本发明涉及一种核酸酶激活型荧光纳米探针及其制备方法，该探针包括壳层和核层，其中核层包括药物和双链DNA探针分子，双链DNA探针分子包括双链DNA、荧光基团和淬灭基团；壳层包裹核层，荧光基团位于双链DNA一条链的5’末端或3’末端，淬灭基团位于该链的3’末端或5’末端或另一条链的5’末端或3’末端。核酸酶激活型荧光纳米探针通过将荧光基团和淬灭基团耦合于同一双链DNA分子中，只有在被胞内核酸酶激活的情况下才能发出荧光，因此可以准确的记录和检测药物载体在体内的传递和代谢情况，而且可以降低背景荧光对药物载体分析的干扰。同时，探针制备方法简单，原料相对便宜，使用有毒有机试剂少，减少了反应步骤，提供了制备效率，便于推广应用。
1.一种核酸酶激活型荧光纳米探针，其特征在于，包括壳层和核层，所述壳层包裹所述核层，所述核层包括药物和双链DNA探针分子，所述双链DNA探针分子包括双链DNA、荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团位于双链DNA一条链的5’末端或3’末端，所述淬灭基团位于该链的3’末端或5’末端或另一条链的5’末端或3’末端。
2.如权利要求1所述的核酸酶激活型荧光纳米探针，其特征在于，所述壳层为有机聚合物、磷脂或无机材料。
3.如权利要求1所述的核酸酶激活型荧光纳米探针，其特征在于，所述荧光基团为芘、异硫氰酸荧光素、罗丹明、绿色罗丹明、X-罗丹明、多甲藻黄素叶绿素蛋白、藻红蛋白、羧基荧光素、花青素系列荧光染料、四甲基罗丹明、德克萨斯红、四氯羧基荧光素、亚历克斯荧光素系列、硝基苯并氧杂恶二唑、六氯荧光素、萘并荧光素、二苯基蒽系列、香豆素系列或吖啶中的一种。
4.如权利要求1所述的核酸酶激活型荧光纳米探针，其特征在于，所述淬灭基团为黑洞淬灭剂系列、4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸或蒙蔽淬灭剂中的一种。
5.如权利要求1所述的核酸酶激活型荧光纳米探针，其特征在于，所述的双链DNA长度为8-30个碱基对。
6.一种核酸酶激活型荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
合成双链DNA探针分子，所述双链DNA探针分子包括双链DNA、荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团位于双链DNA一条链的5’末端或3’末端，所述淬灭基团位于该链的3’末端或
7.如权利要求6所述的核酸酶激活型荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述壳层包裹双链DNA探针分子步骤包括：首先，量取氯仿和甲醇混合备用；其次，称取1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷溶于上述制备的氯仿甲醇混合液中，得到1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷的氯仿甲醇溶液，再称取1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯溶于上述制备的氯仿甲醇混合液中，得到1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯得氯仿甲醇溶液；再量取该1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷的氯仿甲醇溶液和1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯得氯仿甲醇溶液混合，在氮气装置中吹至成膜，干燥过夜后除去过量的氯仿和甲醇；
然后加入合成的双链DNA探针分子，水化，再在超声仪中超声，过聚碳酸酯膜，反复挤压即可得到脂质体壳层包载的双链DNA探针分子。
8.如权利要求7所述的核酸酶激活型荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述氯仿和甲醇混合是按照体积比为2∶1混合。
9.如权利要求7所述的核酸酶激活型荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述
1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷的氯仿甲醇溶液浓度为6.986mg/ml，所述1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯氯仿甲醇溶液的浓度为7.582mg/ml。
10.如权利要求7所述的核酸酶激活型荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述1，
2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷的氯仿甲醇溶液与所述1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯氯仿甲醇溶液混合是按照体积比为1∶4混合。
11.如权利要求7所述的核酸酶激活型荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述聚碳酸酯膜的孔径为200nm。
核酸酶激活型荧光纳米探针及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及纳米药物领域，尤其涉及一种核酸酶激活型荧光纳米探针及其制备方法。【背景技术】
[0002] 癌症已成为威胁人类生命的最大杀手之一。研究无创、无害且有效的癌症治疗方法已成为当务之急。而纳米技术的纳米药物载体的出现，为癌症的治疗带来了新的曙光。纳米载体通过精确的靶向治疗将药物高剂量地集中传递到肿瘤部位而减少其对正常细胞的损伤；纳米药物载体不但可以提高药物的溶解度，增强药物的稳定性，避免药物在到达病灶前被降解，而且还可以同时对多种药物进行共定位靶向传递和控制释放，从而达到减少给药剂量，降低药物毒副作用，增加药物的有效吸收，提高药物生物利用度。 [0003] 尽管纳米药物载体为肿瘤的治疗提供了新的方法和思路，为肿瘤药物制剂的开发带来了新的机遇，而且体外实验效果也非常显著，但是在临床应用中研究者却发现，肿瘤纳米药物载体的疗效并不理想，纳米药物载体的靶向治疗很难名副其实。这种体内外疗效的差异表明，在采用纳米药物载体进行临床治疗的过程中一些关乎药物载体体内转运过程、作用原理和药物动力学的关键问题没有得到解决，而研究这些问题的主要手段就是进行药物载体的体内分析。
[0004] 但目前常规的体内药物分析方法如免疫分析、光谱分析、放射同位素分析、色谱-质谱联用等分析方法对于药物载体的体内分析并不适用，这里的“药物载体”不单指载体材料，它指一个完整的纳米颗粒，包括药物、载体材料及修饰在载体上的生物配体分子等。这些微量分离分析技术并不能实时、原位、动态地监测药物载体在活体动物内的传递和代谢情况，而且无法检测药物进入细胞的情况。【发明内容】
[0005] 基于此，有必要提供一种能实时动态的监测纳米药物载体在体内的传递和代谢的核酸酶激活型荧光纳米探针。
[0006] 同时，还有必要提供一种能实时动态的监测纳米药物载体在体内的传递和代谢的核酸酶激活型荧光纳米探针的制备方法。
[0007] 一种核酸酶激活型荧光纳米探针，包括壳层和核层，所述壳层包裹所述核层，所述核层包括药物和双链DNA探针分子，所述双链DNA探针分子包括双链DNA、荧光基团和淬灭基团；所述荧光基团位于双链DNA一条链的5’末端或3’末端，所述淬灭基团位于该链的3’末端或5’末端或另一条链的5’末端或3’末端。
[0008] 优选的，所述壳层为有机聚合物、磷脂或无机材料。
[0009] 优选的，所述荧光基团为芘、异硫氰酸荧光素、罗丹明、绿色罗丹明、X-罗丹明、多甲藻黄素叶绿素蛋白、藻红蛋白、羧基荧光素、花青素系列荧光染料、四甲基罗丹明、德克萨斯红、四氯羧基荧光素、亚历克斯荧光素系列、硝基苯并氧杂恶二唑、六氯荧光素、萘并荧光素、二苯基蒽系列、香豆素系列或吖啶中的一种。
[0010] 优选的，所述淬灭基团为黑洞淬灭剂系列、4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸或蒙蔽淬灭剂中的一种。
[0011] 优选的，所述的双链DNA长度为8-30个碱基对。
[0012] 一种核酸酶激活型荧光纳米探针的制备方法，包括如下步骤： [0013] 合成双链DNA探针分子，所述双链DNA探针分子包括双链DNA、荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团位于双链DNA一条链的5’末端或3’末端，所述淬灭基团位于该链的3’末端或5’末端或另一条链的5’末端或3’末端；
[0014] 用壳层包裹双链DNA探针分子。
[0015] 优选的，所述壳层包裹双链DNA探针分子步骤包括：首先，量取氯仿和甲醇混合备用；其次，称取1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷溶于上述制备的氯仿甲醇混合液中，得到1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷的氯仿甲醇溶液，再称取1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯溶于上述制备的氯仿甲醇混合液中，得到1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯得氯仿甲醇溶液；再量取该1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷的氯仿甲醇溶液和1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯得氯仿甲醇溶液混合，在氮气装置中吹至成膜，干燥过夜后除去过量的氯仿和甲醇；然后加入合成的双链DNA探针分子，水化，再在超声仪中超声，过聚碳酸酯膜，反复挤压即可得到脂质体壳层包载的双链DNA探针分子。
[0016] 优选的，所述氯仿和甲醇混合是按照体积比2∶1混合。
[0017] 优选的，所述1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷的氯仿甲醇溶液浓度为6.986mg/ml，所述1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯氯仿甲醇溶液的浓度为7.582mg/ml。 [0018] 优选的，所述1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷的氯仿甲醇溶液与所述1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯氯仿甲醇溶液混合是按照体积比为1∶4混合。 [0019] 优选的，所述聚碳酸酯膜的孔径为200nm。
[0020] 核酸酶激活型荧光纳米探针通过将荧光基团和淬灭基团耦合于同一双链DNA分子中，在未被核酸酶分解激活的情况下，由于淬灭基团的存在，双链DNA探针分子不发光，但当携带该双链DNA探针分子的药物载体进入相应的组织细胞，在胞内核酸酶的酶解作用下，双链DNA探针分子解离，荧光基团和淬灭基团分离而发出荧光，因此可以准确的记录和检测药物载体在体内的传递和代谢情况，而且可以最大限度的降低背景荧光对药物载体分析的干扰。同时，该核酸酶激活型荧光纳米探针制备方法简单，原料相对便宜，不需要使用过多有毒的有机试剂，减少了反应步骤，提供了制备效率，便于推广应用。 【附图说明】
[0021] 图1是实施例采用的双链DNA探针分子的结构示意图；
[0022] 图2是实施例采用的双链DNA探针分子的酶切前后的荧光强度图； 【具体实施方式】
[0023] 核酸酶激活型荧光纳米探针，巧妙的利用了细胞内源性的DNA酶来激发其中的探针分子荧光以探测药物载体与细胞的相互作用，核酸酶激活型探针分子最初是没有荧光的，只有进入细胞，被细胞内的DNA酶降解才能发出荧光，因此在对动物进行活体成像分析时，就能最大限度地降低背景荧光对药物载体分析的干扰。由于该核酸酶激活型探针分子可以作为药物载体的一部分，因此可以用来研究药物在体内的分级控释性能、药物载体和药物在肿瘤组织和体内各脏器的分布情况等。
[0024] 核酸酶激活型荧光纳米探针，包括壳层和核层，其中核层包括双链DNA探针分子和药物，所述壳层为有机聚合物、磷脂或无机材料等。
[0025] 双链DNA探针分子包括DNA分子、荧光基团和淬灭基团。DNA分子为一段由A、T、C、G核苷酸组成的双链的随意序列，序列长度太短无法商品化构建，太长则构建成本较高，所以一般选用8-30个碱基对的双链DNA分子；荧光基团标记于双链DNA分子一条链的5’末端或3’末端，而该链的3’末端或5’末端或者相对应的另一条链的5’末端或者3’末端标记有可以淬灭该荧光基团的淬灭基团，如图1所示为一段具有24个碱基对的标记有荧光基团和淬灭基团的双链DNA探针分子。
[0026] 其中荧光基团为芘(pyrene)、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(Rhodamine)、绿色罗丹明(Rhodamine Green)、X-罗丹明(X-Rhodamine)、多甲藻黄素叶绿素蛋白(PerCP)、藻红蛋白(PE)、羧基荧光素(FAM)、花青素系列荧光染料(Cy系列，Cy3、Cy5、Cy5.5等)、四甲基罗丹明(Tetramethylrhodamine)、德克萨斯红(Texas Red)、四氯羧基荧光素(TET)、亚历克斯荧光素系列(Alexa Fluor系列荧光染料)、硝基苯并氧杂恶二唑(NBD)、六氯荧光素(HEX)、萘并荧光素(Naphthofluorescein)、二苯基蒽系列(D2-PA、D3-PA、D4-PA)香豆素系列(coumarin系列)、吖啶(Acridine)等，优选为罗丹明、X-罗丹明、羧基荧光素、Cy3、Cy5、D2-PA、D3-PA、D4-PA。
[0027] 淬灭基团为黑洞淬灭剂系列(Black Hole Quencher系列，BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3)、4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)、蒙蔽淬灭剂(ECLIPSE)等，优选为BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸。
[0028] 核酸酶激活性荧光纳米探针的具体制备流程包括：
[0029] 首先，商品化合成8-30个碱基对的双链DNA探针分子。
[0030] 所述双链DNA探针分子包括双链DNA、荧光基团和淬灭基团，荧光基团标记于双链DNA分子一条链的5’末端或3’末端，而淬灭基团标记于该链的3’末端或5’末端或者相对应的另一条链的5’末端或者3’末端。
[0031] 其次，用脂质体壳层包载双链DNA探针分子。
[0032] 量取一定体积的氯仿和甲醇按体积比2∶1混合备用；称取一定量的1，2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷(DOTAP)和1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯(DOPC)分别溶于上述的氯仿甲醇混合液中，其中DOTAP浓度为6.986mg/ml，DOPC浓度为7.582mg/ml；再量取一定体积的DOTAP氯仿甲醇溶液和DOPC氯仿甲醇溶液按体积比1∶4混合，放置在一定的容器中，在氮气装置中吹至成 膜，干燥过夜后除去过量的氯仿和甲醇；然后加入商品化合成的双链DNA探针分子，水化，再在超声仪中超声10分钟，过孔径为200nm的聚碳酸酯膜，反复挤压即可得到脂质体壳层包载的双链DNA探针分子。
[0033] 具体检测实施例如下：
[0034] 首先，商品化合成一段具有24个碱基对的双链DNA探针分子，其结构如图1所示。然后，向准备好的1ml的离心管中加入15ml 26mM/ml的上述双链DNA探针分子的磷酸溶解液；再加入60μl的10×脱氧核糖核酸酶I(DNase I)缓冲液。在荧光仪上检测这种混合溶液的荧光强度；检测完毕后再加入200单位的脱氧核糖核酸酶I，在37℃水浴孵化30分钟，再检测其荧光强度。
[0035] 通过对商品化合成的双链DNA探针分子进行荧光激活实验分析，如图2所示，可以发现激活前双链DNA探针分子荧光强度为0，即双链DNA探针分子不发荧光，在进行DNase I酶解激活后，双链DNA探针分子中DNA双链解离，淬灭基团与荧光基团分离，探针发出荧光。
[0036] 对脂质体包载的双链DNA探针分子可以通过测量其粒径和zeta电位来检测：分别量取10ml的氯仿，5ml的甲醇，混匀放置；精密称取34.93mg的DOTAP、37.91mg的DOPC分别溶于5ml的氯仿甲醇溶液。将20μl DOTAP氯仿甲醇溶液和80ul的DOPC氯仿甲醇溶液混合，放置在小瓶中；氮气装置吹至成膜。干燥过夜，除去过量的氯仿和甲醇；然后加入0.5ml的商品化合成的双链DNA探针分子，水化；水化的悬液置于水浴超声仪中超声10min；
过200nm的聚碳酸酯膜，反复挤压，检测探针的粒径、zeta电位。
[0037] 核酸酶激活型荧光纳米探针通过将荧光基团和淬灭基团耦合于同一双链DNA分子中，在未被核酸酶分解激活的情况下，由于淬灭基团的存在，双链DNA探针分子不发光，但当携带该双链DNA探针分子的药物载体进入相应的组织细胞，在胞内核酸酶的酶解作用下，双链DNA探针分子解离，荧光基团和淬灭基团分离而发出荧光，因此可以比较准确的记录和检测药物载体在体内的传递和代谢情况，而且可以最大限度的降低背景荧光对药物载体分析的干扰。同时，该核酸酶激活型荧光纳米探针制备方法简单，原料相对便宜，不需要使用过多有毒的有机试剂，减少了反应步骤，提供了制备效率，便于推广应用。 [0038] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
