一种HPA等位基因分型检测试剂盒

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种HPA等位基因分型检测试剂盒。本发明的试剂盒中含有引物和MGB-探针，该试剂盒可以根据扩增后观察两种荧光曲线的不同和散点图的分布，判断等位基因基因型，从而完成HPA等位基因分型检测。本发明的试剂盒能够满足高通量的实验需求，在拥有合适DNA检材的情况下，在2小时内即可完成整个分型实验，解决了对中国人群HPA-1～5、15进行系统性快速分型的问题，同时能够鉴别出纯杂合子情况，直接得出分型结果，具有灵敏、稳定、准确、高效的特点。

权利要求

1.一种HPA等位基因分型检测试剂盒，该试剂盒包括引物1-12和MGB-Taqman探针

1-12，其中，引物1-12的序列依次分别为SEQ ID NO：1-12所示，MGB-Taqman探针1-12的序列依次分别为SEQ ID NO：13-24所示。

2.如权利要求1所述的HPA等位基因分型检测试剂盒，其特征在于，所述MGB-Taqman探针均一端设荧光报告基团，另一端设淬灭基团。

3.如权利要求2所述的HPA等位基因分型检测试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM或VIC，所述荧光淬灭基团为TAMRA。

4.如权利要求3所述的HPA等位基因分型检测试剂盒，其特征在于，所述MGB-Taqman探针1、3、5、7、9和11的5′端设有荧光报告基团FAM；所述MGB-Taqman探针2、4、6、8、10和12的5′端设有荧光报告基团VIC。

5.如权利要求1-4中任一权利要求所述的HPA等位基因分型检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照及阴性对照。

6.如权利要求5中所述的HPA等位基因分型检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2和阳性杂合对照品；且所述阳性纯合对照品1为含有6对HPA抗原系统等位基因a的纯合子的DNA的样品，所述阳性纯合对照品2为含有6对HPA抗原系统等位基因b的纯合子的DNA的样品，所述阳性杂合对照含有6对HPA抗原系统等位基因a和等位基因b的杂合子的DNA的样品。

说明书

一种HPA等位基因分型检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种HPA等位基因分型检测试剂盒。

背景技术

[0002] 血小板是无核的血细胞，血小板的功能主要是促进止血和加速凝血，同时血小板还有维护毛细血管壁完整性的功能。血小板在止血和凝血过程中，具有形成血栓，阻塞创
口，释放和凝血有关的各种因子等功能。在血液快速流动的动脉和小动脉系统形成血栓的
过程中，血小板起着核心作用。

[0003] 血小板膜含有多种蛋白质，这些蛋白质连接有大量的碳水化合物支链而成为糖蛋白。血小板糖蛋白不仅对维持血小板形态和完整性非常重要，同时构成了血小板的各种受
体，使血小板发挥止血及有关的功能。血小板糖蛋白基因发生变异时，可改变血小板糖蛋白
结构和表达水平，进而影响血小板的黏附、聚集和血栓形成。

[0004] 随着分子生物学和单克隆抗体技术的发展，许多血小板糖蛋白的基因序列已得到证实，并使得对血小板糖蛋白多态性的深入研究成为可能。此后，在关于血小板糖蛋白的生
物化学本质、功能及其分子生物学研究方面取得了巨大进步。血小板糖蛋白基因上存在人
类血小板同种异型抗原系统(human platelet alloantigen，HPA)，每个抗原系统是由共显
性双等位基因控制。对血小板糖蛋白IIIa和糖蛋白Ib的基因序列研究发现，在血小板糖
蛋白IIIa基因的第2号外显子上存在HPA-11a/1b等位基因，血小板糖蛋白I b基因的受
体结合区存在HPA-22a/2b等位基因。

[0005] 血小板输注在临床上有着重要的作用。然而，由于血小板上存在特异性血小板抗原，临床使用时往往因抗原不合而发生血小板输注无效、输血后紫癜等。更为严重的是，许
多患者由于血小板减少，且输注无效，影响了临床治疗的开展和进行，甚至发生出血、死亡。
因此，在输注血小板以前检测受体和供体的特异性血小板抗原，有助于避免因抗原不合而
造成的不良后果。另外，近年来不断有文献报道血小板抗原与一些疾病的关联。如HPA-1、
HPA-2、HPA-15等位基因多态性与心肌梗塞和缺血性脑血管病显著相关。因此，快速而准确
地检测HPA抗原系统对临床个性化治疗、医学研究和新型抗血栓药物-血小板糖蛋白抑制
剂的开发和评价具有重要意义。

[0006] 现有技术中已知共有6对HPA抗原系统：HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5和HPA-15，每个系统包括a/b一对等位基因。在中国人群中，HPA-1～5和HPA-15具有较高的
多态性，HPA不配合输注极易引发同种抗体的产生。因此，开发一种快速、精准的HPA-1～
5、15基因分型试剂盒可有效推进血小板同型输注，为血小板同种免疫反应(疾病)的治疗
提供帮助。

[0007] 目前在普通实验室进行HPA分型的方法主要有：序列特异引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)、序列特异性寡核苷酸聚合酶链式反应(PCR-SSO)、直接测序分型聚合酶链式反
应(PCR-SBT)、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(PCR-RFLP)等，这些方法都有其各
自的局限性，上述各方法的原理及其缺陷如下所示：

[0008] 1)PCR-SSP

[0009] 主要原理：设计出一套特异性针对各等位基因的引物，直接扩增有序列差异的各等位基因特异性片断，通过琼脂糖电泳来判断有无扩增产物来确定基因的多态性；

[0010] 主要实验流程：设计序列特异性引物→扩增→琼脂糖凝胶电泳→观察；

[0011] 实验缺陷：无法自动获取结果；一对等位基因需要双管操作；特异性引物的先天不足导致非特异性的产生，准确度有待提高。

[0012] 2)PCR-SSO

[0013] 主要原理：利用标记的等位基因特异性的指示物一寡核苷酸探针与所含目的SNP片段进行杂交，然后使用发光或产色底物来进行检测；

[0014] 主要试验流程：扩增→产物连接尼龙膜支持物→标记特异性探针杂交；

[0015] 实验缺陷：杂交温度须严格控制；洗涤条件严格；易产生假阳性及假阴性。

[0016] 3)PCR-SBT

[0017] 主要原理：根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，
然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列；

[0018] 主要试验流程：目的片段扩增→产物纯化→测序；

[0019] 实验缺陷：实验成本高。

[0020] 4)PCR-RFLP

[0021] 主要原理：基于SNP所致的目标基因上限制性酶切位点的丢失或获得，相关基因片断通过SNP的5′端和3′端的引物进行扩增，产物用限制性酶进行降解，然后进行聚丙
烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳并分析；

[0022] 主要试验流程：目的片段扩增→产物酶解→电泳观察；

[0023] 实验缺陷：操作复杂；酶解增长实验时间；有些HPA等位基因无合适的酶切点。

[0024] 针对上述检测方法的缺陷，本领域急需一种准确度高、操作简单、成本低且快速便捷的检测方法。

[0025] Taqman技术的基本原理是：在普通的PCR系统中，加入一条与靶片段两引物内的序列互补的荧光标记探针，该探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，成
为Taqman探针。当探针完整时，由于淬灭基团的作用，报告基团不能产生荧光，当有靶片段
存在时，标记探针与之结合，在PCR过程中，当引物延伸至标记探针结合部位时，由于Taq酶
具有5’-3’端核酸外切酶活性，遂将探针5’端的荧光报告基团切下(水解)。由于报告基
团与淬灭基团分离，淬灭作用解除，从而引起报告基团荧光信号增长。随着PCR的过程的进
行，荧光信号伴PCR产物的增长而增长。荧光PCR就是利用此原理，在PCR反应前后，分析
检测反应中特定荧光信号的变化，得到信号增强值，再利用试验确定的信号增强阐值，即可
以判别样品的阴阳性。荧光检测所获得Ct值(cycle threshold)与扩增前样品中模板数
对数值成线形负相关。据此建立标准曲线，可以定量分析样品中目的基因数量。

[0026] MGB(Minor Groove Binder)是不同于Taqman探针、杂交探针和分子信标的另一类探针。普通的Taqman探针在5’端标记荧光报告基团(如Fam等)，在3’端标记荧光淬灭
基团(如TAMRA)，而MGB探针在普通的Taqman探针的3’端再连接一个多肽修饰物，其作用
可以大大提高荧光和模板结合的Tm值。因此，与普通的Taqman探针相比，可以使探针的长
度缩短，报告基团与淬灭基团的位置更近，淬灭效果好，反应液的荧光本底低，分辨率提高，
提高了检测的特异性。由于HPA为一种双等位共显性基因，因此可利用Taq技术进行SNPs
分型，目前利用该技术对HPA成系统分型没有相关报道。

发明内容

[0027] 本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种HPA等位基因分型检测试剂盒。

[0028] 本发明的原理为：采用TaqMan技术检测SNPs分型HPA-1～5、15等位基因，具体如下：PCR反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因(a/b)，
5’端为报告荧光基团，3’端为淬灭荧光基团。PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引
物之间的互补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团
只发出微弱荧光。特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶
活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’端淬灭荧光基团的淬灭作用，从而发出荧光。两
个探针的5’端标有不同的荧光(FAM或VIC)，3’端标有MGB淬灭基团结合体。由于HPA为
一种双等位共显性基因，在检测SNPs分型时，使用两种不同的荧光标记SNP中两个碱基，形
成双通道荧光增长曲线。当等位基因为纯合子时，表现为一条荧光曲线出现增长；而杂合情
况时，两条荧光曲线同时增长。

[0029] 本发明的设计思路为：根据HPA-1～5、15等位基因所在位点附近序列，设计目标SNP的一对荧光探针，并在探针序列的上下游分别设计一段引物用以扩增。在实际检测中，
只需要加入基因组DNA，PCR预混液、引物和探针，进行PCR反应。在PCR完成后，根据检测
到的荧光信号来判断样品中存在哪种等位基因，结果有3种可能：两种等位基因各自的纯
合子和杂合子。只有一种信号出现是纯合子，如果两种信号同时出现，就是杂合子。

[0030] 本发明一方面提供了一种HPA等位基因分型检测试剂盒，该试剂盒包括引物1-12和MGB-Taqman探针1-12，其中，引物1-12的序列依次分别为SEQ ID NO：1-12，MGB-Taqman
探针1-12的序列依次分别为SEQ ID NO：13-24。

[0031] 表1本发明中的探针和引物的序列

[0032]

[0033]

[0034] 优选的，所述MGB探针的3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，本发明中的荧光淬灭基团为TAMRA；其中，所述MGB-Taqman探针1(SEQ ID NO：13)、MGB-Taqman探针
3(SEQ ID NO：15)、MGB-Taqman探针5(SEQ ID NO：17)、MGB-Taqman探针7(SEQ ID NO：19)、
MGB-Taqman探针9(SEQ ID NO：21)和MGB-Taqman探针11(SEQID NO：23)的5′端设有荧
光报告基团FAM；所述MGB-Taqman探针2(SEQ ID NO：14)、MGB-Taqman探针4(SEQID NO：
16)、MGB-Taqman探针6(SEQ ID NO：18)、MGB-Taqman探针8(SEQ ID NO：20)、MGB-Taqman
探针10(SEQ ID NO：22)和MGB-Taqman探针12(SEQ ID NO：24)的5′端设有荧光报告基
团VIC。

[0035] 其中，MGB-探针1(SEQ ID NO：13)用于检测等位基因HPA-1a，MGB-探针2(SEQIDNO：14)用于检测等位基因HPA-1b，MGB-探针3(SEQ ID NO：15)用于检测等位基因HPA-2b，
MGB-探针4(SEQ ID NO：16)用于检测等位基因HPA-2a，MGB-探针5(SEQ IDNO：17)用于
检测等位基因HPA-3a，MGB-探针6(SEQ ID NO：18)用于检测等位基因HPA-3b，MGB-探针
7(SEQ ID NO：19)用于检测等位基因HPA-4b，MGB-探针8(SEQ IDNO：20)用于检测等位基因
HPA-4a，MGB-探针9(SEQ ID NO：21)用于检测等位基因HPA-5b，MGB-探针10(SEQ ID NO：
22)用于检测等位基因HPA-5a，MGB-探针11(SEQID NO：23)用于检测等位基因HPA-15a，
MGB-探针12(SEQ ID NO：24)用于检测等位基因HPA-15b。

[0036] 本发明的试剂盒中，6种抗原(HPA-1、HPA-2、HPA-3、HPA-4、HPA-5和HPA-15)均成系统，因此用于检测每种抗原系统的1对引物和2条探针在一起混合包装，不同的系统之间
独立包装。

[0037] 除引物及探针外，本发明的试剂盒中还可包括PCR反应液、TE缓冲液等常规PCR试剂，还可包括阳性对照及阴性对照。

[0038] 所述PCR反应液和TE缓冲液可以通过市售途径获取。

[0039] 所述阳性对照品包括阳性纯合对照品1、阳性纯合对照品2和阳性杂合对照品，且所述阳性纯合对照品1为含有6对HPA抗原系统等位基因a的纯合子的DNA(等位基因类
型为：HPA-1aa、HPA-2aa、HPA-3aa、HPA-4aa、HPA-5aa和HPA-15aa)的样品，所述阳性纯合
对照品2为含有6对HPA抗原系统等位基因b的纯合子的DNA(等位基因类型为：HPA-1bb、
HPA-2bb、HPA-3bb、HPA-4bb、HPA-5bb和HPA-15bb)的样品，所述阳性杂合对照含有6对HPA
抗原系统等位基因a和等位基因b的杂合子的DNA(等位基因类型为：HPA-1ab、HPA-2ab、
HPA-3ab、HPA-4ab、HPA-5ab和HPA-15ab)的样品。

[0040] 所述阴性对照是指以等量的双蒸水替换样本制得的对照组。

[0041] 本发明第二方面，提供了上述HPA等位基因分型检测试剂盒的使用方法，包括下列步骤：

[0042] 1)以样本DNA作为模板，采用试剂盒中的引物及MGB-Taqman探针进行实时荧光定量PCR反应后进行检测；

[0043] 2)根据实时荧光定量PCR检测结果，根据PCR检测结果来判断样本DNA中HPA等位基因的类型。

[0044] 所述步骤1)中的PCR反应是在96孔PCR反应板中进行的，每孔检测一种HPA抗原系统的一对等位基因类型。例如：在检测样品的HPA-1型抗原系统的等位基因类型时，应
该在一个微孔中加入模板DNA、用于检测HPA-1型抗原系统的上下游引物及MGB探针混合液
PCR反应液和TE缓冲液，加样完成后将反应板简短离心混匀，进行PCR反应，检测HPA-1的
等位基因类型。

[0045] 上述实时荧光定量PCR的反应条件为60℃30sec，95℃10min，而后92℃15sec与60℃1min交替进行40个循环，在60℃时进行荧光检测。

[0046] 所述作为模板的样本DNA的浓度为10ng/μl。

[0047] 本发明中，所述作为模板的样本DNA可以由本领域技术人员根据现有提取方法制备。

[0048] 本发明的试剂盒根据两种荧光曲线的不同和散点图的分布，判断等位基因基因型，同时由于使用了一对等位基因的两种探针混合同时扩增，因此可以实现一孔完成一个
等位基因的分型，并且可以鉴别出杂合子的情况，直接得出分型结果。整个检测结构一目了
然，实验的客观性和准确性得到提高。

[0049] 本发明基于TaqMan技术开发的HPA-1～5、15基因分型试剂盒相比现有其他试剂盒而言，具有快速、简便、准确、直观的特点，实验成本低，且仅需微量检材即可完成实验所
需。本发明的检测试剂盒可以根据扩增后观察两种荧光曲线的不同和散点图的分布，判断
等位基因基因型，从而完成分型。由于一对等位基因的两种探针混合同时扩增，实现一孔完
成一个等位基因的分型，满足高通量的实验需求，且能鉴别出纯杂合子情况，直接得出分型
结果，具有灵敏、稳定、准确、高效的特点。在拥有合适DNA检材的情况下，本发明的试剂盒
在2小时内即可完成整个分型实验，解决了对中国人群HPA-1～5、15进行系统性快速分型
的问题。

附图说明

[0050] 图1等位基因HPA-3的实验结果散点图。

[0051] 图2等位基因HPA-3的荧光曲线图。

具体实施方式

[0052] 下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规
条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory
Press，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

[0053] 实施例1、试剂盒各组分的配制和组装：

[0054] 1)引物和探针的合成：引物及探针由美国应用生物系统公司ABI合成，引物1-12的序列分别为SEQ ID NO：1-12，MGB-Taqman探针1-12的序列为SEQ ID NO：13-24，具体序
列如表2中所示。其中MGB探针的3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA；且其中MGB-Taqman
探针1、3、5、7、9和11的5′端设有荧光报告基团FAM；其中MGB-Taqman探针2、4、6、8、10
和12的5′端设有荧光报告基团VIC，并且将引物与探针的混合液稀释至：引物的浓度为
900nM，探针的浓度为200nM。

[0055] 表2本实施例中使用的探针和引物的序列

[0056]

[0058] 2)阳性对照和阴性对照：

[0059] 阴性对照为双蒸水；阳性对照有三种：阳性纯合对照1、阳性纯合对照2和阳性杂合对照，其中，阳性纯合对照1的等位基因类型为：HPA-1aa、HPA-2aa、HPA-3aa、HPA-4aa、
HPA-5aa、HPA-15aa；阳性纯合对照2的等位基因类型为：HPA-1bb、HPA-2bb、HPA-3bb、
HPA-4bb、HPA-5bb、HPA-15bb；阳性杂合对照的等位基因类型为：HPA-1ab、HPA-2ab、
HPA-3ab、HPA-4ab、HPA-5ab、HPA-15ab。

[0060] 将上述引物、探针、阳性对照以及阴性对照分装后组成试剂盒。

[0061] 实施例2、模板DNA的提取：

[0062] 本实施例中所用8个样本：样品1(简称为Z1)、样品2(简称为Z2)、样品3(简称为Z3)、样品4(简称为Z4)、样品5(简称为Z5)、样品6(简称为Z6)、样品7(简称为Z7)、样
品8(简称为Z8)来源于中国上海健康献血员外周血DNA，均系无关供者。模板DNA由盐析
法制得。

[0063] 提取制得模板DNA后，使用TE缓冲液将模板DNA稀释至浓度为10ng/μl。

[0064] 实施例3、实时荧光定量PCR检测：

[0065] 1)本实施例中所用试剂盒96孔反应板中每孔中所对应的样品格局对照参见表3中所示。

[0066] 表3反应板格局对照列表

[0067]阴性 阳性纯合 阳性纯合 阳性杂合
样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 对照 对照1
对照2 对照
样品1， 样品2， 样品3， 样品4， 样品5， 样品6， 样品7，样品8， 阴性对 阳性纯和 阳性纯和 阳性杂合HPA-1 HPA-1 HPA-1 HPA-1 HPA-1 HPA-1 HPA-1 HPA-1 HPA-1 照， 对 对照1， 对照，
HPA-1 照1， HPA1 HPA1
HPA1
样品1， 样品2， 样品3， 样品4， 样品5， 样品6， 样品7，样品8， 阴性对 阳性纯和 阳性纯和 阳性杂合HPA-2 HPA-2 HPA-2 HPA-2 HPA-2 HPA-2 HPA-2 HPA-2 HPA-2 照， 对 对照1， 对照，
HPA-2 照1， HPA-2 HPA-2
HPA-2
HPA-3 样品1， 样品2， 样品3， 样品4， 样品5， 样品6， 样品7，样品8， 阴性对 阳性纯和 阳性纯和 阳性杂合
HPA-3 HPA-3 HPA-3 HPA-3 HPA-3 HPA-3 HPA-3 HPA-3 照， 对 对照1， 对照，
HPA-3 照1， HPA-3 HPA-3
HPA-3
HPA-4 样品1， 样品2， 样品3， 样品4， 样品5， 样品6， 样品7，样品8， 阴性对 阳性纯和 阳性纯和 阳性杂合对
HPA-4 HPA-4 HPA-4 HPA-4 HPA-4 HPA-4 HPA-4 HPA-4 照， 照1， 对照1， 对照，
HPA-4 HPA-4 HPA-4 HPA-4
HPA-5 样品1， 样品2， 样品3， 样品4， 样品5， 样品6， 样品7， 样品8， 阴性对 阳性纯和对 阳性纯和 阳性杂合
HPA-5 HPA-5 HPA-5 HPA-5 HPA-5 HPA-5 HPA-5 HPA-5 照， 照1， 对照1， 对照，
HPA-5 HPA-5 HPA-5 HPA-5
样品1， 样品2， 样品3， 样品4， 样品5， 样品6， 样品7， 样品8，阴性对 阳性纯和对 阳性纯和 阳性杂合HPA-15 HPA-15 HPA-15 HPA-15 HPA-15 HPA-15 HPA-15 HPA-15 HPA-15 照， 照1， 对照1， 对照，
HPA-15 HPA-15 HPA-15 HPA-15

[0069] 横向的，在表3中，第一行的12个孔中均加入用于检测HPA-1等位基因的引物和探针混合液；第二行的12个孔中均加入用于检测HPA-2等位基因的引物和探针混合液；第
三行的12个孔中均加入用于检测HPA-3等位基因的引物和探针混合液；第四行的12个孔
中均加入用于检测HPA-4等位基因的引物和探针混合液；第五行的12个孔中均加入用于检
测HPA-5等位基因的引物和探针混合液；第六行的12个孔中均加入用于检测HPA-15等位
基因的引物和探针混合液。

[0070] 而纵向的，在表3中，第一列的6个孔中均加入样品1模板DNA；第二列的6个孔中均加入样品2模板DNA；第三列的6个孔中均加入样品3模板DNA；第四列的6个孔中均加
入样品4模板DNA；第五列的6个孔中均加入样品5模板DNA；第六列的6个孔中均加入样
品6模板DNA；第七列的6个孔中均加入样品7模板DNA；第8列的6个孔中均加入样品8
模板DNA；第九列的6个孔中均加入阴性对照；第十列的6个孔中均加入阳性纯合对照1(阳
性纯合对照1中，每种HPA抗原系统的等位基因类型分别为：HPA-1aa、HPA-2aa、HPA-3aa、
HPA-4aa、HPA-5aa、HPA-15aa)；第十一列的6个孔中均加入阳性纯合对照2(阳性纯合对
照2中，每种HPA抗原系统的等位基因类型分别为：HPA-1bb、HPA-2bb、HPA-3bb、HPA-4bb、
HPA-5bb、HPA-15bb)；第十二列的6个孔中均加入阳性杂合对照(阳性杂合对照中，每
种HPA抗原系统的等位基因类型分别为：HPA-1ab、HPA-2ab、HPA-3ab、HPA-4ab、HPA-5ab、
HPA-15ab)。

[0071] 同时，上述96孔板的每个孔中均需加入PCR分型反应液以及TE缓冲液。

[0072] 2)Taq-Man PCR的反应体系的配制：

[0073] 按照表3中的格局分布，在96孔板的每孔中分别加入所对应的模板DNA或对照组DNA、对应的引物和探针、PCR分型反应液以及TE缓冲液，其中每孔的反应体系的配比如下
所示：

[0074] 引物和探针混合液：0.125μl

[0075] (待检SNP位点对应的引物与探针的混合液，引物的浓度为900nM，探针的浓度为200nM)

[0076]

[0077] 合计：5μl

[0078] 3)进行PCR反应：

[0079] PCR的反应参数如表4中所示。

[0080] 表4PCR的反应参数列表

[0081]

[0082] 实施例4：实验结果

[0083] 将PCR产物在60℃下进行荧光检测，实验结果如表5中所示。

[0084] 使用ABI StepOne荧光定量PCR仪进行检测(也可使用ABI7500荧光定量PCR仪)可以得出实验结果散点图，如图1所示等位基因HPA-3的实验结果散点图。

[0085] HPA-3的荧光曲线图如图2所示，在图2中，下部曲线为ALLELE 1，上部曲线为ALLELE2，中间混合的曲线为ALLELE 1/ALLELE 2。

[0086] 表5实验结果列表

[0087]

[0088]

[0089] 根据表5中的结果可得：

[0090] 样品1中，每种HPA抗原系统的等位基因类型分别为：HPA-1aa、HPA-2aa、HPA-3ab、HPA-4aa、HPA-5aa、HPA-15ab；

[0091] 样品2中，每种HPA抗原系统的等位基因类型分别为：HPA-1aa、HPA-2aa、HPA-3bb、HPA-4aa、HPA-5aa、HPA-15bb；

[0092] 样品3中，每种HPA抗原系统的等位基因类型分别为：HPA-1aa、HPA-2ab、HPA-3ab、HPA-4aa、HPA-5aa；HPA-15ab；

[0093] 样品4中，每种HPA抗原系统的等位基因类型分别为：HPA-1aa、HPA-2aa、HPA-3aa、HPA-4aa、HPA-5aa、HPA-15aa；

[0094] 样品5中，每种HPA抗原系统的等位基因类型分别为：HPA-1aa、HPA-2aa、HPA-3bb、HPA-4aa、HPA-5aa、HPA-15aa；

[0095] 样品6中，每种HPA抗原系统的等位基因类型分别为：HPA-1aa、HPA-2aa、HPA-3aa、HPA-4aa、HPA-5ab、HPA-15ab；

[0096] 样品7中，每种HPA抗原系统的等位基因类型分别为：HPA-1aa、HPA-2aa、HPA-3ab、HPA-4ab、HPA-5aa、HPA-15ab；

[0097] 样品8中，每种HPA抗原系统的等位基因类型分别为：HPA-1ab、HPA-2aa、HPA-3ab、HPA-4aa、HPA-5aa、HPA-15ab。

[0098] 上述检测结果与临床单位测序检测结果完全一致。

[0099] 本实施例基于TaqMan技术开发的HPA-1～5、15基因分型试剂盒，相比现有其他试剂盒而言，具有快速、简便、准确、直观的特点，实验成本低，且仅需微量检材即可完成实
验所需。该检测试剂盒可以根据扩增后观察两种荧光曲线的不同和散点图的分布，判断等
位基因基因型，从而完成分型。由于一对等位基因的两种探针混合同时扩增，实现一孔完成
一对等位基因的分型，满足高通量的实验需求，且能鉴别出纯杂合子情况，直接得出分型结
果，具有灵敏、稳定、准确、高效的特点。在拥有合适DNA检材的情况下，本发明的试剂盒在
2小时内即可完成整个分型实验，解决了对中国人群HPA-1～5、15进行系统性快速分型的
问题。