一种抗寄生虫的化合物及其制备方法

摘要

本发明的目的在于提供一种高活性、药效持久的抗寄生虫的化合物及其制备方法。所述的抗寄生虫的化合物，分子式为：C36H50O7；所述的抗寄生虫的化合物的制备方法包括培养基的制备、平板及斜面培养、种子培养、摇瓶发酵、分离和提纯化合物、硅胶层析。所述的化合物为具有抗动物体内外寄生虫及其虫卵活性的新化合物1，与莫西菌素相比，相同实验环境和剂量下，即以200μg/kg，莫西菌素对抑制猪体内线虫感染为35天，对虫卵再出现为80天。本发明所得到的新化合物比目前市售的抗寄生虫类药物莫西菌素有更强的抗多种寄生虫的活性。

权利要求

1.一种抗寄生虫的化合物，其特征在于：分子式为：C36H50O7；结构式为：

2.一种根据权利要求1的抗寄生虫的化合物的制备方法，其特征在于：步骤如下：

步骤一：培养基的制备：平板及斜面培养：培养基的组成为：葡萄糖10g/L，麦芽糖3g/L，酵母抽提粉3g/L，K2HPO4·3H2O0.5g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl0.5g/L，KNO31g/L，微量元素溶液5g/L，pH7.0～7.2，使用去离子水配制，微量元素溶液为：MgSO4·7H2O80g/L，CaCO310g/L，FeCl36g/L，ZnSO42g/L，MnSO42g/L，CuSO40.5g/L，CoCl20.4g/L，用去离子水定容，置于28℃的培养箱中，相对湿度40～60％，培养9d；

步骤二：种子培养：种子培养基组成为：葡萄糖5g/L，麦芽糊精20g/L，可溶性淀粉1g/L，酵母膏10g/L，牛肉膏1g/L，酪蛋白胨1g/L，pH7.0～7.2，使用自来水配制；将成熟斜面上的孢子用灭菌后的接种铲挖块接种于种子培养摇瓶中，挖块大小为1×0.5cm，种子摇瓶装液量25ml/250ml，于28℃，250rpm旋转式摇床上培养48h；

步骤三：摇瓶发酵：发酵培养基组成为：葡萄糖10g/L，乳糖25g/L，棉籽饼粉25g/L，CaCO33g/L；pH7.0～7.2，使用自来水配制；将种子液以8％的移种量接入发酵摇瓶中，发酵摇瓶装液量为25ml/250ml三角烧瓶，于28℃，250rpm旋转式摇床上培养9d；

步骤四：分离和提纯化合物：发酵液经100～200目筛网过滤后，滤渣用甲醇提取，提取液浓缩至一定体积后用EtOAc萃取，将EtOAc萃取液浓缩后依次进行硅胶柱层析，RP-18柱层析所得到的化合物，得到无色的粉末状化合物；

步骤五：硅胶层析：其所用到的填料是200-300目的硅胶，流动相为石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1-5∶5(V/V)两种洗脱液混合进行梯度洗脱,其中RP-18柱层析使用混合溶剂，甲醇与水＝80∶20-95∶5(V/V)的溶液进行梯度洗脱的。

说明书

一种抗寄生虫的化合物及其制备方法

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及生物科学，具体说就是一种抗寄生虫的化合物及其制备方法。 (二)背景技术

[0002] 放线菌是自然界分布最广泛的微生物类群之一，而链霉菌(Streptomyces)是放线菌中最大的一个类群，也是抗生素的重要产生菌。目前，包括出现在专利中的种已经超过3000个，至1996年有效描述的种有464个和亚种45个。据统计，链霉菌产生的抗生素占抗生素的70％左右。占放线菌产生抗生素的90％以上。而目前我国发现的农用抗生素，无论是大面积应用还是局部地区商品化产品，或是有较大应用潜力的农用抗生素产生菌均为链霉菌。尼莫克汀(Nemadectin)(图一)由蓝灰链霉菌Streptomyces cyaneogriseussp.noncyanogenus发酵产生，是十六元大环内酯化合物，属于米尔贝霉素族(Milbemycin)抗生素。以尼莫克汀为基础半化学合成的莫西克汀(Moxidectin)(图二)在C-23位引入＝N-OCH3基团，亲脂性更强。莫西克汀同伊维菌素(Ivermectin)的作用机制基本相似，但比伊维菌素具有更高的活性。莫西克汀可用于抗多种体内外寄生虫，其中内寄生虫主要是线虫，外寄生虫有螨、蜱和蚤类。它抗寄生虫的特点是：作用强烈，用药量少，并且对人安全、无毒害、不污染环境，只杀害虫，不杀害虫天敌，也不易产生抗药性，可以作为防治该类药物产生抗性的复配及轮换用药，是目前最有前途的广谱、高效、新型、抗虫、无交叉感染的生物杀虫剂，被誉为当今活性最高的杀虫剂之一，是目前最有前途的抗虫抗生素。
(三)发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种高活性、药效持久的抗寄生虫的化合物及其制备方法。

[0004] 本发明的目的是这样实现的：所述的抗寄生虫的化合物，分子式为：C36H50O7； [0005] 结构式为：

[0006]

[0007] 所述的抗寄生虫的化合物的制备方法，步骤如下：

[0008] 步骤一：培养基的制备：平板及斜面培养：培养基的组成(g/L)：葡萄糖10，麦芽糖3，酵母抽提粉3，K2HPO4·3H2O 0.5，MgSO4·7H2O0.5，NaCl 0.5，KNO3 1，微量元素溶液5，pH 7.0～7.2，使用去离子水配制，微量元素溶液(g/L)：MgSO4·7H2O 80，CaCO3 10，FeCl36，ZnSO4 2，MnSO4 2，CuSO4 0.5，CoCl2 0.4，用去离子水定容，置于28℃的培养箱中，相对湿度40～60％，培养9d；

[0009] 步骤二：种子培养：种子培养基组成(g/L)：葡萄糖5，麦芽糊精20，可溶性淀粉1，酵母膏10，牛肉膏1，酪蛋白胨1，pH 7.0～7.2，使用自来水配制；将成熟斜面上的孢子用灭菌后的接种铲挖块接种于种子培养摇瓶中(挖块大小约1×0.5cm)，种子摇瓶装液量
25ml/250ml，于28℃，250rpm旋转式摇床上培养48h；

[0010] 步骤三：摇瓶发酵：发酵培养基组成(g/L)：葡萄糖10，乳糖25，棉籽饼粉25，CaCO33；pH 7.0～7.2，使用自来水配制；将种子液按8％的移种量接入发酵摇瓶中，发酵摇瓶装液量为25ml/250ml三角烧瓶，于28℃，250rpm旋转式摇床上培养9d；

[0011] 步骤四：分离和提纯化合物：发酵液经100～200目筛网过滤后，滤渣用甲醇提取，提取液浓缩至一定体积后用EtOAc萃取，将萃取夜浓缩后依次进行硅胶柱层析，RP-18柱层析所得到的化合物，得到无色的粉末状化合物。

[0012] 步骤五：硅胶层析：其所用到的填料是200-300目的硅胶，流动相为石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1-5∶5(V/V)两种洗脱液混合进行梯度洗脱。其中RP-18柱层析使用混合溶剂，甲醇与水＝80∶20-95∶5(V/V)的溶液进行梯度洗脱的。

[0013] 本发明抗寄生虫的化合物及其制备方法，所述的化合物为具有抗动物体内外寄生虫及其虫卵活性的新化合物1，以200μg/kg的计量下能够有效驱杀猪体内线虫和体外血虱。对抑制线虫感染长达42d，对虫卵再出现抑制长达85d。与莫西菌素相比，相同实验环境和剂量下，即以200μg/kg，莫西菌素对抑制猪体内线虫感染为35d，对虫卵再出现为80d。因此得出结论，本发明所得到的新化合物有比目前市售的抗寄生虫类药物莫西菌素有更强的抗多种寄生虫的活性。

[0014] (四)附图说明

[0015] 图1为本发明的尼莫克汀(Nemadectin)结构式；

[0016] 图2为本发明的尼莫克汀(Moxidectin)结构式；

[0017] 图3为本发明的链霉菌neau3在高氏一号培养基上的菌落形态；

[0018] 图4为本发明的链霉菌neau3在荧光倒置相差显微镜(400×)下的菌丝形态； [0019] 图5为本发明的链霉菌neau3在扫描电镜(5000×)下的菌丝形态。

[0020] (五)具体实施方式

[0021] 下面结合附图举例对本发明作进一步说明。

[0022] 实施例1：菌株发酵：本发明涉及的一种链霉菌属菌株，为从湖北省来凤县的一个土样中分离得到的。2009年10月10日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。保藏登记号为：CGMCC No.3316，命名为链霉菌neau3(Streptomyces sp.neau3)的菌株。该菌株不但能够产生尼莫克汀，还能产生新化合物1。

[0023] 该菌株的16S rDNA序列为：

[0024] GCCCCGGAGTTCCGTCGTTATAGTGCAGTCGACGATGAAGCCTTTCGGGGTGGATTAGT

[0025] GGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAA

[0026] ACGGGGTCTAATACCGGATAACACTCTGTCCCGCATGGGACGGGGTTAAAAGCTCCGGC

[0027] GGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCG

[0028] ACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAG

[0029] ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCG

[0030] ACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCG

[0031] AAAGTGACGGTACCTGCAAAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT

[0032] ACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGT

[0033] CACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCT

[0034] AGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGG

[0035] AGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGC

[0036] GTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAG

[0037] GTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGG

[0038] GGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGG

[0039] AGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGG

[0040] AAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGT

[0041] CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTG

[0042] TTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGG

[0043] AGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGC

[0044] TACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCG

[0045] GTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATC

[0046] GCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACG

[0047] TCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTC

[0048] GAAGGTGGGACTGGCGATGGACGAAGTCGTAGCAGAGTGATCTACGGCC

[0049] 该序列在美国国立卫生研究院全国生物技术研究中心(NCBI)的数据库GeneBank等记号为：DQ924968.1，由东北农业大学生物化工研究室提供。

[0050] 平板及斜面培养：培养基的组成(g/L)：葡萄糖10，麦芽糖3，酵母抽提粉3，K2HPO4·3H2O 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，KNO31，微量元素溶液5，pH 7.0～7.2，使用去离子水配制。

[0051] 微量元素溶液(g/L)：MgSO4·7H2O 80，CaCO3 10，FeCl3 6，ZnSO42，MnSO4 2，CuSO40.5，CoCl2 0.4，用去离子水定容。置于28℃的培养箱中，相对湿度40～60％，培养9d。 [0052] 种子培养：种子培养基组成(g/L)：葡萄糖5，麦芽糊精20，可溶性淀粉1，酵母膏
10，牛肉膏1，酪蛋白胨1，pH 7.0～7.2，使用自来水配制。

[0053] 将成熟斜面上的孢子用灭菌后的接种铲挖块接种于种子培养摇瓶中(挖块大小约1×0.5cm)，种子摇瓶装液量25ml/250ml，于 28℃，250rpm旋转式摇床上培养48h。 [0054] 摇瓶发酵：发酵培养基组成(g/L)：葡萄糖10，乳糖25，棉籽饼粉25，CaCO3 3；pH7.0～7.2，使用自来水配制。

[0055] 将种子液按8％的移种量接入发酵摇瓶中，发酵摇瓶装液量为25ml/250ml三角烧瓶，于28℃，250rpm旋转式摇床上培养9d。

[0056] 实施例2：化合物的分离：30L发酵液经200目筛网过滤，并且用水清洗虑饼，发酵液和清洗用的水全都弃掉，用10L甲醇浸提过滤后得到的滤渣，通过减压蒸馏的方法最后将甲醇溶液浓缩到大约2L，再将浓缩液用相同体积的EtOAc浸提3次，将得到的EtOAc相减压蒸馏会产生30g油状物质。将所得油状物上硅胶柱(粒径200～300目)进行层析，分别用石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1-5∶5(V/V)两种洗脱液混合进行梯度洗脱，得到了三个组分，将组分三上RP-18硅胶柱进行层析，用甲醇∶水＝80∶20-95∶5(V/V)二种洗脱液混合进行梯度洗脱，会得到化合物1(30mg)。其中得到化合物1的结构式为：

[0057]

[0058] 化合物1的物理化学性质如下：

[0059] 性状(Appearance)：白色粉末；

[0060] 溶解性(Solubility)：易溶于氯仿、丙酮、甲醇；

[0061] 比旋度(Specific rotation)：[α]D25+45.1(c 0.10，EtOH)；

[0062] 分子式(Molecular formula)：C36H50O7；

[0063] ESIMS m/z：593[M-H]-，High-resolution ESIMS：617.3447[M+Na]+(calcd for C36H50O7Na，617.3449)；

[0064] UV absorption spectrum：λmax(EtOH)nm(log ε)：270(4.16)，296(4.03)； [0065] IR absorption spectrum：vmaxcm-1 3447，2961，2927，1705，1613，1457，1383，1282，1162，997；

[0066] 1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.82(1H，s，H-3)，6.97(1H，s，H-6)，6.51(1H，d，J＝11.2，H-9)，6.24(1H，dd，J＝11.2，14.9，H-10)，5.90(1H，dd，J＝7.0，14.9，H-11)，2.54(1H，m，H-12)，1.98(1H，m H-13a)，2.17(1H，m，H-13b)，5.13(1H，m，H-15)，2.28(2H，m，H-16)，3.71(1H，m，H-17)，1.23(1H，m，H-18a)，2.05(1H，m，H-18b)，4.17(1H，m，H-19)，1.38(1H，br t，J＝11.8，H-20a)，2.05(1H，m，H-20b)，1.73(1H，m，H-22a)，1.98(1H，m，H-22b)，3.80(1H，m，H-23)，1.63(1H，m，H-24)，3.69(1H，d，J＝10.9，H-25)，2.24(3H，s，H-26)，5.80(2H，br s，H-27)，1.08(3H，d，J＝6.6，H-28)，1.63(3H，br s，H-29)，0.79(3H，d，H-30)，5.13(1H，d，J＝7.9，H-32)，2.54(1H，m，H-33)，1.58(3H，d，J＝0.8，H-34)，0.93(3H，d，J＝6.6，H-35)，0.98(3H，d，J＝6.6，H-36)；

[0067] 13C NMR(CDCl3，100MHz)δ165.6(s，C-1)，114.9(s，C-2)，133.3(d，C-3)，126.1(s，C-4)，160.3(s，C-5)，107.5(d，C-6)，138.3(s，C-7)，124.0(s，C-8)，127.7(d，C-9)，122.1(d，C-10)，146.3(d，C-11)，34.4(d，C-12)，47.8(t，C-13)，136.1(s，C-14)，121.7(d，C-15)，34.1(t，C-16)，69.1(d，C-17)，40.0(t，C-18)，64.6(d，C-19)，44.1(t，C-20)，
99.8(s，C-21)，41.0(t，C-22)，69.5(d，C-23)，35.9(d，C-24)，76.7(d，C-25)，15.6(q，C-26)，66.6(t，C-27)，19.7(q，C-28)，16.3(q，C-29)，13.9(q，C-30)，130.7(s，C-31)，
137.4(d，C-32)，26.8(d，C-33)，11.0(q，C-34)，22.8(q，C-35)，22.8(q，c-36). [0068] 新化合物1在结构上与尼莫克汀(图1)最主要的不同是，化合物1对应尼莫克汀的酯键已断裂，分子呈链状。

[0069] 实施例3：结合图4、图5，出发菌株的形态鉴定：

[0070] (1)在高氏一号培养基上，菌落颜色为灰白色，菌落形态实心圆形，见图3。 [0071] (2)孢子丝直、柔曲，孢子椭圆形，圆球形或柱形，表面光滑，荧光 倒置相差显微镜和扫描电镜照片分别见图4、图5。

[0072] 实施例4：抗虫活性测定

[0073] 对猪体内外寄生虫及其虫卵的触杀作用：

[0074] 将100头断奶仔猪分为四组，分别进行如下处理。第一组为高剂量组，皮下注射剂量为400μg/kg；第二组为中剂量组，皮下注射剂量为300μg/kg；第三组为低剂量组200μg/kg；第四组为对照组，不做任何处理。依试验前后猪体内外寄生虫(卵)罹患数量进行比较来确定新化合物对驱杀猪体内线虫和体外血虱的效果。依据猪再感染寄生虫的时间，确定药物在猪体内的残效期。

[0075] 新化合物1，以200μg/kg的计量下能够有效驱杀猪体内线虫和体外血虱。对抑制线虫感染长达42d，对虫卵再出现抑制长达85d。