一种复合菌剂及其应用

摘要

本发明属于农业微生物技术领域，公开了一种复合菌剂及其应用。它是由大肠杆菌(Escherichia.coli)发酵液1～3份，木霉(Trichoderma virens)发酵液2～3份，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)发酵液1～4份，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵液4～6份混合而成。本发明提供的复合微生物菌剂不仅可以提高秸秆和牛粪的沼气产量，提高产气速率，而且可以进一步将固废含量降低30％。本方法具有速效、成本低、使用方法简单、易于普及等优点，可以推广使用。

权利要求

1.一种复合微生物菌剂，其特征在于该复合微生物菌剂由大肠杆菌(Escherichia.coli)发酵液，木霉(Trichoderma virens)发酵液，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)发酵液和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵液组成，4种发酵液中的有效活菌数分别都在10亿个/毫升以上。

2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于所述的复合微生物菌剂中4种菌的发酵液配比如下：大肠杆菌发酵液1～12重量份，木霉发酵液2～12重量份，荧光假单胞菌发酵液1～15重量份，枯草芽孢杆菌发酵液4～15重量份；4种发酵液中的有效活菌数分别都在10亿个/毫升以上。

3.根据权利要求2所述的复合微生物菌剂，其特征在于所述的复合微生物菌剂中4种菌的发酵液配比如下：大肠杆菌发酵液1～3重量份，木霉发酵液2～3重量份，荧光假单胞菌发酵液1～4重量份，枯草芽孢杆菌发酵液4～6重量份；4种发酵液中的有效活菌数分别都在10亿个/毫升以上。

4.权利要求1所述的复合微生物菌剂在处理秸秆和/或牛粪产沼气中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于将所述复合微生物菌剂与加入产甲烷接种物的秸秆和/或牛粪接触，促进秸秆和/或牛粪降解产生沼气；所述的产甲烷接种物选自粪坑沉渣、沼气池底沼渣、黑色阴沟污泥或垃圾填埋场污泥至少1种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的秸秆和/或牛粪需补充水份将含水率调整到91％-97％，进行湿式厌氧发酵产沼气。

说明书

一种复合菌剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于农业微生物技术领域，涉及一种复合菌剂及其应用。

背景技术

[0002] 秸秆类生物质是纤维素组分含量很高的农作物残留物，包括玉米、水稻、麦、棉花等的秸秆。秸秆作为一种天然纤维素，可被生物降解利用，能够适应符合环境要求的产品的开发。它的化学成分主要含纤维素、半纤维素和木质素。几十年来人们在纤维素以及相关酶的理论研究和实践应用方面均取得了较大进步，但迄今尚无一种微生物或一套酶系按传统方法用于大规模降解纤维素，并取得显著经济效益，目前其利用率仅有1％左右，限制其利用的主要原因是生物转化的成本高和降解酶的催化效率低。农林废弃物这种纤维素资源的转化利用研究将在为人类解决能源、粮食和环境污染等问题中起着巨大的作用，也是我国可持续发展战略的一项重要内容。

[0003] 我国有十分丰富的农林废弃物资源，每年仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等)就约有7亿吨，其中除很小的一部分被直接还原至自然界和用作动物饲料外，绝大部分都被焚烧掉，不但污染环境，又造成资源的巨大浪费。因此，如何科学、合理地开发利用这一资源，成为全世界重要的研究课题之一。更高效的利用秸秆，对缓解人类的粮食和能源危机，加速我国天然资源再生利用的发展和缓解三农问题具有重大意义，同时在环境污染的防治和良性生态系统的建立上也会发挥重要作用，其社会效益非常显著。据统计，我国目前的秸秆利用率为33％，但经过一定技术处理后利用的仅占2.6％，其余大部分只是作为燃料等直接利用，开发前景非常广阔。经技术处理后利用普遍存在成本过高，利用率低等问题。

[0004] 发达的畜牧业是现代农业的标志，乳制品占畜产品的比重是衡量畜牧业发达与否的重要指标。近年来我国奶牛业发展保持了旺盛的增长势头，截止2004年，我国奶牛饲养量已经达到1000万头。规模化养殖业在为发展农村经济，提高城乡居民生活水平做出巨大贡献的同时，随着粪污相对集中排放，也带来系列的环境问题。由于技术和经济的原因，我国有相当数量的奶牛养殖场粪污没有得到有效处理，粪污处理问题已经严重影响了自身的持续发展，粪污综合治理迫在眉睫。由于沼气技术(厌氧消化)在实现奶牛粪污资源化循环利用、改善农村能源、环境、卫生条件和有利于温室气体减排方面的独特作用，日益受到世界各国政府的重视，诸多因素将使沼气技术有更好的发展空间。

[0005] 据统计每头奶牛日产鲜牛粪约30公斤，牛尿和冲洗废水150公斤，奶牛粪便已成为我国农村环境主要污染源之一。沼气发酵是奶牛粪便最有应用前景的处理工艺之一，在使奶牛粪便无害化的同时，产生的沼液沼渣可作为有机肥料，沼气可作为能源。但是由于奶牛粪便有机质浓度高，作为原料进行沼气发酵时，普遍存在调试启动慢，运行过程不稳定，易出现酸化和不产气或产气率低等问题，这已经在很大程度上制约了沼气发酵在奶牛粪便处理中的应用。

[0006] 专利号为CN 1888073A(200510077792.3)公开了一种复合菌剂预处理秸秆的沼气发酵方法，复合菌剂为高温单胞菌、枯草芽孢杆菌、木酶菌和地衣芽孢杆菌，向潮湿后的秸秆加入复合菌剂和作为秸秆堆沤的氮源碳氢铵并补加水，用塑料布覆盖堆沤，然后将堆沤好的秸秆投入沼气池，同时加入碳酸氢铵和甲烷的接种物，密闭2-7天，即产沼气。预处理后的秸秆发酵速度和产气速度快，初始产气时间缩短，产气率提高30％左右，能使所有的玉米秸秆、稻草、麦秆等农作物秸秆作为沼气发酵的原料，适用范围广。该方法的局限性在于预处理时方法复杂，复合菌剂只能在预处理秸秆时使用，不能直接促进沼气产生，限制了其推广。

[0007] 目前国内利用复合菌剂处理牛粪的专利较少，专利CN 1332795公开了一种能降解动物排泄物的称作JSB98.0的混合微生物群，由谷氨酸杆菌HO777，克氏微球菌HO778，脱氮副球菌HO779，谷氨酸杆菌HO780以及蕈状芽孢杆菌HO781五个活性菌株组成。需要将该微生物群在15℃以分批方式加入到微生物培养系统中，并以半连续方式或连续方式加入含排泄物的水性基质，其方式限制了微生物菌剂处理动物排泄物的能力且降解能力不高，限制了该方法的推广。

[0008] 南京加德绿色能源研发有限公司拥有一项选择特定功能微生物降解目标物质的“计算机辅助菌种选择技术(Computer-Assisted Strain Construction and Development Engineering：CASCADE)，它可将微生物新陈代谢途径中遗传与化学信息相关联，应用基于计算机知识模式搜索的筛选思路，对符合降解目标的特定微生物的代谢能力进行评定，从中选择最优的微生物菌种，最大化产生所期望的目标产物。本发明所提供的复合菌剂即通过应用该技术后得到的。

发明内容

[0009] 本发明的目的是为了克服现有技术秸秆和牛粪发酵产气量的不足，提供一种复合菌剂。

[0010] 本发明的另一目的是提供该复合菌剂在处理秸秆和/或牛粪发酵产甲烷中的应用。

[0011] 一种复合微生物菌剂，该复合微生物菌剂主要由大肠杆菌(Escherichia.coli)发酵液，木霉(Trichoderma virens)发酵液，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)发酵液和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵液组成，4种发酵液中的有效活菌数分别都在10亿个/毫升以上。

[0012] 所述的复合微生物菌剂配比如下：大肠杆菌发酵液1～12重量份，木霉发酵液2～12重量份，荧光假单胞菌发酵液1～15重量份，枯草芽孢杆菌发酵液4～15重量份，
4种发酵液中的有效活菌数分别都在10亿个/毫升以上；优选大肠杆菌发酵液1～3重量份，木霉发酵液2～3重量份，荧光假单胞菌发酵液1～4重量份，枯草芽孢杆菌发酵液4～
6重量份；4种发酵液中的有效活菌数分别都在10亿个/毫升以上。

[0013] 本发明所述的复合微生物菌剂在处理秸秆和/或牛粪产沼气中的应用。

[0014] 其中，将所述复合微生物菌群与加入产甲烷接种物的秸秆和/或牛粪接触，促进秸秆和/或牛粪降解产生沼气。

[0015] 所述的产甲烷接种物选自粪坑沉渣、沼气池底沼渣、黑色阴沟污泥或垃圾填埋场污泥至少1种或多种。

[0016] 所述的秸秆和/或牛粪需补充水份，将含水率调整到91％-97％，进行湿式厌氧发酵产沼气。

[0017] 应用方法一：

[0018] 本发明复合微生物菌剂应用于以作物秸秆为原料的厌氧发酵，具体步骤如下：

[0019] 1、选用占沼气池容积20-40％(Kg/L)的无有毒物质污染的作物秸秆如稻草、玉米杆、麦草等用人工或者机械方法铡短，长度在3cm以下。

[0020] 2、将破碎后的秸秆按料水重量比1∶1～3加水润湿，成分搅拌后过夜使秸秆溶胀。

[0021] 3、将溶胀后的秸秆加入秸秆原料质量0.5～5％的生石灰(氧化钙)，混合均匀后进行堆沤，堆沤温度保持在40～60℃，维持时间为4～8天。

[0022] 4、将堆沤好的秸秆投入沼气池中，加水调配成含水率91％-97％左右的混合物，加入干重占秸秆和水混合物质量10-20％(g/g)的产甲烷接种物，调节pH至7.4-7.8。

[0023] 5、最后，按秸秆和水混合物质量5-10％(g/g)的量加入本发明复合菌剂，搅拌均匀，封盖。

[0024] 应用方法二：

[0025] 1.取质量占沼气池容积30-60％(Kg/L)新鲜牛粪，加水调配成含水率91％-97％左右的混合物，加入沼气池中。

[0026] 2.加入干重占牛粪与水混合物质量5-10％(g/g)的产甲烷接种物，调节pH至6.8-7.4。

[0027] 3.按占牛粪与水混合物质量1～10％(g/g)的接种量加入本发明复合菌剂。

[0028] 4.35℃左右厌氧发酵，封盖并定时搅拌。

[0029] 本发明与现有技术相比的有益效果：

[0030] 1.本发明复合菌剂应用于秸秆和牛粪发酵产沼气具有速效、长效、成本低、使用方法简单、易于普及等优点，受到用户的欢迎。

[0031] 2.加入本发明复合菌剂的秸秆产气效果良好，在中温35℃左右加入复合菌剂后，秸秆的产气速率大大提高，并且秸秆的产气量较不加菌提高50-150％。加入本发明复合菌剂的牛粪发酵产气效果良好，在中温35℃左右加入复合菌剂后，发酵物的产气速率大大提高，并且产气量较不加菌提高200-400％。

[0032] 3.采用本发明复合菌剂，发酵罐采用连续运行的方式，可保证发酵罐产气长期使用，并且复合菌剂促进沼气生产的作用不出现明显的衰减。

[0033] 4.利用本发明复合菌剂处理秸秆，厌氧发酵后较不加菌含固量减量提高30％左右。

[0034] 5.本发明复合菌剂中各微生物起协同作用，能够与秸秆和牛粪中的微生物菌群协同配合，促进秸秆和牛粪中产甲烷菌的生长，不会出现菌种间相互抑制现象。具体实施方式：

[0035] 实施例1微生物发酵液的制备

[0036] 本实施例仅以大肠杆菌(ATCC10795)，木霉(ATCC10045)，荧光假单胞菌(ATCC11150)，枯草芽孢杆菌(ATCC10774)为例对发明的具体内容做详细描述，并不限制本发明复合微生物菌剂中四种微生物来源的选择。

[0037] (1)将以上4种微生物分别活化至保藏用斜面培养基，25-37℃培养24-48小时。4种微生物的斜面培养及组成为：

[0038] 大肠杆菌、荧光假单胞菌斜面培养基采用LB培养基，液体培养基组成为：蛋白胨10克，酵母膏5克，氯化钠10克，自来水1000毫升，琼脂15克，pH＝7.2；

[0039] 木霉菌种斜面培养基采用PDA培养基，培养基组成为：马铃薯汁1000mL，葡萄糖20克，琼脂20克，pH＝7.0；

[0040] 枯草芽孢杆菌斜面培养基采用LB培养基，液体培养基组成为：蛋白胨10克，酵母膏5克，氯化钠10克，自来水1000毫升，琼脂15克，pH＝7.0；

[0041] (2)分别将活化好的菌种接种到各自的液体培养基，23-37℃，转速为160转/分，连续培养25-37小时，得摇瓶培养液。

[0042] 四种微生物的摇瓶及发酵罐培养基配方如下：

[0043] 大肠杆菌：蛋白胨10克，酵母膏5克，氯化钠10克，自来水1000毫升，pH＝7.2；

[0044] 木霉菌：马铃薯汁1000毫升，葡萄糖20克，pH＝7.0；

[0045] 荧光假单胞菌：蛋白胨10克，酵母膏5克，氯化钠10克，自来水1000毫升，pH＝7.2；

[0046] 枯草芽孢杆菌：蛋白胨10克，酵母膏5克，氯化钠10克，自来水1000毫升，pH＝7.0；

[0047] (3)种子罐100升，装料量80升，分别按上述4种微生物液体培养基配方投料，然后121℃灭菌20分钟，冷却后分别加入0.8升上述培养至对数期的种子液。培养温度28-37℃，搅拌转速120转/分，通气量1∶1.2(与发酵液体积比)，培养25-37小时至对数期，得发酵种子液。

[0048] (4)生产发酵罐1000升，装料量800升，生产罐培养基配方同种子罐培养基，然后121℃灭菌20分钟，冷却后分别加入8升上述发酵种子液。培养温度28-37℃，搅拌转速120转/分，通气量1∶1.2(与发酵液体积比)，培养25-37小时至对数期，分别得上述四种微生物的发酵液。

[0049] 通过检测，以上4种发酵液中的有效活菌数分别都在10亿个/毫升以上。

[0050] 实施例2：利用复合微生物菌剂处理牛粪厌氧发酵产沼气

[0051] (1)实施例1制备的四种微生物发酵液按如下重量份混合均匀成为复合微生物菌剂：大肠杆菌液1份，木霉菌液2份，荧光假单胞菌液2份，枯草芽孢杆菌4份。

[0052] (2)取奶牛场的新鲜牛粪600千克，加水调配成含水率95％左右的混合物，按照质量等分成两份分别加入两个相同的发酵罐(容积为1000升)中。

[0053] (3)加入干重占牛粪与水混合物质量10％(g/g)的产甲烷接种物(选自粪坑沉渣)，调节pH至6.8-7.2。

[0054] (4)在其中一个厌氧发酵罐中按牛粪和水混合物质量的5％(g/g)的接种量加入(1)制备的复合菌剂，另一个作空白对照加入等量的水。搅拌均匀，封盖，保持35℃中温厌氧发酵。定时搅拌，防腐型气体流量计记录气体产量。2个厌氧发酵罐产气情况如表1所示。

[0055] 表1牛粪厌氧发酵对照

[0056]

[0057] 实施例3：利用复合微生物菌剂处理秸秆厌氧发酵产沼气

[0058] (1)实施例1制备的四种微生物发酵液按如下重量份混合均匀成为复合微生物菌剂：大肠杆菌液2份，木霉菌液2份，荧光假单胞菌液2份，枯草芽孢杆菌5份。

[0059] (2)选用无有毒物质污染的稻草秸秆400kg，用人工或者机械方法铡短，长度在3cm以下。

[0060] (3)在铡碎的秸秆中加入相当于秸秆质量2倍的水润湿，充分搅拌后过夜使秸秆溶胀。

[0061] (4)将溶胀后的秸秆加入秸秆原料质量1％的生石灰(氧化钙)，混合均匀后进行堆沤，堆沤温度保持在50℃，维持时间为6天。

[0062] (5)将堆沤好的秸秆按照质量等分为两份，分别投入两个相同的发酵罐(容积为1000升)中，加水调配成含水率93％左右的混合物，分别加入干重占秸秆和水混合物质量
10％(g/g)的产甲烷接种物(选自黑色阴沟污泥)，调节pH至7.4-7.8。

[0063] (6)在其中一个厌氧发酵罐中按占秸秆和水混合物质量10％(g/g)的接种量加入(1)制备的复合菌剂，另一个作空白对照加入等量的水。搅拌均匀，封盖。35℃厌氧发酵，并定时搅拌，防腐型气体流量计纪录气体产量。两个厌氧发酵罐的产气情况如表2所示：

[0064] 表2.秸秆厌氧发酵对照

[0065]

[0066] 实施例4：利用复合微生物菌剂处理牛粪和秸秆混合物厌氧发酵产沼气[0067] (1)实施例1制备的四种微生物发酵液按如下重量份混合均匀成为复合微生物菌剂：大肠杆菌液3份，木霉菌液3份，荧光假单胞菌液1份，枯草芽孢杆菌4份。

[0068] (2)分别选用无有毒物质污染的稻草秸秆200kg，用人工或者机械方法铡短，长度在3cm以下。

[0069] (3)在铡碎的秸秆中加入相当于秸秆质量2倍的水润湿，充分搅拌后过夜使秸秆溶胀。

[0070] (4)将溶胀后的秸秆加入秸秆原料质量1％的生石灰(氧化钙)，混合均匀后进行堆沤，堆沤温度保持在50℃，维持时间为6天。

[0071] (5)将堆沤好的秸秆按照质量等分成两份分别投入两个相同的发酵罐(容积为1000升)中，再分别向每个发酵罐中加入取自奶牛场的新鲜牛粪400千克。加水调配秸秆和牛粪混合物成含水率94％左右，分别加入干重占秸秆、牛粪和水混合物质量10％(g/g)的产甲烷接种物(选自沼气池底沼渣)，调节pH至7.2-7.4。

[0072] (6)在其中一个厌氧发酵罐中按秸秆、牛粪和水混合物质量10％(g/g)的接种量加入(1)制备的复合菌剂，另一个作空白对照加入等量的水。搅拌均匀，封盖。35℃厌氧发酵，并定时搅拌，防腐型气体流量计纪录气体产量。两个厌氧发酵罐的产气情况如表3所示：

[0073] 表3.秸秆牛粪厌氧混合物发酵对照

[0074]

[0075] 实施例5

[0076] 实施例1制备的四种微生物发酵液按如下重量份混合均匀成为复合微生物菌剂：大肠杆菌液7份，木霉菌液8份，荧光假单胞菌液4份，枯草芽孢杆菌6份。

[0077] 按照实施例3的方法利用本实施例制备的复合微生物菌剂处理秸秆产沼气，产气情况如表4：

[0078] 表4秸秆厌氧发酵对照

[0079]

[0080] 实施例6

[0081] 实施例1制备的四种微生物发酵液按如下重量份混合均匀成为复合微生物菌剂：大肠杆菌液10份，木霉菌液12份，荧光假单胞菌液8份，枯草芽孢杆菌15份。

[0082] 按照实施例2的方法利用本实施例制备的复合微生物菌剂处理奶牛粪产沼气，产气情况如表5：

[0083] 表5牛粪厌氧发酵对照

[0084]

[0085] 实施例7

[0086] 实施例1制备的四种微生物发酵液按如下重量份混合均匀成为复合微生物菌剂：