生物节律信息的获取方法

摘要

本发明提供了一种用于获取关于生物个体的生物节律信息的简单、低侵入性的方法。在该方法中，基于从生物个体的口腔粘膜上皮细胞中提取的生物活性剂，特别是α-淀粉酶的活性随时间的变化来获取有关所述生物个体的生物节律的信息。根据该方法，可以采用显示所述生物活性剂的活性随时间的变化的活性变化曲线作为用于推定所述生物节律的分子时间表，由此可以检测所述生物个体的生物节律的偏差。

权利要求

1.一种获取与生物个体的生物节律有关的信息的方法，包括基于生物活性剂的活性随时间的变化来获取所述信息，从而能够检测所述生物节律的偏差，其中，所述生物活性剂是从所述生物个体的口腔粘膜上皮细胞中提取的α-淀粉酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，采用显示所述活性随时间变化的活性变化曲线作为用于推定所述生物节律的分子时间表。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，通过利用所述分子时间表，基于所述活性变化曲线显示的在一天内的活性局部极大值的数量来检测所述生物节律的偏差。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，通过比对针对所述生物个体多次形成的所述分子时间表来检测所述生物个体的所述生物节律的偏差。

5.根据权利要求2所述的方法，其中，通过在预定的时间使所述生物活性剂的活性与所述分子时间表进行比对来检测所述生物个体的所述生物节律的偏差。

说明书

生物节律信息的获取方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于获取有关生物个体(生命单元，bion)的生物节律的信息的方法。更具体地说，本发明涉及一种基于从生物个体的口腔粘膜上皮细胞中提取的生物活性剂的活性值随时间的变化来获取特别是有关昼夜节律的信息的方法。

背景技术

[0002] 已知生物个体中的各种生物现象均显示出“周期性节律”，这种“周期性节律”以自支持的方式进行摆动。这种周期性节律被称为“生物节律”。特别地，具有大约一天的周期(循环时间)的“生理节律”广泛地支配这些生物现象，如睡眠-觉醒节律以及体温、血压和分泌的激素的量值的昼夜变化。此外，已知该生理节律还涉及精神和身体活动、运动的能力、药物敏感性等。

[0003] 生物节律由被称为“时钟基因”的基因组控制。该时钟基因(在下文中它还可称为“时钟分子”)起通过对其表达、活性、局部化的存在等进行自动地周期性变化(摆动)的“生物钟”的作用。具体地，通过对其他各种基因组进行控制，该时钟基因管理上述的各种生物现象。可以认为这些基于时钟分子的生物钟存在于生物个体的活体内的各种水平的细胞、组织和器官中的每一个上，并且这些生物钟彼此进行同步化以整体上产生生物个体的生物节律。

[0004] 已经阐明时钟分子的基因多态性以及基因突变会是癌症、糖尿病、血管疾病、经改变的神经疾病等的关键原因。此外，近年来，已经指出时钟分子的基因的多态性或突变还涉及精神障碍(如双相型障碍和抑郁症)的危象。与之相联系，已经尝试了一种治疗方法，在该方法中通过用光照射来对由于基因多态性或突变引起的已经不正常的生物钟进行重新设置。

[0005] 另一方面，例如，睡眠-觉醒周期不仅由生物钟自发控制，而且还处于社会生活的限制之下。因此，在日常生活中就寝时间或起床时间的变化可能会造成“在实际生活中上床睡觉和起床的周期”与“基于生物钟的睡眠-觉醒周期”之间的节律偏差(相位偏差)。这样的节律的偏差(延迟)被认为诱导所谓的“时差症”或睡眠障碍，并进一步被认为造成上述的精神障碍。

[0006] 在所谓的“外部时间”与所谓的“内部时间”之间，如在“现实生活中的上床睡觉时间与起床的周期”与“基于生物钟的睡眠-觉醒周期”之间产生的偏差(延迟)被认为是生物节律的“内部的去同步化作用(internal desynchronization)”。该“内部的去同步化作用”可以说成是一种这样的状态，在该状态下活体内的器官的生物钟被去同步化。该内部的去同步化作用被认为是起因于以下事实，即，这些器官的生物钟彼此与外部时间同步的容易程度(可以说同步化作用的速度)有所不同。已知当产生内部的去同步化作用时，在体温、血压等的昼夜变化方面会观察到两相节律(双相节律，biphasic rhythm)。通过利用该生物节律将药物治疗的效果最大化的尝试已经开始。由于用作药物的靶的分子(药物的靶分子)的表达量以及对该药物进行代谢的酶(药物代谢酶)的生理节律，该药物的治疗效果也被认为显示出昼夜变化。考虑到这一点，已经提出了一种被称为“生理时钟疗法”的思维方式，在这种思维方式中通过确定每种药物的最佳药物治疗时间来设计治疗效果的最大化。

[0007] 此外，在更为熟悉的方面，利用精神和身体活动的生理节律以及运动的能力，已经对在学习或追踪方面将个人的能力全部发挥的作用时间以及个人困难(或容易)地变胖的饮食时间进行调查。

[0008] 根据前述，应当考虑到的是准确地知道基于生物钟的生物节律对于防止各种疾病、对于改善不良的身体状态(如时差症)、对于时间治疗学的意识、对于个人能力的展示、对于日常饮食等都是非常有用的。

[0009] PCT专利公开第WO 2004/012128号披露了至少基于在作为来自生物个体的样品的标准样本上的基因表达产物量的测量数据来推定生物时间的方法。在该生物钟推定方法中，用于推定生物钟的分子时间表是基于基因的表达产物的表达量(具体地，mRNA)而形成的。顺便提及，PCT专利公开第WO 2004/012128号并没有描述被视为样品的特定组织(或细胞)或待测量的特定基因。

[0010] 日本专利公开第Hei 6-189914号描述了一种生物节律曲线测量装置，用于测量来自人的深部体温的测量值的生物节律曲线。在该生物节律曲线测量装置中，进行了一项发明，使得可通过去除紊乱的影响(外部的影响)来对真正的生物节律曲线进行测量。顺便提及，日本专利公开第Hei 6-189914号示出了直肠温度或鼓膜温度(作为深部体温的一个具体实例)，并描述了直肠温度是特别优选的。

[0011] 此外，作为与本发明相关的发明，可以提及日本专利公开第2002-168860、2006-345869、以及2006-345870号，这些专利每个均披露了通过使用受试者(受治疗者)的唾液中的α-淀粉酶的活性作为指示物来确定应激的方法。在该应激确定方法中，对“唾液”中的α-淀粉酶的活性进行了测量，由此可以简单并容易地确定受试者体内的应激程度。

[0012] PCT专利公开第WO 2004/012128号中披露的生物钟推定方法是一种基于被视为来自生物个体的样品的标准样本的mRNA的表达量的方法。虽然PCT专利公开第WO2004/012128号并未描述被视为样品的具体组织(或细胞)或待测量的具体基因，但迄今对白细胞中的时钟基因的表达进行检查的方法已作为一种简单的方法被广泛地采用。然而，在该方法中，采集血液样品是必不可少的，它会伴随着受试者体内的身体疼痛。

[0013] 此外，有必要对人进行测量以便进行将白细胞与被视为样品的血液分离的操作，从白细胞中提取mRNA的操作，对时钟基因mRNA等的表达进行分析，这就是为什么花费大量的时间和人力来实施该方法的原因。实际上，为了从一个器官样本中提取mRNA并确定该mRNA，通常，需要复杂的操作来避免该mRNA分解。尤其是，如果mRNA的分解发生在处理非常小量的生物样本时，则不可能获得稳定的测量结果。

[0014] 在日本专利公开第Hei 6-189914号中披露的生物节律曲线测量装置是一种用于测量特别是直肠温度的装置。然而，对直肠内的体温进行测量将精神或身体疼痛强加给受试者，并且因此进行测量的人也有一种负担的感觉。

[0015] 因此，本发明的一个目的是提供一种用于获取有关生物个体的生物节律的信息的简单并且低侵入性的方法。

发明内容

[0016] 为了达到上述目的，根据本发明，提供了一种基于从生物个体的口腔粘膜上皮细胞中提取的生物活性剂(具体地，α-淀粉酶)的活性随时间的变化来获取有关生物个体的生物节律的信息的方法。

[0017] 在该方法中，采用显示了该生物活性剂的活性随时间而变化的活性变化曲线作为用于估计生物节律的分子时间表。

[0018] 在该方法中，可以通过使用该分子时间表基于在一天内活性变化曲线显示的活性的局部极大值的数量来检测该生物节律的偏差(延迟)。

[0019] 此外，通过对形成该生物个体的分子时间表进行多次操作，并对由此形成的分子时间表进行对比，可以检测该生物个体的相位偏差。

[0020] 此外，还可通过在预定的时间将生物活性剂的活性与分子时间表进行比对来检测生物个体的生物节律的相位偏差。

[0021] 根据本发明，提供了一种用于获取关于生物个体的生物节律的信息的简单、低侵入性的方法。

附图说明

[0022] 图1是示出了α-淀粉酶活性随时间变化的实例的示图。

[0023] 图2是示出了α-淀粉酶的活性变化曲线的相位的示图，其呈现出一种典型地两相节律。

[0024] 图3示出了显示α-淀粉酶的活性变化曲线的相位变化的示图。

[0025] 图4是从口腔粘膜细胞中提取的蛋白质的染色质图。

[0026] 图5是示出了目标蛋白质在每个特定的时间的表达量的示图。

[0027] 图6是示出了α-淀粉酶的RT-PCR的结果的图。

[0028] 图7是示出了口腔粘膜上皮细胞的悬浮液(混悬液)以及细胞的溶液的α-淀粉酶活性的示图。

[0029] 图8是示出了实施例3中α-淀粉酶活性的测量结果(8:00起床)的示图。

[0030] 图9是示出了唾液中α-淀粉酶的活性的示图。

[0031] 图10是示出了实施例4中α-淀粉酶活性的测量结果(6:00起床)的示图。

[0032] 图11是示出了实施例5中α-淀粉酶活性的测量结果(6:00起床)的示图。

[0033] 图12是示出了在第二天至第七天在9:00至21:00的时间内α-淀粉酶的活性的示图。

具体实施方式

[0034] 1.生物活性剂

[0035] 为了建立一种以简单且低侵入性的方式来获取有关生物个体的生物节律的信息的方法，本发明的发明人首先注意到作为生物组织的口腔粘膜上皮细胞，其可以以极低侵入性的方式被作为样品。然后，本发明的发明人将α-淀粉酶识别为在口腔粘膜上皮细胞中显示表达量的昼夜变化的分子，并且发现该α-淀粉酶的活性呈现出生物节律。基于该发现，已经完成了本发明。

[0036] 具体地，根据本发明，提供了一种基于从生物个体的口腔粘膜上皮细胞中提取的α-淀粉酶的活性随时间的变化来获取有关生物个体的生物节律的信息的方法。顺便提及，本发明中考虑的生物个体并没有特别限制，并且广泛地包括除了人之外的实验动物如小鼠、大鼠、猴子等。

[0037] 已知α-淀粉酶是一种包含在胰液和唾液中的消化酶。此外，已报道在使用啮齿类动物的实验中，在唾液腺中的大量α-淀粉酶中观察到了生理节律(Bellavia SL，et.al.Circadian rhythm ofalpha-amylase in rat parotid gland.Acta.Odontol.Latinoam.1990；5(1)：13-23)。然而，迄今在口腔粘膜上皮的细胞中出现的α-淀粉酶的表达还是未知的。此外，还没有对与口腔粘膜上皮细胞中的α-淀粉酶有关的生物节律进行过调查。

[0038] 2.生物活性剂的获取

[0039] 口腔粘膜上皮细胞是可以以最小化的侵入进行采样的生物组织之一，并且例如用于通过使用从口腔粘膜上皮细胞中获得的基因组来确定基因表型。

[0040] 在本发明中，例如，可以通过一种方法对口腔粘膜上皮细胞进行采样，在该方法中通过使用刷子、压舌板等将细胞的样品从口腔粘膜的表面刮掉。采样部位优选为面颊的背侧上的粘膜；为了抑制测量结果的分散，期望从左侧和右侧上的粘膜采集样品。

[0041] 可以通过一种方法将通过刷子等所采集的口腔粘膜上皮细胞回收到缓冲液中，在该方法中将刷子等在容纳在样品管中的如磷酸盐缓冲液(PBS)的缓冲液中进行洗涤。在这种情况下，为了防止细胞溶解，使用等张溶液作为缓冲液。

[0042] 对以这种方式获得的包含细胞的悬浮液进行离心或过滤，以便分离口腔粘膜上皮细胞。通过常用的方法可进行离心或过滤。然而，为了在对口腔粘膜上皮细胞进行采样时消除已经混合到悬浮液中的唾液，期望对离心或过滤的操作进行多次。从唾液腺中分泌的大量的α-淀粉酶存在于唾液中，并且当该α-淀粉酶被混合到如以上所分离的细胞中时，对仅在口腔粘膜上皮细胞中存在的α-淀粉酶的活性进行准确测量是不可能的。

[0043] 将如以上所分离的细胞溶解用于制备蛋白质提取物。通过使用例如含有商业化的蛋白质提取物试剂或添加在其上的表面活性剂的缓冲液可以进行细胞的溶解。此外，通过一种方法可以进行溶解，在该方法对含有悬浮在其中的细胞的缓冲液进行物理的细胞破碎，如超声波处理。将细胞溶液进行离心或过滤以从其中除去不溶物质，由此制备蛋白质提取物。

[0044] 可以通过采用已知的方法来进行在如以上制备的蛋白质提取物中α-淀粉酶的活性的测量，在该方法中可以使用商业化的测量装置或测量试剂盒。顺便提及，用于测量的具体方法将在稍后的实施例中进行描述。

[0045] 因此，在根据本发明的方法中，利用了可以容易采样的口腔粘膜上皮细胞。因此，与根据相关领域的方法相比，受试者的精神和/或身体负担可以得到极大减轻。

[0046] 此外，由于采用比mRNA更稳定的蛋白质作为测量的目标，因此复杂的操作是不必要的，并且不同于根据相关领域的方法，可通过简单的操作来获得稳定的测量结果。此外，虽然mRNA的表达分析通常需要约两小时，但是通过使用将在稍后描述的商业化的测量装置可以在几分钟内完成α-淀粉酶活性的测量。因此，可以在短时间内获得测量结果。

[0047] 3.分子时间表

[0048] 图1是示出了α-淀粉酶的活性随时间变化的示图。该图示出了通过一种这样的方法获得的活性变化曲线的实例，在该方法中在一天之内在每一预定的时间实施通过以上提及的方法进行的口腔粘膜上皮细胞中α-淀粉酶的活性的测量，并且对活性的测量值进行标绘。在该图中，时间呈现在横坐标轴上，而活性呈现在纵坐标轴上。在该图中，示出了在0:00测得最小活性(1)并且在12:00测得最大活性(h)的情况作为一个实例。

[0049] 活性变化曲线可通过对在各个时间测量的活性值的绘图(plots)进行检查或观察而获得。此外，为了获得更为准确的曲线，可以使用这样的周期(循环时间)的计算方法作为自相关法(相关图)、功率谱法、余弦法(cosinor method)、周期图法等[0050] 如在该图中所看到的，α-淀粉酶的活性经历了昼夜变化，显示出一种生理节律。因此，基于α-淀粉酶活性随时间的变化可获得受试者生物个体中生物节律的信息。此外，可通过利用α-淀粉酶的活性变化曲线作为“分子时间表”来对该受试者生物个体的生物节律进行推定。

[0051] 具体地，可以假设，例如，对于已知具有图1所示的活性变化曲线(在下文中，用于与“分子时间表”相同的含义)的受试者生物个体，在预定的时间处测量的活性值是h。在这种情况下，基于图1所示的活性变化曲线(分子时间表)，该受试者生物个体中的生理节律(内部时间)可推定为在12:00。类似地，在活性值为1的情况下，该受试者生物个体中的生理节律(内部时间)可推定为在0:00。此外，在活性值为m的情况下，该生理节律(内部时间)可推定为在6:00或18:00。

[0052] 此外，对于与上述相同的受试者生物个体，假设例如在三小时的间隔所测量的两个活性值分别是p和q。如果q高于p(p＜q)，则该受试者生物个体中的生理节律(内部时间)可推定为在对应于该活性的上升阶段的午前(0:00至12:00)。相反，如果q低于p(p＞q)，则该生理节律(内部时间)可推定为在午后(12:00至24:00)。此外，通过确定p和q的变化率(q/p)并将该变化率与与活性变化曲线相切的倾斜进行比对，可对该生理节律中的内部时间进行更准确地推定。

[0053] 4.生物节律偏差的检测

[0054] 现在，以下将对通过活性变化曲线的变化来检测受试者生物个体中的生物节律的偏差(延迟)的方法进行描述。

[0055] 活性变化曲线的形状的特征可在于其最大值(或最小值)、最大值(或最小值)的观察时间、曲线从最大值到最小值(或从最小值到最大值)的倾斜等。在本发明中，活性变化曲线的形状将称为“相位”。此外，通过该活性变化曲线所限定的受试者生物个体中的生理节律的形状也将称为“相位”。

[0056] 具体地，图1所示的活性变化曲线(分子时间表)具有一种形状、或“相位”，其特征在于最小值1、最大值h、最小值的观察时间(外部时间)0:00、以及最大值的观察时间12:00。

[0057] (4-1)检测两相节律的方法

[0058] 首先，将描述通过使用分子时间表，基于在一天内显示活性变化曲线的活性的极大值的数量来检测生物节律的偏差(延迟)的方法。

[0059] 如上面已经描述的，在生物节律中“外部时间”与“内部时间”之间产生的偏差(延迟或差异)被认为是“内部的去同步化作用”。已知当产生内部的去同步化作用时，在体温、血压等的昼夜变化中观察到了两相节律。所以，通过检测该两相节律，可以检测内部去同步化作用，即生物节律的偏差(延迟)。

[0060] 本发明的发明人发现能够用作内部去同步化作用的指示物的多相节律也可在α-淀粉酶活性的昼夜变化(像体温、血压等的昼夜变化)中检测到，如将在实施例中详细地描述的。

[0061] 图2是示出了典型的两相节律的活性变化曲线的相位的示图。该图表示具有图1所示的活性变化曲线的受试者生物个体中，在已经产生内部去同步化作用的情况下活性变化曲线的实例。

[0062] 在图1中，受试者生物个体的相位的特征在于单个的局部极大值(最大值)h以及该局部极大值(最大值)的观察时间(外部时间)12:00。另一方面，在图2中的受试者生物个体的相位中，出现了两个局部极大值h1和h2。具体地，图2所示的活性变化曲线作为由该活性的两个局部极大值(即在一天之内在12:00时的局部极大值h1以及在18:00时的局部极大值h2)伴随的两相节律被观察。

[0063] 这样的多个活性极大值被认为是起因于整个受试者生物个体的生物节律的瞬间去同步化作用，这是因为以下事实，即器官中的生物钟在用外部时间进行的同步化作用速度方面彼此不同。

[0064] 因此，可以通过使用分子时间表，特别是基于在一天内活性变化曲线显示的活性的局部极大值的数量是否不小于2个来检测生物节律的偏差(延迟)以及该偏差的程度。顺便提及，活性的局部极大值的数量并不限于2个，并且在一些情况下观察到三个以上活性的局部极大值所伴随的多相节律。

[0065] 这里，原则上图2所示的在12:00处的局部极大值h1的观察时间(外部时间)12:00与图1所示的起始活性变化曲线的最大值h的观察时间相一致。当在受试者生物个体的生物节律中产生内部的去同步化作用时，在不同于最大值h的观察时间12:00的时间处(图2中的18:00)观察到了一个新的局部极大值h2。于是，由于活性的局部极大值的观察时间(在所示出的实施例中的12:00和18:00)之间的间隔越长，内部去同步化作用的程度可被视为越大。

[0066] 此外，局部极大值h1和局部极大值h2的大小随着受试者生物个体中产生的内部去同步化作用的程度而变化。当在受试者生物个体中产生的内部去同步化作用逐渐被校正，并且整个生物个体的生物节律逐渐被同步化时，这些大小逐渐发生变化。更具体地，例如，当生物节律逐渐恢复到内部去同步化作用之前的节律时，具有在观察时间18:00处出现的局部极大值h2逐渐消失。

[0067] 此外，当生物节律逐步与内部去同步化作用之后的节律同步化时，相反，当18:00处的局部极大值h2逐渐增加时，观察时间12:00处的起始局部极大值h1逐渐消失。

[0068] 因此，基于图2所示的活性变化曲线中的局部极大值h2的大小，优选基于局部极大值h1与局部极大值h2的振幅比率(h2/h1)，可以获知生物节律的偏差(延迟)的程度。这里，内部去同步化作用的程度被判断为在振幅比率(h2/h1)近似为1的情况下(即，在局部极大值h1与局部极大值h2近似相等时)是最大的。

[0069] 因此，生物节律的偏差(延迟)的程度以及从该偏差中恢复的条件可通过使用分子时间表，特别是基于在一天之内活性变化曲线显示的活性的两个或多个局部极大值的观察时间之间的间隔、局部极大值的大小以及局部极大值的振幅比来确定。在活性变化曲线被观察作为由三个以上局部极大值所伴随的多相节律的情况下，可基于局部极大值的大小以及该局部极大值的振幅比来进行确定。

[0070] (4-2)多次形成的分子时间表进行比对的方法

[0071] 现在，以下将描述针对受试者生物个体通过对多次形成的分子时间表进行比对来检测生物节律的偏差(延迟)的方法。

[0072] 图3示出了说明活性变化曲线的相位中的变化的示图。在图3的(A)中，由虚线指示的活性变化曲线是图1中所示的曲线(在下文中，还称为“分子时间表1”)，而由实线所指示的活性变化曲线表示针对相同的受试者但在不同的测量日通过与图1的情况中相同的测量所获得的活性变化曲线(在下文中，也称为“分子时间表2”)的实例。在该图中，时间呈现在横坐标轴上，并且α-淀粉酶的活性呈现在纵坐标轴上。

[0073] 分子时间表1具有使得最小值(1)的观察时间(外部时间)是0:00，并且最大值(1)的观察时间是12:00的相位。另一方面，分子时间表2具有一个变化的相位，使得最小值(1)的观察时间是6:00，并且最大值(1)的观察时间是18:00。

[0074] 这可以被理解为针对受试者生物个体的活性变化曲线中的偏差(延迟或差异)在分子时间表1的形成时间与分子时间表2的形成时间之间产生。更具体地说，在分子时间表2的形成时间该受试者生物个体内的生物节律(内部时间)在分子时间表1的形成时间的6小时之后(或18小时之前)。

[0075] 因此，通过针对相同的受试者生物个体多次形成分子时间表并将这些分子时间表彼此进行比对，可以检测到该受试者生物个体中生物节律的相位的偏差(延迟)。

[0076] (4-3)在预定时间的活性与分子时间表进行比对的方法

[0077] 现在，以下将对通过比对在预定的时间生物活性剂的活性与分子时间表来检测生物节律的偏差(延迟)的方法进行描述。

[0078] 图3的(B)中的图示出了通过将图3的(A)中的分子时间表1(同样参见图1)从虚线变成实线，并且将分子时间表2从实线变成虚线的多个分子时间表。

[0079] 如上面已经描述的，在针对已知具有图1的活性变化曲线(分子时间表)的受试者生物个体在预定的时间测量的活性是m的情况下，基于分子时间表1，该受试者生物个体中的生理节律(内部时间)可被推定为是6:00或18:00。

[0080] 这里，可以假设针对相同的受试者生物个体通过在不同的测量日在6:00(外部时间)进行测量而获得的活性已经从m变为1(参见图3的(B)圆点)。在这种情况下，可以推定，受试者生物个体中的生理节律(内部时间)已经在最初之后6小时(或18小时之前)，变成由分子时间表2表示的生理节律。

[0081] 因此，通过将在预定时间的活性与初步形成的分子时间表进行比对，也可以更容易地对该受试者生物个体中的生物节律的相位的偏差(延迟)进行检测。

[0082] 如以上已经描述的，根据本发明的方法，可以通过将显示α-淀粉酶的活性随时间变化的活性变化曲线作为分子时间表来推定每个受试者生物个体的内在的生物节律并检测该生物节律的相位的偏差(延迟)。

[0083] 在以下的实施例中，将会示出口腔粘膜上皮细胞中的α-淀粉酶活性的特定的测量数据。由此，将描述α-淀粉酶的活性呈现生理节律并且该生理节律受起床时间的影响，导致该生物节律的相位的偏差(延迟)的产生。

[0084] 实施例

[0085] (实施例1)

[0086] <α-淀粉酶的鉴定>

[0087] 在实施例1中，进行显示口腔粘膜上皮细胞中的生理节律的蛋白质的鉴定。

[0088] 口腔粘膜上皮细胞的样品取自一位男性成人(32岁)。通过使用商业化的口腔粘膜上皮采样刷子(CYB-1，由Medical PackagingCorporation生产)，在10:00、13:00、16:00、19:00、22:00、1:00、4:00、以及7:00进行八次采样。在采集了口腔粘膜上皮细胞的样品之后，将刷子在保存于管中的PBS中进行洗涤，以回收PBS中的细胞。将包含细胞的悬浮液进行离心(3,000rpm，30秒)，将由此分离的口腔粘膜上皮细胞溶解在蛋白质提取缓冲液(RIPA Buffer，由PIERCE Biotechnology生产)中，并且将得到的溶液也进行离心(3,000rpm，30秒)以制备蛋白质提取物。

[0089] 根据常用的方法，使以上获得的蛋白质提取物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。图4示出了通过对电泳之后的丙烯酰胺凝胶进行考马斯染色(CBB)所获得的蛋白质的染色质图。在该图中，泳道1和泳道14是分子量标记物(在该图的左侧指出了分子量)。泳道2～13是从在上面提及的时间所采集的口腔粘膜上皮细胞中提取的蛋白质。在该图中，关于由箭头所指示的约50kDa的蛋白质(在下文中，称为“目标蛋白质”)，确认了表达量的昼夜变化。

[0090] 图5是示出了在上面提及的每一时间处该目标蛋白质的表达量的示图。关于表达量，通过密度测定法对图4所示的染色质图中的目标蛋白质的条带进行定量确定，用每个样品中蛋白质的总量对确定的值进行标准化，并且标准化的表达量以相对值表示，取在1:00处的值为1(10:00、13:00、16:00、19:00：n＝6，22:00、1:00、4:00、7:00：n＝3)。

[0091] 随后，通过肽质量指纹分析(peptide mass fingerpnt analysis)对目标蛋白质进行蛋白质鉴定。将目标蛋白质的条带从丙烯酰胺凝胶留空白，通过胰蛋白酶对留空白的凝胶进行胶内消化，并且从该凝胶中提取肽片段。通过质谱仪(oMALDI-Qq-TOF MS/MS QSTARPulsar i，由Applied Biosystems生产的TOF-MS)对由此获得的肽片段进行分析，并且通过使用MASCOT(由Matrix Science生产)将分析结果与NCBInr(Taxonomy human)进行比对，由此对蛋白质进行鉴定。结果，该目标蛋白质被鉴定为α-淀粉酶。

[0092] 根据如以上实施例1的结果，在口腔上皮细胞中显示生理节律的蛋白质可被鉴定为α-淀粉酶。

[0093] (实施例2)

[0094] <口腔粘膜上皮细胞中α-淀粉酶的表达的证实>

[0095] 在实施例2中，进行了用于证实在口腔粘膜上皮细胞中出现的α-淀粉酶的表达的实验。

[0096] 从通过与实施例1中相同的方法所分离的口腔粘膜上皮细胞，通过使用商业化的总RNA提取和纯化试剂盒(由AgilentTechnologies生产)来对RNA进行提取，并且根据通常的方法对RNA进行RT-PCR。这里使用的引物的序列示于下面的“表1”中。

[0097] 表1

[0098]正向引物 tggca actgc acagg catta 序列号1
反向引物 tgctt tgcgg atttg catt 序列号2

[0099] 图6是示出了通过RT-PCR扩增的DNA片段的迁移图像(染色质图)的示图。在该图中，泳道1是DNA大小标记物；泳道2是阴性对照；并且泳道3对应于口腔粘膜上皮细胞。

[0100] 如该图中所示，证实了约150bps的DNA片段(由图中的箭头所指示)的扩增。因此，证实了口腔粘膜上皮细胞中α-淀粉酶mRNA的表达。

[0101] 接着，为了证实α-淀粉酶在蛋白质水平上的表达，进行了以下实验。

[0102] 在与实施例1中相同的方法中，采集了口腔粘膜上皮细胞的样品，然后将刷子在容纳在管中的PBS中进行洗涤，以获得含有细胞的悬浮液。对细胞的悬浮液进行α-淀粉酶的活性的测量。通过使用唾液α-淀粉酶测定试剂盒(由Salmetrics生产)进行该测量。

[0103] 图7是示出了α-淀粉酶的活性的示图。在该图中，“PBS”表示针对细胞的悬浮液测量的活性(约20U/ml)。因为细胞的悬浮液并不包含处于溶解状态的口腔粘膜上皮细胞，所以针对该悬浮液测量的活性被认为是起因于在采集口腔粘膜细胞上皮细胞的样品时通过粘附至刷子而在被混合到该悬浮液中的唾液中包含的α-淀粉酶。在该图中，“唾液”表示存在于用PBS稀释20倍的唾液中的α-淀粉酶的活性。

[0104] 在该图中，“PBS+TritonX100”和“PBS+Sonic”均表示在细胞的悬浮液中口腔粘膜上皮细胞溶解的情况下所测量的活性。在“PBS+TritonX100”的情况下，将表面活性剂(Triton X-100)添加到细胞的悬浮液中以使细胞溶解。此外，在“PBS+Sonic”的情况下，将细胞的悬浮液进行超声波处理以使细胞溶解。

[0105] 对“PBS+TritonX100”和“PBS+Sonic”测量的活性分别是约50U/ml和65U/ml，它们比在口腔粘膜上皮细胞未溶解的情况下所测量的活性更高(参见“PBS”)。

[0106] 这提示在“PBS+TritonX100”和“PBS+Sonic”的情况中，细胞的溶解导致了除了包含在所混合的唾液中的α-淀粉酶之外，还测量了从口腔粘膜上皮细胞中洗脱的α-淀粉酶的活性。这又指示在口腔粘膜上皮细胞中发生了α-淀粉酶的表达。

[0107] 根据实施例2的结果，证实了，口腔粘膜上皮细胞中处于mRNA水平的α-淀粉酶的表达以及在细胞中处于蛋白质水平的α-淀粉酶的表达已经发生。

[0108] (实施例3)

[0109] <α-淀粉酶活性的生理节律的检查>

[0110] 在实施例3中，对口腔粘膜上皮细胞中的α-淀粉酶的活性的昼夜变化进行了搜索，并检查了α-淀粉酶活性的生理节律。

[0111] (1)对在8:00起床的受试者A(男性，32岁)在1:00、4:00、7:00、10:00、13:00、16:00、19:00、以及22:00进行了口腔粘膜上皮细胞的采样。在每次采样时，将细胞悬浮在
500μL的PBS中。

[0112] (2)将悬浮液进行离心(3000rpm，30秒)以使细胞沉淀，并且排除上清液PBS。将由此分离的细胞保存在冷冻状态直到随后的步骤。

[0113] (3)通过向其中加入在30μL量中的100mM的NaPO4(pH6.0)、100mM的NaCl、以及0.1 Triton X-100而使细胞溶解。将由此溶解的细胞再次进行离心(3000rpm，30秒)，并且将得到的上清液作为蛋白质提取物进行采集。

[0114] (4)通过使用BCA蛋白质测定试剂盒(由PIERCEBiotechnoloty生产)来测量每一蛋白质提取物中的蛋白质的浓度，并且将在各时间所采集的样品中的蛋白质的浓度调整至1mg/mL。

[0115] (5)在蛋白质浓度调整之后，将蛋白质提取物中的每一种(以25μL的量)滴加到COCORO METER(由Nipro Corporation生产)的芯片上，并且通过使用COCORO METER对α-淀粉酶活性进行测量。

[0116] 顺便提及，在1:00采集了口腔粘膜上皮细胞的样品之后让受试者A睡觉。在4:00和7:00的测量时间时，使受试者A醒来一次，用于采集口腔粘膜上皮细胞的样品，并且之后再次让其睡觉直到下一个采样时间。

[0117] 结果示于图8中。在该图中，时间呈现在横坐标轴上，并且α-淀粉酶的活性呈现在纵坐标轴上。

[0118] 起床(8:00)之后在9:00的第一次测量时，α-淀粉酶活性为约12U/ml。在13:00和16:00活性上升至约20U/ml，并且在19:00达到了约25U/ml的最大值。此后，在22:00和1:00α-淀粉酶活性分别下降至约22U/ml和约19U/ml。在4:00和7:00的α-淀粉酶活性是可与在9:00的活性(约12U/ml)比较的。

[0119] 因此，已经证明α-淀粉酶活性显示出一种昼夜变化，具体而言它表示一种生理节律，在大约起床时间达到最小值并且在晚上在19:00时达到最大值。

[0120] 为了进行比较，图9示出了唾液中的α-淀粉酶的活性的测量结果。在该图中，时间呈现在横坐标轴上，并且α-淀粉酶的活性呈现在纵坐标轴上。

[0121] 与图8所示的口腔粘膜上皮细胞中的α-淀粉酶不同，唾液中的α-淀粉酶的活性并不显示出一种生理节律。已知从唾液腺分泌的α-淀粉酶的量对应激是高度敏感的(参见上面提及的日本专利公开第2002-168860、2006-345869以及2006-345870号)。因此，可以认为在测量时由于应激引起的α-淀粉酶的量的变化是导致刚刚提及的测量结果的因素之一。

[0122] (实施例4)

[0123] <α-淀粉酶活性的生理节律的检查2>

[0124] 在实施例4中，对于与实施例3中相同的受试者A，检查了口腔粘膜上皮细胞中α-淀粉酶的活性的生理节律，其中起床时间从8:00变至6:00。顺便提及，就寝时间是在0.00采集了口腔粘膜上皮细胞的样品之后。

[0125] (1)对在06:00起床的受试者A(男性，32岁)在0:00、3:00、6:00、9:00、12:00、15:00、18:00以及21:00进行了口腔粘膜上皮细胞的采样。在每次采样时，将细胞悬浮在
500μL的PBS中。

[0126] (2)将悬浮液进行离心(3000rpm，30秒)以使细胞沉淀，并且排除上清液PBS。再次进行相同的操作。将由此分离的细胞保存在冷冻状态直到随后的步骤。

[0127] (3)通过向其中加入在30μL量中的20mM的Tris-Cl(pH 7.0)、150mM的NaCl、以及蔗糖单月桂酸酯(lucrose Monolaurate)而使细胞溶解。将由此溶解的细胞再次进行离心(3000rpm，30秒)，并且将得到的上清液作为一种蛋白质提取物进行采集。

[0128] (4)通过吸光度(280nm)的分析来测量蛋白质提取物中蛋白质的浓度。

[0129] (5)通过使用唾液α-淀粉酶测定试剂盒(由Salmetrics生产)来测量蛋白质提取物的α-淀粉酶活性。程序是按照该试剂盒所附的方案。

[0130] 结果示于图10中。在该图中，时间呈现在横坐标轴上，并且活性呈现在纵坐标轴上。顺便提及，示出的活性值是通过用在上面(4)中计算的蛋白质的量进行标准化由在上面的(5)中测量的活性获得的那些值。

[0131] 随着起床时间变至6:00，α-淀粉酶活性的生理节律在15:00呈现出最大值(约3.5U/mg)。因此，与在8:00起床的情况下相比(参见图8)，对最大值进行测量的时间是在四小时之前。这提示起床时间的变化造成了受试者的生物节律的偏差(延迟)。

[0132] 根据实施例3和4的结果，已经证明口腔粘膜上皮细胞中的α-淀粉酶活性显示了一种生理节律，并且进一步地，该生理节律可以在起床时间的影响下发生变化。

[0133] (实施例5)

[0134] 在实施例5中，根据以下时间表(进程)使四位受试者经历生理节律(睡眠-觉醒节律)偏移最初的10小时之后，以产生人为的内部去同步化作用(时差症)状态。

[0135] (1)第一天：从17:30开始，以四小时的间隔收集口腔粘膜上皮细胞。就寝时间为23:30。在17:30开始采集口腔粘膜上皮细胞的样品，并且此后以四小时的间隔重复。

[0136] (2)第二天：起床时间7:30。起床之后，让受试者醒着直到下一天(第三天)的9:30，由此改变睡眠-觉醒节律。通过让受试者暂时醒着，在起床时间之前在1:30和5:30进行采样。从那时起，通过让受试者暂时醒着在睡眠小时期间类似地进行采样。

[0137] (3)第三天：就寝时间9:30。起床时间17:30。

[0138] (4)第四天至第八天：维持睡眠-觉醒节律，其中就寝时间为9:30并且起床时间为17:30。

[0139] (5)以与实施例4中相同的方式来测量所采集的口腔粘膜上皮细胞中α-淀粉酶的活性。

[0140] 结果示于图11中。在该图中，时间呈现在横坐标轴上，并且α-淀粉酶的活性呈现在纵坐标轴上。

[0141] 在第二天和第三天的就寝时间(9:30)之前，当睡眠-觉醒节律还未被改变时，在9:30测量α-淀粉酶活性的局部极大值(参见该图中的标记“p1”)。在这种情况下，α-淀粉酶活性的生理节律是单相的。

[0142] 在第四天当睡眠-觉醒节律已经被改变时，并接着证实了在21:30出现活性的新的局部极大值(参见标记“p2”)。在这种情况下，α-淀粉酶活性的生理节律已变为两相的。

[0143] 这些结果表明，通过检测α-淀粉酶活性的生理节律中呈现的多相节律，可以检测由于睡眠-觉醒节律的改变而在受试者中产生的内部的去同步化作用(时差症)。

[0144] 图12是示出了在第二天至第七天在9:30和21:30α-淀粉酶活性的示图，这是在睡眠-觉醒节律的改变之后观察到两相局部极大值时的时间。

[0145] 在第二天当睡眠-觉醒节律还为被改变时，在9:30的α-淀粉酶活性足以比在21:30的活性更大。

[0146] 另一方面，在第四天当睡眠-觉醒节律已被改变时，并从那时起，在9:30的α-淀粉酶活性逐渐变低，并且相反，在21:30的活性逐渐升高。这表明受试者正逐渐从由于睡眠-觉醒节律的变化而在该受试者体内产生的内部去同步化作用中恢复，并且该受试者的生物节律正逐渐与变化之后(即，就寝时间为9:30并且起床时间为17:30的睡眠-觉醒节律)的睡眠-觉醒节律同步化。

[0147] 因此，通过以上结果已经证明，基于在9:30和21:30观察到的活性的两相局部极大值的大小或振幅比，可以在受试者体内确定内部去同步化作用、或生物节律的偏差(延迟)的程度或从该偏差(延迟)中恢复的条件。

[0148] 工业实用性

[0149] 根据与本发明有关的方法，采用显示了α-淀粉酶的活性随时间的变化的活性变化曲线作为一种分子时间表，由此可以简单并且最小侵入的方式来推定每位受试者的内在的生物节律。因此，对于每位个体使得可以知道他或她自身特有的生物节律，以便设定最佳的药物治疗时间、作用时间以及吃饭时间，其又可用于实现生理时钟治疗，用于展示个人的能力，并用于日常饮食。

[0150] 此外，当通过根据本发明的方法来检测生物节律的偏差(延迟)时，可将检测结果用于预防可能起因于生物节律的偏差的各种疾病，并用于改善不良的身体状态如时差症。