转cry2A基因水稻品系T2A-1的PCR检测方法及其应用

摘要

本发明“转cry2A基因水稻品系T2A-1的PCR检测方法及其应用”，涉及生物技术领域。本发明转cry2A基因水稻品系T2A-1的PCR检测方法，其特征在于：PCR反应中的正向引物依据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的1-473位碱基序列设计，反向引物依据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的474-708位碱基序列设计。能利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出转cry2A基因水稻品系T2A-1，以及以转cry2A基因水稻品系T2A-1为亲本的水稻品系。

权利要求

1.转cry2A基因水稻品系T2A-1的PCR检测方法，其特征在于：PCR反应中的正向引物依据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的1-473位碱基序列设计，反向引物依据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的474-708位碱基序列设计；

所述正向引物为T2A-1-F1：5‘-GTTTCGCTCATGTGTTGAGC-3’，所述反向引物为T2A-1-R1：5‘-TGATACTCCGTTTGCATTGC-3’，扩增区域为扩增SEQ IDNO.1的266-496位，扩增产物大小为231bp。

2.权利要求1所述PCR检测方法在鉴别水稻品系T2A-1以及以水稻品系T2A-1为亲本的水稻品种上的应用。

说明书

转cry2A基因水稻品系T2A-1的PCR检测方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种鉴别转cry2A基因水稻品系T2A-1的转化体特异性PCR方法及其应用。

背景技术

[0002] 水稻作为世界上超过一半人口的主食，是最重要的粮食作物之一。在过去的半个多世纪里，水稻育种取得了巨大的成功。水稻的单位产量实现了翻番，部分地方甚至提高至3倍，这为保障世界粮食安全作出了巨大的贡献。但近十几年来水稻的产量停滞不前，这一方面是由于在育种技术上没有新的突破以及遗传多样性在栽培品种中的逐步变窄，另一方面也是因为频繁发生的病虫害以及旱灾等自然灾害使得水稻生产损失惨重。然而，世界人口的持续增长以及社会经济的快速发展导致对粮食的需求不断增加。

[0003] 针对这些问题，我国学者围绕水稻抗病虫、抗旱、营养高效利用、优质、高产等五大重要性状，利用转基因技术这种新兴的育种手段对水稻品种进行全面改良以实现农业的可持续发展。目前我国已经有多个转基因水稻品系进行了生产性实验，申请生产应用生物安全证书。其中，华中农业大学研发的转crylAb/crylAc基因水稻华恢1号和Bt汕优63的生产应用生物安全证书于2009年8月获得了批准(http://www.stee.agri.gov.cn/biosafety/spxx/P020091127591594596689.pdf，审批编号：农基安证字(2009)第072号和第73号)，成为我国首批允许商业化种植的转基因水稻。

[0004] 使用不同Bt基因的转基因水稻是延缓昆虫抗性产生，提高Bt水稻使用寿命的一种重要策略。Chen等人培育了转人工合成的cry2A基因的水稻品系T2A-1(Chen H，Tang W，Xu C G，etal.Transgenic indica rice plants harboring a synthetic cry2A*gene of Bacillus thuringiensis exhibitenhanced resistance against lepidopteran rice pests.Theor Appl Genet，2005，111：1330-1337)，其田间实验表现出了对螟虫的高度抗性，为发展Bt水稻提供了新的种质资源材料。2006年，该品系获准在湖北省进行环境释放(转Cry2A基因抗虫水稻T2A-1在湖北省的环境释放安全审批书.农基安审字(2006)第005号)，2009年获准在湖北省进行生产性实验(转cry2A基因抗虫水稻T2A-1在湖北省的生产性试验安全审批书.农基安审字(2009)第007号)(http://new.croplab.org/web/detail.jsp？i_＝554)。转cry2A基因水稻品系T2A-1在通过生产性试验获得生产应用安全证书后，将可能成为我国又一个即将在生产上商业化种植的转基因水稻。

[0005] 进行转基因成分检测是对转基因植物进行有效监督管理，保障其健康发展的重要技术基础。PCR技术是转基因成分检测中应用最为广泛的技术。在应用这种技术进行转基因作物定性检测时，根据其扩增的靶标区域和特异性将其分为四类：一、筛选检测，以转基因通用的外源启动子和终止子为靶标区域；二、基因特异性检测，以特异的外源目的基因为靶标区域；三、构建特异性检测，以转基因元件之间的特异构建为靶标区域；四、转化体特异性检测，以转化体特异性片段为靶标区域。这四类检测方法对转基因作物的品系检测特异性是逐渐增加的。这四类检测方法对转基因作物的检测特异性是逐渐增加的，转化体特异性检测是目前对转基因品系检测特异性最高的检测方法，也是目前转基因检测中最常用的身份检测方法，这种检测方法甚至能够区分同一转化载体产生的不同转化植株品系。

[0006] 目前已经有部分专利和文献报道了我国转基因水稻品系的转化体特异性片段序列和检测方法，例如：谢家建等人于2007年和2008年分别利用TAIL-PCR、genome walking和LD-PCR等方法获得了转基因水稻克螟稻、Bt汕优63、科丰6号和科丰8号的转化体特异性片段序列，并建立了转化体特异性的检测方法。然而，在对现有的专利和文献的分析中发现，还没有任何关于转cry2A基因水稻品系T2A-1的转化体特异性片段序列和转化体特异性检测方法的文章和专利报道。

发明内容

[0007] 针对上述领域中的空白，提供了转cry2A基因水稻品系T2A-1的转化体特异性序列以及鉴别转cry2A基因水稻品系T2A-1的转化体特异性PCR方法，该PCR方法能利用普通的PCR仪器、试剂快速准确鉴别出转cry2A基因水稻品系T2A-1，以及以转cry2A基因水稻品系T2A-1为亲本的水稻品系。

[0008] 转cry2A基因水稻品系T2A-1的PCR检测方法，其特征在于：PCR反应中的正向引物依据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的1-473位碱基序列设计，反向引物依据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的474-708位碱基序列设计。

[0009] 所述正向引物为T2A-1-F1：5‘-GTTTCGCTCATGTGTTGAGC-3’，

[0010] 所述反向引物为T2A-1-R1：5‘-TGATACTCCGTTTGCATTGC-3’，

[0011] 扩增区域为扩增SEQ ID NO1的266-496位，扩增产物大小为231bp。

[0012] 所述PCR检测方法在鉴别T2A-1以及以T2A-1为亲本的水稻品种上的应用。

[0013] 本发明发明人采用TAIL-PCR方法，即以T2A-1的基因组的模板，根据转cry2A基因水稻品系T2A-1的T-DNA(图1)边界区域设计三个巢式特异性PCR引物bar-T1、bar-T2和bar-T3，依次与8个简并引物AD2～AD6、AD8、AD9和AD11分别组合进行三次PCR扩增(引物序列见表1)，PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖胶上进行电泳，采用QIAquick Gel Extraction kit回收扩增片段，连接到pGEM-T easy(Promega，Madison，Wis.)，采用ABI PRISM 1300Genetic Analyzer进行序列测定。采用vectorNTI10.0(Invitrogen)比较和分析测定的序列与载体序列相似性，在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN检索相似的水稻基因组序列。分析结果表明8个AD引物中只有AD8的第三级获得了扩增产物(图2)。回收引物AD8的第三级扩增片段，连到载体上，进行序列测定，经序列测定扩增的条带大小为708bp，如SEQ ID NO.1所示。将如SEQ ID NO.1提交NCBI数据库比对分析，其中1-473bp为转化载体序列，474-708bp为水稻基因组序列。即该系列为T2A-1的转化体特异性序列，即T2A-1这个转基因品种说唯一拥有的序列。这种唯一性由外源转化载序列以及外源转化载体在宿主基因组的特定插入位置决定。在转基因过程中，外源基因可能插入到宿主基因组的很多个位置，外源基因插入位置不同将得到不同的转基因品系，即得到不同的转化体特异性。本发明获得的转化体特异性序列的5’端1～473bp为外源转化载体序列，3’端474-708bp为宿主水稻的基因组序列。基于转化体特异性片段与转基因品系的一一对应性，通过在该特异性序列上设计引物，正向引物设计在1～473bp位置，反向引物设计在3’端474-708bp位置，采用这对正反向引物对待测品系的基因组进行PCR扩增，是一种检测未知水稻品系是否是T2A-1及其子代的有效手段。在检测中，由于设计的正反向引物的正确靶标序列就是其设计所依据的转化体特异性序列，即SEQ ID NO.1，即事先已经非常清楚引物在靶标序列上的识别位置和靶标序列片段长度，因此能够预先计算出扩增产物应该为多长，当某个待测品系的基因组扩增产物出现相应长度的扩增片段时，说明该品系就是T2A-1或者以T2A-1为亲本的水稻品种。

[0014] 本发明的核心贡献在于获得并向公众提供了T2A-1的转化体特异性序列，基于转化体特异性序列与转基因品系的一一对应性，提供了其在检测T2A-1上的应用，即根据其设计特异性引物来鉴别待测品系是否是T2A-1或其子代。而根据一段已知序列采用引物常规设计规则来设计扩增该段序列的引物，对于本领域普通技术人员来说是普遍掌握的常规技能，本发明的检测方法不限于采用哪一对特异性引物，不同的人根据SEQ ID NO.1即本发明的检测方法中的设计思路可能会设计出不同的引物对，但都是基于本发明提供了转化体特异性序列SEQ IDNO.1所示的序列这个前提，因此都在本发明的保护范围内。发明人同时也提供了采用一对自已设计的特异性引物T2A-1-F1/T2A-1-R1进行检测的方法。

[0015] 由于转cry2A基因水稻品系T2A-1在通过生产性试验获得生产应用安全证书后，将可能成为我国又一个即将在生产上商业化种植的转基因水稻品系。因此本发明为特异性鉴定转cry2A基因水稻品系T2A-1提供了便利，该方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价值。

附图说明

[0016] 图1转cry2A基因水稻品系T2A-1的转化载体T-DNA区构建图谱

[0017] 图2转cry2A基因水稻品系T2A-1的转化体特异性序列TAIL-PCR扩增图谱[0018] M：DNA Marker DL2000，大小依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-8：引物AD2～AD6、AD8、AD9和AD11的TAIL-PCR第三级扩增反应产物

[0019] 图3转cry2A基因水稻品系T2A-1转化体特异性PCR检测结果

[0020] M：DNA Marker DL2000；1：转cry2A基因水稻品系T2A-1，2：空白对照，3-6：4个市场水稻样品。

具体实施方式

[0021] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。

[0022] 实施例1

[0023] 转cry2A基因水稻品系T2A-1转化体特异性序列的克隆

[0024] 1实验材料

[0025] 1.1植物材料

[0026] 转基因水稻：转cry2A基因水稻品系T2A-1(华中农业大学研发)，本实验室有保存，自申请日起二十年内，可向公众发放用于实验研究。

[0027] 1.2酶与试剂

[0028] 分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、DL2000Marker购自大连宝生物生物工程有限公司。

[0029] 其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

[0030] 1.3实验仪器

[0031] PCR扩增仪：Eppendorf Mastercycle gradient(Eppendorf co.)

[0032] 核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)

[0033] DNA测序仪(Applied Biosystem377型全自动荧光序列分析仪)

[0034] DNA电泳分析系统：Kodak EDAS 290(Kodak co.)

[0035] 其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。

[0036] 2实验方法和过程

[0037] 2.1水稻基因组DNA提取与检测

[0038] 2.1.1水稻基因组DNA的提取

[0039] 取苗期水稻叶片做为DNA提取的材料，依照柱式植物DNAout试剂盒(天泽基因公司)的操作手册，进行水稻材料总DNA的提取。

[0040] 2.1.2水稻基因组DNA检测

[0041] 取5μl提取的DNA溶液，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳，根据其亮度和带型来初步判断提取DNA的质量。采用紫外分光光度计测定所提取的DNA的浓度和纯度。

[0042] 2.2转cry2A基因水稻品系T2A-1转化体特异性序列的分离

[0043] TAIL-PCR用于扩增已知区域的侧翼序列。根据转cry2A基因水稻品系T2A-1的T-DNA边界区域设计三个巢式特异性PCR引物bar-T1、bar-T2和bar-T3，依次与8个简并引物AD2～AD6、AD8、AD9和AD11分别组合进行三次PCR扩增，引物序列见表1。PCR反应条件见表2。

[0044] 表1用于TAIL-PCR扩增的特异性引物和简并引物

[0045]primers sequence
bar-T1 5’-AAGGCACGCAACGCCTACGAC-3’
bar-T2 5’-TACACCCACCTGCTGAAGTC-3’
bar-T3 5’-TCAAGAGCGTGGTCGCTGTC-3’
AD2 5’-AGTGNAGAANCAAAGG-3’
AD3 5’-CATCGNCNGANACGAA-3’
AD4 5’-TG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)AGA-3’
AD5 5’-TCGTNCGNACNTAGGA-3’
AD6 5’-NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT-3’
AD8 5’-(C/G)TTGNTA(C/G)TNCTNTGC-3’
AD9 5’-(A/T)CAGNTG(A/T)TNGTNCTG-3’
AD11 5’-CA(A/T)CGICNGAIA(C/G)GGA-3’

[0046] 表2TAIL-PCR反应程序和条件

[0047]

[0048] 2.3序列测定和分析

[0049] PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖胶上进行电泳，采用QIAquick Gel Extraction kit回收扩增片段，连接到pGEM-T easy(Promega，Madison，Wis.)，采用ABI PRISM1300Genetic Analyzer进行序列测定。采用vectorNTI10.0(Invitrogen)比较和分析测定的序列与载体序列相似性，在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLASTN检索相似的水稻基因组序列。

[0050] 3实验结果

[0051] 3.1转cry2A基因水稻品系T2A-1转化体特异性序列测定

[0052] 转cry2A基因水稻品系T2A-1的T-DNA边界TAIL-PCR扩增结果表明，8个AD引物中只有AD8的第三级获得了扩增产物(图2)。回收引物AD8的第三级扩增片段，连到载体上，进行序列测定。经序列测定扩增的条带大小为708bp。

[0053] 3.2转cry2A基因水稻品系T2A-1转化体特异性序列分析

[0054] 将获得的708bp序列提交NCBI数据库比对分析，其中1-473bp为转化载体序列，474-708bp为水稻基因组序列。

[0055] 实施例2

[0056] 本发明的转化体特异性PCR方法应用于鉴别转cry2A基因水稻品系T2A-1[0057] 1实验材料

[0058] 1.1植物材料

[0059] 转基因水稻：转cry2A基因水稻品系T2A-1

[0060] 4个水稻材料，购自市场。

[0061] 1.2酶与试剂

[0062] 分子生物学试剂，如dNTPs、Taq DNA聚合酶、Marker等购自大连宝生物生物工程有限公司。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

[0063] 1.3实验仪器

[0064] PCR扩增仪：Mastercycle gradient(Eppendorf co.)

[0065] 核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)

[0066] DNA电泳分析系统：Kodak EDAS 290(Kodak co.)

[0067] 其它仪器包括：离心机，恒温加热板，电子天平，培养箱等。

[0068] 2实验方法和过程

[0069] 2.1水稻基因组DNA提取与检测

[0070] 见实施例1中2.1水稻基因组DNA提取与检测。

[0071] 2.2鉴别转cry2A基因水稻品系T2A-1的转化体特异性PCR方法

[0072] 本发明的PCR方法应用于鉴别水稻样品中是否含有转cry2A基因水稻品系T2A-1。采用引物T2A-1-F1/T2A-1-R1组合(序列见表4)，检测购自市场的4个水稻样品，见图2。
实验结果表明，转cry2A基因水稻品系T2A-1能特异性扩增出231bp的产物，检测的4个市场样品中均未能扩增获得相同大小的片段。

[0073] 克隆转cry2A基因水稻品系T2A-1的扩增片段，按实施例1中“2.3序列测定和分析”进行序列分析。序列分析结果表明，扩增片段序列与序列SEQ ID NO1的266-496位完全一致。

[0074] 检测结果表明本发明提供的PCR方法能很好地鉴别出水稻样品中是否含有转cry2A基因水稻品系T2A-1。

[0075] PCR反应体系为：0.25μL rTaq(5U/μL)，5μL 10×PCR Buffer(Mg2+Plus)，4μL dNTP(各2.5mM)，引物各2μL(10μM)，模板各2μL(20ng/μL)，加灭菌蒸馏水补足体积至50μL。

[0076] 扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；72℃10min。

[0077] 表4.鉴别转cry2A基因水稻品系T2A-1的转化体特异性PCR引物

[0078]引物 序列
T2A-1-F1 5’-GTTTCGCTCATGTGTTGAGC-3’
T2A-1-R1 5’-TGATACTCCGTTTGCATTGC-3’