基质的气体静力学的力通过气水压力试验(hydro pneumatic test)进行评估。肺脏被盐溶液覆盖并且肺脏被麻醉师吹气。没有空气渗漏时，在动物恢复前水流被除去。假设有空气渗漏，水流与空气渗漏的测量系统相连接。如图16所示，胶原箔覆盖了肺组织并提供不透水或者不透空气的封闭，同时保护组织的细胞结构。

[0122] 胸廓切开用可吸收的线呈层状地缝合，并且皮肤用丝缝合。动物苏醒并且在实验动物场中观察7、15、21和28天，在此期间评估可能的空气渗漏存在。

[0123] 术后镇痛药(酮基布洛芬(Ketoprophene)，Findol 10％，0.3ml/10Kg/die，肌肉注射)和抗生素(恩氟沙星2.5mg/Kg/die，肌肉注射)治疗延长至7天。动物被给予常规的复合饲料，因为水流没有妨碍生理机能。每天监控动物健康。在8、16、22和29天，动物再一次通过支气管插管术全身麻醉，并且沿着肋间隙经皮肤的切口再一次在第五肋间隙进行再一次的胸廓切开术。在切开肋间肌之后，肋骨牵引器(Finocchietto)和自动静止腹部拉钩被放置在原位。在胸膜腔开口之后，以前用胶原生物基质处理的肺叶或者整个肺脏被摘除。胸廓切开用Vicryl 2缝合，并且皮肤用丝1缝合。在操作结束时，动物一般仍然是没有感觉的，用Tanax E.V.(3ml/10Kg)处以安乐死。

[0124] 结果：

[0125] 麻醉、外科手术和术后时期总体没有发生事故，除了两只动物之外。没有动物显示炎症或者损害伤口愈合的迹象。如在数据中所显示的那样，在外科手术后无论短期或者长期都没有观察到持续的空气渗漏。生物基质被重新塑造成类似胸膜的内脏膜，平滑和平整，没有临床相关的粘连或者纤维化的迹象。

[0126] 组织切片：第2周

[0127] 图17显示了根据本发明的实施方式用与血纤蛋白密封剂结合一起的胶原箔生物基质封闭的肺组织的组织切片。图18显示了根据本发明的实施方式用显示细胞高亲合力的血纤蛋白密封剂封闭的肺组织的组织切片。图19显示了胶原生物基质(切片的下半部)封闭肺组织的组织切片，并且在胶原生物基质内，细胞被移植以促进组织生长。图20提供了图19的特写镜头，显示了被补充的纤维原细胞以及在胶原生物基质间隙中生长的纤维原细胞。

[0128] 组织切片：第4周

[0129] 图21了显示植入四周后重新塑造的胶原生物基质。胶原最初的层状结构被重新塑造成层状的自身的组织。内源的胶原合成产生新的胸膜，呈现出与正常的肺胸膜相同的平行层状结构。由于胶原生物基质的平行结构，内源的人工合成胶原层也显示出平行的层状结构。在重新塑造的生物基质/新的胸膜和肺组织之间的边界上没有明显的炎症反应。A部分显示了泡状结构，而B部分显示了具有包括修复细胞(主要是纤维原细胞)和血管的层状胶原结构的重新塑造的生物基质/新胸膜。

[0130] 图22描述了肺脏表面上肺胸膜的正常组织图。A部分显示了泡状结构，而B部分显示了具有包括细胞纤维原细胞和血管的层状胶原结构的肺胸膜。

[0131] 如这些实验所示，生物功能的胶原箔生物基质可以被放置在外科手术产生的肺胸膜缺损的边缘上、以及肺脏外表面上，以便引导细胞向内生长和控制组织再生，因此防止再生创伤组织对壁胸膜和胸壁的粘连。生物功能的胶原箔生物基质的边缘可以被固定在靠近缺损的肺胸膜的部分。生物基质表面的结构可以是无孔的，并在肺脏外表面和胸膜腔之间形成机械稳定的暂时不透液体和不透空气的屏障。胸膜的纤维原细胞可以侵入生物基质中，并按照多层状结构的导引，沿着平行的多层状结构以便被引导纵向向内生长展开，生长进入胶原箔生物基质。多层胶原箔生物基质可以被完全整合。胸膜组织的修复细胞可以渗透胶原生物基质的多层结构。

[0132] 在本公开中所论及的全部专利、专利公布、专利申请、期刊文章、书、技术参考资料等等全部并入本文以供参考。

[0133] 通过实施例和为便于更清楚地理解，已经详细描述了典型的的实施方式，同时技术人员也能认识到可能存在的各种修改、改进和变化。因此，本发明的范围应当仅受权利要求的限制。