一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法

摘要

本发明公开了一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，该序列具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。该序列是一种新的TPS基因序列，使人们对TPS基因的研究对象从大肠杆菌和真菌等微生物及少数有限的植物体进一步扩展到垫状卷柏等多种植物体。并且，根据该TPS基因在垫状卷柏植物体内催化合成的海藻糖所表现出的优良的抗旱、耐盐等性能可以预料：如果将其通过转基因技术导入玉米等其他植物的基因中，将可培育出具有相应的优良的抗旱、耐盐等性能的植物新品种。本发明还公开了一种上述来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列的克隆方法。

权利要求

1.一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，该序列如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的序列，其特征在于：所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

3、一种权利要求1所述的来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步骤：（1）总RNA的提取和纯化：

采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物垫状卷柏叶片中提取得到纯化的垫状卷柏叶片总RNA；

（2）中间片段的克隆：

A、中间片段cDNA第一链的合成

以上述步骤（1）纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以oligod (T) 18：5´-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3´为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的cDNA模板；

B、PCR扩增

以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为cDNA模板，利用下述上游引物jf1和下游引物jx1，进行PCR扩增：jf1: 5´-TGGTCGTAAGGTTATGTTGGG-3´，jx1: 5´-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3´；

扩增得到垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列；

（3）3´端的克隆：

以前述步骤（2）A中得到的cDNA第一链为模板，利用下述上游引物S1和下游引物AP2进行PCR扩增：S1: 5´-GCCATCAGAGAAAGCGGTTACT-3´，AP2: 5´-TACGTACGGCATG ACAGTG-3´；

扩增得到完整的3´端，通过克隆测序，得到3´端序列；

（4）5´端的克隆：

C、合成5´端的cDNA第一链：

以上述步骤（1）纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以下述下游引物jx1和上游引物SMARTIIA Oligo为反转录引物，进行反转录：jx1: 5´- TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3´，SMARTIIA Oligo: 5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3´；

合成得到反转录产物5´端的cDNA第一链；

D、第一段PCR扩增：

以前述步骤C所得反转录产物5´端的cDNA第一链为cDNA模板，利用下述下游引物A2和同源上游引物C1，进行5´端第一段PCR扩增：A2: 5´-TCTTTTCATTTTGACAGGCGAC-3´，C1：5´-ATCGGATGGCCTGGTGTCTATG-3´；

扩增得到的产物为cDNA 5´端第一段，通过克隆测序，得到5´端第一段的序列；

E、第二段PCR扩增：

以前述步骤C所得反转录产物5´端的cDNA第一链为cDNA模板，利用下述下游引物A5和上游引物P3，进行5´端第二段PCR扩增；

A5: 5´-GCGGTCTTCTTGACGCAATCCAATGTAG-3´，P3: 5´-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3´ ；

扩增得到的产物为cDNA 5´端第二段，通过克隆测序，得到5´端第二段序列；

（5）ORF的克隆和拼接：

将上述步骤（2）所得中间片段序列、步骤（3）所得3´端序列、和步骤（4）所得5´端第一段序列和第二段序列进行拼接，得到的cDNA全长作为ORF扩增的cDNA模板；

以下述上游引物ORF4和下游引物ORF5进行PCR扩增：ORF 4：5´-CCCAAGCTT(Hind )CCTCGAG(Xho )ATGCCTACTCCGTATTCCAATAC -3´，ORF5: 5´-CGC GGATCC (BamH )ATTAATTATCGACAGCGACAACC-3´；

扩增得到的产物为完整开放阅读框，即垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因，通过克隆测序，即得其基因序列。

4、根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步骤（1）中，采用的RNA提取方法为Trizol法；纯化方法为DNA酶消化法。

5、根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步骤（2）中进行PCR扩增时，扩增体系为：TaqPlusPCR Master Mix 10 μL ，cDNA模板 1 μL ，

2×引物：jx1/jf1 0.5 μL ，ddH2O 8 μL ；

扩增程序为：

94℃，5min；

94 ℃，30 s，55 ℃，45 s，72℃，1 min 30 s；30个循环；

72 ℃，8 min；4℃保温。

6、根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步骤（3）中进行PCR扩增时，扩增体系为：TaqPlusPCR Master Mix 10 μL ，cDNA模板 2 μL ，

2×引物：S1/AP2 0.5 μL ，ddH2O 7 μL ；

扩增程序为：

94℃，3 min；

94℃，30 s；55℃，45 s；72℃，1 min 30 s；33个循环；

72℃，8 min；12℃保温。

7、根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步骤（4）中进行第一段PCR扩增时，扩增体系为：

TaqPlusPCR Master Mix 12 μL ，cDNA模板 2 μL ，

2×引物：A2/C1 0.5 μL ，ddH2O 5 μL ；

扩增程序为：

94℃，3 min；

94℃，30 s；65℃，45 s；72℃，1 min 30 s ；2个循环；

每两个循环递减2℃；

94℃，30 s；55℃，45 s；72℃，1 min 30 s ；25个循环；

72℃，8 min；12℃保温。

8、根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步骤（4）中进行第二段PCR扩增时，扩增体系为：

TaqPlusPCR Master Mix 10 μL ，cDNA模板 1.5 μL ，

2×引物：A5/P3 0.5 μL ，ddH2O 7.5 μL ；

扩增程序为：

94℃，30 s；72℃，2 min；5个循环；

94℃，30 s；70℃，30 s；72℃，2 min ；5个循环；

94℃，30 s；68℃，30 s；72℃，2 min ；25个循环；

12℃保温。

9、根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于：所述的步骤（5）中进行PCR扩增时，扩增体系为：

2+

2×GC BufferⅠ、含Mg 10 μL ，

2×引物：ORF4/ORF5 0.5 μL ，cDNA模板 1 μL ，dNTP Mixture 3.2 μL ，TaKaRa LA Taq 0.2 μL ，ddH2O 4.6 μL ；

扩增程序为：

94℃，5 min；

94℃，30 s；57℃，1 min 30 s；72℃，2 min ；10个循环；

94℃，30 s；72℃，2 min 30 s ；25个循环；

72℃，8 min；12℃保温。

说明书

一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及

其克隆方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法。

背景技术

[0002] 垫状卷柏（Selaginella pulvinata Maxim）为卷柏科卷柏属植物，俗称“九死还魂草”。它一般多生长在荒山秃岭及干旱的岩石缝中，极耐干旱，也耐寒。在天气干旱的时候，小枝就卷起来，缩成一团，以保住体内的水分。一旦得到雨水，气温升高，卷缩的小枝会平展开来。有研究表明垫状卷柏这类复苏植物体内含有大量的应激代谢物-海藻糖。

[0003] 海藻糖又称酵母糖，是由两个吡喃环葡萄糖分子通过α-1,1糖苷键连结而成的非还原性糖，其理化性质十分稳定，能够在高温、高寒、高盐和干燥失水等恶劣条件下对生物细胞起到保护作用。海藻糖作为渗透调节物质通过渗透调节来维持高的细胞质渗透压，保证在干旱胁迫下细胞的正常生理功能；在缺水情况下，可以保持细胞膜的液体流动相，防止细胞膜通透性增加，出现融合现象；可以替代水分子通过氢键作用参与肽链折叠，维持在缺水情况下蛋白质的空间结构和功能。

[0004] 在生物体内，海藻糖的生物合成过程为：先由海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase,TPS）催化尿苷二磷酸葡萄糖（UDP）和6-磷酸葡萄糖反应生成6-磷酸海藻糖，再在海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶 （treha1ose-6-phosphate phosphatase,TPP）的作用下脱磷酸，最终生成海藻糖。其中，海藻糖-6-磷酸合成酶是该合成途径中的一个关键酶；不同生物体内的海藻糖-6-磷酸合成酶具有各自不同的特点，如在编码基因和结构等方面即存在着明显的差异。

[0005] 目前人们研究海藻糖的主要策略之一，是通过对海藻糖上述合成途径相关基因的克隆与表达研究，增强其合成途径的代谢，从而实现海藻糖在生物体内的富集。其中海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）成为主要关注对象之一，许多科学家在此方面进行了不懈的努力。但目前，人们对大肠杆菌和真菌等体内TPS基因的研究与利用相对较多，对植物体内TPS基因的开发研究还非常有限。

发明内容

[0006] 本发明的主要目的就是针对现有技术对植物体内海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）基因开发研究的局限性，提供一种来源于植物垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶的基因序列，以期待应用于其它转基因作物中使之具有相应的优良的抗旱耐盐等性能。

[0007] 本发明的另一个目的是提供一种上述基因序列的克隆方法。

[0008] 为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

[0009] 一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列，该序列具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。

[0010] 其所对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

[0011] 上述核苷酸序列，可通过包括下述步骤的方法，从植物垫状卷柏叶片中提取总RNA、设计引物、进行PCR扩增、测序等克隆得到：

[0012] （1）总RNA的提取和纯化：

[0013] 可采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物垫状卷柏叶片中提取得到纯化的垫状卷柏叶片总RNA；

[0014] 常用的RNA提取方法很多，如试剂盒法（Trizol法）、热硼酸法、异硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸钠法、十六烷基三甲基溴化铵法、及各种改进方法等，均可用于垫状卷柏叶片总RNA的提取；本发明中可优选Trizol法。

[0015] 纯化主要是为了去除总RNA中的DNA污染，获得纯化的垫状卷柏叶片总RNA，以满足后续对目的基因的表达进行定量检测等需要。常用的RNA纯化方法包括：DNA酶消化法(简称 D法)、酸酚变性法(简称S法)、EDTA法(简称 E法)等；本发明中可优选DNA酶消化法。

[0016] （2）中间片段的克隆：

[0017] A、中间片段cDNA第一链的合成

[0018] 以上述步骤（1）纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以oligod (T) 18：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3’为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的cDNA模板；

[0019] B、PCR扩增

[0020] 以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为cDNA模板，利用下述上游引物jf1和下游引物jx1，进行PCR扩增：

[0021] jf1: 5’-TGGTCGTAAGGTTATGTTGGG-3’，

[0022] jx1: 5’-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3’；

[0023] 扩增得到垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。

[0024] 本步骤中，扩增体系可优选为：

[0025] TaqPlusPCR Master Mix 10 μL ，

[0026] cDNA模板 1 μL ，

[0027] 2×引物（jx1/jf1） 0.5 μL ，

[0028] ddH2O 8 μL 。

[0029] 扩增程序可优选为：

[0030] 94℃，5min；

[0031] 94℃，30 s，55℃，45 s，72℃，1 min 30 s（30个循环）；

[0032] 72℃，8 min；4℃保温。

[0033] （3）3’端的克隆：

[0034] 根据上述步骤（2）得到的中间片段序列，设计并合成用于扩增3’端的特异性上游引物S1和通用性下游引物AP2，分别为：

[0035] S1: 5’-GCCATCAGAGAAAGCGGTTACT-3’，

[0036] AP2: 5’-TACGTACGGCATG ACAGTG-3’；

[0037] 以前述步骤（2）A中得到的cDNA第一链为模板，利用上游引物S1和下游引物AP2进行PCR扩增；扩增得到完整的3’端，通过克隆测序，得到3’端序列。

[0038] 本步骤中，扩增体系可优选为：

[0039] TaqPlusPCR Master Mix 10 μL ，

[0040] cDNA模板 2 μL ，

[0041] 2×引物（S1/AP2） 0.5 μL ，

[0042] ddH2O 7 μL 。

[0043] 扩增程序可优选为：

[0044] 94℃，3 min；

[0045] 94℃，30 s；55℃，45 s；72℃，1 min 30 s（33个循环）

[0046] 72℃，8 min；12℃保温。

[0047] （4）、5’端的克隆：

[0048] C、合成5’端的cDNA第一链

[0049] 以上述步骤（1）纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以下述特异性下游引物jx1和5’端接头上游引物SMARTIIA Oligo为反转录引物，进行反转录：

[0050] jx1: 5’- TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3’，

[0051] SMARTIIA Oligo: 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’；

[0052] 合成得到反转录产物5’端的cDNA第一链；

[0053] D、第一段PCR扩增

[0054] 根据上述步骤（2）得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物A2和同源上游引物C1：

[0055] A2: 5’-TCTTTTCATTTTGACAGGCGAC-3’，

[0056] C1：5’-ATCGGATGGCCTGGTGTCTATG-3’；

[0057] 以前述步骤C所得反转录产物5’端的cDNA第一链为cDNA模板，利用特异性下游引物A2和同源上游引物C1，进行5’端第一段PCR扩增；

[0058] 扩增得到的产物为cDNA 5’端第一段，通过克隆测序，得到5’端第一段的序列。

[0059] 本步骤中，扩增体系可优选为：

[0060] TaqPlusPCR Master Mix 12 μL ，

[0061] cDNA模板 2 μL ，

[0062] 2×引物（A2/C1） 0.5 μL ，

[0063] ddH2O 5 μL 。

[0064] 扩增程序可优选为：

[0065] 94℃，3 min；

[0066] 94℃，30 s；65℃，45 s；72℃，1 min 30 s （2个循环）；

[0067] 每两个循环递减2℃；

[0068] 94℃，30 s；55℃，45 s；72℃，1 min 30 s （25个循环）；

[0069] 72℃，8 min；12℃保温。

[0070] E、第二段PCR扩增

[0071] 根据前述步骤D所得cDNA 5’端第一段的序列，设计并合成特异性下游引物A5和5’端通用性上游引物P3：

[0072] A5: 5’-GCGGTCTTCTTGACGCAATCCAATGTAG-3’，

[0073] P3: 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ ；

[0074] 以前述步骤C所得反转录产物5’端的cDNA第一链为cDNA模板，利用特异性下游引物A5和5’端通用性上游引物P3，进行5’端第二段PCR扩增：

[0075] 扩增得到的产物为cDNA 5’端第二段，通过克隆测序，得到5’端第二段序列。

[0076] 本步骤中，扩增体系可优选为：

[0077] TaqPlusPCR Master Mix 10 μL ，

[0078] cDNA模板 1.5 μL ，

[0079] 2×引物（A5/P3） 0.5 μL ，

[0080] ddH2O 7.5 μL 。

[0081] 扩增程序可优选为：

[0082] 94℃，30 s；72℃，2 min（5个循环）；

[0083] 94℃，30 s；70℃，30 s；72℃，2 min （5个循环）；

[0084] 94℃，30 s；68℃，30 s；72℃，2 min（25个循环）；

[0085] 12℃保温。

[0086] （5）ORF的克隆和拼接：

[0087] 将上述步骤（2）所得中间片段序列、步骤（3）所得3’端序列、和步骤（4）所得5’端第一段序列和第二段序列进行拼接，得到的cDNA全长作为ORF（Open Reading Frame，开放阅读框）扩增的cDNA模板；

[0088] 以下述上游引物ORF4和下游引物ORF5进行PCR扩增：

[0089] ORF 4：5’-CCCAAGCTT(Hind Ⅲ )CCTCGAG(Xho Ⅰ )ATGCCTACTCCGTATTCCAATAC -3’，

[0090] ORF5: 5’-CGC GGATCC (BamH Ⅰ)ATTAATTATCGACAGCGACAACC-3’；

[0091] 扩增得到的产物为完整开放阅读框，即垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因，通过克隆测序，即得其基因序列。

[0092] 本步骤中，扩增体系可优选为：

[0093] 2×GC BufferⅠ（含Mg2+） 10 μL ，

[0094] 2×引物（ORF4/ORF5） 0.5 μL ，

[0095] cDNA模板 1 μL ，

[0096] dNTP Mixture 3.2 μL ，

[0097] TaKaRa LA Taq 0.2 μL ，

[0098] ddH2O 4.6 μL 。

[0099] 扩增程序可优选为：

[0100] 94℃，5 min；

[0101] 94℃，30 s；57℃，1 min 30 s；72℃，2 min （10个循环）；

[0102] 94℃，30 s；72℃，2 min 30 s （25个循环）；

[0103] 72℃，8 min；12℃保温。

[0104] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0105] 本发明来源于植物垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）的基因序列是一种新的TPS基因序列，使人们对TPS基因的研究对象从大肠杆菌和真菌等微生物及少数有限的植物体进一步扩展到垫状卷柏等多种植物体。

[0106] 并且，根据该TPS基因在垫状卷柏植物体内催化合成的海藻糖所表现出的优良的抗旱、耐盐等性能可以预料：如果将其通过转基因技术导入玉米等其他植物的基因中，将可培育出具有相应的优良的抗旱、耐盐等性能的植物新品种。

附图说明

[0107] 图1为SpTPS1基因中间片段电泳检测结果图，

[0108] 图2为SpTPS1基因3’端电泳检测结果图，

[0109] 图3为SpTPS1基因5’第一段电泳检测结果图，

[0110] 图4为SpTPS1基因5’第二段电泳检测结果图，

[0111] 图5为SpTPS1基因电泳检测结果图，

[0112] 图6是表达载体pTU+SpTPS1示意图，

[0113] 图7是再生植株（转spTPS1基因T1代株系）PCR检测结果图，

[0114] 图8是再生植株（转spTPS1基因T1代株系）的Southern杂交检测结果图。

具体实施方式

[0115] 下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。

[0116] 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

[0117] 在下述各实施例中，将垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶简称为SpTPS1。通过各实施例，最终得到来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶核苷酸序列（如SEQ ID NO.1所述）及其所对应的氨基酸序列（如SEQ ID NO.2所述）。

[0118] 实施例1

[0119] 本实施例为垫状卷柏叶片总RNA的提取和纯化，包括下述步骤：

[0120] （1）取垫状卷柏幼嫩叶片放入液氮预冷过的研钵，立即加入液氮，尽可能的研磨碎样品，趁液氮尚未挥发将样品按每管0.1 g分装入用液氮预冷过的1.5 mL离心管中，立即向每管加入1 mL Trizol（Invitrogen公司），剧烈振荡后，室温放置5 min。

[0121] （2）4℃、12000 r/min离心2 min，将上清液转入新的无RNase的离心管中。

[0122] （3）向每管加入0.1 mL 5 mol/L的NaCl，混合均匀，再向每管加入0.3 mL氯仿，剧烈振荡15 s后，室温放置3 min，4℃、12000 r/min 离心15 min，在尽可能不吸入中间层的情况下，吸出上清液转入另一干净的1.5 mL离心管中。

[0123] （4）向每管加入与所得上清液相等体积的异丙醇，轻轻混匀后，室温放置10 min，4℃、12000 r/min离心10 min，小心倒掉管中液体，保留沉淀，加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀。

[0124] （5）4℃、7500 r/min离心5 min，小心倒掉管中液体，保留沉淀，再加入1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，4℃、7500 r/min离心5 min，所得沉淀即为垫状卷柏叶片总RNA，-20℃保存。

[0125] 实施例2

[0126] 本实施例为SpTPS1 基因中间片段的克隆，方法如下：

[0127] 以上述实施例1所得纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以oligod (T) 18：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18-3’为反转录引物，按照Takara公司的TM
PrimeScript Reverse Transcriptase说明书进行cDNA第一链合成，扩增体系总体积为
20 μL；得到中间片段的cDNA第一链。

[0128] 先通过比对5个已知的海藻糖-6-磷酸合成酶氨基酸序列：复活卷柏TPS1（Selaginella lepidophylla TPS1 U96736.1）；番茄TPS1（Solanum lycopersicum TPS1 E.F151131.1）；拟南芥TPS1（Arabidopsis thalianaTPS1 NM106505.4）；小立豌藓TPS1（Physcomitrella patens subsp TPS1 XM001778453）；甘 蔗TPS1（Saccharum hybrid cultivar TPS1 EU761244），确定出中间位置的保守区域，再以复活卷柏TPS1为询问序列在NCBI进行核苷酸比对，结合比对情况，得到一对兼并引物：

[0129] jf1: 5’-TGGTCGTAAGGTTATGTTGGG -3’；

[0130] jx1: 5’-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3’。

[0131] 以前述中间片段的cDNA第一链为cDNA模板，以设计的引物jf1和jx1进行垫状卷柏海藻糖-6-磷酸合成酶基因cDNA中间片段的扩增。

[0132] 扩增体系为：TaqPlusPCR Master Mix 10 μL

[0133] cDNA模板 1 μL

[0134] 2×引物（jx1/jf1） 0.5 μL

[0135] ddH2O 8 μL

[0136] 扩增程序为：94℃，5min；

[0137] 94℃，30 s，55℃，45 s，72℃，1 min 30 s（30个循环）；

[0138] 72℃，8 min；4℃保温。

[0139] 取所得扩增产物10 μL经1%非变性琼脂糖凝胶80 V电泳40 min，EB染色后紫外线检测扩增片段，结果如图1所示。

[0140] 扩增得到的产物为SpTPS1 基因cDNA中间片段，通过包括下述步骤的方法克隆测序，得到的中间片段序列如SEQ ID NO.3所述：

[0141] ①目的片段的回收与纯化：

[0142] 将扩增出来的特异条带用干净刀片在紫外光下快而准确的从琼脂糖中挖出，置于1.5 mL离心管中，用凝胶回收试剂盒（北京天根公司）回收胶中的DNA片段；

[0143] ②连接反应：

[0144] 将回收的DNA片段克隆于TaKaRa公司的pMD18-T载体中。连接反应采用连接试剂盒（Takara公司），扩增体系总体积10 μL，16℃连接过夜；

[0145] ③感受态细胞的制备：

[0146] Ⅰ、从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3-5 mL LB液体培养基中，37℃、225 r/min振荡培养12 h左右，直至对数生长后期；将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3 h至OD600＝0.35-0.5左右；

[0147] Ⅱ、将培养液转入离心管中，冰上放置10 min，然后于4℃下3000 r/min离心10 min；

[0148] Ⅲ、弃去上清，用预冷的0.05 mol/L的CaCl2 溶液10 mL轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30 min后，4℃下3000 r/min离心10 min；

[0149] Ⅳ、弃去上清，加入4 mL预冷含15%甘油的0.05 mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；

[0150] Ⅴ、将感受态细胞分装成200 μL的小份，贮存于-80℃可保存半年；

[0151] ④质粒DNA的转化：

[0152] Ⅰ、从-80℃冰箱中取出一管大肠杆菌感受态细胞DH5α，置于冰上融化；

[0153] Ⅱ、在无菌条件下加入10 μL连接反应液，轻轻涡旋混匀后，在冰上放置30 min；

[0154] Ⅲ、42℃水浴热击90 s，不要摇动，之后迅速放入冰浴冷却2-3 min；

[0155] Ⅳ、加入700 μL无Amp的LB液体培养基，混匀后，37℃、100 r/min摇床振摇培养，温育45 min；

[0156] Ⅴ、取100 μL已转化的菌液涂于一个LB/Amp的培养平板上，正面朝上放置30 min，待菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住，然后倒转培养皿，37℃避光培养16-24 h；随后筛选阳性菌落；

[0157] ⑤重组菌落的鉴定与保存：

[0158] 从外观上看，一般白色且圆的菌落为阳性，准确鉴定还需要以下的步骤：

[0159] Ⅰ、在过夜培养的平板上用灭菌的牙签挑取几个白色菌落，分别点种于盛有含0.1 g/L Amp的LB液体培养基的1.5 mL离心管中，37℃、100 r/min振摇培养过夜；

[0160] Ⅱ、取10 μL的菌悬液于1.5 mL离心管中，加入90 μL ddH2O，煮沸10 min，离心，取上清液2 μL作为模板，用引物jf1/jx1进行PCR扩增，PCR扩增体系和扩增条件均同前，用1% 的非变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；如果产物为目的条带时，此重组菌落为阳性克隆，否则为阴性；同时设不加菌悬液的阴性对照；

[0161] Ⅲ、取已经鉴定的阳性克隆的菌落悬浮液750 μL，加入250 μL的灭菌甘油，混匀后，用液氮速冻，置于-80℃冰箱中保存备用；

[0162] Ⅳ、最后送英骏生物技术公司测序，所得序列在NCBI的Blastn 进行比对分析，验证克隆片段是否正确。

[0163] 实施例3

[0164] 本实施例为SpTPS1基因3’端的克隆，方法如下：

[0165] 根据上述中间片段的测序结果，设计合成1个特异性上游引物：

[0166] S1: 5’-GCCATCAGAGAAAGCGGTTACT-3’,

[0167] 另外设计合成1个3’端通用性下游引物：

[0168] AP2: 5’-TACGTACGGCATGACAGTG-3’;

[0169] 以前述实施例2得到的中间片段cDNA第一链为模板，利用上游引物S1和下游引物AP2进行PCR扩增；

[0170] 扩增体系为：

[0171] TaqPlusPCR Master Mix 10 μL ，

[0172] cDNA模板 2 μL ，

[0173] 2×引物（S1/AP2） 0.5 μL ，

[0174] ddH2O 7 μL 。

[0175] 扩增程序为：

[0176] 94℃，3 min；

[0177] 94℃，30 s；55℃，45 s；72℃，1 min 30 s（33个循环）

[0178] 72℃，8 min；12℃保温。

[0179] 取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。

[0180] 扩增得到的产物为SpTPS1 基因3’端，通过克隆测序，得到的3’端序列如SEQ ID NO.4所述。

[0181] 克隆测序参照前述中间片段的测序方法，将电泳检测后的产物经胶回收试剂盒回收，再将回收的产物克隆到pMD18-T载体上，转化E. coli DH5α感受态细胞，以S1/AP2为引物，经菌液PCR验证后，用质粒小提试剂盒提取质粒（北京天根生化科技有限公司），并将菌液送英骏生物技术公司测序。所得序列在NCBI的Blastn 进行比对分析，验证克隆片段是否正确。

[0182] 实施例4

[0183] 本实施例为SpTPS1基因5’端的克隆，包括下述步骤：

[0184] （1）、5’端的cDNA第一链合成：

[0185] 以上述实施例1所得纯化的垫状卷柏叶片总RNA作为模板，以下述特异性下游引物jx1和5’端接头上游引物SMARTIIA Oligo为反转录引物，采用MMLV Reverse Transcriptase（大连宝生物公司）进行反转录，反转录扩增体系总体积为10 μL：

[0186] jx1: 5’-TGTTCGGGCATTGTTGTCAT-3’，

[0187] SMARTIIA Oligo: 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’；

[0188] 合成得到反转录产物5’端的cDNA第一链；

[0189] （2）、第一段PCR扩增：

[0190] 根据上述步骤（2）得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物A2：

[0191] A2: 5’-TCTTTTCATTTTGACAGGCGAC-3’，

[0192] 再根据设计中间片段的5个已知的6-磷酸海藻糖合成酶序列的比对（同上），在靠近5’端处寻找同源区段，设计并合成同源上游引物C1：

[0193] C1：5’-ATCGGATGGCCTGGTGTCTATG-3’；

[0194] 以前述步骤（1）所得反转录产物5’端的cDNA第一链为cDNA模板，利用特异性下游引物A2和同源上游引物C1，进行5’端第一段PCR扩增；

[0195] 扩增体系为：

[0196] TaqPlusPCR Master Mix 12 μL ，

[0197] cDNA模板 2 μL ，

[0198] 2×引物（A2/C1） 0.5 μL ，

[0199] ddH2O 5 μL 。

[0200] 扩增程序为：

[0201] 94℃，3 min；

[0202] 94℃，30 s；65℃，45 s；72℃，1 min 30 s （2个循环）；

[0203] 每两个循环递减2℃；

[0204] 94℃，30 s；55℃，45 s；72℃，1 min 30 s （25个循环）；

[0205] 72℃，8 min；12℃保温。

[0206] 取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。

[0207] 扩增得到的产物为SpTPS1 基因5’端第一段，通过克隆测序，得到的5’端第一段序列如SEQ ID NO.5所述。

[0208] 克隆测序参照前述中间片段的测序方法，将电泳检测后的产物经胶回收试剂盒回收，再将回收的产物克隆到pMD18-T载体上，转化E. coli DH5α感受态细胞，以A2/C1为引物，经菌液PCR验证后，提取质粒，并将菌液送英骏生物技术公司测序。所得序列在NCBI的Blastn 进行比对分析，验证克隆片段是否正确。

[0209] （3）、第二段PCR扩增：

[0210] 根据前述步骤（2）所得cDNA 5’端第一段的序列，设计并合成特异性下游引物A5：

[0211] A5: 5’-GCGGTCTTCTTGACGCAATCCAATGTAG-3’，

[0212] 另外根据5’端反转录接头引物设计合成1个5’端通用性上游引物P3：

[0213] P3: 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ ；

[0214] 以前述步骤（1）所得反转录产物5’端的cDNA第一链为cDNA模板，利用特异性下游引物A5和5’端通用性上游引物P3，进行5’端第二段PCR扩增：

[0215] 扩增体系为：

[0216] TaqPlusPCR Master Mix 10 μL ，

[0217] cDNA模板 1.5 μL ，

[0218] 2×引物（A5/P3） 0.5 μL ，

[0219] ddH2O 7.5 μL 。

[0220] 扩增程序为：

[0221] 94℃，30 s；72℃，2 min（5个循环）；

[0222] 94℃，30 s；70℃，30 s；72℃，2 min （5个循环）；

[0223] 94℃，30 s；68℃，30 s；72℃，2 min（25个循环）；

[0224] 12℃保温。

[0225] 取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。

[0226] 扩增得到的产物为SpTPS1 基因5’端第二段，通过克隆测序，得到的5’端第二段序列如SEQ ID NO.6所述。

[0227] 克隆测序参照前述中间片段的测序方法，将电泳检测后的产物经胶回收试剂盒回收，再将回收的产物克隆到pMD18-T载体上，转化E. coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR验证后，送英骏生物技术公司测序。所得序列在NCBI的Blastn进行比对分析，验证克隆片段是否正确。

[0228] 实施例5

[0229] 本实施例为SpTPS1基因开放阅读框ORF克隆，方法如下：

[0230] 将上述实施例2所得中间片段序列、实施例3所得3’端序列、和实施例4所得5’端第一段序列和第二段序列进行拼接，得到cDNA全长（作为ORF扩增的cDNA模板），通过NCBI里ORF finder工具分析开放阅读框，并根据表达载体的酶切位点的需要设计上游引物ORF4和下游引物ORF5如下：

[0231] ORF 4：5’-CCCAAGCTT(Hind Ⅲ )CCTCGAG(Xho Ⅰ )ATGCCTACTCCGTATTCCAATAC -3’，

[0232] ORF5: 5’-CGC GGATCC (BamH Ⅰ)ATTAATTATCGACAGCGACAACC-3’；

[0233] 以拼接得到的cDNA全长作为ORF扩增的cDNA模板，以上游引物ORF4和下游引物ORF5进行PCR扩增：

[0234] 扩增体系为：

[0235] 2×GC BufferⅠ（含Mg2+） 10 μL ，

[0236] 2×引物（ORF4/ORF5） 0.5 μL ，

[0237] cDNA模板 1 μL ，

[0238] dNTP Mixture 3.2 μL ，

[0239] TaKaRa LA Taq 0.2 μL ，

[0240] ddH2O 4.6 μL 。

[0241] 扩增程序为：

[0242] 94℃，5 min；

[0243] 94℃，30 s；57℃，1 min 30 s；72℃，2 min （10个循环）；

[0244] 94℃，30 s；72℃，2 min 30 s （25个循环）；

[0245] 72℃，8 min；12℃保温。

[0246] 取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。

[0247] 扩增得到的产物为完整开放阅读框，即垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因，通过克隆测序，即得其基因序列，如SEQ ID NO.1所述；其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

[0248] 克隆测序参照前述中间片段的测序方法，将电泳检测后的产物经胶回收试剂盒回收，再将回收的产物克隆到pMD18-T载体上，转化E. coli DH5α感受态细胞，经菌液PCR验证后，送英骏生物技术公司测序。所得序列在NCBI的Blastn进行比对分析。

[0249] 实施例6

[0250] 由于基因在克隆、表达过程中具有诸多不确定性，最终得到的基因是否具有如预料相应的功能也是不确定的；因此，本实施例中，为了研究所克隆的上述垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因（SpTPS1）是否具有某些特定的功能，发明人进行了深入研究，以便进一步验证其功能，具体操作如下：

[0251] （1）、构建植物表达载体，农杆菌介导转化玉米获得转基因再生植株[0252] 由单子叶植物组成型启动子Ubiquitin启动垫状卷柏海藻糖合成酶基因SpTPS1，以抗除草剂基因Bar为选择标记，构建表达载体pTU+SpTPS1，如图6所示。图6中：LB，植物表达载体左边界（长度25bp,L25）；RB, 植物表达载体右边界（长度25bp,R25）；bar,抗除草剂选择标记基因；TEV enhancer,增强子，作用是增强bar基因的表达；2×PS，串联的两个35S启动子，启动bar基因的表达；Ubiquitin，单子叶植物玉米泛素启动子；T-nos,胭脂碱合成酶终止子；aadA,壮观霉素标记，用于表达载体转化大肠杆菌时作为筛选标记。

[0253] 以玉米自交系18-599的胚性愈伤组织为受体，农杆菌介导转化pTU+spTPS1，经过除草剂筛选，分化得到再生植株。

[0254] （2）、再生植株的分子鉴定

[0255] 对再生植株进行目的基因PCR检测（目的基因的提取方法和检测方法同以上实施例中SpTPS1基因的提取方法和检测方法），得到一株阳性植株并到云南加代繁殖种子，收获38个后代株系。

[0256] 转spTPS1基因的38个T1代株系，部分株系PCR检测如图7所示，M为DNA分子量标记DL2000，CK-为阴性对照；CK+为阳性质粒(pTU+spTPS1)对照,D6、C3、A6、E4、B5分别为转spTPS1基因T1代不同株系，各转基因T1代不同株系结果全为阳性。

[0257] 选择基因组DNA量足够的E4和A6两个株系，用能均匀将基因组DNA切割成几kb左右大小的限制性内切酶Spe Ⅰ 和Apa Ⅰ酶切E4和A6两个株系的基因组DNA，酶电泳分离酶切产物后进行Southern杂交检测，如图8所示， 1为 T1代转基因株系E4（Spe Ⅰ 酶切），2为未转基因对照，3.为阳性对照（pTU+SpTPS1），4为T1代转基因株系E4（Apa Ⅰ 酶切），5为 T1代转基因株系A6（Apa Ⅰ 酶切）；结果表明， SpTPS1基因以单拷贝形式整合到了玉米基因组中。

[0258] （3）、转spTPS1基因T2代株系的耐旱性鉴定

[0259] 于2010年在新疆和四川等地分别设置鉴定点进行。据各鉴定点的田间调察，转基因植株平均株高1.5 m，比对照降低0.8 m，株型紧凑。对鉴定材料进行干旱处理，高度降低、株型紧凑的转基因植株叶片仍然保持舒展，而非转基因对照叶片严重卷曲、萎焉。转基因植株初步表现出较强的耐旱性。

[0260] 序 列 表

[0261] <110> 四川农业大学

[0262] <120> 一种来源于垫状卷柏的海藻糖-6-磷酸合成酶基因序列及其克隆方法[0263] <160> 6

[0264] <210> 1

[0265] <211> 2790

[0266] <212> DNA

[0267] <213> 来源于垫状卷柏（Selaginella pulvinata Maxim）的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的核苷酸序列

[0268] <400> 1

[0269] atgcctactc cgtattccaa tacgaattcc tcaagcgctc ccttagtgcc tctcaatctc 60[0270] aatctgccgc cttcgttagc gtcttccaga gtcgagcgcc ttgtccgaga gcggcaactg 120[0271] aggaggaatg acgaccagcc tgaatcggtg caagaatcgc acgaacaggt acaagatcat 180[0272] acgcaggagc agccggattc acccttgacg ccggatcgtc agcagcggct gctcgttgta 240[0273] gcgaatcggt tgccggtttc cgccacgcgc aagggcgacg atcaatggag cttggaagtg 300[0274] agcgctggcg gcctcgtctc tgcgcttctt ggtgtgaagc agttccaggt agtatggatc 360[0275] ggccggcccg gtgtctatgt ccaggacgag ctcggcaagc aatcgcttgc caaggcgctt 420[0276] gaggaaaagg gatttgtggg tgtgttgcta gacgaggaaa cagtggatca atattacaat 480[0277] ggctactgca acaatgtctt gtggcctctc tttcactaca ttggattgcg tcaagaagac 540[0278] cgcctggccg cgactcgaag tcttcaatca caattcggcg cctacaagcg tgcaaacagg 600[0279] ctgtttgcag atgccgtcat taaacactac caagaaggcg atttcgtttg gacacatgat 660[0280] tatcacctca tggtcctgcc tagctatctc aaggagcacg acccacgaat gaaagtcgga 720[0281] tggttcctgc acactccatt tccttcatct gaaatatata gaacactgcc tctccgctca 780[0282] gaattgcttc agggtgtcct tggtgcagat ttggttggtt tccacacgta cgactatgcc 840[0283] aggcattttg ttagcgcctg tacaaggata ttgggtctgg aagggactcc cgagggagtg 900[0284] gaagatcaag ggaaaataac gcgtgttgcc gcgtttcctg tcgggataga ttctgaaagg 960[0285] tgcatccagg ctgttgaaac agatgcagtg aagaagcata tagaagaact cagtgccaga 1020[0286] tttgctggcc gtaaggtgat gttgggagtg gataggcttg atccaattaa gggcatacca 1080[0287] caaaagctac tcgcatttga gaagtttttg gaggaaaatc cacattggcg tgacaaggtg 1140[0288] attctggtcc agattgcggt tcccacaaga caagatgtgc tggaatatca aaagctcgca 1200[0289] agccaggtgc atgaaatcgt gggtcgcatc aacggtcgtt acggttctct tacgactgta 1260[0290] cccatccacc atctcgaccg ttcgatgaaa tttcctgagc tctgtgcttt gtacaccatt 1320[0291] actgatgtgt tgcttgtaac atccttacgg gatggtatga acctcgttag ctacgagttt 1380[0292] gtcgcctgtc aaaatgaaaa gaagggagct ctcgtattaa gtgagttcgc aggtgctgca 1440[0293] caatcactag gtgcaggctc aattttggta aacccatgga acattattga aaccgctaat 1500[0294] gctattggag aagcacttaa catgcccgag gaagaacgtg aagagcgtca tagacttaac 1560[0295] ttcatgcacg ttacacccca tagtgctcag gtctgggcgg agacattcac cagtgaattg 1620[0296] aatgactcaa tactggaggc ggagctgcgt actttgcata ttcctccaca actgccatca 1680[0297] gacaaagtgg ttactaagtt cgccgagtcg aagaatcggc taatgattct gggtttcaat 1740[0298] tctgcactaa ctgcaccagt ggaagctcca cgtggaagag ctcctgacca gattagagaa 1800[0299] atgaagattc gcctacatcc aaacttggaa gaagtgttca atgttctttg cagtgatcca 1860[0300] agaaccacta tagtcattct tagtgggagt gaacgtgctg ttttggatga ggcatttgga 1920[0301] gagtttgata tgtggttggc agcagagaat ggaatgtttc ttcgtcacac acaaggagag 1980[0302] tggatgacaa ccatgcctga gcacctaaac atggattggg tagagagtgt acagttggta 2040[0303] tttgattatt tctgtgagag aacgcctcgt tcgtttgtgg aagcccgtgg aacttcattg 2100[0304] gtgtggaatt acaagtatgc agatgtggaa tttgggagag tacaagcacg ggatatgcta 2160[0305] cagcatcttt ggacaggacc gatttccaat gcagctgtgg atgttgttca aggtgggagg 2220[0306] tctgtagaag ttcgccctgt tggagtctca aagggctctg caattgatcg gattcttggg 2280[0307] gagattgtac atagcaagca catggttact cctattgatt tcgttatgtg tattggtcat 2340[0308] ttcttgagca aggatgaaga tatatacaca ttctttgagc cagagctccc atttttagag 2400[0309] agcggaaatt caagtgcaaa ggttctagac aagagattag gttccaaggg atctggcaaa 2460[0310] ttaggtggat caaggctcaa atcttatcct ccaatgtctc ctgacagggt ggtgcgcaag 2520[0311] attgatgatg agcggctgat tgaagacgct ggtagatggg aaggctcgtc agtgcttgat 2580[0312] ctcaagggtg aaaattattt ctcttgtgct gtggggacta tgaagcgttc attagcacga 2640[0313] tactgtttga attcttctga cgaagtactt acattcttga gctcacttgc tgcggcttca 2700[0314] gaatcttttc ctcaaaagag gagcgattcc tttaagagga atggtggatg gcatagccca 2760[0315] actccaaggg ttgtcgctgt cgataattaa 2790[0316] <210> 2

[0317] <211> 929

[0318] <212> PRT

[0319] <213> 来源于垫状卷柏（Selaginella pulvinata Maxim）的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的氨基酸序列

[0320] <400> 2

[0321] Met Pro Thr Pro Tyr Ser Asn Thr Asn Ser Ser Ser Ala Pro Leu Val[0322] 1 5 10 15[0323] Pro Leu Asn Leu Asn Leu Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Arg Val Glu[0324] 20 25 30

[0325] Arg Leu Val Arg Glu Arg Gln Leu Arg Arg Asn Asp Asp Gln Pro Glu[0326] 35 40 45

[0327] Ser Val Gln Glu Ser His Glu Gln Val Gln Asp His Thr Gln Glu Gln[0328] 50 55 60

[0329] Pro Asp Ser Pro Leu Thr Pro Asp Arg Gln Gln Arg Leu Leu Val Val[0330] 65 70 75 80[0331] Ala Asn Arg Leu Pro Val Ser Ala Thr Arg Lys Gly Asp Asp Gln Trp[0332] 85 90 95[0333] Ser Leu Glu Val Ser Ala Gly Gly Leu Val Ser Ala Leu Leu Gly Val[0334] 100 105 110

[0335] Lys Gln Phe Gln Val Val Trp Ile Gly Arg Pro Gly Val Tyr Val Gln[0336] 115 120 125

[0337] Asp Glu Leu Gly Lys Gln Ser Leu Ala Lys Ala Leu Glu Glu Lys Gly[0338] 130 135 140

[0339] Phe Val Gly Val Leu Leu Asp Glu Glu Thr Val Asp Gln Tyr Tyr Asn[0340] 145 150 155 160[0341] Gly Tyr Cys Asn Asn Val Leu Trp Pro Leu Phe His Tyr Ile Gly Leu[0342] 165 170 175[0343] Arg Gln Glu Asp Arg Leu Ala Ala Thr Arg Ser Leu Gln Ser Gln Phe[0344] 180 185 190

[0345] Gly Ala Tyr Lys Arg Ala Asn Arg Leu Phe Ala Asp Ala Val Ile Lys[0346] 195 200 205

[0347] His Tyr Gln Glu Gly Asp Phe Val Trp Thr His Asp Tyr His Leu Met[0348] 210 215 220

[0349] Val Leu Pro Ser Tyr Leu Lys Glu His Asp Pro Arg Met Lys Val Gly[0350] 225 230 235 240[0351] Trp Phe Leu His Thr Pro Phe Pro Ser Ser Glu Ile Tyr Arg Thr Leu[0352] 245 250 255[0353] Pro Leu Arg Ser Glu Leu Leu Gln Gly Val Leu Gly Ala Asp Leu Val[0354] 260 265 270

[0355] Gly Phe His Thr Tyr Asp Tyr Ala Arg His Phe Val Ser Ala Cys Thr[0356] 275 280 285

[0357] Arg Ile Leu Gly Leu Glu Gly Thr Pro Glu Gly Val Glu Asp Gln Gly[0358] 290 295 300

[0359] Lys Ile Thr Arg Val Ala Ala Phe Pro Val Gly Ile Asp Ser Glu Arg[0360] 305 310 315 320[0361] Cys Ile Gln Ala Val Glu Thr Asp Ala Val Lys Lys His Ile Glu Glu[0362] 325 330 335[0363] Leu Ser Ala Arg Phe Ala Gly Arg Lys Val Met Leu Gly Val Asp Arg[0364] 340 345 350

[0365] Leu Asp Pro Ile Lys Gly Ile Pro Gln Lys Leu Leu Ala Phe Glu Lys[0366] 355 360 365

[0367] Phe Leu Glu Glu Asn Pro His Trp Arg Asp Lys Val Ile Leu Val Gln[0368] 370 375 380

[0369] Ile Ala Val Pro Thr Arg Gln Asp Val Leu Glu Tyr Gln Lys Leu Ala[0370] 385 390 395 400[0371] Ser Gln Val His Glu Ile Val Gly Arg Ile Asn Gly Arg Tyr Gly Ser[0372] 405 410 415[0373] Leu Thr Thr Val Pro Ile His His Leu Asp Arg Ser Met Lys Phe Pro[0374] 420 425 430

[0375] Glu Leu Cys Ala Leu Tyr Thr Ile Thr Asp Val Leu Leu Val Thr Ser[0376] 435 440 445

[0377] Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu Val Ser Tyr Glu Phe Val Ala Cys Gln[0378] 450 455 460

[0379] Asn Glu Lys Lys Gly Ala Leu Val Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala Ala[0380] 465 470 475 480[0381] Gln Ser Leu Gly Ala Gly Ser Ile Leu Val Asn Pro Trp Asn Ile Ile[0382] 485 490 495[0383] Glu Thr Ala Asn Ala Ile Gly Glu Ala Leu Asn Met Pro Glu Glu Glu[0384] 500 505 510

[0385] Arg Glu Glu Arg His Arg Leu Asn Phe Met His Val Thr Pro His Ser[0386] 515 520 525

[0387] Ala Gln Val Trp Ala Glu Thr Phe Thr Ser Glu Leu Asn Asp Ser Ile[0388] 530 535 540

[0389] Leu Glu Ala Glu Leu Arg Thr Leu His Ile Pro Pro Gln Leu Pro Ser[0390] 545 550 555 560[0391] Asp Lys Val Val Thr Lys Phe Ala Glu Ser Lys Asn Arg Leu Met Ile[0392] 565 570 575[0393] Leu Gly Phe Asn Ser Ala Leu Thr Ala Pro Val Glu Ala Pro Arg Gly[0394] 580 585 590

[0395] Arg Ala Pro Asp Gln Ile Arg Glu Met Lys Ile Arg Leu His Pro Asn[0396] 595 600 605

[0397] Leu Glu Glu Val Phe Asn Val Leu Cys Ser Asp Pro Arg Thr Thr Ile[0398] 610 615 620

[0399] Val Ile Leu Ser Gly Ser Glu Arg Ala Val Leu Asp Glu Ala Phe Gly[0400] 625 630 635 640[0401] Glu Phe Asp Met Trp Leu Ala Ala Glu Asn Gly Met Phe Leu Arg His[0402] 645 650 655[0403] Thr Gln Gly Glu Trp Met Thr Thr Met Pro Glu His Leu Asn Met Asp[0404] 660 665 670

[0405] Trp Val Glu Ser Val Gln Leu Val Phe Asp Tyr Phe Cys Glu Arg Thr[0406] 675 680 685

[0407] Pro Arg Ser Phe Val Glu Ala Arg Gly Thr Ser Leu Val Trp Asn Tyr[0408] 690 695 700

[0409] Lys Tyr Ala Asp Val Glu Phe Gly Arg Val Gln Ala Arg Asp Met Leu[0410] 705 710 715 720[0411] Gln His Leu Trp Thr Gly Pro Ile Ser Asn Ala Ala Val Asp Val Val[0412] 725 730 735[0413] Gln Gly Gly Arg Ser Val Glu Val Arg Pro Val Gly Val Ser Lys Gly[0414] 740 745 750

[0415] Ser Ala Ile Asp Arg Ile Leu Gly Glu Ile Val His Ser Lys His Met[0416] 755 760 765

[0417] Val Thr Pro Ile Asp Phe Val Met Cys Ile Gly His Phe Leu Ser Lys[0418] 770 775 780

[0419] Asp Glu Asp Ile Tyr Thr Phe Phe Glu Pro Glu Leu Pro Phe Leu Glu[0420] 785 790 795 800[0421] Ser Gly Asn Ser Ser Ala Lys Val Leu Asp Lys Arg Leu Gly Ser Lys[0422] 805 810 815[0423] Gly Ser Gly Lys Leu Gly Gly Ser Arg Leu Lys Ser Tyr Pro Pro Met[0424] 820 825 830

[0425] Ser Pro Asp Arg Val Val Arg Lys Ile Asp Asp Glu Arg Leu Ile Glu[0426] 835 840 845

[0427] Asp Ala Gly Arg Trp Glu Gly Ser Ser Val Leu Asp Leu Lys Gly Glu[0428] 850 855 860

[0429] Asn Tyr Phe Ser Cys Ala Val Gly Thr Met Lys Arg Ser Leu Ala Arg[0430] 865 870 875 880[0431] Tyr Cys Leu Asn Ser Ser Asp Glu Val Leu Thr Phe Leu Ser Ser Leu[0432] 885 890 895[0433] Ala Ala Ala Ser Glu Ser Phe Pro Gln Lys Arg Ser Asp Ser Phe Lys[0434] 900 905 910

[0435] Arg Asn Gly Gly Trp His Ser Pro Thr Pro Arg Val Val Ala Val Asp[0436] 915 920 925

[0437] Asn

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[0440] <212> DNA

[0441] <213> 来源于垫状卷柏（Selaginella pulvinata Maxim）的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的中间片段核苷酸序列

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[0443] ttggtcgtaa ggttatgttg ggagtggata ggcttgatcc aattaagggc ataccacaaa 60[0444] agctactcgc atttgagaaa tttttggagg aaaatccaca ttggcgtgac aaggtgattc 120[0445] ttgtccagat tgcggttccc acaagacaag atgtgctgga atatcaaaag ctcgcaagcc 180[0446] aggtgcatga gatcgtgggt cgcatcaacg gtcgttacgg ttctcttacg actgtaccca 240[0447] tccaccatct cgaccgttcg atgaaatttc ttgagctctg tgctttgtac gccattactg 300[0448] atgtgttgct tgtaacatcc ttacgggatg gtatgaacct cgttagttac gaatttgtcg 360[0449] cctgtcaaaa tgaaaagaag ggagctctcg tattaagtga gttcgcaggt gctgcacaat 420[0450] cactaggtgc aggctcaatt ctggtaaacc catggaacat tattgaaacc gctaatgcta 480[0451] ttggagaagc acttaacatg cccgaggaag aacgtgaaga acgtcataga cttaacttca 540[0452] tgcacgttac aactcatagt gctcaggtct gggcggagac attcaccagt gaattgaatg 600[0453] actcaatatt ggaggcggag ctgcgtactt tgcatattcc tccacaactg ccatcagaga 660[0454] aagcggttac taagtttgcc gagtcgaaga atcggctaat gattctgggt ttcaattctg 720[0455] cactaactgc accagtggaa gctccacgtg gaagagctcc tgaccagatt agagaaatga 780[0456] agattcgcct acatccaaac ttgaaagaag tgttcaatgt tctttgcagt gatccaagaa 840[0457] ccactatagt cattcttagt gggagtgaac gtgctgtatt ggatgaggca tttggagagt 900[0458] ttgatatgtg gttggcagca gagaatggaa tgttccttcg tcacacacaa ggagagtgga 960[0459] tgacaacaat gcccgaaca 979[0460] <210> 4

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[0462] <212> DNA

[0463] <213> 来源于垫状卷柏（Selaginella pulvinata Maxim）的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的3′端核苷酸序列

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[0488] <212> DNA

[0489] <213> 来源于垫状卷柏（Selaginella pulvinata Maxim）的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的5′端第一段核苷酸序列

[0490] <400> 5

[0491] atcggatggc ctggtgtcta tgtccaggac gagctcggca agcaatcgct tgccaaggcg 60[0492] cttgaggaaa agggatttgt gggtgtgttg ctagacgagg aaacagtgga tcaatattac 120[0493] aatggctact gcaacaatgt cttgtggcct ctctttcact acattggatt gcgtcaagaa 180[0494] gaccgcctgg ccgcgactcg aagtcttcaa tcacaattcg gcgcctacaa gcgtgcaaac 240[0495] aggctgtttg cagatgccgt cattaaacac taccaagaag gcgatttcgt ttggacacat 300[0496] gattatcacc tcatggtcct gcctagctat ctcaaggagc acgacccacg aatgaaagtc 360[0497] ggatggttcc tgcacactcc atttccttca tctgaaatat atagaacact gcctctccgc 420[0498] tcagaattgc ttcagggtgt ccttggtgca gatttggttg gtttccacac gtacgactat 480[0499] gccaggcatt ttgttagcgc ctgtacaagg atattgggtc tggaagggac tcccgaggga 540[0500] gtggaagatc aagggaaaat aacgcgtgtt gccgcgtttc ctgtcgggat agattctgaa 600[0501] aggtgcatcc aggctgttga aacagatgca gtgaagaagc atatagaaga actcagtgcc 660[0502] agatttgctg gccgtaaggt gatgttggga gtggataggc ttgatccaat taagggcata 720[0503] ccacaaaagc tactcgcatt tgagaagttt ttggaggaaa atccacattg gcgtgacaag 780[0504] gtgattctgg tccagattgc ggttcccaca agacaagatg tgctggaata tcaaaagctc 840[0505] gcaagccagg tgcatgaaat cgtgggtcgc atcaacggtc gttacggttc tcttacgact 900[0506] gtacccatcc accatctcga ccgttcgatg aaatttcctg agctctgtgc tttgtacgcc 960[0507] attactgatg tgttgcttgt aacatcctta cgggatggta tgaacctcgt tagctacgag 1020[0508] tttgtcgcct gtcaaaatga aaaga 1045[0509] <210> 6

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[0511] <212> DNA

[0512] <213> 来源于垫状卷柏（Selaginella pulvinata Maxim）的海藻糖-6-磷酸合成酶基因的5′端第二段核苷酸序列

[0513] <400> 6

[0514] agcagtggta tcaacgcaga gtacgcgggg atatatgagt tttattttag caaactataa 60[0515] aggtttgcct ctctccactt acctagtaag tggttggttt cccgtgtgtt cgtctgccgt 120[0516] cttcacatgc ctactccgta ttccaatacg aattcctcaa gcgctccctt agtgcctctc 180[0517] aatctcaatc tgccgccttc gttagcgtct tccagagtcg agcgccttgt ccgagagcgg 240[0518] caactgagga ggaatgacga ccagcctgaa tcggtgcaag aatcgcacga acaggtacaa 300[0519] gatcatacgc aggagcagcc ggattcatcc ttggcgccgg atcgtcagca gcggctgctc 360[0520] gttgtagcga atcggttgcc ggtttccgcc acgcgcaagg gcgacgatca atggagcttg 420[0521] gaagtgagcg ctggcggcct cgtctctgcg cttcttggtg tgaagcagtt ccaggtagta 480[0522] tggatcggct ggcccggtgt ctatgtccag gacgagctcg gcaagcaatc gcttgccaag 540[0523] gcgcttgagg aaaagggatt tgtgggtgtg ttgca 575