大肠菌增菌增酶培养液及其制备方法

摘要

本发明公开一种大肠菌增菌增酶培养液，包括组分A、B，其中：组分A：每1000ml蒸馏水中含有胰蛋白胨0.5～2g，氯化钠2～5g，磷酸二氢钾6～8g，氢氧化钠1～2g；组分B：每100mL蒸馏水中含有β-半乳糖苷酶诱导物0.05-0.2g，亚致死细菌快速修复物3-6g，细菌快速增长剂2-5g；其中，组分A与组分B体积比为100∶1。本发明的大肠菌增菌增酶培养液，能够对大肠菌进行快速增菌，与此同时增加β-半乳糖苷酶的量，对菌体培养6～7小时即可达到检测所需的菌体量，增菌增酶速度快、效率高本发明还公开一种大肠菌增菌增酶培养液的制备方法。

权利要求

1.一种大肠菌增菌增酶培养液，其特征在于，包括组分A、B，其中：组分A：每1000ml蒸馏水中含有胰蛋白胨0.5～2g，氯化钠2～5g，磷酸二氢钾6～

8g，氢氧化钠1～2g；

组分B：每100mL蒸馏水中含有β-半乳糖苷酶诱导物0.05-0.2g，亚致死细菌快速修复物3-6g，细菌快速增长剂2-5g；

其中，组分A与组分B体积比为100∶1；

所述β-半乳糖苷酶诱导物为乳糖、异丙基硫代半乳糖苷或者半乳糖中的任一种；

所述亚致死细菌快速修复物为甘油、葡萄糖、丙酮酸钠、抗坏血酸或维生素E中的任一种或多种；

所述细菌快速增长剂为三磷酸腺苷、肌酐、肌苷或者牛血清提取物中的任一种或多种。

2.如权利要求1的大肠菌增菌增酶培养液，其特征在于，组分A中，每1000ml蒸馏水中还含有自由基清除剂1g～3g、十二烷基磺酸钠0.03g～0.06g；所述自由基清除剂为活性炭、可溶性淀粉、半胱氨酸、二苯胺、巯基乙醇或α-生育酚中的任一种。

3.一种大肠菌增菌增酶培养液的制备方法，其特征在于，将组分A灭菌后与组分B以体积比100∶1混合，其中：组分A为：每1000ml蒸馏水中含有胰蛋白胨0.5～2g，氯化钠

2～5g，磷酸二氢钾6～8g，氢氧化钠1～2g，组分B为：每100mL蒸馏水中含有β-半乳糖苷酶诱导物0.05-0.2g，亚致死细菌快速修复物3-6g，细菌快速增长剂2-5g；所述β-半乳糖苷酶诱导物为乳糖、异丙基硫代半乳糖苷或者半乳糖中的任一种；所述亚致死细菌快速修复物为甘油、葡萄糖、丙酮酸钠、抗坏血酸或维生素E中的任一种或多种；所述细菌快速增长剂为三磷酸腺苷、肌酐、肌苷或者牛血清提取物中的任一种或多种。

4.如权利要求3的大肠菌增菌增酶培养液的制备方法，其特征在于，组分A中，每

1000ml蒸馏水中还含有自由基清除剂1g～3g、十二烷基磺酸钠0.03g～0.06g；所述自由基清除剂为活性炭、可溶性淀粉、半胱氨酸、二苯胺、巯基乙醇或α-生育酚中的任一种。

5.如权利要求3的大肠菌增菌增酶培养液的制备方法，其特征在于，组分A先在121℃下灭菌15分钟后再与组分B混合。

说明书

大肠菌增菌增酶培养液及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及菌群的培养，特别涉及一种大肠菌增菌增酶培养液及其制备方法。

背景技术

[0002] 在食品行业，大肠菌群的含量是一项重要的卫生指标。由于于各种食品成分复杂，存在干扰菌体生理状态、影响检测结果的物质，因此，在检测前需要进行菌体分离富集，以去除干扰物质，然后将分离得到的菌体进行检测，如果将菌体直接进行检测，常常因菌量小而无法检出，造成错误的检测结果。目前，通常采用增菌液对菌体进行培养，增加菌体量，从而保证检测结果正确，该种增菌液多为大肠菌增菌培养基，采用该培养基增菌需要12小时才能达到检测所需的菌体量，因此增菌时间太长，不能满足快速检测的要求，造成检测效率低下的问题。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于，提供一种大肠菌增菌增酶培养液，对大肠菌进行增菌增酶培育，快速达到检测要求的菌体量。

[0004] 为解决以上技术问题，本发明的技术方案是，一种增菌增酶培养液，包括组分A、B，其中：

[0005] 组分A：每1000ml蒸馏水中含有胰蛋白胨0.5～2g，氯化钠2～5g，磷酸二氢钾6～8g，氢氧化钠1～2g；

[0006] 组分B：每100mL蒸馏水中含有β-半乳糖苷酶诱导物0.05-0.2g，亚致死细菌快速修复物3-6g，细菌快速增长剂2-5g；其中，组分A与组分B体积比为100∶1。

[0007] 其中，组分A中，每100ml蒸馏水中还含有自由基清除剂1g～3g、十二烷基磺酸钠0.03g～0.06g。

[0008] 其中，所述β-半乳糖苷酶诱导物为乳糖、异丙基硫代半乳糖苷或者半乳糖中的任一种。

[0009] 其中，所述亚致死细菌快速修复物为甘油、葡萄糖、丙酮酸钠、抗坏血酸、维生素E中的任一种或多种。

[0010] 其中，所述细菌快速增长剂为三磷酸腺苷、肌酐，肌苷或者牛血清提取物中的任一种或多种。

[0011] 其中，所述自由基清除剂为活性炭、可溶性淀粉、半胱氨酸、二苯胺、巯基乙醇或α-生育酚中的任一种。

[0012] 本发明还提供一种增菌增酶培养液的制备方法，将组分A灭菌后与组分B以体积比100∶1混合，其中：组分A为：每1000ml蒸馏水中含有胰蛋白胨0.5～2g，氯化钠2～5g，磷酸二氢钾6～8g，氢氧化钠1～2g，组分B为：每100mL蒸馏水中含有β-半乳糖苷酶诱导物0.05-0.2g，亚致死细菌快速修复物3-6g，细菌快速增长剂2-5g。

[0013] 其中，组分A中，每1000ml蒸馏水中还含有自由基清除剂1g～3g、十二烷基磺酸钠0.03g～0.06g。

[0014] 其中，组分A先在121℃下灭菌15分钟后再与组分B混合。

[0015] 与现有技术相比，本发明的大肠菌增菌增酶培养液，能够对大肠菌进行快速增菌，与此同时增加β-半乳糖苷酶的量，对菌体培养6～7小时即可达到检测所需的菌体量，增菌增酶速度快、效率高、成本低廉。

具体实施方式

[0016] 以下通过具体实施例对本发明进行说明。

[0017] 实施例一

[0018] 本发明的大肠菌增菌增酶培养液包括组分A、组分B，其中：

[0019] 组分A：胰蛋白胨0.5g，氯化钠2g，活性炭2g，十二烷基磺酸钠0.05g，磷酸二氢钾7g，氢氧化钠2g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，121℃灭菌15分钟，室温保存供使用。

[0020] 组分B：乳糖0.2g，甘油3g，三磷酸腺苷3g，溶于100mL蒸馏水，过滤除菌，取100μl到10ml培养液组分A中。

[0021] 实施例二

[0022] 本发明的大肠菌增菌增酶培养液包括组分A、组分B，其中：

[0023] 组分A：胰蛋白胨0.8g，氯化钠3g，可溶性淀粉1g，十二烷基磺酸钠0.04g，磷酸二氢钾6g，氢氧化钠1g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，121℃灭菌15分钟，室温保存供使用。

[0024] 组分B：半乳糖0.07g，葡萄糖4g，肌酐5g，溶于100mL蒸馏水，过滤除菌，取100μl到10ml培养液组分A中。

[0025] 实施例三

[0026] 本发明的大肠菌增菌增酶培养液包括组分A、组分B，其中：

[0027] 组分A：胰蛋白胨1g，氯化钠4g，半胱氨酸3g，十二烷基磺酸钠0.06g，磷酸二氢钾6g，氢氧化钠2g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，121℃灭菌15分钟，室温保存供使用。

[0028] 组分B：异丙基硫代半乳糖苷0.15g，丙酮酸钠3g，肌苷2g，溶于100mL蒸馏水，过滤除菌，取100μl到10ml培养液组分A中。

[0029] 实施例四

[0030] 本发明的大肠菌增菌增酶培养液包括组分A、组分B，其中：

[0031] 组分A：胰蛋白胨1.5g，氯化钠2g，二苯胺g，十二烷基磺酸钠0.05g，磷酸二氢钾7g，氢氧化钠17g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，121℃灭菌15分钟，室温保存供使用。

[0032] 组分B：乳糖0.2g，维生素E3g，牛血清提取物3g，溶于100mL蒸馏水，过滤除菌，取100μl到10ml培养液组分A中。

[0033] 实施例五

[0034] 本发明的大肠菌增菌增酶培养液包括组分A、组分B，其中：

[0035] 组分A：胰蛋白胨2g，氯化钠3g，巯基乙醇1g，十二烷基磺酸钠0.06g，磷酸二氢钾7g，氢氧化钠1g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，121℃灭菌15分钟，室温保存供使用。

[0036] 组分B：半乳糖0.2g，抗坏血酸4g，三磷酸腺苷3g，溶于100mL蒸馏水，过滤除菌，取100μl到10ml培养液组分A中。

[0037] 实施例六

[0038] 本发明的大肠菌增菌增酶培养液包括组分A、组分B，其中：

[0039] 组分A：胰蛋白胨0.5g，氯化钠3g，α-生育酚1g，十二烷基磺酸钠0.04g，磷酸二氢钾8g，氢氧化钠1g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，121℃灭菌15分钟，室温保存供使用。

[0040] 组分B：异丙基硫代半乳糖苷0.18g，甘油、5g，肌酐2g，溶于100mL蒸馏水，过滤除菌，取100μl到10ml培养液组分A中。

[0041] 以下以两个应用例对本发明大肠菌增菌增酶培养液的效果进行说明。

[0042] 应用例一

[0043] 1、样品

[0044] 利用大肠杆菌标准菌株ATCC8739制备一系列不同菌浓度的大肠杆菌稀释液。

[0045] 2、培养液组成与制备

[0046] 本发明的大肠菌群增菌增酶培养液的配方及制备方法参见前述实施例一～实施例六。

[0047] 将以下两种培养基/培养液作为对照例，与本发明的大肠菌群增菌增酶培养液进行实施效果对照。

[0048] 对照例1：乳糖胆盐发酵培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)，培养基配方与制备方法参见GB/T4789.2-2008)。

[0049] 对照例2：大肠菌群增菌培养液，其组分及制备方法为：将胰蛋白胨0.5g，氯化钠2g，自由基清除剂1g，十二烷基磺酸钠0.03g，磷酸二氢钾6g，氢氧化钠1g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，121℃灭菌15分钟，室温保存供使用。

[0050] 3、菌体培养

[0051] 取五种不同菌浓度的稀释液各1mL分别加入到前述大肠菌增菌增酶培养液、对照例1、对照例2中，每个稀释液每种培养液/培养基做2个重复，放入39-42℃的恒温培养箱中培养6～7小时。

[0052] 4、发光检测

[0053] 分别取培养完毕的菌悬液100μl，置于96孔板中相应检测孔中，加入50μl发光试剂底物、发光增强剂和大肠菌温和裂解液混合试剂反应30分钟，在振荡器上摇匀振荡1分钟后，进行发光检测，发光检测的波长为560nm，检测积分时间为1s。此检测步骤中，以β-半乳糖苷酶作为标记物，β-半乳糖苷酶分解发光试剂底物时，反应体系会发出生物光，在一定范围内β-半乳糖苷酶的量与发光强度呈正相关，通过发光值间接测定大肠菌群的数量。其中，发光试剂底物选用荧光素-β-半乳糖苷，发光增强剂选用季铵盐高聚物，大肠菌温和裂解液选用硫酸粘菌素B。

[0054] 5、数据处理

[0055] 下列表1、2、3为经本发明大肠菌增菌增酶培养液、对照例1、对照例2培育后的菌液发光值检测结果表。各表中，序号为0的检样的菌液浓度为0，将其作为对照样，测得其发光值，计算6h检样发光值与对照样发光值的比值T1、计算7h检样发光值与对照样发光值的比值T2，若T2与T1的比值K少于或等于1.1(阀值)，则结果为大肠菌群未检出，若T2与T1的比值K大于1.1，则结果为大肠菌群检出。其中：阀值的理论值应为1，但检测过程中发光值会有轻微的波动，故将阀值设为略高于1。阀值是由大量检测数据经统计学分析得出。

[0056] 表1、经对照例1(乳糖胆盐发酵培养基)培育的菌液发光值检测结果[0057]菌液浓度 7h发光值 T2 K 结果
序号 6h发光值 T1
(CFU/mL)
0 0 1164 1098
1-1 2 1169 1.00 1101 1.00 1.00 未检出
1-2 2 1157 0.99 1099 1.00 1.01 未检出
2-1 18 1155 0.99 1100 1.00 1.01 未检出
2-2 18 1156 0.99 1102 1.00 1.01 未检出
3-1 170 1812 1.56 3210 2.92 1.88 检出
3-2 170 1923 1.65 3425 3.12 1.89 检出
4-1 1700 23001 19.76 68002 61.93 3.13 检出
4-2 1700 26020 22.35 75201 68.49 3.06 检出
5-1 17000 190191 163.39 821929 748.57 4.58 检出
5-2 17000 219002 188.15 920921 838.73 4.46 检出[0058] 表2、经对照例2(大肠菌群增菌培养液)培育的菌液发光值快速检测结果[0059]
序 菌液浓度 7h发光值 T2 K 结果
6h发光值 T1
号 (CFU/mL)
0 0 1060 998
1-1 2 1149 1.08 1103 1.11 1.0 未检出
1-2 2 1155 1.09 1099 1.10 1.0 未检出
2-1 18 1521 1.43 4302 4.31 3.0 检出
2-2 18 1458 1.38 4104 4.11 2.9 检出
3-1 170 9399 8.87 23210 23.26 2.6 检出
3-2 170 11002 10.38 27092 27.15 2.6 检出
4-1 1700 32025 30.21 120012 120.25 3.9 检出
4-2 1700 34207 32.27 130133 130.39 4.0 检出
5-1 17000 280190 264.33 2002902 2006.92 7.5 检出
5-2 17000 332287 313.48 2399231 2404.04 7.6 检出[0060] 表3、经本发明大肠菌群增菌增酶培养液培养的菌液发光值快速检测结果[0061]
菌液浓度
序号 6h发光值 T1 7h发光值 T2 K 结果
CFU/mL
0 0 1100 1078
1-1 2 3219 2.93 8001 7.42 2.54 检出
1-2 2 2867 2.61 7200 6.68 2.56 检出
2-1 18 14442 13.13 32228 29.90 2.28 检出
2-2 18 15580 14.16 35004 32.47 2.29 检出
3-1 170 89692 81.54 360091 334.04 4.10 检出
3-2 170 75697 68.82 310912 288.42 4.19 检出
4-1 1700 327821 298.02 2310121 2142.97 7.19 检出
4-2 1700 361240 328.40 2530133 2347.06 7.15 检出
5-1 17000 1812224 1647.48 16002922 14845.01 9.01 检出
5-2 17000 2010023 1827.29 17991092 16689.32 9.13 检出[0062] 从表1、表2、表3的检测数据可以得出，以大肠杆菌标准菌株ATCC8739作为测试对象，在其他检测参数相同的条件下，经乳糖胆盐发酵基培育的检样6～7小时内只能检出
170CFU/mL，经大肠菌群增菌培养液培育的检样6～7小时内检出18CFU/mL，而经本发明大肠菌群增菌增酶培养液培养的6～7小时内能检出2CFU/mL(或更低)，因此，得出结论：本发明的大肠菌群增菌增酶培养液对大肠菌群的增菌增酶效果显著，用于大肠菌群检测时，检测更灵敏。

[0063] 应用例二

[0064] 1、样品：一大肠菌群呈阳性(＞30MPN/100g)的黄豆酱试验样。

[0065] 2.培养液组成与制备

[0066] 本发明的大肠菌群增菌增酶培养液的配方及制备方法参见前述实施例一～实施例六。

[0067] 将以下两种培养基/培养液作为对照例，与本发明的大肠菌群增菌增酶培养液进行实施效果对照。

[0068] 对照例1：乳糖胆盐发酵培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)[0069] 培养基配方与制备方法(参考GB/T4789.2-2008)

[0070] 对照例2：大肠菌群增菌培养液，其组分及制备方法为：胰蛋白胨2g，氯化钠5g，自由基清除剂3g，十二烷基磺酸钠0.06g，磷酸二氢钾8g，氢氧化钠2g，溶解于1000ml蒸馏水，取10ml分装到试管中，121℃灭菌15分钟，室温保存供使用。

[0071] 3、样品处理

[0072] 用电子天平移取10g黄豆酱样品到含有灭菌玻璃珠的90ml无菌生理盐水中，振荡摇匀，取该样品稀释液10ml过30μm聚丙烯滤膜，去除大颗粒酱渣，滤后液过0.45μm混合醋酸纤维素滤膜，用无菌生理盐水对截留在膜上的菌体反复冲洗三次，去除干扰菌体生理状态、影响β-半乳糖苷酶活性及检测反应体系的物质。

[0073] 4、菌体培养

[0074] 用灭菌不锈钢镊子将截留菌体的滤膜夹起，分别放入盛有10ml乳糖胆盐培养液、大肠菌群增菌培养液、大肠菌群增菌增酶培养液的试管内，每种培养液做2个重复。利用振荡试管的方式将滤膜上的菌体洗脱到试管内培养液中，放入39-42℃的恒温培养箱内培养6～7小时。

[0075] 5、发光值检测

[0076] 取孵育完毕的菌悬液100μl，置于96孔板中相应检测孔中，加入50μl发光试剂底物、发光增强剂和大肠菌温和裂解液混合试剂反应30分钟，在振荡器上摇匀振荡1分钟后，进行发光检测，发光检测的波长为560nm，检测积分时间为1s。其中，发光试剂底物选用荧光素-β-半乳糖苷，发光增强剂选用季铵盐高聚物，大肠菌温和裂解液选用曲拉通。

[0077] 6、数据处理

[0078] 下列表4为经本发明大肠菌增菌增酶培养液、对照例1、对照例2培育后的检样发光值检测结果表。以乳糖胆盐发酵培养基为例进行说明：序号1-1、1-2为经乳糖胆盐发酵培养基培育的检样，序号1-0为未添加菌体的乳糖胆盐发酵培养基，将其作为对照样，测得其发光值，计算序号为1-1、1-2的检样6h检样发光值与对照样发光值的比值T1、7h检样发光值与对照样发光值的比值T2，若T2与T1的比值K少于或等于1.1(阀值)，则结果为大肠菌群未检出，若T2与T1的比值K大于1.1，则结果为大肠菌群检出。其中：阀值的理论值应为1，但检测过程中发光值会有轻微的波动，故将阀值设为略高于1。阀值是由大量检测数据经统计学分析得出。