中药治疗慢性肾脏损伤动物模型的建立方法

摘要

本发明公开了一种中药治疗慢性肾脏损伤动物模型的建立方法，该方法选用SD大鼠作为动物模型，D-硝基精氨酸腹腔注射给予SD大鼠，持续给药2-4个月后，血清中肌酐、尿素氮的含量明显升高，肾脏组织病理发生明显改变，氧化指标丙二醛浓度和谷胱甘肽过氧化酶活性明显升高，超氧化物歧化酶活性明显下降，肾脏组织中的一氧化氮水平和诱导型一氧化氮合酶活性均明显升高。D-硝基精氨酸所致肾脏损伤是通过其在肾脏发生手性转化过程中产生大量O2-离子和手性转化产物L-硝基精氨酸抑制一氧化氮合酶活性建立起来的，该机制与中药治疗肾脏损伤的通路相吻合。本发明动物模型的建立，将为中药治疗肾脏损伤疾病提供有效的研究载体。

权利要求

1.一种中药治疗慢性肾脏损伤动物模型的建立方法，其特征在于该方法选用SD清洁级大鼠，重量为80-120克，将D-硝基精氨酸用5％葡萄糖超声溶解，腹腔注射于SD大鼠，剂量为100-150mg/kg/d，每周给药4-7次，持续给药8-16周，构建为动物模型。

说明书

中药治疗慢性肾脏损伤动物模型的建立方法

技术领域：

[0001] 本发明涉及医疗评价、检测技术领域，具体涉及中药治疗慢性肾脏损伤动物模型的建立方法。

背景技术

[0002] 硝基精氨酸对一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性的抑制具有立体选择性，在体外L-硝基精氨酸(NG-nitro-L-arginine，L-NNA)可有效地抑制NOS，而其D-硝基精氨酸对NOS则几乎无抑制作用。体内一氧化氮(NO)是由一氧化氮合酶催化L-精氨酸氧化生成，一氧化氮作为体内的重要信号分子，具有调节血管阻力、血压、血小板聚集与黏附等多种生物学功能。NOS的催化作用可被L-NNA等精氨酸衍生物所抑制，从而引起动物血压长时间升高、肾脏动脉管腔缩小、动脉管壁局限性的坏死、微细血管堵塞，引起肾脏损伤。但是研究发现在大鼠体内D-NNA具有与L-NNA类似的升高动脉血压的生物活性。研究发现，D-NNA可能在体内发生手性转化。D-NNA手性转化存在两步反应机制：a.D-NNA在肾脏D型氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase，DAAO)作用下氧化脱氨生成α-酮酸；
b.α-酮酸在转氨酶参与下，通过立体选择性获取氨基生成L-NNA，实现手性转化。并进一步发现D-NNA可在大鼠体内单向手性转化生成L-NNA，肾脏是D-NNA发生转化的主要器官。
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体内D-NNA到L-NNA手性转化的过程中可以产生O2 离子。而O2 可以和细胞大分子反应，导致脂质过氧化、DNA和蛋白质的氧化。脂质过氧化可能导致膜损伤；DNA过氧化可以产生修复酶的活化作用，使得细胞内能量迅速衰竭，导致细胞死亡；对蛋白质的损害，尤其是酶，可以导致其功能的损伤。因此利用D-NNA建立肾功能损伤动物模型存在两种可行性机制：
a.D-NNA在DAAO作用下手性转化为L-NNA，L-NNA可抑制NOS的活性，进而使得NO产生减少，动物血压长时间升高、肾脏动脉管腔缩小、动脉管壁局限性的坏死、微细血管堵塞，引起- -
肾脏损伤；b.D-NNA转化为L-NNA的过程中，产生O2 离子，O2 离子对生物膜中不饱和脂肪酸(PUFA)的共价键有特殊的亲和力，使其发生一系列反应从而破坏生物膜的完整性和流动性，引起肾脏损伤。

[0003] 中药治疗肾脏损伤恰恰可以通过改善上述两条途径，一是激活L-Arg-NO途径产生NO，改善肾脏损伤：a.NO抑制血小板的活化，从而抑制血小板的粘附与聚集，阻止其释放5-羟色胺与凝血因子，阻断其凝血反应后的微血栓形成，改善肾脏血流，畅通血液循环；b.NO激活平滑肌细胞膜上可溶性鸟苷酸环化酶(GC)，经过一系列多途径的人体生物反应起到扩张血管平滑肌，改善血液循环。二是部分中药能有效降低MDA水平、提高谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低体内D-NNA手性转化过程中产生的-
O2 离子，防止脂质过氧化、DNA和蛋白质的氧化。目前，中药治疗慢性肾脏损伤动物模型的建立方法国内外文献尚未报道。
发明内容：

[0004] 本发明的目的在于提供一种成本低、使用方便、模型性能稳定、机理明确、适应性广的用于中药治疗慢性肾脏损伤动物模型的构建方法。

[0005] 本发明公开了一种中药治疗慢性肾脏损伤动物模型的建立方法，该方法选用SD(Sprague-Dawley)大鼠作为动物模型，D-硝基精氨酸(D-NNA)腹腔注射给予SD大鼠，持续给药2-4个月后，血清中肌酐(Crea)、尿素氮(Bun)的含量明显升高，肾脏组织病理表现为单核细胞浸润、肾小管扩张、间质增生、充血，氧化指标丙二醛(MDA)浓度和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性明显升高，超氧化物歧化酶(SOD)活性明显下降，肾脏组织中的NO水平和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性均明显升高。D-NNA所致肾脏损伤是通过其在肾脏发-生手性转化过程中产生大量O2 和手性转化产物L-NNA抑制NOS活性建立起来的，该机制与中药治疗肾脏损伤的通路相吻合。

[0006] 本发明所用动物为SD大鼠，重量80-120克，清洁级；动物模型构建方法：将D-硝基精氨酸(D-NNA)用5％葡萄糖超声溶解，腹腔注射于SD大鼠，剂量为100-150mg/kg/d，每周给药5-7次，持续给药8-16周。

[0007] 本发明的慢性肾脏损伤动物模型的的制备方法包括：将D-NNA用5％葡萄糖超声溶解，腹腔注射于SD大鼠，剂量为100-150mg/kg/d，每周给药5-7次，持续给药8-16周。得到的动物模型氧化指标丙二醛(MDA)浓度和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性明显升高，超氧化物歧化酶(SOD)活性明显下降；肾脏组织中的NO水平和iNOS活性均明显升高；血清肌酐(Crea)、尿素氮(Bun)的含量明显升高；肾脏组织病理表现为单核细胞浸润、肾小管扩张、间质增生、充血。

附图说明

[0008] 图1为肾脏组织皮质和髓质中一氧化氮(NO)水平。

[0009] 图2为肾脏组织中一氧化氮合酶(iNOS)的表达。

[0010] 图3为肾脏病理组织学变化(400×)。

[0011] (a)Control，(b)SM，(c)D-NNA，(d)D-NNA+SM.

[0012] 本发明的优点和有益效果为：

[0013] 1.本发明针对中药治疗肾脏损伤提供一种良好的动物模型；

[0014] 2.本发明机理明确、重现性好；

[0015] 3.本发明成功率高、性能稳定；

[0016] 4.可以做病理形态学对比分析，还可以进行统计学处理、分析；

[0017] 该动物模型的建立，为肾脏损伤的发病学、治疗学和药效学的研究奠定了重要的实验基础；该动物模型的建立，将为中药治疗肾脏损伤疾病提供有效的研究载体，为中药在肾脏疾病治疗方面取得更大的突破，提高治疗的有效性。具体实施方式：

[0018] 以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

[0019] 现结合实施例，对本发明动物模型构建方法以及中药对模型动物的治疗效果做详细描述。

[0020] 实施例

[0021] 一、实验动物与材料

[0022] 24只健康雄性SD大鼠(清洁级)，购自浙江省实验动物中心。

[0023] 丹参注射液(SM，10ml注射液相当于15g生药)：购自正大青春宝药业有限公司。

[0024] D-硝基精氨酸(D-NNA)购自Bachem Biosciences。

[0025] 二、试验方法

[0026] 将健康SD大鼠随机分成四组，分别为对照组，模型组，丹参对照组，丹参治疗组各六只。对照组(Control)在实验过程中注射5％葡萄糖溶液；模型组(D-NNA)腹腔注射给予D-NNA(120mg/kg/d)，连续给药12周，每周给药7次；丹参对照组(SM)在第13周开始静脉注射给予丹参注射液(5g/kg/d)，连续给药4周，每周给药5次；丹参治疗组(D-NNA+SM)腹腔注射给予D-NNA(120mg/kg/d)，连续给药12周，每周给药7次，第13周静脉注射给予丹参注射液(5g/kg/d)，连续给药4周，每周给药5次。该试验用于检测慢性肾脏损伤动物模型的制备效果和丹参注射液对肾脏损伤的保护作用。

[0027] 三、实验结果：

[0028] 1.各组SD大鼠血清中Crea和Bun水平

[0029] 分别在第12周和16周结束，采集各组大鼠血液，分离血清，利用全自动生化分析仪检测各组SD大鼠血清中Crea、Bun水平。结果显示，连续给予D-NNA 12周，模型组血清中Crea和Bun水平明显高于对照组；经过4周丹参注射液治疗后，模型组血清中Crea和Bun水平得到明显改善，见(表1)。

[0030] 表1血清中Crea和Bun水平

[0031]

[0032] 与D-NNA组比较*，P＜0.05and**，P＜0.01；与Control组比较#，P＜0.05and##，P＜0.01

[0033] 2、各组SD大鼠肾脏组织中MDA浓度和GSH-Px、SOD活性

[0034] 分别在第12周和16周结束，收集各组大鼠肾脏，研磨后分析肾脏组织中MDA浓度和GSH-Px、SOD活性。结果显示，连续给予D-NNA 12周，模型组肾脏组织中MDA浓度和GSH-Px活性明显升高，SOD活性明显下降；经过4周丹参注射液治疗后，模型组肾脏组织中MDA浓度和GSH-Px、SOD活性均得到明显改善见(表2)。

[0035] 表2肾脏组织中MDA浓度和GSH-Px、SOD活性

[0036]

[0037] 与D-NNA组比较*，P＜0.05and**，P＜0.01；与Control组比较#，P＜0.05and##，P＜0.01

[0038] 3.各组SD大鼠肾脏组织中一氧化氮水平

[0039] 在第16周结束，分离各组大鼠肾脏皮质和髓质，分析皮质和髓质中NO水平。结果显示，模型组皮质和髓质中NO水平均明显低于对照组；经过4周丹参注射液治疗后，模型组皮质和髓质中NO水平均得到明显改善(图1)。

[0040] 4.各组SD大鼠肾脏组织中诱导性一氧化氮合酶(iNOS)表达

[0041] 在第16周结束，提取各组大鼠肾脏组织总蛋白，经过SDS-PAGE分离后进行Western blot分析。结果显示，模型组肾脏组织中iNOS的表达明显低于对照组；经过4周丹参注射液治疗后，模型组肾脏组织中iNOS的表达得到了明显提高见(图2)。

[0042] 5.各组SD大鼠肾脏病理组织学变化

[0043] 在第16周结束，制备各组大鼠肾脏组织病理切片，苏木素-伊红(HE)染色后进行镜检。结果显示，模型组肾脏组织病理表现为严重的单核细胞浸润，中等程度的肾小管扩张、充血和轻微的间质增生；经过4周丹参注射液治疗后，模型组的单核细胞浸润、肾小管扩张、间质增生和充血均得到了一定的改善(表3，图3)。

[0044] 表3肾脏病理组织学变化

[0045]

[0046] -：无病变，+：轻微病变，++：中等病变，+++：严重病变.