重组肠道病毒71型病毒VP1抗原的纯化方法

摘要

本发明涉及基因工程重组蛋白的纯化方法，旨在提供一种重组肠道病毒71型病毒VP1抗原的纯化方法。该方法包括：利用大肠杆菌表达生产重组肠道病毒71型病毒VP1蛋白，得到该蛋白的包涵体；将包涵体溶解于增溶液中；在水浴和磁力搅拌条件下向复性液中逐滴加入包涵体溶液，然后在搅拌复性48小时。本发明提出通过蛋白复性能使以包涵体形式存在的蛋白变成可溶性蛋白，大大提高了表达产物的回收率。采用亲和层析一步纯化，纯度大于95％。纯化的方法操作简单、方便、省时，有利于大规模的工业化生产。具有成本低廉、工艺简便，纯化蛋白纯度高等优点，可以为EV71型诊断试剂的开发和血清流行病学调查提供诊断用抗原。

权利要求

1.一种重组肠道病毒71型病毒VP1抗原的纯化方法，包括以下步骤：

(1)利用大肠杆菌表达生产重组肠道病毒71型病毒VP1蛋白，得到该蛋白的包涵体；

其过程具体包括：分段设计合成肠道病毒71型病毒VP1蛋白的基因片段，并于体外拼接成完整的核苷酸序列；拼接好的基因序列经测序验证正确后，按分子克隆方法构建至重组表达载体pET3a中，转化宿主细胞BL21DE3(pLyss)，然后采用发酵生产；发酵结束后发酵液离心收集菌体，破碎菌体，离心收集包涵体；

(2)按每1g包涵体∶15ml增溶液的比例，将包涵体溶解于增溶液中；所述增溶液的pH值为8.5，其组成及配比浓度为：盐酸胍4～6M、EDTA1～10mM、Tris5～20mM，余量为H2O；

(3)在20～25℃的水浴和磁力搅拌条件下，向复性液中逐滴加入包涵体溶液，使复性液中的VP1蛋白浓度控制在0.1～1mg/ml；然后在15℃搅拌复性48小时；所述复性液的pH值为7.2，其组成及配比浓度为：PB5～20mM，Arg0.1～1mol/L，浓度为1～20％且分子量为5000～30000道尔顿的PEG。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)复性液中的VP1蛋白浓度控制在0.1～0.5mg/ml。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中增溶液的组成及配比浓度为：盐酸胍6M、EDTA5mM、Tris10mM，余量为H2O。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)复性液中精氨酸浓度为

0.1～0.3mol/L。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)复性液的组成及配比浓度为：PB10mM，Arg100mM，10％PEG20000，pH7.2。

6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，包涵体蛋白经过稀释复性后，还进行亲和层析纯化。

7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述亲和层析纯化包括：

在GE公司的XK50/30柱中装入200mL的Chelating Sepharose Fast Flow凝胶，平衡缓冲液为20mM PB、0.5M NaCl、PH7.0，洗脱缓冲液为20mM PB、0.5M NaCl、0.5M咪唑、PH7.0；

先用0.2M硫酸镍溶液平衡柱子，然后用平衡缓冲液平衡；将经过复性的复性液以20ml/min的流速上样于平衡好的柱子，上完样后用平衡缓冲液冲洗2个柱体积；然后以线性梯度洗脱，收集含目标蛋白的洗脱峰。

说明书

重组肠道病毒71型病毒VP1抗原的纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基因工程重组蛋白的纯化方法。更确切地讲本发明是一种重组肠道病毒71型病毒VP1抗原的纯化方法。

背景技术

[0002] 手、足、口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的一种急性传染病。该病自1957年首次报道以来，曾多次流行，世界卫生组织于2006年曾将本病列为第四位引起死亡的的疾病。美国、澳大利亚、意大利、法国、荷兰、西班牙、罗马尼亚、巴西、加拿大、德国等国家经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV71引起的手足口病。20世纪90年代后期，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势。1998年，台湾地区暴发EV71的大流行，约有12万以上的人被感染，死亡78人。

[0003] 研究发现，引发手足口病的病毒有一个共同特点，均为肠道病毒科，为单股正链小RNA病毒。这些病毒有20多种(型)，包括肠道病毒71型(EV 71)、柯萨奇病毒A组的16型、埃可病毒以及其它柯萨奇病毒。目前国内爆发的手足口病主要是由EV 71和Cox A16引起的。由柯萨奇病毒引起的手足口病一般症状较轻，而EV71则相对较重，20％的患者可以伴有引起无菌性或病毒性脑炎，心肌炎和脑麻痹后遗症的患者。因此，有关EV71的病毒生物学特性、致病机理、诊断和预防等的研究日益受到人们的重视。

[0004] EV71病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径大约在24～30nm。由EV71病毒基因组编码的分子量分别为34KD、30KD、26KD和7KD的多肽VP1、VP2、VP3、VP4，构成病毒的外壳。VP1、VP2和VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面，而VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接，因而抗原决定簇基本上位于VP1-VP3上。

[0005] 其中，病毒衣壳蛋白VP1是该病毒主要的中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性。VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，VP1基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，并可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考，因此VP1基因成了EV71基因分型和遗传进化分析的最重要的对象。

[0006] 目前，基因重组的EV71衣壳蛋白VP1已经在原核和真核表达系统中得到表达。真核表达系统由于具有原核表达系统不具有的蛋白翻译后加工过程，因此表达的蛋白活性高；但同时也具有蛋白表达量低，生产周期长，生产成本高的缺点。原核表达系统虽然表达量高，生产周期短、成本低廉，但缺点是表达产物多以不溶解的包涵体形式聚集，蛋白回收率往往很低。

[0007] 因此，提出一种成本低廉、工艺简便、蛋白回收率高的肠道病毒71型VP1抗原的纯化方法显得尤为重要。

发明内容

[0008] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种重组肠道病毒71型VP1抗原的纯化方法。

[0009] 为解决技术问题，本发明通过以下技术方案实现：是将肠道病毒71型VP1蛋白的编码基因插入原核表达载体中，通过大肠杆菌表达生产重组蛋白，经复性、纯化制备而成。

[0010] 本发明中的重组肠道病毒71型病毒VP1抗原的纯化方法，包括以下步骤：

[0011] (1)利用大肠杆菌表达生产重组肠道病毒71型病毒VP1蛋白，得到该蛋白的包涵体；

[0012] (2)按每1g包涵体∶15ml增溶液的比例，将包涵体溶解于增溶液中；所述增溶液的pH值为8.5，其组成及配比浓度为：盐酸胍4～6M、EDTA 1～10mM、Tris 5～20mM，余量为H2O。

[0013] (3)在20～25℃的水浴和磁力搅拌条件下，向复性液中逐滴加入包涵体溶液，使复性液中的VP1蛋白浓度控制在0.1～1mg/ml；然后在15℃搅拌复性48小时；所述复性液的pH值为7.2，其组成及配比浓度为：PB 5～20mM，Arg 0.1～1mol/L，浓度为1～20％且5000-30000道尔顿的PEG。

[0014] 作为一种改进，所述步骤(1)包括：分段设计合成肠道病毒71型VP1蛋白的基因片段，并于体外拼接成完整的核苷酸序列；拼接好的基因序列经测序验证正确后，按分子克隆方法构建重组表达质粒，然后由工程菌大肠杆菌发酵生产；发酵结束后发酵液离心收集菌体，破碎菌体，离心收集包涵体。

[0015] 作为一种改进，所述步骤(3)复性液中的蛋白浓度控制在0.1～0.5mg/ml。

[0016] 作为一种改进，所述步骤(2)中增溶液的组成及配比浓度为：盐酸胍6M、EDTA5mM、Tris 10mM，余量为H2O。

[0017] 作为一种改进，所述步骤(3)复性液中精氨酸浓度为0.1～0.3mol/L。

[0018] 作为一种改进，所述步骤(3)复性液的组成及配比浓度为：PB 10mM，Arg 100mM，10％PEG20000，pH 7.2。

[0019] 作为一种改进，包涵体蛋白经过稀释复性后，还进行亲和层析纯化。

[0020] 作为一种改进，所述亲和层析纯化包括：

[0021] 在GE 公 司 的 XK 50/30 柱 中 装 入 200mL 的 Chelating Sepharose Fast FlowSepharose胶，平衡缓冲液为20mM PB、0.5M NaCl、PH 7.0，洗脱缓冲液为20mM PB、0.5M NaCl、0.5M咪唑、PH 7.0；先用0.2M硫酸镍溶液平衡柱子，然后用平衡缓冲液平衡；将经过复性的复性液以20ml/min的流速上样于平衡好的柱子，上完样后用平衡缓冲液冲洗2个柱体积；然后以线性梯度洗脱，收集目标峰的洗脱液。

[0022] 本发明的有益效果在于：

[0023] 1、本发明提出了一种新的复性体系，通过蛋白复性，能使以包涵体形式存在的蛋白变成可溶性蛋白，大大提高了表达产物的回收率。由于采用了特别的复性体系，提高了重组肠道病毒71型VP1抗原的复性收率，复性收率达到每克包涵体最终获得200毫克蛋白。

[0024] 2、采用亲和层析一步纯化，纯度大于95％。纯化的方法操作简单、方便、省时，有利于大规模的工业化生产。

[0025] 3、本发明采用包涵体的复性、亲和层析的方法来纯化肠道病毒71型VP1抗原，具有成本低廉、工艺简便，纯化蛋白纯度高等优点，可以为EV71型诊断试剂的开发和血清流行病学调查提供诊断用抗原。

附图说明

[0026] 图1为EV71 VP1抗原的层析图。

[0027] 图2为纯化后的EV71 VP1抗原的电泳图。

[0028] 图1中：A为280nm的光吸收曲线，B为电导曲线；

[0029] 图2中：从左到右依次为泳道1：Marker；泳道2：BSA对照；泳道3：纯化后的EV71VP1。

具体实施方式

[0030] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0031] 在基因工程中，已知目的基因核苷酸序列获得目的基因的方法主要有PCR扩增和人工化学合成方法。本实施例选取了当前流行的肠道病毒71型C 4亚型，采用人工化学合成的方法合成了编码肠道病毒71型VP1蛋白的核苷酸序列，具体是根据基因片段人工合成的需要，将设计的基因分段合成，体外拼接成完整的序列。拼接好的基因序列，经测序验证正确后按分子克隆(《Molecular Cloning》，J.Sambrook等著；)方法，构建了重组表达质粒。然后由工程菌大肠杆菌进行发酵生产，发酵结束后发酵液离心收集菌体，破碎菌体，离心收集包涵体，包涵体蛋白经过稀释复性后，经过亲和层析纯化。本发明使用大肠杆菌来表达重组EV71 VP1，大肠杆菌因其低廉性、高效性和稳定性等优点在科研生产中被广泛应用。因为利用大肠杆菌表达生产重组蛋白已是本领域内非常成熟的技术，本发明对此不再赘述。

[0032] 但是，外源蛋白在大肠杆菌中的高水平表达常常形成不溶的、无活性的聚集体(aggregation)，或称为包涵体(inclusion body)。包涵体必须经过变性、复性重新折叠形成原始空间构象才能获得生物学功能。但是，蛋白质复性是在体外环境中进行，过程极其复杂，其确切机理至今尚未明了。而且，不同种类的蛋白，其复性所需的条件往往是不一样的，体外复性由于缺乏细胞内广泛存在的辅助肽链折叠的酶系和分子，常常复性效率极其低下。

[0033] 复性时蛋白浓度、缓冲液体系、pH值、离子强度、各种高分子聚合物、表面活性剂，甚至变性剂稀释的速度，都会对最终复性结果有影响。本发明研究了不同因素对重组EV71-VP1复性的影响，优化了多种影响复性的各种因素，选择最优的复性体系，使得复性产物的收率大为提高。具体优化后的控制条件如下：

[0034] 1、控制复性体系中的蛋白浓度。蛋白质的浓度是使蛋白质聚集的主要因素之一，本发明中采用稀释方式复性，并且在水浴和磁力搅拌下，逐滴加入变性蛋白(包涵体)，使变性蛋白在复性液中始终处于低浓度状态。复性液中的蛋白浓度控制在0.1～1mg/ml。优选地，蛋白浓度在0.1～0.5mg/ml。

[0035] 2、复性体系中添加精氨酸(Arginine)。现有的研究表明，蛋白质的辅因子、配基或底物可起到很好的促折叠作用，其作用可能是稳定蛋白质的折叠中间体，从而防止了蛋白质的聚集。本发明的研究表明，在复性液中添加适合浓度的精氨酸能够大大促进重组EV71-VP1的复性效率。所述的复性体系精氨酸浓度为0.03～1mol/L，优选的为0.1～0.3mol/L。

[0036] 3、复性体系中添加(聚乙二醇PEG)。PEG分子通过与折叠中间体特异的形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集。本发明的研究表明，在复性液中添加适合浓度的PEG可以有效的有效防止复性过程中重组蛋白的聚集。所述的复性体系中聚乙二醇的分子量为5000～30000道尔顿，优选的为20000道尔顿；浓度为1～20％，优选的为10％。

[0037] 4、亲和层析纯化。复性后的蛋白仍然含有杂蛋白、内毒素、核酸，需进一步分离去除。本发明设计了亲和层析来去除杂质最终得到高纯度的重组蛋白。

[0038] 实例1.重组EV71 VP1工程菌构建与发酵

[0039] VP1基因来源于肠道病毒71型C4亚型，本实施例采用了全合成的方式，以大肠杆菌偏爱的密码子来设计并合成了VP1的全基因。ADI基因用Nde I与BamH I双酶切，嵌入同样酶切的载体pET3a中，构建成载体pET3a-VP1，转化宿主细胞BL21 DE3(pLyss)，筛选阳性克隆并测序。测序正确的阳性菌株作为生产用原始工程菌。挑取单个克隆在500ml含50ug/ml氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃300rpm震荡培养直到OD600达到1.2左右，接种到15L发酵罐(B.Braun C)，直到OD600达到20左右(以双蒸水为空白对照)，加入1mM IPTG开始诱导表达。诱导表达4小时后放罐。

[0040] 实例2.复性

[0041] 发酵液6000g离心15分钟，收集菌体。1500psi压力高压匀浆破碎细胞，6000g离心15分钟收集包涵体，用PBS缓冲液洗涤包涵体两次。按1g包涵体∶15ml增溶液的比例进行溶解，增溶液成分为6M盐酸胍，5mM EDTA，10mM Tris，pH 8.5，25℃搅拌2小时。缓慢倒入2000ml的复性液中(10mM PB，100mM Arg，10％PEG20000，pH 7.2)。15℃搅拌复性48小时。

[0042] 实例3.纯化

[0043] 在GE 公 司 的 XK 50/30 柱 中 装 入 200mL 的 Chelating Sepharose Fast FlowSepharose胶，平衡缓冲液为20mM PB，0.5M NaCl，PH 7.0，洗脱缓冲液为20mM PB，0.5M NaCl，0.5M咪唑，PH 7.0。先用0.2M硫酸镍溶液平衡柱子，然后用平衡缓冲液平衡。复性液以20ml/min的流速上样于平衡好的柱子，上完样后用平衡缓冲液冲洗2个柱体积，然后以线性梯度洗脱，收集目标峰。用SDS-PAGE电泳检测目标蛋白纯度，Lowry法检测蛋白目标浓度。经过分析，每克包涵体可以获得VP1蛋白量为200毫克，蛋白回收率为20％，经SDS-PAGE电泳检查纯度95％以上。

[0044] 实例4.病人血清检测

[0045] 使用纯化的VP1检测了68份病人血清，其中EV71病人阳性血清31份，阴性血清37份。抗原稀释度为1∶500血清稀释度为1∶100，二抗稀释度为1∶10000，并设空白对照，检测结果见下表。

[0046]EV71 IgM阳性 EV71 IgM阴性 总计
检测阳性 29 3 32
检测阴性 2 34 36
总计 31 37 68

[0047] 据此测算灵敏度为93.5％，特异性为91.9％。

[0048] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。