禽IL-2与新城疫病毒HN基因重组融合蛋白及其应用

摘要

本发明涉及一种重组禽白细胞介素2与新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase,HN）融合蛋白（chIL-2-HN融合蛋白）的制备方法和应用，属于生物工程技术领域。该融合蛋白为禽IL-2蛋白和新城疫病毒HN蛋白通过柔性Linker肽融合而成，编码该融合蛋白的DNA序列插入表达载体pPICZαA，电转化酵母菌X-33,获得高效表达重组chIL-2-HN融合蛋白的基因工程菌，通过液体培养、纯化制得的重组chIL-2-HN融合蛋白，该重组融合蛋白可作为新城疫新型基因工程疫苗，也可作为新城疫常规疫苗的新型免疫佐剂。本发明的chIL-2-HN融合蛋白经动物免疫实验证实，安全性好，无毒副作用。能够有效增强机体细胞免疫和体液免疫水平，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.chIL-2-HN融合蛋白，其特征在于：组成为：禽白细胞介素2的氨基酸序列、新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶的氨基酸序列、以及位于禽白细胞介素2氨基酸序列和新城疫病毒HN 蛋白的氨基酸序列之间的柔性Linker肽氨基酸序列；其中，所述的柔性Linker肽为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；所述chIL-2-HN融合蛋白按照如下方法制备得到：编码禽白细胞介素2的氨基酸序列的基因是根据GenBank中禽IL-2的核苷酸序列收录号：AY029588，利用DNA Star、primer premier 软件设计2条引物片段F1、F2，禽IL-2基因由5’端引入KpnI内切酶位点的引物F1与5’端引入柔性接头的引物F2扩增得到；引物序列如下：F1: SEQ ID NO.1；

5’-CGGGTACCATGTGCAAAGTACTGATCTTTGGC-3’，

F2: SEQ ID NO.2；

5’-GCTGCCGCCGCCGCCTTTTTGCAGATATCTCAC-3’；

编码新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶的氨基酸序列的基因是根据GenBank中新城疫病毒HN基因的核苷酸序列收录号：GU573799.1，利用DNA Star、primer premier 软件设计2条引物片段F3、F4，新城疫病毒HN基因由5’端引入柔性接头的引物F3与5’端引入Not I内切酶位点的引物F4 扩增获得，引物序列如下：F3: SEQ.ID.NO.3；

5’- GGCGGCGGCGGCAGCATGGACCGTGTAGTTAGC-3’，

F4: SEQ.ID.NO.4；

5’-TAGCGGCCGCaactctatcatccttgaggatctcaac-3’；

以上述获得的禽IL-2基因和新城疫病毒HN基因为模板，利用F1和F4引物，通过重叠PCR方法扩增chIL-2-HN融合基因；将PCR方法扩增获得的chIL-2-HN融合基因插入到毕赤酵母载体pPICZαA中，得到重组表达的毕赤酵母载体，命名为pPICZαA-chIL-2-HN；将获得的重组表达的毕赤酵母载体pPICZαA-chIL-2-HN，电击转化入毕赤酵母菌 X-33感受态细胞中，高抗性筛选和PCR鉴定，获得表达重组融合蛋白的基因毕赤酵母X-33菌株并在适宜的培养条件下培养，分离培养液上清，获得重组融合蛋白。

2.权利要求1所述chIL-2-HN融合蛋白在制备预防和治疗鸡新城疫药物方面的应用。

说明书

禽IL-2与新城疫病毒HN基因重组融合蛋白及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及涉及禽白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）与新城疫病毒HN融合蛋白，及编码该融合蛋白的DNA序列以及含该DNA序列的载体和宿主细胞，还涉及重组融合蛋白及其应用，属于生物技术制药工业中的基因工程生产疫苗和免疫佐剂的技术领域。

背景技术

[0002] 新城疫(Newcastle disease, ND) 是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起禽类的一种以呼吸困难、拉黄绿色稀便、神经机能紊乱和粘膜、浆膜出血为主要特征的高度接触性、急性败血性传染病。被国际兽疫局列为对动物危害最大的A类传染病之一，给养禽业造成了巨大经济损失。鸡新城疫由于ND发病率和死亡率都很高，是威胁养禽业的头号疾病，对该病的控制成功与否直接决定了养禽业的发展趋势。

[0003] NDV-HN基因编码的HN 蛋白在NDV致病过程中发挥着重要作用。HN蛋白即血凝素-神经氨酸酶蛋白，是NDV除F糖蛋白之外另一种较大的糖蛋白, 也为病毒的主要宿主保护性抗原。HN具有HA和NA两种活性，一是吸附细胞表面含唾液酸的受体；另一种是由NA催化裂解唾液酸受体，这两种活性在病毒侵染细胞过程中起着识别细胞受体、介导病毒吸附细胞膜的重要作用。HN 蛋白是诱导机体产生中和性抗体的主要病毒蛋白，在机体抗感染免疫中起着重要作用，用基因工程表达的HN 蛋白具有良好的免疫原性，免疫鸡后能产生较高水平的特异性抗体，对强毒攻击有很好的保护作用。

[0004] 在新城疫免疫预防中常规使用的疫苗主要有各种不同毒力的弱毒疫苗和油乳剂灭活疫苗。但传统新城疫灭活疫苗的共同特性是能诱导强烈的体液免疫应答，而细胞免疫反应则相对软弱。在新城疫的抗感染免疫中，抗体反应对于机体抵抗病毒的感染是必需的，但不能阻止病毒的传播。因而，近年来随着分子生物学技术的飞速发展，NDV基因工程疫苗的研制已成为人们研究的热点，但基因工程疫苗在诱导机体免疫反应方面还存在一些不尽如人意之处，动物保护实验效果不够理想。因此，研究者试图从多方面增强NDV疫苗的免疫效果，其中用细胞因子作为分子免疫佐剂，已引起研究者的关注。

[0005] 白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）是由T淋巴细胞分泌的一种淋巴因子，能促进T细胞、B细胞的增殖和分化，并可增强单核细胞以及NK细胞的杀伤活性，在免疫应答反应过程中起着重要的调节作用。研究发现，IL-2能特异性诱导机体细胞免疫，非特异作用于机体体液免疫，与抗原物质混合使用，可使机体提前产生免疫力，降低应激反应，减少免疫损害，延长有效抗体维持时间，是一种天然的免疫增强剂。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种具有良好免疫效果的chIL-2-HN融合蛋白。

[0007] 本发明的目的还在于提供一种编码该融合蛋白的DNA序列。

[0008] 本发明的目的还在于提供一种含该DNA序列的载体以及宿主细胞。

[0009] 本发明的目的还在于提供一种以毕赤酵母菌为宿主细胞的基因工程chIL-2-HN融合蛋白的制备方法。

[0010] 另外，本发明的目的还在于提供一种该融合蛋白在鸡新城疫防治中的应用。

[0011] 为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种chIL-2-HN融合蛋白，包括禽白细胞介素2（chIL-2）的氨基酸序列、新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶（HN 蛋白）的氨基酸序列、以及位于禽白细胞介素2氨基酸序列和新城疫病毒HN 蛋白的氨基酸序列之间的柔性Linker肽氨基酸序列；由禽白细胞介素2（chIL-2）基因和鸡新城疫病毒HN 基因通过柔性Linker肽（G-G-G-G-S）串联连接而成。

[0012] 该蛋白具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

[0013] 所述的柔性Linker肽具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

[0014] 同时，本发明的技术方案还采用了一种分离的DNA序列，编码具有序列为SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的融合蛋白。

[0015] 该DNA序列具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

[0016] 本发明的技术方案还采用了一种重组毕赤酵母载体和宿主细胞，它含有具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的DNA序列。

[0017] 重组融合蛋白在鸡新城疫预防和治疗中的应用。

[0018] 具体地：本发明的chIL-2-HN融合蛋白及其DNA序列如下：

[0019] chIL-2-HN融合蛋白基因是由禽IL-2基因和鸡新城疫病毒HN基因通过柔性Linker（G-G-G-G-S）基因串联而成连接，该串联DNA序列所编码的氨基酸序列即为chIL-2-HN融合蛋白。一方面，新城疫病毒HN蛋白能诱导机体产生高水平的特异性抗体，对强毒攻击有很好的保护作用。同时，白细胞介素-2能促进T细胞、B细胞的增殖和分化，能特异性诱导机体细胞免疫。二者通过柔性氨基酸肽连接，在保持独立的空间结构的同时能有效发挥各自的生物学功能。

[0020] 本发明还采用了一种能高效表达chIL-2-HN融合蛋白的基因工程菌的构建方法：

[0021] 为生产成本低的chIL-2-HN融合蛋白，须构建一种能生产chIL-2-HN融合蛋白的基因工程菌，本发明选用的基因工程菌是毕赤酵母X-33菌，重组的毕赤酵母X-33菌株，是通过同源重组技术，将chIL-2-HN融合蛋白的基因整合到毕赤酵母X-33菌基因组中，因此重组的毕赤酵母X-33菌株基因组中携带有chIL-2-HN融合蛋白的基因。

[0022] 本发明还采用了一种可溶性的重组chIL-2-HN融合蛋白的制备方法：

[0023] 选用毕赤酵母表达系统，在BMMY培养基中，重组的毕赤酵母X-33菌，在甲醇诱导下能高效表达chIL-2-HN融合蛋白；收集培养液上清经Ni柱亲和层析纯化后，收集穿透峰，冷冻干燥，可得到纯度极高的重组chIL-2-HN融合蛋白。

[0024] 本发明将重组chIL-2-HN融合蛋白免疫鸡。通过对免疫鸡的NDV-HN抗体和抗体亚型、脾淋巴细胞增殖、血清中IL-4 和IFN-γ 的测定以及动物攻毒保护实验。评价重组chIL-2-HN的免疫特性。

[0025] 本发明的重组chIL-2-HN融合蛋白的制备方法，其生产包括以下步骤：

[0026] （a）获得编码chIL-2-HN融合蛋白的基因序列；

[0027] ① 获得禽IL-2基因序列：

[0028] 根据GenBank中禽IL-2的核苷酸序列（收录号：AY029588），利用DNA Star、primer premier 软件设计2条引物片段F1、F2扩增禽IL-2基因。引物由大连宝生物工程公司合成。引物F1 5’端引入Kpn I内切酶位点，F2 5’端引入柔性接头。

[0029] 引物序列如下：

[0030] F1: SEQ ID NO.1；

[0031] 5’-CGGGTACCATGTGCAAAGTACTGATCTTTGGC-3’

[0032] F2: SEQ ID NO.2；

[0033] 5’-GCTGCCGCCGCCGCCTTTTTGCAGATATCTCAC-3’

[0034] 将NDV-I 系疫苗做50 倍稀释，通过尿囊腔接种于10 日龄鸡胚，0. 2 mL/ 枚，37 ℃继续孵化。于接种后48-72 h 取出未死的鸡胚，取脾脏无菌研碎，并按试剂盒的要求立即进行总mRNA 的提取和扩增。以鸡胚脾脏总mRNA为模板，RT-PCR 扩增鸡IL-2 基因。按RT-PCR 试剂盒的要求，在50 μL 反应体系中分别加入10 ×buffer 5μL ，MgCl2 10 μL ， dNTP混合物5μL ，RNA 酶抑制剂1μL，反转录酶1μL，Taq 酶1 μL，上、下游引物F1和F2 各2 μL ，模板5 μL ，无RNA 酶水18 μL 。50 ℃ 30 min 反转录， 94 ℃2 min灭活反转录酶。采用降落PCR 进行扩增，参数为：94 ℃ 50 s，58 ℃ 45 s ，72 ℃100 s，循环6 次，94 ℃ 50 s，56 ℃ 50 s ，72 ℃ 100 s，循环27 次，72 ℃延伸10 min。扩增的 PCR产物经含有溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒（大连TaKaRa公司）使用说明进行回收即为禽IL-2基因片段；

[0035] ② 获得新城疫病毒HN基因

[0036] 根据GenBank中新城疫病毒HN基因的核苷酸序列（收录号：GU573799.1），利用DNA Star、primer premier 软件设计2条引物片段F3、F4扩增新城疫病毒HN基因，引物F3 5’端引入柔性接头，F4 5’端引入Not I内切酶位点。引物序列如下：

[0037] F3: SEQ.ID.NO.3；

[0038] 5’- GGCGGCGGCGGCAGCATGGACCGTGTAGTTAGC-3’

[0039] F4: SEQ.ID.NO.4；

[0040] 5’-TAGCGGCCGCAACTCTATCATCCTTGAGGATCTCAAC-3’

[0041] 将冻存的NDV 毒株经37 ℃水浴融化后通过尿囊腔途径接种9～10 日龄非免疫鸡胚( 每个胚0. 2 mL)，37 ℃孵化。24 h 内死亡的鸡胚弃去，无菌收集24～48h 死亡鸡胚的尿囊液(有红细胞或卵黄使尿囊液变浑浊的鸡胚液弃去)，经反复冻融3 次后、8 000r/ min 4 ℃离心15 min ，取上清液，20 ℃保存待用。病毒RNA 的提取按照大连宝生物工程有限公司RNA 提取试剂盒说明进行操作。以提取的总RNA 4 μL 为模板，加入MgCl2 3 μL 10 ×反转录buffer 2.5 μL，dNTP Mixture (10 mmol/L) 2.5 μL ，Rnase Inhititor 0.5μL (20U) ，RT 酶0.5 μL ，Taq 酶0.5 μL ，引物F3 1 μL , 引物F4
1 μL ，灭菌dH2O 9.5μL,总体系25 μL 。按以下反应条件进行RT -PCR 反应: 50 ℃
40 s , 94 ℃ 2 min , 94 ℃ 60 s , 55 ℃60 s，72 ℃ 2 min 11 个循环；94 ℃ 60 s，
53 ℃ 60 s ，72 ℃ 2 min 12 个循环；94 ℃ 60 s ，51 ℃ 60s ，72 ℃ 2min 10个循环；
72 ℃ 10 min 。PCR产物经含有溴化乙锭1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒使用说明进行回收即为新城疫病毒HN基因；

[0042] ③ 重叠PCR扩增chIL-2-HN融合蛋白的基因序列

[0043] 以上述①②获得的禽IL-2基因和新城疫病毒HN基因为模板，利用F1和F4引物，通过重叠PCR方法扩增chIL-2-HN融合基因。

[0044] PCR反应体系50μl:10×PCR Buffer，5μL，MgCl2，3μL ；dNTP，10mmol/L，1μL；禽IL-2基因和新城疫病毒HN基因做为模板各加入5μL，引物F1和引物 F4，终浓度为
20pmol/L各2μL；TaKaRa ExTaq 0.5μL；灭菌超纯水，34.5μL；

[0045] PCR反应条件：94℃预变性2min，进入PCR循环：94℃30s，退火温度从55℃，每循环1min，共30个循环；72℃延伸10min， PCR产物经含有溴化乙锭1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒使用说明进行回收即为chIL-2-HN融合基因；

[0046] （b）将步骤（a）获得的chIL-2-HN融合蛋白的基因序列，插入到毕赤酵母载体pPICZαA中，得到重组表达的毕赤酵母载体，命名为pPICZαA-chIL-2-HN；

[0047] （c）高效表达chIL-2-HN融合蛋白的基因工程菌株的构建

[0048] 将上述chIL-2-HN融合基因PCR产物和毕赤酵母表达载体pPICZαA均用Kpn Ⅰ、Not I双酶切，T4 DNA Ligase连接，连接产物转化E.coli DH5α，重组表达质粒进行KpnⅠ和Not I双酶切鉴定；酶切和PCR鉴定为阳性的质粒测序，命名为pPICZαA-chIL-2-HN；采用电转化法，将重组质粒pPICZαA-chIL-2-HN转化进入毕赤酵母菌X-33中，通过高抗性筛选和PCR鉴定，获得表达重组融合蛋白的基因工程毕赤酵母X-33菌株；

[0049] （d）获得可溶性的chIL-2-HN融合蛋白

[0050] 将上述筛选到携带有chIL-2-HN融合蛋白基因的重组毕赤酵母X-33菌接种到5 mL BMGY中，30℃ 230r/min振荡培养约22 h至OD600达到3~6；室温3000r/min离心2 min， 收集菌体重悬于25 mL BMMY培养基，进行诱导表达28℃，250r/min培养60 h，期间每24 h补加终浓度为1%的甲醇；72 h后，5000r/min离心10 min收集培养液上清，即为获得的chIL-2-HN融合蛋白。

[0051] 本发明的重组 chIL-2-HN融合蛋白能有效增强机体的体液和细胞免疫应答，本发明应用重组的chIL-2-HN融合蛋白免疫鸡，抗体亚型测定结果显示，chIL-2-HN融合蛋白免疫组鸡体能产生一个平衡的IgG1和IgG2a抗体反应。细胞因子ELISA试验结果表明融合蛋白免疫组主要刺激Th1分化（FNI -g），但也能刺激Th2(IL-4) 的分化。

[0052] 新城疫病毒强毒攻毒试验表明：chIL-2-HN融合蛋白能明显提高机体的攻毒保护率，说明重组的chIL-2-HN融合蛋白能有效增强机体的体液和细胞免疫应答。

[0053] 本发明易于实现大量生产：本发明重组的 chIL-2-HN融合蛋白在生产时选择毕赤酵母表达系统，其优点在于技术简单，成本低，产量高，能大规模发酵，易于实现大量生产。

[0054] 本发明设计开发的chIL-2-HN融合蛋白，不仅具有免疫鸡后能产生较高水平的特异性抗体，对强毒攻击有很好的保护作用；另外也具有白细胞介素-2的细胞因子免疫佐剂作用。本发明为制备重组chIL-2-HN融合蛋白提供了切实可行的技术路线，按本方法制备的chIL-2-HN融合蛋白可作为新城疫新型基因工程疫苗，也可作为新城疫常规疫苗的新型免疫佐剂，在鸡新城疫预防和治疗中具有广阔的应用前景。

附图说明

[0055] 图1重组质粒pPICZαA-chiIL2- HN酶切及PCR鉴定；

[0056] Lane 1-2.阴性对照；Lane3. PCR扩增产物；4. KpnI/NotI 双酶切产物; Lane M. λDNA/EcoR I+Hind III marker

[0057] 图2 转化子基因组DNA的PCR鉴定；

[0058] Lane 1.阴性对照；Lane 2.X-33 PCR 扩增产物；Lane 3.X-33/pPICZαA PCR 扩增产物；Lane 4.X-33/pPICZαA-chiIL2-HN PCR 扩增产物

[0059] 图3 重组酵母发酵上清中表达产物的SDS-PAGE分析；

[0060] Lane 1.X-33/pPICZαA；Lane 2-6.X-33/pPICZαA-chiIL2-HN 在 0、24、 48、72、96 h 发酵液上清；Lane M.低分子量蛋白Marke

[0061] 图4重组酵母发酵上清液中表达产物Western blot分析；

[0062] Lane 1.X-33/pPICZαA；Lane 2-6 X-33pPICZαA-IL2- IL2-HN 在0、24、48、72、96 h 诱导上清；Lane M.预染低分子量蛋白Marker

[0063] 图5a、图5b、图5c为NDV-HN抗体和抗体亚型分析；

[0064] 图6 免疫重组蛋白后的淋巴细胞增值情况；

[0065] 图7 细胞因子检测。

[0066] 具体实施方式：

[0067] 实施例1

[0068] 获得编码chIL-2-HN融合蛋白的基因序列：

[0069] 根据GenBank中禽IL-2的核苷酸序列（收录号：AY029588），利用DNA Star、primer premier 软件设计2条引物片段F1、F2扩增禽IL-2基因。引物由大连宝生物工程公司合成。引物F1 5’端引入Kpn I内切酶位点，F2 5’端引入柔性接头。引物序列如下：

[0070] F1: SEQ ID NO.1；

[0071] 5’-CGGGTACCATGTGCAAAGTACTGATCTTTGGC-3’

[0072] F2: SEQ ID NO.2；

[0073] 5’-GCTGCCGCCGCCGCCTTTTTGCAGATATCTCAC-3’

[0074] 将NDV-I 系疫苗做50 倍稀释，通过尿囊腔接种于10 日龄鸡胚，0. 2 mL/ 枚，37 ℃继续孵化。于接种后48-72 h 取出未死的鸡胚，取脾脏无菌研碎，并按试剂盒的要求立即进行总mRNA 的提取和扩增。以鸡胚脾脏总mRNA为模板，RT-PCR 扩增鸡IL-2 基因。按RT-PCR 试剂盒的要求，在50 μL 反应体系中分别加入10 ×buffer 5μL ，MgCl2 10 μL ， dNTP混合物5μL ，RNA 酶抑制剂1μL，反转录酶1μL，Taq 酶1 μL，上、下游引物F1和F2 各2 μL ，模板5 μL ，无RNA 酶水18 μL 。50 ℃ 30 min 反转录， 94 ℃2 min灭活反转录酶。采用降落PCR 进行扩增，参数为：94 ℃ 50 s，58 ℃ 45 s ，72 ℃100 s，循环6 次，94 ℃ 50 s，56 ℃ 50 s ，72 ℃ 100 s，循环27 次，72 ℃延伸10 min。扩增的 PCR产物经含有溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒（大连TaKaRa公司）使用说明进行回收即为禽IL-2基因片段。

[0075] 根据GenBank中新城疫病毒HN基因的核苷酸序列（收录号：GU573799.1），利用DNA Star、primer premier 软件设计2条引物片段F3、F4扩增新城疫病毒HN基因，引物F3 5’端引入柔性接头，F4 5’端引入Not I内切酶位点。引物序列如下：

[0076] F3: SEQ.ID.NO.3；

[0077] 5’- GGCGGCGGCGGCAGCATGGACCGTGTAGTTAGC-3’

[0078] F4: SEQ.ID.NO.4；

[0079] 5’-TAGCGGCCGCAACTCTATCATCCTTGAGGATCTCAAC-3’

[0080] 将冻存的NDV 毒株经37 ℃水浴融化后通过尿囊腔途径接种9～10 日龄非免疫鸡胚( 每个胚0. 2 mL)，37 ℃孵化。24 h 内死亡的鸡胚弃去，无菌收集24～48h 死亡鸡胚的尿囊液(有红细胞或卵黄使尿囊液变浑浊的鸡胚液弃去)，经反复冻融3 次后、8 000r/ min 4 ℃离心15 min ，取上清液，20 ℃保存待用。病毒RNA 的提取按照大连宝生物工程有限公司RNA 提取试剂盒说明进行操作。以提取的总RNA 4 μL 为模板，加入MgCl2 3 μL 10 ×反转录buffer 2.5 μL，dNTP Mixture (10 mmol/L) 2.5 μL ，Rnase Inhititor 0.5μL (20U) ，RT 酶0.5 μL ，Taq 酶0.5 μL ，引物F3 1 μL , 引物F4
1 μL ，灭菌dH2O 9.5μL,总体系25 μL 。按以下反应条件进行RT -PCR 反应: 50 ℃
40 s , 94 ℃ 2 min , 94 ℃ 60 s , 55 ℃60 s，72 ℃ 2 min 11 个循环；94 ℃ 60 s，
53 ℃ 60 s ，72 ℃ 2 min 12 个循环；94 ℃ 60 s ，51 ℃ 60s ，72 ℃ 2min 10个循环；
72 ℃ 10 min 。PCR产物经含有溴化乙锭1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒使用说明进行回收即为新城疫病毒HN基因。

[0081] 以上述获得的禽IL-2基因和新城疫病毒HN基因为模板，利用F1和F4引物，通过重叠PCR方法扩增chIL-2-HN融合基因。

[0082] PCR反应体系50μl:10×PCR Buffer，5μL，MgCl2，3μL ；dNTP，10mmol/L，1μL；禽IL-2基因和新城疫病毒HN基因做为模板各加入5μL， 引物F1和引物 F4，终浓度为
20pmol/L各2μL；TaKaRa ExTaq 0.5μL；灭菌超纯水，34.5μL；

[0083] PCR反应条件：94℃预变性2min，进入PCR循环：94℃30s，退火温度从55℃，每循环1min，共30个循环；72℃延伸10min， PCR产物经含有溴化乙锭1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒使用说明进行回收即为chIL-2-HN融合基因。（SEQ.ID.NO.5）。

[0084] 实施例2

[0085] chIL-2-HN融合基因重组酵母表达载体的构建

[0086] 用Kpn I、Not I内切酶对上述chIL-2-HN融合基因PCR产物和毕赤酵母表达载体pPICZαA进行双酶切，并置于37 ℃水浴作用2 h，酶切产物同样经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行回收鉴定。经过酶切的chIL-2-HN融合基因和毕赤酵母表达载体pPICZαA按1：3的摩尔比4℃过夜连接。取连接产物加入含有100 μL感受态DH5α的聚丙烯离心管中，轻轻混匀后冰浴30 min。将聚丙烯离心管从冰中取出后42 ℃热休克90 sec，然后立即冰浴2 min。加入800 μL 37 ℃预热的LB培养基，于37℃振摇（100～150 rpm）45 min。取100 μL菌液均匀涂布含氨苄青霉素(Amp) 50 μg/mL的琼脂LB平板，在37 ℃正置20 min后，倒置培养16~20 h。按《分子克隆实验指南》上的碱裂解法提取质粒。
对提取质粒进行Kpn Ⅰ和Not I双酶切鉴定。以酶切出现2000bp左右大小DNA片段的质粒为阳性质粒（图1）。并将阳性质粒命名为pPICZαA-chIL-2-HN。送上海Invitrongen公司测序。

[0087] 实施例3

[0088] 表达chIL-2-HN融合蛋白的基因工程菌株的构建：

[0089] 取实施例2得到的阳性的重组酵母表达载体pPICZαA-chIL-2-HN进行SacI线性化，线性化的重组表达载体pPICZαA-chIL-2-HN 5 μg与80 μL感受态毕赤酵母菌X-33相混合，转移至预冷的0.2 cm电转杯，置冰上5 min，1.5 kV、25 μF、200 Ω电击，立即加入1 mL预冷的1 mol/L山梨醇，取200 μL涂布于YPDS平板上，30℃培养至单菌落出现；详细步骤参照Pichia Expression Kit；采用PCR方法分析毕赤酵母转化子，用煮--冻--煮法制备PCR模板，用引物F1和F4：反应体系同上，PCR反应条件：94℃5 min；94℃ 45 s，
48℃45 s，72℃ 45 s，25个循环；72℃ 6 min；鉴定扩增出大小约为2200 bp的克隆定为毕赤酵母阳性转化子（图2），即为表达chIL-2-HN融合蛋白的基因工程毕赤酵母X-33菌株。

[0090] 实施例4

[0091] 重组chIL-2-HN融合蛋白的诱导表达：

[0092] 将筛选到携带有chIL-2-HN融合蛋白基因的重组毕赤酵母菌X-33菌接种到5mL BMGY中，30℃230r/min振荡培养约22 h至OD600达到3~6；室温3000r/min离心2 min， 收集菌体重悬于25 mL BMMY培养基，进行诱导表达28℃，250 r/min培养60 h，期间每24 h补加终浓度为1%的甲醇；72 h后，5000r/min离心10min收集培养液上清，即为获得的chIL-2-HN融合蛋白。chIL-2-HN融合蛋白的分子量可通过SDS-PAGE电泳凝胶鉴定，具体步骤如下：

[0093] 将收集的上述培养液上清100 μL，加等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液（100 mmol/L Tris·Cl(pH6.8)；200 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)；4% SDS(电泳级)；0.2 %溴酚蓝；20%甘油），100 ℃煮沸5 min以使蛋白质变形，取10 μL加样进行SDS-PAGE凝胶电泳，SDS-PAGE电泳凝胶的配制及电泳条件参照分子克隆手册。将电泳胶制备好后，向电泳槽内倒入Tris-甘氨酸电泳缓冲液（25 mmol/L Tris；250 mmol/L甘氨酸(电泳级)(pH8.3)；0.1% SDS），加样结束后接通电源。电源负极端接上槽，正极端接下槽。在浓缩胶中电压为
80 V，进入分离胶中电压调整为120 V。直到样品到达分离胶底部后关闭电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝染色1 h，随后在脱色摇床上脱色1-2 h，观察结果。重组的chIL-2-HN融合蛋白分子量约100 KDa（图3）。同时用NDV阳性血清作为一抗进行Western-blot试验，重组毕赤酵母菌X-33菌的培养液上清上样的泳道有一条特异性目的条带，而阴性对照毕赤酵母菌X-33菌的培养液上清的上样泳道没有出现条带（图4），结果表明，重组chIL-2-HN融合蛋白得到了成功表达，并且具有很好的免疫原性。

[0094] 实施例5

[0095] 重组chIL-2-HN融合蛋白的应用：

[0096] 1）动物免疫

[0097] 用上述重组chIL-2-HN融合蛋白免疫鸡，评价其免疫特性。将20日龄的健康雏鸡200只随机分成5组，40只/组。第一组为阴性对照，免疫200 μL PBS；第二组,第三组，第四组分别免疫200 ppm的r IL-2，r HN，r IL-2-HN重组蛋白（用200 μL PBS稀释）。采用胸部肌肉注射方式进行免疫。第五组为鸡新城疫Ⅰ系疫苗对照，采用滴鼻、点眼的途径免疫200 μL；所有组间隔两周免疫一次，共免疫三次。并分别于免疫接种后第7天、14天、21天、28天、35天时各随机抽取5只心脏采血，分离血清。同时，无菌采取各试验鸡的胸腺以供进行淋巴细胞增殖试验用。同时于最后一次免疫后一周，取各组试验鸡15 只应用F48E9标准强毒进行攻击（1000 ELD50/只），攻毒后连续观察7天，记录各组试验鸡的发病、死亡情况。

[0098] 2）新城疫病毒HN抗体和抗体亚型检测

[0099] 通过ELISA检测每组免疫后NDV-HN IgG抗体的产生，发现免疫组在首免1周后就能检测到IgG抗体反应。在第二次加强免疫后抗体产生不断增加。相对于IgG水平，rHN免疫组在首免和第一次加强免疫时要略低于NDV Vaccine免疫组，但在第二次加强免疫后，两者差异不明显（p>0.05）。相对于IgG1水平和IgG2a抗体反应，IgG1抗体是r HN免疫组鸡的主要的抗体亚型，而IgG2a抗体是NDV Vaccine免疫组鸡的主要的抗体亚型，然而，使用chIL-2-HN融合蛋白免疫组鸡能产生一个平衡的IgG1和IgG2a抗体反应。特别是在第二次加强免疫后，观察到占优势的IgG1和IgG2a抗体的水平，表明IL-2能有助于调节Th1类型免疫反应（图5a、图5b、图5c）。

[0100] 3）四甲基偶氮唑蓝法（MTT）分析

[0101] 从第一次免疫后第1、3、5周每周无菌采取各试验鸡的胸腺，检测胸腺T淋巴细胞的增殖情况。结果显示在第5周时chIL-2-HN 融合蛋白免疫组诱导胸腺T淋巴细胞增殖能力最强，其它组依次为rIL-2免疫组、NDV Vaccine免疫组、r HN免疫组和PBS对照组。r IL-2免疫组在第1周和第3周诱导胸腺T淋巴细胞增殖能力低于NDV Vaccine免疫组，但在第5周明显高于NDV Vaccine免疫组，差异显著（p<0.05）（图6）。

[0102] 4）血清中IL-4 和IFN-γ 的测定

[0103] 应用定量ELISA对血清中的IL-4和IFN-γ进行定量分析发现chIL-2-HN 融合蛋白免疫组诱导IL-4和IFN-γ的分泌在各免疫组最强，差异极显著（p<0.01）。其次是rIL-2免疫组，NDV Vaccine免疫组和r HN免疫组主要诱导IL-4的分泌。其诱导两种细胞因子的分泌水平明显低于rIL-2免疫组，差异显著（p<0.05）（图7）。

[0104] 5）攻毒试验结果

[0105] 在免疫接种后第35天时，对各免疫组剩余鸡取15只应用F48E9强毒攻击。结果如表1所示，r HN免疫组15只试验鸡在7天观察期内有5只发病，保护率仅为66.7 %，其中2只死亡；而NDV vaccine免疫组发病1只，保护率为93.3 %。chIL-2-HN 融合蛋白免疫组 15只试验鸡在7天观察期内仅有2只发病，保护率达86.7 %（表1）。

[0106]

[0107] 最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明,而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明。本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

[0108] 序列表

[0109] <110> 河南科技大学

[0110] <120> 禽IL-2与新城疫病毒HN基因重组融合蛋白及其应用

[0111] <170> patentin version 3.3

[0112] <210> 1

[0113] <211> 32

[0114] <212> DNA

[0115] <213>人工合成

[0116] <223> 引物F1

[0117] <400> 1

[0118] cgggtaccat gtgcaaagta ctgatctttg gc 32 [0119] <210> 2

[0120] <211> 33

[0121] <212> DNA

[0122] <213>人工合成

[0123] <223> 引物F2

[0124] <400> 2

[0125] gctgccgccg ccgccttttt gcagatatct cac 33[0126] <210> 3

[0127] <211> 33

[0128] <212> DNA

[0129] <213>人工合成

[0130] <223> 引物F3

[0131] <400> 3

[0132] ggcggcggcg gcagcatgga ccgtgtagtt agc 33[0133] <210> 4

[0134] <211> 37

[0135] <212> DNA

[0136] <213>人工合成

[0137] <223> 引物F4

[0138] <400> 4

[0139] tagcggccgc aactctatca tccttgagga tctcaac 37[0140] <210> 5

[0141] <211> 2154

[0142] <212> DNA

[0143] <221> chIL-2-HN融合蛋白的基因

[0144] <400> 5

[0145] atgtgcaaag tactgatctt tggctgtatt tcggtagcaa tgctaatgac tacagcttat 60[0146] ggagcatctc tatcatcagc aaaaaggaaa cctcttcaaa cattaataaa ggatttagaa 120[0147] atattggaaa atatcaagaa caagattcat ctcgagctct acacaccaac tgagacccag 180[0148] gagtgcaccc agcaaactct gcagtgttac ctgggagaag tggttactct gaagaaagaa 240[0149] actgaagatg acactgaaat taaagaagaa tttgtaactg ctattcaaaa tatcgaaaag 300[0150] aacctcaaga gtcttacggg tctaaatcac accggaagtg aatgcaagat ctgtgaagct 360[0151] aacaacaaga aaaaatttcc tgattttctc catgaactga ccaactttgt gagatatctg 420[0152] caaaaaggcg gcggcggcag catggaccgt gtagttagca gagtcgtgct ggagaatgag 480[0153] gaaagagaag caaagaacac atggcgcctg gttttccgga tcgcagtctt acttttaatg 540[0154] gtaatgactc tagctatctc cgcagctgcc ctggcatata gcacgggggc cagtacgccg 600[0155] catgacctcg caggcatatc gactgtgatc tccaagacag aagataaggt tacgtcttta 660[0156] ctcagttcaa gtcaagatgt gatagatagg atatacaagc aggtggctct tgaatccccg 720[0157] ctggcgctac taaacactga atctataatt atgaatgcaa taacctctct ttcttatcaa 780[0158] attaacgggg ctgagaacaa tagcggatgt ggtgcgcctg ttcatgaccc agattatatc 840[0159] ggggggatag gcaaagaact catagtggac gacaccagtg atgtcacatc attttatcct 900[0160] tctgcatatc aagaacactt gaatttcatc ccggcgccca ccacaggatc cggttgcact 960[0161] cggataccct catttgacat gagcgccacc cattattgtt atactcacaa tgtgatacta 1020[0162] tccggttgca gagatcactc acactcacat caatacttag cacttggtgt gcttcggaca 1080[0163] tctgcaacag ggagggtatt cttttctact ctgcgctcca tcaatttaga tgacacccaa 1140[0164] aatcggaagt cctgcagtgt gagtgcaacc cctttaggtt gtgatatgct gtgctctaag 1200[0165] gtcacaggga ctgaagagga ggattacaag tcaattgccc ccacatcaat ggtgcacgga 1260[0166] aggctagggt ttgacggtca ataccatgag aaggacttag acaccacggt cttatttaaa 1320[0167] gattgggtgg caaattaccc gggagtggga ggagggtctt ttattgacga ccgtgtatgg 1380[0168] ttcccagttt acggagggct caaacccaat tcacccagtg acactgcaca agaagggaaa 1440[0169] tatgtaatat acaagcgcca taacaacacc tgccccgatg aacaagatta ccaaattcgg 1500[0170] atggctaagt cttcatataa acccgggcga tttggtggaa agcgcgtaca gcaagccatc 1560[0171] ctatccatca aagtgtcaac atccctgggt aaggacccgg tgctgactat tccacctaat 1620[0172] acaatcacac tcatgggagc cgaaggcaga atcctcacag tagggacatc tcacttcttg 1680[0173] taccaacgag ggtcttccta tttctcccct gccttattat atcccatgac agtaaataac 1740[0174] aaaacggcta cactccatag tccttacacg tttaatgctt tcactcggcc aggtagtgtc 1800[0175] ccttgccagg catcagcaag atgccccaac tcatgcatca ctggggtcta taccgatcca 1860[0176] tatcccttaa tcttccatag gaatcatact ctacgagggg tcttcgggac gatgcttgat 1920[0177] gatgagcaag cgaggcttaa ccccgtatct gcggtattcg acaacatatc tcgcagtcgt 1980[0178] gtcactcggg tgagttcaag cagcaccaag gcagcataca cgacatcgac atgttttaaa 2040[0179] gttgtcaaga ccaataaagc ttattgtctt agtatcgcag aaatatccaa taccctattc 2100[0180] ggggaattca ggatcgttcc cttattagtt gagatcctca aggatgatag agtt 2154[0181] <210> 6

[0182] <211> 5

[0183] <212> PRT

[0184] <221> 柔性Linker肽

[0185] <400> 6

[0186] ggggs 5

[0187] <210> 7

[0188] <211> 718

[0189] <212> PRT

[0190] <221> chIL-2-HN融合蛋白

[0191] <400> 7

[0192] mckvlifgci svamlmttay gaslssakrk plqtlikdle ileniknkih lelytptetq 60[0193] ectqqtlqcy lgevvtlkke teddteikee fvtaiqniek nlksltglnh tgseckicea 120[0194] nnkkkfpdfl heltnfvryl qkggggsmdr vvsrvvlene ereakntwrl vfriavlllm 180[0195] vmtlaisaaa laystgastp hdlagistvi sktedkvtsl lsssqdvidr iykqvalesp 240[0196] lallntesii mnaitslsyq ingaennsgc gapvhdpdyi ggigkelivd dtsdvtsfyp 300[0197] sayqehlnfi papttgsgct ripsfdmsat hycythnvil sgcrdhshsh qylalgvlrt 360[0198] satgrvffst lrsinlddtq nrkscsvsat plgcdmlcsk vtgteeedyk siaptsmvhg 420[0199] rlgfdgqyhe kdldttvlfk dwvanypgvg ggsfiddrvw fpvygglkpn spsdtaqegk 480[0200] yviykrhnnt cpdeqdyqir makssykpgr fggkrvqqai lsikvstslg kdpvltippn 540[0201] titlmgaegr iltvgtshfl yqrgssyfsp allypmtvnn ktatlhspyt fnaftrpgsv 600[0202] pcqasarcpn scitgvytdp yplifhrnht lrgvfgtmld deqarlnpvs avfdnisrsr 660[0203] vtrvsssstk aayttstcfk vvktnkaycl siaeisntlf gefrivpllv eilkddrv 718