具有抑制α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶作用的中药组合物及其制备方法和用途

摘要

一种具有抑制α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶作用的中药组合物及其制备方法和用途，该中药组合物的原料药中包含骨碎补，还可以包括夜交藤，骨碎补与夜交藤的重量比为(0.5～2)∶1，优选重量比为1∶1。该中药组合物基于α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶两种酶抑制剂作用，具有降餐后血糖，降血尿酸双重功能，本产品其资源丰富，价格低廉，安全无毒，与拜唐苹和别嘌呤醇的作用一致，故可用于治疗葡萄糖耐量缺损、糖尿病、肥胖，高尿酸血症、痛风症等病症。

权利要求

1.一种具有抑制α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶作用的中药组合物，其特征在于原料药为骨碎补和夜交藤，制备步骤为：水提取物的制备：取配方量的药材，骨碎补与夜交藤的重量比为0.5∶1、1∶1或2∶1，向药材中加15～25倍重量的蒸馏水，室温冷浸1～2h，隔水煎煮1～1.5h，过滤，再加蒸馏水重复煎煮一次；合并两次滤液，冷却至室温后离心，加热浓缩；浸膏的制备：向水提浓缩液中加入乙醇并混匀，使乙醇的体积浓度达到45～60％，

4℃冰箱过夜后离心，取上清液浓缩得浸膏，每步制备完成后，均加蒸馏水定容至0.5g生药/mL。

2.制备权利要求1所述具有抑制α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶作用的中药组合物的方法，其特征在于制备步骤为：a.水提取物的制备：取配方量的药材，向药材中加15～25倍重量的蒸馏水，室温冷浸

1～2h，隔水煎煮1～1.5h，过滤，再加蒸馏水重复煎煮一次；合并两次滤液，冷却至室温后离心，加热浓缩；

b.浸膏的制备：向水提浓缩液中加入乙醇并混匀，使乙醇的体积浓度达到45～60％，

4℃冰箱过夜后离心，取上清液浓缩得浸膏；

所述每步制备完成后，均加蒸馏水定容至0.5g生药/mL。

3.权利要求1所述具有抑制α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶作用的中药组合物在制备治疗葡萄糖耐量缺损、糖尿病、高尿酸血症或痛风症药物中的应用。

说明书

具有抑制α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶作用的中药组合

物及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种具有α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶抑制剂作用的药物及其制备方法和用途。

背景技术

[0002] 餐后高血糖是葡萄糖耐量缺损(IGT)临床特征，也是1型和2型糖尿病常见的症状，与IGT、糖尿病并发症关联[1.A Ceriello and S Colagiuri International Diabetes Federation guideline for management of postmeal glucose：a review of recommendations[J].Diabet Med，2008，25(10)：151～11156.]。及时在IGT阶段控制餐后高血糖，可以使1/3的高危人群血糖恢复正常，减少1/3的高危人群患糖尿病和其并发症的发生。

[0003] 为此在2007年第43届EASD年会上，IDF发布《餐后血糖管理指南》，将α-葡萄糖苷酶抑制剂(AGIs)列为一线药物。α-葡萄糖苷酶抑制剂包括阿卡波糖和伏格列波糖以及米格列醇。该类药物能特异性地抑制位于小肠近端上皮细胞表面的α-葡萄糖苷酶，延缓对双糖和多种复杂的碳水化合物的水解，通过对此酶的可逆性抑制，使肠道对单糖的吸收减慢，来控制餐后高血糖。

[0004] 我国IGT、糖尿病患者具有自己鲜明的临床特点，其饮食结构不同于西方人，以碳水化合物为主，血糖代谢紊乱状态于西方人不同，餐后高血糖比例较西方高。故选择AGIs来进行干预是最为适宜的。如IGT拜唐苹治疗组经随访3.3年，糖尿病发病的危险下降了31％，同时使新诊断高血压的发病率下降34％，心肌梗塞发病的危险下降91％，任何心血管事件的发病率降低49％[2.Chiasson JL，Gomis R，Hanefeld M，et al.The STOP-NIDDMTrial：an international study on the efficacy of an alpha-glucosidase inhibitor to prevent type 2diabetes in a population with impaired glucose tolerance：rationale，design，and preliminary screening data：Study to Prevent Non-Insulin-Dependent Diabetes Mellitus[J.Diabetes Care，1998，21：1720～1725.]。拜唐苹在中国2型糖尿病患者控制血糖效果显著[3.Pan，Chang-Yu；Landen，Harald.Post-Marketing Surveillance of Acarbose Treatment in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus and Subjects with Impaired Glucose Tolerance in China[J].Clinical Drug Investigation，2007，27(6)：397～405.]。但是，上述这类抑制剂市场价格都比较贵，要满足低收入患者长期用其干预IGT、2型糖尿病的餐后高血糖，延缓2型糖尿病的发生或减轻胰岛β细胞功能的衰竭，是件不容易坚持的事。

[0005] 高尿酸血症是一种嘌呤代谢障碍性疾病，它不仅是老年人的高发病，而且还趋年轻化。由于尿酸盐结晶沉积在胰岛β细胞，使其损伤而诱发2型尿病，其患者糖尿病的发生率约5.1％～15.74％。反之，糖尿病患者长期高糖状态损害肾功能，导致肾小球滤过尿酸下降，肾小管排泄能力减退，又加重了高尿酸血症，二者互为因果，相互促进[4.李长贵，王蓓.高尿酸血症和糖代谢异常.中华医学信息导报，2006.21(22)：18.]。因此，控制高尿酸血症非常关键，其治疗的首选药物为黄嘌呤氧化酶抑制剂，主要是上世纪60年代上市的别嘌呤醇，用于抑制嘌呤碱转化为尿酸的过程，其疗效肯定一直延用至今，但应用后的副作用也很明显，患者可出现发热、过敏性皮疹、腹痛、腹泻、白细胞及血小板减少，甚至肝功能损害等表现，故研究新的黄嘌呤氧化酶抑制剂十分必要。

[0006] 我国中药资源丰富，价格低廉，从单味中药或复方中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂或黄嘌呤氧化酶抑制剂已有许多报道。但鉴于上述两方面原因的考虑把单味中药或组合物，同时作为α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶两种酶抑制剂筛选，尚未见报道。用骨碎补和其组合物，同时进行这两种酶抑制剂作用的筛选，也未见报道。

发明内容

[0007] 发明目的：本发明的目的在于提供一种具有α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶抑制剂作用的中药组合物和制备方法，以及中药组合物在制备治疗葡萄糖耐量缺损、糖尿病、肥胖、高尿酸血症、痛风症的应用。

[0008] 技术方案：一种具有抑制α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶作用的中药组合物，原料药中包含骨碎补。

[0009] 具有抑制α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶作用的中药组合物，原料药中还包括夜交藤。上述骨碎补与夜交藤的重量比为(0.5～2)∶1。优选骨碎补与夜交藤的重量比为1∶1。

[0010] 制备具有抑制α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶作用的中药组合物的方法，制备步骤为：水提取物的制备：取配方量的药材，向药材中加15～25倍重量的蒸馏水，室温冷浸1～2h，隔水煎煮1～1.5h，过滤，再加蒸馏水重复煎煮一次；合并两次滤液，冷却至室温后离心，加热浓缩；浸膏的制备：向水提浓缩液中加入乙醇并混匀，使乙醇的体积浓度达到
45～60％，4℃冰箱过夜后离心，取上清液加热浓缩得浸膏；粗多糖的制备：在上述醇沉离心得到的沉淀物中，依次加入无水乙醇、丙酮和乙醚，混匀后，经离心后得离心沉淀物，室温下挥干至粉末得本发明药物的活性组分。上述每步制备完成后，均加蒸馏水定容至0.5g生药/mL。

[0011] 上述具有抑制α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶作用的中药组合物，在制备治疗葡萄糖耐量缺损、糖尿病、肥胖、高尿酸血症或痛风症药物中的应用。

[0012] 药效学实验如下：

[0013] 一、α-葡萄糖苷酶类抑制剂研究

[0014] 实验药物

[0015] 骨碎补与夜交藤，购于江苏省中医院，由本校药学院陈建伟教授鉴定。拜唐苹(成分：阿卡波糖，每片含50毫克，批号：113608)，购于拜耳医药保健有限公司；倍欣(成分：伏格列波糖，每片含0.2毫克，批号：070403)，天津武田药品有限公司产品。

[0016] 实验试剂

[0017] α-葡萄糖苷酶来源于Saccharomyces cerevisia购于Sigma公司；对硝基苯酚-α-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，产于德国Merck公司；还原型谷胱甘肽，KHK进口分装；其他试剂均为国产分析纯。

[0018] 实验动物

[0019] 雄性ICR小鼠，清洁级，18～20g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。

[0020] 实验1

[0021] 骨碎补和骨碎补与夜交藤组合物的提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性测定：中药管反应系统为67mmol/L磷酸钾缓冲液(37℃，pH6.8)1.0mL，3mmol/L谷胱甘肽溶液25μL，64013nkat/L α-葡萄糖苷酶溶液25μL，分别与100μL骨碎补和骨碎补与夜交藤组合物的提取物1.0mg、3.0mg、5.0mg、10.0mg相当生药/mL，(阳性药拜唐苹浓度、加量与骨碎补和骨碎补与夜交藤组合物的水提物平行)混匀，37℃水浴保温10min后，加入20mmol/L pNPG溶液15μL，再置原水浴中继续保温10min后，加入0.01mol/LNa2CO3溶液5mL冷却后，以空白管调零，于波长400nm处测定在酶的作用下释放出对硝基酚(pNP)的吸光度(A)。α-葡萄糖苷酶管除不加骨碎补和骨碎补与夜交藤组合物的提取物、空白管内加α-葡萄糖苷酶不加pNPG外，均由蒸馏水补足体积，其他反应同前。中药空白管其提取物浓度、加量与中药管平行，其他操作同空白管。α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式如下：

[0022] 酶活性抑制率(I％)＝[酶管A-(中药管A-中药空白管A)]/酶管A×100[0023] 骨碎补与其组合物的水提物对α-葡萄糖苷酶活性的影响结果见表1。

[0024] 表1骨碎补与其组合物的水提物对α-葡萄糖苷酶活性的影响

[0025]

[0026] 骨碎补与其组合物的浸膏对α-葡萄糖苷酶活性的影响结果见表2。

[0027] 表2骨碎补与其组合物的浸膏对α-葡萄糖苷酶活性的影响

[0028]

[0029] 实验2

[0030] 骨碎补与其组合物的提取物抑制ICR小鼠离体小肠α-麦芽糖酶活性测定：ICR小鼠禁食24h后，脱臼颈椎处死，立即取小肠上端(约10cm)，用冷生理盐水冲洗数次，剪碎，加5倍4℃预冷的0.1mol/LpH6.8磷酸缓冲液，冰浴中匀浆机10000r/min，1～2min，多次，直至呈匀浆，4℃、4000r/min，离心20min，取上清液分装，-20℃冷冻备用。

[0031] 小肠匀浆α-麦芽糖酶管加入蒸馏水50μL，中药管加入50μL不同浓度的骨碎补与其组合物的提取物(其分别为0.025g、0.05g、0.10g、0.15g、0.2g相当生药/mL)、阳性药管拜唐苹、倍欣(其分别为10mg/mL、0.2mg/mL)，然后各管加入小肠匀浆上清50μL，混匀，37℃水浴保温10min后，再分别加入含42mmol/L麦芽糖的马来酸缓冲液(1.16g马来酸溶于100mL1mol/L NaOH中，pH7.0)50μL，混匀后，37℃温孵30min，加入Tris-HCl(6.1g Tris溶于5mol/L HCl 8.5mL中，以NaOH调pH至7.0)终止反应。然后，分别取各管反应液20uL，加入酶酚试剂3mL，混匀，37℃水浴保温10min后，以空白管调零，于波长505nm处，测定产生葡萄糖含量。空白管内加酶不加麦芽糖，以等量的蒸馏水补足体积。中药空白管其提取物浓度、加量与中药管平行，其他操作同空白管。按以下公式计算离体小肠α-麦芽糖酶抑制百分率。酶活性抑制率(I％)＝[酶管葡萄糖A-(中药管葡萄糖A-中药空白管A)]/酶管葡萄糖A)×100

[0032] 骨碎补与其组合物的水提物对ICR小鼠离体小肠α-麦芽糖酶活性影响结果见表3。

[0033] 表3骨碎补与其组合物的水提物对ICR小鼠离体小肠α-麦芽糖酶活性影响[0034]

[0035] 骨碎补与其组合物的浸膏对ICR小鼠离体小肠α-麦芽糖酶活性影响结果见表4。

[0036] 表4骨碎补与其组合物的浸膏对ICR小鼠离体小肠α-麦芽糖酶活性影响[0037]

[0038] 另外，10mg/mL阿卡波糖，0.2mg/mL伏格列波糖，对ICR小鼠离体小肠α-麦芽糖酶抑制率分别为93.1％和89.6％。

[0039] 二、黄嘌呤氧化酶抑制剂研究

[0040] 实验药物

[0041] 中药同前。别嘌呤醇(每片含0.1克，批号：090804)，购于上海信谊万象药业股份有限公司。

[0042] 实验试剂

[0043] 次黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶，购于Sigma公司；盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、N-1-萘乙胺盐酸盐、四硼酸钠、EDTA-2钠、冰醋酸等试剂，均为国产分析纯。

[0044] 实验1

[0045] 骨碎补与其组合物的提取物抑制黄嘌呤氧化酶活性测定：中药管反应系统为50μLpH8.2缓冲液(20.8mmol/L磷酸二氢钾，15.6mmol/L四硼酸钠，0.1mmol/L EDTA-2钠)配制0.1u/mL黄嘌呤氧化酶(XOD)，蒸馏水750μL，分别与100μL骨碎补与其组合物的提取物6.25mg、12.5mg、25mg、50mg、100mg相当生药/mL。100μL阳性药别嘌呤醇浓度25ug、
50ug、100ug、150ug、200ug/mL。混匀，37℃水浴保温15min后，加入100μL 0.8mmol/L次黄嘌呤-10mmol/L盐酸羟胺溶液，再置原水浴中继续保温30min后，加入5.2mmol/L对氨基苯磺酸-3.858mmol/LN-1-萘乙胺盐酸盐溶液2.0mL，混匀，冷却后，以蒸馏水调零，于波长
550nm处测定吸光度(A)。黄嘌呤氧化酶管除不加骨碎补与其组合物的提取物、空白管内加黄嘌呤氧化酶不加次黄嘌呤外，均由蒸馏水补足体积，其他反应同前。中药空白管其提取物浓度、加量与中药管平行，其他操作同空白管。黄嘌呤氧化酶抑制率计算公式如下：

[0046] 酶活性抑制率(I％)＝[(酶管A-空白管A)-(中药管A-中药空白管A)]/(酶管A-空白管A)×100

[0047] 骨碎补与其组合物的水提物对黄嘌呤氧化酶活性的影响结果见表5。

[0048] 表5骨碎补与其组合物的水提物对黄嘌呤氧化酶活性的影响

[0049]

[0050] 骨碎补与其组合物的浸膏对黄嘌呤氧化酶活性的影响结果见表6。

[0051] 表6骨碎补与其组合物的浸膏对黄嘌呤氧化酶活性的影响

[0052]

[0053] 骨碎补与其组合物的多糖对黄嘌呤氧化酶活性的影响结果见表7。

[0054] 表7骨碎补与其组合物的多糖对黄嘌呤氧化酶活性的影响

[0055]

[0056] 别嘌呤醇对黄嘌呤氧化酶活性的影响结果见表8。

[0057] 表8别嘌呤醇对黄嘌呤氧化酶活性的影响

[0058]

[0059] 根据我们以往在此类抑制剂研究中的积累，采用目前已报道的相关纯酶和组织酶来联合筛选，以阳性药作参照，结果更为可靠。

[0060] 骨碎补单味药对α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶的抑制作用为首次发现，从骨碎补组合物的药效分析看，此组合物对两种酶的抑制作用比骨碎补单味效果更好。其水提和浸膏部分是对这两种酶作用的主要有效部位。

[0061] 实验中制备的浸膏呈极性，不影响酶促反应体系，且可以避免直接醇提物的非极性，需加入助溶剂溶解，而引起抑制结果假阳性的现象。

[0062] 总之，该中药组合物基于α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶两种酶抑制剂作用，具有降餐后血糖，降血尿酸双重功能，本产品其资源丰富，价格低廉，安全无毒，与拜唐苹和别嘌呤醇的作用一致，故可用于治疗葡萄糖耐量缺损、糖尿病、肥胖，高尿酸血症、痛风症等病症。

[0063] 有益效果：本发明来源于从迄今为止尚无降血糖、降血尿酸、α-葡萄糖苷酶抑制剂和黄嘌呤氧化酶抑制剂作用的70位中药和16种组合物中筛选得到，由骨碎补与夜交藤组成，此组合物对α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶的抑制作用比骨碎补单味效果更佳。

[0064] 从中医理论看，本方中骨碎补为水龙骨科多年生附生蕨类植物槲蕨Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm的根茎。味苦，性温。归肾、肝经。具有补肾助阳，强骨，续伤镇痛，温脾止泻功效。骨碎补在本方中有上述两种酶抑制剂的作用，通过补肾温脾，调节脾运化水谷，化生气血，对降低餐后高血糖和高血尿酸，治疗葡萄糖耐量缺损、糖尿病、肥胖、高尿酸血症，以及骨质疏松等并发症起重要作用。

[0065] 夜交藤为蓼科植物何首乌的藤茎Polygonum multiflorum Thunb。味甘，微苦，性平。归心、肝经。有养心安神，祛风，通络的功效。与骨碎补配伍，不仅提高对两种酶的抑制作用，还能调和阴阳，然不寐之源，其行经络，通血脉，对“糖毒”引起的神经系统和心血管并发症，以及对高血尿酸引起的痛风症起到预治作用。

具体实施方式

[0066] 实施例1

[0067] 结合具体实施方式，对本发明进一步说明如下：

[0068] 原料药配比：骨碎补1质量份、夜交藤1质量份

[0069] 本发明中，骨碎补为水龙骨科多年生附生蕨类植物槲蕨Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm的根茎。味苦，性温。归肾、肝经。具有补肾助阳，强骨，续伤镇痛，温脾止泻功效。骨碎补在本方中有上述两种酶抑制剂的作用，通过补肾温脾，调节脾运化水谷，化生气血，对降低餐后高血糖和高血尿酸，治疗葡萄糖耐量缺损、糖尿病、肥胖、高尿酸血症，以及骨质疏松等并发症起重要作用。

[0070] 夜交藤为蓼科植物何首乌的藤茎Polygonum multiiflorum Thunb。味甘，微苦，性平。归心、肝经。有养心安神，祛风，通络的功效。与骨碎补配伍，不仅提高对两种酶的抑制作用，还能调和阴阳，然不寐之源，其行经络，通血脉，对“糖毒”引起的神经系统和心血管并发症起到预治作用，以及对高血尿酸引起的痛风症起到防治作用。

[0071] 制备实施例：

[0072] (1)骨碎补与夜交藤配伍的水提取物的制备：取骨碎补与夜交藤饮片各50g，在骨碎补与夜交藤按1∶1重量比配伍的药材中，加20倍蒸馏水，室温冷浸2h，隔水煎煮1h，过滤，再加蒸馏水重复煎煮1次；合并2次滤液，冷却至室温后离心3000rpm/min，10min，上清液部分沸水浴上浓缩，加蒸馏水定容。

[0073] (2)骨碎补与夜交藤配伍的浸膏的制备：按上述方法制备水提液，向水提浓缩液中加入乙醇浓度达到50vt％，混匀，4℃冰箱过夜后离心3000rpm/min，10min，取上清液部分沸水浴上浓缩，加蒸馏水定容。

[0074] (3)骨碎补与夜交藤配伍的多糖的制备：在上述醇沉离心得到的沉淀物中，依次加入2倍量的无水乙醇、丙酮、乙醚各2次，混匀后，经离心3000rpm/min，10min，依次脱水，室温下挥干至粉末，称重，其得率为1.26％，然后加蒸馏水定容。

[0075] 实施例2

[0076] (1)骨碎补的水提取物的制备：在骨碎补药材中，加20倍蒸馏水，室温冷浸2h，隔水煎煮1h，过滤，再加蒸馏水重复煎煮1次；合并2次滤液，冷却至室温后离心3000rpm/min，10min，上清液部分沸水浴上浓缩，加热浓缩后蒸馏水定容至0.5g生药/mL。

[0077] (2)骨碎补浸膏的制备：按上述方法制备水提液，向水提浓缩液中加入乙醇浓度达到50vt％，混匀，4℃冰箱过夜后离心3000rpm/min，10min，取上清液部分沸水浴上浓缩，加蒸馏水定容。

[0078] (3)骨碎补多糖的制备：在上述醇沉离心得到的沉淀物中，依次加入2倍量的无水乙醇、丙酮、乙醚各2次，混匀后，经离心3000rpm/min，10min，依次脱水，室温下挥干至粉末，称重，其得率为1.26％，然后加蒸馏水定容。

[0079] 实施例3

[0080] (1)骨碎补与夜交藤配伍的水提取物的制备：在骨碎补与夜交藤按0.5∶1重量比配伍的药材中，加15倍重量的蒸馏水，室温冷浸1h，隔水煎煮1h，过滤，再加蒸馏水重复煎煮1次；合并2次滤液，冷却至室温后离心3000rpm/min，10min，上清液部分沸水浴上浓缩，加热浓缩后蒸馏水定容至0.5g生药/mL。

[0081] (2)骨碎补与夜交藤配伍的浸膏的制备：按上述方法制备水提液，向水提浓缩液中加入乙醇浓度达到45vt％，混匀，4℃冰箱过夜后离心3000rpm/min，10min，取上清液部分沸水浴上浓缩，加蒸馏水定容。

[0082] (3)骨碎补与夜交藤配伍的多糖的制备：在上述醇沉离心得到的沉淀物中，依次加入2倍重量的无水乙醇、丙酮、乙醚各2次，混匀后，经离心3000rpm/min，10min，依次脱水，室温下挥干至粉末，然后加蒸馏水定容。

[0083] 实施例4

[0084] (1)骨碎补与夜交藤配伍的水提取物的制备：在骨碎补与夜交藤按2∶1重量比配伍的药材中，加25倍重量的蒸馏水，室温冷浸2h，隔水煎煮1.5h，过滤，再加蒸馏水重复煎煮1次；合并2次滤液，冷却至室温后离心3000rpm/min，10min，上清液部分沸水浴上浓缩，加热浓缩后蒸馏水定容至0.5g生药/mL。