一种中国对虾“黄海1号”抗高氨氮、高pH值家系选育方法：首先收集不同地区养殖的中国对虾“黄海1号”构建基础群体；然后从不同群体中挑选亲虾，按完全双列杂交模式建立家系，单独育苗和养殖；分别对各家系在仔虾Ⅰ期(P1期)和150日龄进行高氨氮和高pH值胁迫试验，结合养殖成活率筛选耐受性好的家系进行保种；第二年以保种家系为亲本，采用巢式设计建立家系，进行家系内选育；第三年对筛选出的家系进行小规模示范养殖，确定和评估筛选出的家系对环境的适应能力。本发明实现了中国对虾生长和抗逆性状的聚合和累加，经过进一步选育可培育出抗逆新品系或品种，提供中国对虾对不同养殖环境的适应性，对中国对虾品种的更新换代具有重要意义。
1.一种中国对虾“黄海1号”抗高氨氮、高pH值家系选育方法，其特征在于选育方法是：
(1)、收集不同地区养殖的中国对虾“黄海1号”构建基础群体并进行评估；(2)、从不同群体中分别挑选亲虾，按完全双列杂交模式建立家系，单独育苗和养殖；(3)、分别对各家系在仔虾I期和150日龄进行高氨氮和高pH值胁迫试验，同时结合出池时各家系的养殖成活率筛选耐受性好的家系进行保种；(4)、以保种家系为亲本，采用巢式设计建立家系，采用(3)的选育方法筛选抗高氨氮和高pH值家系；(5)、对筛选出的家系进行小规模示范养殖，确定和评估其抗高氨氮和高pH值性状。
2.根据权利要求1所述的一种中国对虾“黄海1号”抗高氨氮、高pH值家系选育方法，其特征在于所述的收集不同地区养殖的中国对虾“黄海1号”构建基础群体并进行评估，是收集3个以上不同地区养殖的中国对虾“黄海1号”雌雄个体各100尾组建基础群体，选择雌虾体长≥14cm，雄虾体长≥12cm的个体作为备选亲虾。
3.根据权利要求1所述的一种中国对虾“黄海1号”抗高氨氮、高pH值家系选育方法，其特征在于所述的从不同群体中分别挑选亲虾，按完全双列杂交模式建立家系，单独育苗和养殖，是从备选亲虾中挑选健康、无病、活力强的个体作为亲虾，采用人工授精技术按完全双列杂交模式建立家系交配组合，每种交配组合为3-5个家系，雌雄比例为1∶1，对建立的家系进行单独育苗和养殖。
4.根据权利要求1所述的一种中国对虾“黄海1号”抗高氨氮、高pH值家系选育方法，其特征在于所述的分别对各家系在仔虾I期和150日龄进行高氨氮和高pH值胁迫试验，同时结合出池时各家系的养殖成活率筛选耐受性好的家系进行保种，抗高氨氮和高pH值家系的筛选共分三次进行：第一次在发育至仔虾I期时进行胁迫实验，连续试验三天，根据各家系不同试验梯度成活率计算半数致死值，以所有家系的平均半数致死值为筛选指标，筛选耐受性好的家系；第二次在各家系生长至150日龄时，每个家系随机取30-50尾进行胁迫试验；连续进行三天，统计每个家系内个体的死亡时间，以家系平均存活时间为指标进行第二次筛选；第三次结合出池，统计各家系养殖成活率，以所有家系的平均养殖成活率为指标进行筛选，最终只选择在三次筛选中表现均高于筛选指标的家系进行保种，作为第二年家系建立的亲本，每个家系的保种亲虾数目为雌虾100-200尾，雄虾50-100尾。
5.根据权利要求1所述的一种中国对虾“黄海1号”抗高氨氮、高pH值家系选育方法，其特征在于所述的以保种家系为亲本，采用巢式设计建立家系，采用(3)的选育方法筛选抗高氨氮和高pH值家系：第二年采用巢式设计建立家系交配组合，每种交配组合建立2-3组，每组雌雄比例控制在2-3∶1，同时以未经胁迫试验的中国对虾“黄海1号”为对照，采用(4)中的胁迫试验设计进行家系内连续选育并进行保种；保种亲虾数目为雌虾100-200尾，雄虾50-100尾。
6.根据权利要求1所述的一种中国对虾“黄海1号”抗高氨氮、高pH值家系选育方法，其特征在于所述的对筛选出的家系进行小规模示范养殖，确定和评估其优良的抗高氨氮和高pH值性状：第三年对筛选出的抗高氨氮、高pH值家系在3个以上养殖区域进行小规模示范养殖，每个示范点养殖面积在50亩以上，同时以未进行胁迫试验的中国对虾“黄海1号”为对照，统计收获时的养殖成活率和亩产量对家系选育效果进行评价。
中国对虾“黄海1号”抗高氨氮、高pH值家系选育方法
技术领域：
[0001] 本发明属于中国对虾遗传改良和优良品种的选育技术，具体讲是一种中国对虾抗高氨氮和高pH值家系的选育方法。背景技术：
[0002] 中国对虾是我国特有的地方品种，也是当前对虾养殖的主要品种之一。目前影响我国中国对虾养殖业持续、稳定和健康发展的主要限制因素有三个方面：苗种、病害和养殖环境。有关中国对虾品种选育及病害方面的研究，我国已陆续开展了大量的科研工作。品种选育方面，已培育出中国对虾“黄海1号”和“黄海2号”2个新品种，分别具有生长速度快和抗WSSV能力强的优良性状。病害防治方面由于基因工程技术的迅速发展，分别在中国对虾病毒病的流行病学、检测技术和综合防治技术等方面取得了突破性进展。但是随着中国对虾养殖生产集约化的发展，以及养殖过程中水质恶化、药物滥用、对虾养殖自身有机污染物的积累严重影响了对虾的生活环境，环境对中国对虾引起的胁迫也日益严重，但目前开展的对虾养殖环境方面的研究主要集中在环境胁迫因子对对虾生长、存活及非特异性免疫因子的影响研究，将遗传育种与养殖环境胁迫因子相结合进行选育的研究工作在国内外均尚未见报道。
[0003] 家系选育具有选育速度快、选育效果明显和优良性状突出等优点，在本发明做出之前，国内外均有类似的研究报道，如中科院海洋研究所相建海等(专利号：ZL03111110.6)制定了“养殖对虾家系的建立和良种选育方法”，阐述了从亲虾、育苗、养殖和收获对养殖对虾生长性状的选择方法。Argue等(美国夏威夷海洋研究所，2002)采用家系选育建立了生长和抗TSV品系，并采用建立的家系估计了2个性状的遗传力和遗传相关等，但相关报道仅限于生长和抗病性等方面的选育研究，没有将养殖环境胁迫因子作为选育目标进行相关研究，同时对于家系选育过程中的家系交配设计方案均没有详细的报道。
发明内容：
[0004] 本发明的目的是提供一种可选育出高产、抗高氨氮和高pH值能力强的中国对虾家系选育方法。
[0005] 本发明是按照以下操作技术方案完成的：1、收集不同地区养殖的中国对虾“黄海1号”构建基础群体并进行评估；2从不同群体中分别挑选亲虾，按完全双列杂交模式建立家系，单独育苗和养殖；3分别对各家系在仔虾I期(P1期)和150日龄进行高氨氮和高pH值胁迫试验，同时结合出池时各家系的养殖成活率筛选耐受性好的家系进行保种；4以保种家系为亲本，采用巢式设计建立家系，采用3方法筛选抗高氨氮和高pH值家系；5对筛选出的家系进行小规模示范养殖，确定和评估其优良的抗高氨氮和高pH值性状。
[0006] 1、收集不同地区养殖的中国对虾“黄海1号”构建基础群体并进行评估：收集3个以上不同地区养殖的中国对虾“黄海1号”雌雄个体各100尾组建基础群体，选择雌虾体长≥14cm，雄虾体长≥12cm的个体作为备选亲虾。
[0007] 2、从不同群体中分别挑选亲虾，按完全双列杂交模式建立家系，单独育苗和养殖：从备选亲虾中挑选健康、无病、活力强的个体作为亲虾，采用人工授精技术按完全双列杂交模式建立家系交配组合，每种交配组合为3-5个家系，雌雄比例为1∶1，对建立的家系进行单独育苗和养殖。
[0008] 3、分别对各家系在仔虾I期(P1期)和150日龄进行高氨氮和高pH值胁迫试验，同时结合出池时各家系的养殖成活率筛选耐受性好的家系进行保种：抗高氨氮和高pH值家系的筛选共分三次进行。第一次在发育至P1期时，每个家系随机取30-50尾，通过设置不同的试验梯度进行。氨氮梯度，以NH4CL(A.R.)溶于海水中制得，分别为2、4、8、16、32、64、128和256mg/L共8个试验梯度；pH值分别为8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4和9.6共
8个试验梯度，采用0.5mol/LHCL和1mol/LNaOH进行调制，连续试验三天，根据各家系不同试验梯度成活率计算半数致死值(LD50)，以所有家系的平均半数致死值为筛选指标，筛选耐受性好的家系；第二次在各家系生长至150日龄时，每个家系随机取30-50尾进行胁迫试验。高氨氮采用的浓度为64mg/L，pH值采用9.2进行胁迫，连续进行三天，统计每个家系内个体的死亡时间，以家系平均存活时间为指标进行第二次筛选；第三次结合出池，统计各家系养殖成活率，以所有家系的平均养殖成活率为指标进行筛选，最终只选择在三次筛选中表现均高于筛选指标的家系进行保种，作为第二年家系建立的亲本，每个家系的保种亲虾数目为雌虾100-200尾，雄虾50-100尾。
[0009] 4、以保种家系为亲本，采用巢式设计建立家系，采用(3)方法筛选抗高氨氮和高pH值家系：第二年采用巢式设计建立家系交配组合，每种交配组合建立2-3组，每组雌雄比例控制在2-3∶1，同时以未经胁迫试验的中国对虾“黄海1号”为对照，采用(3)中的胁迫试验设计进行家系内连续选育并进行保种；保种亲虾数目同(3)。
[0010] 5、对筛选出的家系进行小规模示范养殖，确定和评估其优良的抗高氨氮和高pH值性状：第三年对筛选出的抗高氨氮、高pH值家系在3个以上养殖区域进行小规模示范养殖，每个示范点养殖面积在50亩以上，同时以未进行胁迫试验的中国对虾“黄海1号”为对照，统计收获时的养殖成活率和亩产量对家系选育效果进行评价。
[0011] 本发明技术有以下特点：
[0012] 1、本发明在快速生长新品种-中国对虾“黄海1号”的基础上开展抗高氨氮、高pH值的家系选育，实现了生长和抗逆性状的聚合和累加，提高了中国对虾“黄海1号”对养殖环境的适应性，扩大了中国对虾“黄海1号”的适宜养殖区域，可促进我国对虾养殖业的可持续发展，满足人们日益增长的需求。
[0013] 2、通过小规模示范养殖结果表明，筛选出的抗高氨氮和高pH值家系具有明显的增产效果和较强的适应性，具有良好的推广和应用价值，经小规模的示范测试和比较试验，可以获得高产平均亩产量在80kg以上，养殖成活率较对照群体提高10-15％。
[0014] 3、可以培育出抗逆新品系或新品种，丰富了我国中国对虾的品种资源，提高了中国对虾对不同养殖环境的适应性，对我国生产上中国对虾品种的更新换代具重要意义。具体实施方式：
[0015] 下面通过实施例详细叙述本发明的技术方法：
[0016] 本发明是按照以下操作技术方案完成的：1、收集不同地区养殖的中国对虾“黄海1号”构建基础群体并进行评估；2从不同群体中分别挑选亲虾，按完全双列杂交模式建立家系，单独育苗和养殖；3分别对各家系在仔虾I期(P1期)和150日龄进行高氨氮和高pH值胁迫试验，同时结合出池时各家系的养殖成活率筛选耐受性好的家系进行保种；4以保种家系为亲本，采用巢式设计建立家系，采用3方法筛选抗高氨氮和高pH值家系；5对筛选出的家系进行小规模示范养殖，确定和评估其优良的抗高氨氮和高pH值性状。
[0017] 1、收集了昌邑、河北、胶州和日照4个不同地区养殖的中国对虾“黄海1号”群体组建基础群，每个群体的雌虾和雄虾数量均在100尾以上。对4个群体的体长进行测量与统计，选择雌虾体长≥14cm，雄虾体长≥12cm的个体作为备选亲虾；通过对4个群体生长和抗高氨氮、高pH值性状的杂交优势分析，最终确定采用杂交优势明显的昌邑、日照、河北3个地区养殖的中国对虾“黄海1号”群体作为建立家系的亲本。
[0018] 2、分别从3个群体的备选亲虾中随机选择9尾雄虾和9尾雌虾，按照完全双列杂交模式建立了27个全同胞家系，最后育苗成功的家系为25个，对建立的25个全同胞家系，单独进行育苗和养成工作，养殖密度同一控制在6000尾/亩。
[0019] 3、抗高氨氮和高pH值家系的筛选共分三次进行。
[0020] (1)第一次胁迫试验的具体操作是：待家系发育至P1期时，设置试验梯度：氨氮浓度，以NH4CL(A.R.)溶于海水中制得，梯度分别为2、4、8、16、32、64、128和256mg/L共8个试验梯度；pH值的梯度分别为8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4和9.6共8个试验梯度，采用0.5mol/LHCL和1mol/LNaOH进行调制；采用设置的试验梯度配置试验溶液，每个家系随机取30尾放入盛有400mL试验溶液的烧杯中，微量充气，每隔24h观察、记录各家系幼体死亡数，连续试验三天，采用SPSS13.0软件计算获得家系24h、48h和72h对氨氮耐受性的平均LD50分别为64.48、31.58和16.37mg/L，对pH值耐受性的平均LD50分别为10.09、9.43和9.14，以在24、48和72h耐受性均高于平均LD50为标准进行筛选，分别筛选出对氨氮和pH值耐受性较好的家系14和12个。
[0021] (2)第二次胁迫试验的具体操作是：待各家系发育至150日龄时，每个家系随机取20-30尾个体进行标记，标记的方法是分别在每个个体的第6腹节的左侧、右侧注射不同颜色组合的人造荧光橡胶(Vie标记)，不同的家系标记的颜色组合不同。标记完成后，所有
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家系的试验个体放入50m 的室内养殖池进行试验，试验溶液采用的高氨氮浓度为64mg/L，高pH值为9.2。试验开始后，每隔2-3h从养殖池内捞出死亡或频死的对虾，记录各家系个体的死亡时间，采用SPSS软件统计获得所有家系抗高氨氮的平均存活时间为25.64h，而抗高pH值的平均存活时间为30.16h，筛选出高于所有家系平均存活时间的家系分别为10和
9个。
[0022] (3)第三次家系筛选的具体操作是：到了养殖后期，在家系交尾以前进行收获，统计各家系收获的数量，计算所有家系的平均养殖成活率为61.25％，同时结合在前两次的胁迫试验表现均较好的家系，最终筛选出抗高氨氮和高pH值家系分别为5和6个，并进行留种，用于第二年家系选育的亲本。
[0023] 4、对选育出的11个家系，采用巢式设计建立了55个全同胞家系，根据(3)中的家系选育方法进行家系内连续选育。在养殖过程中以未经胁迫试验的中国对虾“黄海1号”群体为对照，养殖密度统一控制在6000尾/亩，统一进行饲养和管理，最终筛选出抗高氨氮家系和高pH值家系各24个，其中14个家系的抗高氨氮和高pH值能力均较强，最后留种家系
