肺炎克雷伯氏菌(甘露糖敏感血凝)菌毛株

摘要

本发明涉及一种肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株，其主要特征是具有甘露糖敏感血凝菌毛。本发明也涉及该肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株的培养、处理、用途和使用方法。本发明还涉及利用该肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株制备的医疗产品。

权利要求

1.一种肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株(Klebsiella pneumoniae(Mannose sensitive hemagglutination)pilus strain)，保藏号为CGMCC No.3605。

2.用如权利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌菌毛株或其死菌体所制备的制品。

3.一种疫苗，其中包括如权利要求1所述肺炎克雷伯氏菌毛株的死菌体，所述肺炎克雷伯氏菌毛株死菌体是所述疫苗的活性成分。

4.一种疫苗制备方法，所述方法包括：

培养如权利要求1所述肺炎克雷伯氏菌菌毛株，灭活所述菌毛株得到死菌体，将所述死菌体制成疫苗。

说明书

肺炎克雷伯氏菌(甘露糖敏感血凝)菌毛株

技术领域

[0001] 本发明涉及一种新颖的微生物菌株。具体而言，本发明涉及一种肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株。本发明也涉及该肺炎克雷伯氏菌菌株的培养、处理、用途和使用方法。本发明还涉及利用该肺炎克雷伯氏菌菌株制备的医疗用产品。

背景技术

[0002] 克雷伯氏菌属(Klebsiella)目前是除大肠杆菌外最重要的条件致病菌，与沙雷菌属、肠杆菌属与哈夫尼亚菌生化反应很相似，某些氨基酸脱羧酶试验有助于鉴别。

[0003] 克雷伯氏菌属可分五个种，即肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(R.oxytoca)、解鸟氨酸克雷伯氏菌(K.ornithinolytica)、植生克雷伯氏菌(K.planticola)和土生克雷伯氏菌(K.terrigena)。其中肺炎克雷伯氏菌又可分3个亚种：肺炎亚种(subsp.pneumoniae)、臭鼻亚种(subsp.ozaenae)和鼻硬结亚种(subsp.rhinoscleromatis)。

[0004] 在临床分离到的克雷伯氏菌属中，肺炎克雷伯氏菌占80％以上，是本属中最为重要和常见的病原菌。

[0005] 肺炎克雷伯氏菌为长1～2μm、宽0.5～0.8μm的粗短杆菌，可产生荚膜，无芽孢，无动力，常见端对端的成对发育。荚膜为不含氯的多糖物质，较厚，作革兰氏染色即可观察到，但以印度墨汁染色法较易观察。肺炎克雷伯氏菌最适生长温度为37℃，可在12～43℃范围生长，55℃30min可被灭活。在鉴别培养基上因发酵乳糖而现有色菌落；在固体培养基上则可因产生大量荚膜物质而呈灰白色黏胨样菌落，菌落易互相融合，以接种环挑之易拉成丝；而在肉汤中培养数天后液体明显黏稠。

[0006] 克雷伯氏菌具有菌体抗原O和荚膜抗原K，按荚膜抗原K的成分，肺炎克雷伯氏菌可分为80个型，肺炎亚种大多属于荚膜3及12型；臭鼻亚种有4、5、6、15等型，以4型最常见；鼻硬结亚种则多为3型。

[0007] 克雷伯氏菌毒力较强，极少量的肺炎克雷伯氏菌(100个细菌)注射于小鼠腹腔即可引起小鼠死亡。

[0008] 克雷伯氏菌适应性强，能很快适应宿主环境而生存，对各种抗生素易产生耐药性，是产超广谱β内酰胺酶率最高的细菌之一，常同时对多种抗生素耐药。此种耐药性可以为染色体介导，亦可通过耐药质粒传播，在医院某些病房内造成感染局部流行。

[0009] 克雷伯氏菌所致的肺炎可分为原发性肺炎和继发性肺炎。两者的界线有时颇难分清，一般认为在原有肺部感染性疾病的基础上，在一定致病条件下发生本菌的感染为继发性。

[0010] 克雷伯氏菌的毒力可能与其荚膜有关，荚膜可以抑制巨噬细胞的趋化、吞噬作用，但确切的发病机制尚未完全阐明。

[0011] 本属细菌感染的病理特点是细菌生长繁殖快，在各脏器可形成单发或多发脓肿，渗出液中含大量带有荚膜的革兰氏阴性杆菌。

[0012] 肺炎克雷伯氏菌引起的原发性大叶性肺炎，以老年患者、酒精中毒以及患有糖尿病、癌肿、血液病等严重原发疾患者为多。病理变化与肺炎球菌所致者不同，肺泡壁常坏死、液化，形成单个或多个脓腔。肺泡内含大量血性黏稠痰。脓腔表面多有纤维蛋白渗出物覆盖，早期即易发生胸膜粘连。脓胸的发生率约为25％，较肺炎球菌肺炎为高。病灶消散常不完全，引起纤维增生、残余性化脓性病灶或支气管扩张。肺炎克雷白杆菌感染占医院内感染的10％，常见者如尿路感染、呼吸道和伤口感染等。败血症病例中肝、肾、脑等均可出现多发性化脓病灶以及胸腔、心包腔积脓等。病变在结肠者尚可引起假膜性肠炎，偶可致穿孔和弥漫性腹膜炎。硬鼻结亚种和臭鼻亚种的致病性尚未完全阐明，前者可引起慢性肉芽肿性硬结症，后者可能与鼻黏膜和鼻甲萎缩所致的臭鼻症有关，是一种机会感染。

[0013] 现有技术中记载的肺炎克雷伯氏菌是致病菌，不具有医疗应用价值；目前尚没有将肺炎克雷伯氏菌用于制备疫苗的报道。

[0014] 关于细菌菌毛的基础研究较多。细菌菌毛是菌体表面极其纤细的蛋白微丝，须用电镜观察。特点是：细、短、直、硬、多，一般认为菌毛与细菌运动无关，根据形态、结构和功能可分为普通菌毛和性菌毛两类。前者与细菌粘附和侵染宿主有关，后者为中空管子，与传递遗传物质有关。在Sharon N，Eshdat Y，Silverblatt F J，Ofek I，Bacterial adherence tocell surface sugars，ciba Found Symp.1981；80：119～141中，说明了大肠杆菌和沙门氏菌的菌毛中存在与宿主细胞发生粘附的物质，并且该粘附会受到糖，例如D-甘露糖的抑制；而且糖蛋白介导的粘附是普遍的广泛的。在Wim Gaastra and Frist K.de Graaf，Host-Specific Fimbrial Adhesions ofNoninvasive Enterotoxigenic Escherichia coli Strains，MicrobiologicalReviews，June 1982，Vol.46，No.2，P.129～161中讨论了大肠杆菌的多种菌毛的性质也讨论了甘露糖敏感血细胞凝集(Mannose-sensitivehemagglutination，甘露糖敏感血凝)和甘露糖抗性血细胞凝集(MRHA)以及非血细胞凝集(Non-HA)。在Speert DP，Lon BA，Eftekbar F，Opsonin-independent phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa，AntibiotChemother.985；36：88～94中，提示了菌毛部分的介导了人嗜中性粒细胞对假单胞菌的吞噬作用。关于菌毛的综合性论述，参见，牟希亚，细菌菌毛及有关粘附素研究的新进展，微生物学杂志，第4卷，第3期，1984年11月，第14页到第17页。上述公开出版物提示具有甘露糖敏感血细胞凝集(甘露糖敏感血凝)性质的菌毛可能存在于多种属细菌上，比如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的最常见的菌毛是I型普通菌毛(即甘露糖敏感血凝菌毛)。

[0015] 为了预防和/或治疗与细菌感染有关的疾病，需要寻找和提供具有广谱的、高免疫原性的、低毒性的物质。本发明通过筛选从临床上获得的肺炎克雷伯氏菌菌株，获得了一种甘露糖敏感血凝菌毛株，并发现用这种肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株制备的裂解疫苗具有刺激机体免疫作用的用途。所以，本发明提供了具有使用价值的肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株，可以用于生产疫苗。

发明内容

[0016] 发明概述

[0017] 第一方面，本发明提供了一种肺炎克雷伯氏菌菌株，命名为肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株，拉丁名为“Klebsiella pneumoniae(Mannose sensitive hemagglutination)pilus strain”。在分类学上，该菌株属于克雷伯氏菌属(Klebsiella)的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的一种新型菌株。

[0018] 该菌株已经于2010年01月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物所。CGMCC是布达佩斯条约承认的生物材料样品国际保藏单位。该菌株的编号是CGMCC No.3605，分类命名是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。

[0019] 本发明的肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株的特征在于下列的一个或多个：

[0020] a.在菌体周围有许多纤细而刚直的菌毛，

[0021] b.甘露糖敏感血凝试验呈现强阳性，

[0022] c.平板菌落粘附红细胞试验强阳性，

[0023] d.酵母菌的直接凝集试验呈MS血凝，

[0024] e.具有非甘露糖敏感血凝菌毛。

[0025] 第二个方面，本发明提供了肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株的死菌体，菌体裂解成分，菌体制备物，提取物，分离自菌体的物质，其各自可以作为疫苗或免疫调节剂或其他医疗制品的活性成分。肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株的细胞包括细胞壁、细胞质膜、细胞质和细胞器、核区或类核等结构，细胞壁又包括内层和外层，细胞外有一端生有鞭毛，并具有周身菌毛。菌毛种类多样，其中包括甘露糖敏感血凝菌毛，非甘露糖敏感血凝菌毛和性菌毛。从成分而言，有DNA分子，RNA分子，蛋白质，脂类分子等等。培养过程中，也可以产生代谢产物。

[0026] 在一个实施方案中，以本发明的肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株为基础，经过培养和灭活，得到死菌体。死菌体可以作为动物体包括人体的机体免疫系统刺激物，获得有益效果。优选的，死菌体可以从培养基或者培养液中纯化后使用。也可以在其中加入其他试剂或者药剂、佐剂、辅剂等，获得更好的免疫刺激或调控效果。

[0027] 在一个实施方案中，以本发明的肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株为基础，经过培养、提取、纯化等步骤可以得到上述结构或者上述物质中的某一种或者几种或者任意组合，用作动物体包括人体的机体刺激物，获得有益的效果。

[0028] 关于本发明的肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株的用途。本发明的肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株毒性低，免疫作用强，而且具有广谱作用的特性。用该菌株制备的菌苗或者免疫调节剂可以全面激活调控人体的细胞免疫和体液免疫系统，对多种细菌及真菌产生抵抗作用。免疫调节活性和抗肿瘤作用均具明显效果。

[0029] 本发明的肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株的菌苗特别适合免疫机体，用于预防肠杆菌科的细菌感染。

附图说明

[0030] 本发明的肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株的有关保藏信息如下：

[0031] 保藏日期：2010年1月22日；

[0032] 保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

[0033] 保藏单位简称：CGMCC；

[0034] 保藏编号：CGMCC No.3605。

[0035] 图1是从本发明提供的肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株电子显微镜照片(48000X)，显示所描述的肺炎克雷伯氏菌的形态特征(丛毛性、甘露糖敏感血凝菌毛)。

[0036] 发明详述

[0037] 1.定义和解释

[0038] 在本申请中，对下述术语和解释予以特别说明。

[0039] “细菌”是一类单细胞原核生物。基因载体是由一束双链DNA纤维丝组成的，没有任何膜的界限把它和细胞质分开。缺少细胞器。核蛋白体为70S。本申请中谈论的是“真细菌(eubacteria)”。真细菌可以划分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两种类型。

[0040] “革兰氏染色法”是通过使用结晶紫溶液和碘液，依据真细菌的细胞壁结构不同，对细菌进行区分的染色方法。

[0041] “鞭毛”是某些细菌的运动器官，主要由鞭毛蛋白构成。

[0042] “菌毛”是细菌表面的纤丝附属结构，比鞭毛更短、更直，而且细小得多。菌毛由蛋白质构成。菌毛区分为普通菌毛和性菌毛。

[0043] “普通菌毛”与细菌体粘附有关。普通菌毛种类繁多，依据其在细菌粘附中的作用的相对不同，可以分为非专一性粘附菌毛和专一性粘附菌毛。

[0044] “非专一性粘附菌毛”是指那些可以使细菌粘附到多种基质上的菌毛，比如多种真核细胞上，例如多种动物的红细胞，白细胞，上皮细胞，和其他测试中的动物细胞、植物细胞和真菌细胞。也就是这些菌毛对宿主没有严格的选择性，粘附具有广泛性，例如大肠杆菌的1型菌毛(type1 fimbriae)。在使用不同动物来源的红细胞时，非专一性粘附表现出相似模式的红细胞凝集活性；并且红细胞凝集作用(hemagglutination)对甘露糖敏感(mannose-sensitive)。因此，甘露糖敏感红细胞凝集作用(mannose-sensitive hemagglutination，甘露糖敏感血凝)是非专一性粘附菌毛的一个特征。

[0045] “专一性粘附菌毛”是指那些促使细菌粘附到特定基质上的菌毛。也就是这些菌毛对宿主具有严格的选择性，粘附只能在细菌和特殊宿主之间发生，比如大肠杆菌菌毛K88。红细胞凝集作用不表现甘露糖敏感性，即不被甘露糖抑制的血凝。

[0046] “甘露糖敏感血凝菌毛”全称为“甘露糖敏感红细胞凝集作用菌毛”，是指促进细菌粘附到多种基质上的非专一性的粘附菌毛，能够被甘露糖抑制。在本申请中，甘露糖敏感血凝菌毛是一个广义概念。现有研究提示，在细菌，比如铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌等，粘附到宿主细胞的过程中，糖介导粘附普遍存在。有些是甘露糖敏感，有些是L-岩藻糖敏感，D-半乳糖敏感的。在此，“甘露糖敏感血凝菌毛”包括甘露糖敏感细胞凝集作用菌毛，各种其他糖类调节的、与细菌和宿主的非专一性粘附相关的菌毛。

[0047] “克雷伯氏菌”是一个属名，其中的肺炎克雷伯氏菌是条件致病菌。本发明通过选育提供了一种具有医疗用途的肺炎克雷伯氏菌菌株。本发明涵盖用同样的发明思路筛选的具有医疗用途的肺炎克雷伯氏菌菌株。

[0048] 2.详细描述

[0049] 本发明的肺炎克雷伯氏菌菌株，表现出低毒性，具有周身菌毛，菌毛中有甘露糖敏感血凝菌毛。本发明将该菌株命名为肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株，并于2010年1月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No.3605。

[0050] 本发明提供的肺炎克雷伯氏菌全称为肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株，它是一种具有周身菌毛性甘露糖敏感血凝(Mannose SensitiveHemagglutination)菌毛的肺炎克雷伯氏菌，该菌毛株具有跨菌属的广谱免疫原性。

[0051] 如背景技术部分所述，鉴于肺炎克雷伯氏菌是致病菌，没有人利用肺炎克雷伯氏菌菌体或其中的物质进行疾病预防和治疗。

[0052] 本发明的发明人注意到了菌毛在细菌和宿主作用中的重要性，注意到甘露糖敏感血凝菌毛在细菌和宿主作用中的普遍性；力争发现一株具有低毒性、广谱免疫原性的肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株，并利用菌体中的物质，特别是甘露糖敏感血凝菌毛进行免疫刺激和调理。

[0053] 本发明人通过对临床获得的多株肺炎克雷伯氏菌的筛选以及在小鼠中的实验，确定了这株肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株。该菌株的产品在疾病的预防和治疗上表现出有益效果，可以刺激免疫系统。

[0054] 肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌株获得之后，一直保持性质稳定。由肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌株制备的菌苗也在抗感染、抗肿瘤治疗和免疫失调方面均有良好效果。

[0055] 肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株的主要特征如下：

[0056] 1.形态培养特性和生化检验：符合肺炎克雷伯氏菌检验指标。

[0057] 2.菌毛形态和性质

[0058] (1)图1是本发明的菌株的电子显微镜照片，可以看到本菌株的菌体具有的周生菌毛。

[0059] (2)部分菌毛为甘露糖敏感血凝菌毛。经甘露糖敏感血凝和血凝抑制试验，均为强阳性，参见图1。其中有关进行甘露糖敏感血凝试验的方法，参见大连医学院学报，1985，7(1)：1-3。

具体实施方式

[0060] 实施例1.肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌株的来源和鉴定

[0061] 本发明人通过对从临床标本中分离出的6株肺炎克雷伯氏菌，参考(牟希亚，绿脓杆菌甘露糖敏感血凝菌毛株的建立，微生物学报，26(2)：176-179，1986)中的方法，进行筛选和选育，获得一株肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌株。

[0062] 主要鉴定特征如下：

[0063] 在鉴别培养基上发酵乳糖而表现有色菌落；

[0064] 在固体培养基上呈灰白色黏胨样菌落；

[0065] 在肉汤中培养数天后，液体明显黏稠；

[0066] 革兰氏阴性。

[0067] 对本菌株进行了电子显微照相，如图1所示，显示有周生菌毛。甘露糖敏感血凝和血凝抑制试验，均为强阳性。其中甘露糖敏感血凝和血凝抑制试验的方法为本领域普通技术人员所公知并熟练操作以及容易判断，参见例如大连医学院学报，1985，7(1)：1-3。

[0068] 实施例2.菌株培养和菌苗制备

[0069] 将本发明的肺炎克雷伯氏菌甘露糖敏感血凝菌毛株在细菌平板上于37℃培养18小时，收集培养物，并以甲醛溶液杀菌，反复洗涤制成死菌苗，稀释用无菌生理盐水，加入1％苯甲醇作为防腐剂，制备菌苗。

[0070] 实施例3.菌苗的动物实验

[0071] 采用细菌平板培养，1％甲醛生理盐水杀灭细菌，用无菌生理盐水洗涤5次，分光光度计检测菌液浓度，然后检查有无活菌，稀释成18到20亿/ml，制成菌苗。

[0072] 动物实验采用的试验动物是18～20克小白鼠。皮下注射3次，每次注射0.3ml。注射间隔时间为一周。末次注射后第7天，检测免疫的小白鼠的交叉凝集MSHA抗体效价。

[0073] 表1.小白鼠经过本发明的“菌苗”免疫后，其血液中的抗体与两种细菌的MSHA抗原的交叉凝集效价检测

[0074]

[0075] 免疫保护试验先后免疫共43只小白鼠。经过17天自动免疫，免疫过程中大部分小鼠消瘦，先后共死亡7只。存活的小鼠中，最重者24克，最轻者15克。免疫后小鼠的表现出免疫保护。自动免疫保护试验结果如下：

[0076] 表2免疫保护试验结果

[0077]动物组 免疫天数 攻击菌株 免疫组 对照组 P值
死亡率 死亡率
1 17天 对应菌 1％ 100％ P＜0.01
2 17天 大肠杆菌 37.5％ 80％ P＜0.05
3 17天 肺炎杆菌 25％ 100％ P＜0.01
4 17天 绿脓杆菌 12.5％ 100％ P＜0.01

[0078] 结果显示：免疫组的死亡率明显低于对照组，表示具有显著的免疫保护效果。

[0079] 正如对于本领域的技术人员显而易见的，可以做出本发明的许多修改和变化而不背离其精神和范围。本文中所描述的具体实施方案仅以例子的方式给出，并且仅以所附权利要求连同这些权利要求被授予的等效物的整个范围限制本发明。