一种猪流感病毒实时荧光RT-PCR分型试剂盒

摘要

本发明涉及一种猪流感病毒分型试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行猪流感病毒分型的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒对呼吸道样本、血清、肺组织等样品中的猪流感病毒进行分型，从而实现猪流感病毒的早期快速诊断，监控其流行趋势。

权利要求

1.一种猪流感病毒实时荧光RT-PCR分型试剂盒，试剂盒包括：分别装有RNA提取液、H1亚型反应体系、H3亚型反应体系、N1亚型反应体系和N2亚型反应体系、阴性质控品、H1亚型阳性质控品、H3亚型阳性质控品、N1亚型阳性质控品和N2亚型阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中H1亚型反应体系包括H1亚型引物探针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR酶系，其特征在于H1亚型引物探针混合液中H1亚型正向引物的序列为：5’-TGGCACCAAGATATGCTTTTG-3’、H1亚型反向引物的序列为：5’-CAAGTCGCATTGCAGTCATG-3’，H1亚型寡核苷酸探针的序列为：5’CGGGTATCATAACATCGGATGCACCA-3’；其中H3亚型反应体系包括H3亚型引物探针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR酶系，其特征还在于H3亚型引物探针混合液中H3亚型正向引物的序列为：5’-CGTCGTGAAAGCGTGAACAG-3’、H3亚型反向引物的序列为：5’-CGGCATGGTCACGTTCAG-3’，H3亚型寡核苷酸探针的序列为：5’-CCGTCTGAACTGGCTGCATAACCTGG-3’；其中N1亚型反应体系包括N1亚型引物探针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR酶系，其特征还在于N1亚型引物探针混合液中N1亚型正向引物的序列为：5’-GACCTTGCTTTTGGGTTGAACT-3’、N1亚型反向引物的序列为：5’-AAGGATATGCTGCTCCCACTAGTC-3’，N1亚型寡核苷酸探针的序列为：5’-CAGAGGGCGACCCAAAGAGAACACAATC-3’；其中N2亚型反应体系包括N2亚型引物探针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR酶系，其特征还在于N2亚型引物探针混合液中N2亚型正向引物的序列为：5’-GGGCACCACCCTGAACAA-3’、N2亚型反向引物的序列为：5’-CGTTCATCAGCAGGGTACGA-3’，N2亚型寡核苷酸探针的序列为：5’-CCATAGCAACGATACCGTGCATGATCG-3’。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于H1亚型正、反向引物，H3亚型正、反向引物，N1亚型正、反向引物，N2亚型正、反向引物的浓度均为5pmol/反应，H1亚型寡核苷酸探针、H3亚型寡核苷酸探针、N1亚型寡核苷酸探针、N2亚型寡核苷酸探针的浓度均为5pmol/反应。

3.根据权利要求1的试剂盒，RT-PCR酶系由逆转录酶、热启动Taq酶、RNasin、dNTPs、酶系稀释液组成，其特征还在于其中逆转录酶用量为1.5～3.5U/反应、热启动Taq酶用量为3～7U/反应、RNasin用量为15～25U/反应、dNTPs浓度为0.20mmol/L。

说明书

一种猪流感病毒实时荧光RT-PCR分型试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种猪流感病毒分型试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行猪流感病毒分型的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒对呼吸道样本、血清、肺组织等样品中的猪流感病毒进行分型，从而实现猪流感病毒的早期快速诊断，监控其流行趋势。

背景技术

[0002] 猪流感(SI)是一种因猪流感病毒引起的猪呼吸系统疾病，此病在世界各地都有发生，危害严重，经济损失巨大，并对人类的健康构成威胁。猪流感病毒(SIV)属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，甲型流感病毒属(Influenza virus A)。典型病毒颗粒呈球状，直径为80nm～120nm，有囊膜。囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素HA、神经氨酸酶NA和M2蛋白。病毒颗粒内为核衣壳，呈螺旋状对称，直径为10nm，它含核蛋白(neucleoprotein，NP)，3种多聚酶蛋白(polymerase protein 1，PB1；polymerase protein2，PB2；polymerase protein A)和病毒单链RNA。猪流感病毒为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。猪流感病毒能够在多种动物的细胞和鸡胚增殖。病毒具有血凝活性，但不同毒株的抗原性无明显的区分。由于病毒受到抗体的压力很大，因此病毒的变异频繁。尽管不同亚型之间可以组成很多种流感病毒血清型，但从猪身上分离到四种主要的亚型：H1N1、H1N2、H3N2和H3N1，其中有三种亚型造成人感染，分别为：
H1N1、H1N2和H3N2。

[0003] 猪流感病毒在猪群中全年可以传播，但多数暴发于秋季末期和冬季，具有高发病率(几乎100％)和低病死率(病死率≤1％)的特点。猪流感病毒感染可使患病猪生产性能下降，推迟上市；还可引起呼吸道细菌和病毒继发或混合感染，使疫情更为严重，造成猪只死亡。猪是人源、禽源和猪源流感病毒的惟一共同易感宿主，因此猪在禽-猪-人的流感种间传播过程中，起着中间宿主及多重宿主的作用，它能将猪流感病毒传播给人或鸟类。美国曾于1976年在新泽西州迪克斯堡的士兵中出现猪流感爆发，引起200多例病例，其中至少4名士兵进展成肺炎，1人死亡，该病毒与当时从猪体内分离的病毒相同，首次证实了在自然条件下，猪流感病毒可从猪传播给人。1988年，美国出现了猪流感人际间传播的迹象，接触过一例猪流感病例的医护人员中出现了轻微的流感样疾病，并在血清中检测出猪流感抗体。2005年12月至2009年2月期间，美国共报道了12例人感染猪流感病例，但均未出现死亡。1999年10月，香港1名10月龄女婴感染了猪流感病毒H3N2，现已完全康复。这些年来，世界各地都有人感染猪流感病毒不同病毒株的报道，但并没有大规模流行。2009年3月，墨西哥及美国等部分地区暴发了人感染猪流感疫情，即甲型H1N1流感病毒感染，可以人传染人，可能出现全球性爆发流行的潜在危险。

[0004] 人感染猪流感的潜伏期尚不明确，参照流感的潜伏期一般为1-3天。临床症状与流感相似，包括发热、咳嗽、咽痛、躯体疼痛、头痛、畏寒和疲劳等。有些人还会出现腹泻和呕吐，甚至引起严重疾病(肺炎和呼吸衰竭)和死亡。人感染猪流感病毒后，现有资料表明，传染期为发病前1天至发病后7天。若病例发病7天后仍有发热症状，表示仍具有传染性。儿童，尤其是幼儿，传染期可能长于7天。

[0005] 猪作为流感病毒的“混合器”，在流感病毒跨种属障碍而感染新宿主的过程中起着重要的作用。由于猪上皮细胞具有唾液酸2，6-半乳糖苷和唾液酸2，3-半乳糖苷，人流感病毒可与前者结合，而禽流感病毒与后者结合，因此，猪上皮细胞就能够被人流感病毒和禽流感病毒感染，而成为毒株间基因重组的活载体。1998年从美国北卡罗来纳州分离到一株H3N2亚型SIV，其HA，NA和PB1基因为人型流感病毒基因，M，NP和NS基因为猪型流感病毒基因，PB2、PA基因为禽型流感病毒基因。1978年，日本暴发的H1N2SIV是由H1N1和H3N2基因重组而产生的新亚型。国内从山东猪分离出H9N2流感病毒，分析可能是由鸡和鸭流感病毒重组的结果。继H9N2亚型流感病毒1998年首次从猪群中分离到，研究表明，通过进行部分序列分析发现，猪源H9N2亚型与国内分离的禽流感病毒高度同源。SI和人流感之间也可以发生交叉感染和传播。1978年，从台湾的一个猪群中分离到了H3N2亚型SIV，通过测序发现，此病毒发生了人流感病毒和SI病毒基因片段的重组。2009年墨西哥和美国出现的甲型H1N1流感病毒，被认为该毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片断。

[0006] 因此研究SIV在不同时间和地域的型别变化，开展相应的流行病学调查，可以预测人流感的发展趋势，具有深远的公共卫生学意义。由于本病的流行和危害日益严重，因此对SIV分型研究已成为国内外兽医界、医学界和微生物学界的热点之一。

[0007] 目前常用的猪流感病毒分型检测方法包括：

[0008] 1)血清学方法：包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光免疫法、血凝抑制试验等，这些血清学的方法需要对样本预先进行鸡胚或组织培养，无法实现快速诊断，且需要相当完整的靶抗原和型特异性的免疫血清，操作步骤繁琐。

[0009] 2)核酸检测方法；包括RT-PCR方法，由于PCR技术具有简便、快速、灵敏、特异性强等特点，可用于猪流感病毒分型检测和分子流行病学调查等，是实现猪流感病毒快速分型检测的推荐方法。基因芯片方法，该方法具有快速、灵敏和通量高等优点，但价格昂贵，不利于大规模推广。测序分型和全基因组测序的方法，具有准确度高，获取的信息量大的特点，可进行病毒的进化分析，但其对仪器的要求高，检测时间较RT-PCR和基因芯片长。

[0010] 实时荧光(Real-time)RT-PCR技术是在RT-PCR技术上发展起来的。实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法实时荧光RT-PCR技术是实时荧光PCR的一种(Martell，M.，J.Gomez，J.Esteban，S.Sauleda，J.Quer，B.Cabot，R.Esteban，and J.Guardia.1999.High-throughput real-time reverse transcription-PCR quantitation of hepatitis Cvirus RNA.J.Clin.Microbiol.37：327-332；Lee CW，Suarez DL.2004.Application ofreal-time RT-PCR for the quantitation and competitive replication study of H5 andH7 subtype avian influenza virus.J Virol Methods.119(2)：151-8。)，它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶，同时多了一个逆转录反应步骤；相同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。

[0011] 传统的RT-PCR由两个单独的反应程序或步骤完成，第一步是通过逆转录酶作用，将RNA逆转录成cDNA；第二步是在Taq酶作用下，以第一步中形成的cDNA为模板进行PCR扩增。与传统的RT-PCR相比较，一步法实时荧光RT-PCR技术具有如下优点：1、将逆转录和PCR扩增两个在不同反应管中分开进行的二个反应程序合并成一个反应程序，在一个PCR反应管中完全闭管完成检测过程，大大节省了反应时间；2、通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃普通PCR方法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对检测样品进行准确定量分析，从而有效监测药物治疗的效果；3、将RNA逆转录、DNA扩增与检测三过程融合为一体，可以实时、动态监测RNA扩增的全过程，省掉了PCR产物后处理过程，大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；4、由于采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；5、由于在普通RT-PCR基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，进一步提高了检测靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在RNA样品的检测和分析中，已逐渐取代传统的RT-PCR方法，得到十分广泛的应用。

[0012] 我国食品与药品管理局(SFDA)已经批准了诸如HIV-1、HCV等病原体的一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒的生产与临床应用。因此，通过一步法实时荧光RT-PCR方法开发一种猪流感病毒分型试剂盒在技术上是可行的，再加之其方法学上具有简便快速、灵敏度和特异性高的特点，可以实现早期快速分型检测。但目前国内外均尚未开发出检测猪流感病毒实时荧光RT-PCR分型试剂盒，因此开发该试剂盒成为当务之急，它的应用将极大满足猪流感病毒快速分型检测与监测工作的需要。

[0013] 在使用已知的一步法实时荧光RT-PCR技术检测和定量分析样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计、筛选及制备适当的引物和寡核苷酸探针。本发明人在此基础上利用一步法实时荧光RT-PCR技术发明了一种进行猪流感病毒分型的试剂盒，应用于猪流感病毒分型检测及流行状况监测。

发明内容

[0014] 本发明涉及一种猪流感病毒分型试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行猪流感病毒分型的试剂盒。本试剂盒可以对呼吸道样本、血清、肺组织等样品中的猪流感病毒进行分型。

[0015] 本发明的目的是提供一种使用一步法实时荧光RT-PCR技术进行猪流感病毒分型的试剂盒，特别是涉及猪流感病毒的早期感染在实验室诊断中的应用及其流行状况监测。其基本原理是利用一对寡核苷酸的特异性引物和一条寡聚核苷酸的特异性探针，在逆转录酶(RT酶)、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂(RNasin)、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)
2+
以及Mg 等RT-PCR反应缓冲液中，通过DA7600、ABI7500等市售的荧光PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，从而达到快速、实时、定量检测靶多核苷酸的目的。

[0016] 为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：

[0017] 1)使用适当的核酸分析软件分别对已知的猪流感病毒H1型、H3型HA基因和N1型、N2型NA基因的核苷酸序列进行同源性比较，在找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件(例如Primer Express 2)选择并设计寡核苷酸引物和探针。由于所设计的引物和探针均具有互补于猪流感病毒相应型别的序列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性，不同型别的猪流感病毒之间不存在交叉反应的情况，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点，所以提高了猪流感病毒分型检测的可靠性和准确度。

[0018] 2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的TAMRA。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20％)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。

[0019] 3)适宜于一步法实时荧光RT-PCR扩增的反应体系。反应体系包括逆转录酶、热启动Taq酶、2’-脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液。由于要分别确认H抗原和N抗原的型别，两者结合起来才能判断猪流感病毒的具体亚型，因此本试剂盒试剂的反应体系将包括四种：分别是H1亚型反应体系、H3亚型反应体系、N1亚型反应体系和N2亚型反应体系。

[0020] 4)从待测样本中提取RNA，分别加入前述的反应体系中，直接经一步法RT-PCR扩增，从荧光扩增曲线判断猪流感病毒的型别。

[0021] 本发明所提供的样品中猪流感病毒进行分型的试剂盒包括：(1)分别装有RNA提取液(即TRIZOL核酸抽提试剂)、H1亚型反应体系、H3亚型反应体系、N1亚型反应体系和N2亚型反应体系、阴性质控品、H1亚型阳性质控品、H3亚型阳性质控品、N1业型阳性质控品和N2亚型阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

[0022] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中H1亚型反应体系包括H1亚型引物探针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR酶系；H3亚型反应体系包括H3亚型引物探针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR酶系；N1亚型反应体系包括N1亚型引物探针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR酶系；N2亚型反应体系包括N2亚型引物探针混合液、RT-PCR反应液、RT-PCR酶系。其中H1亚型反应体系、H3亚型反应体系、N1亚型反应体系、N2亚型反应体系中RT-PCR反应液、RT-PCR酶系的组分均相同。

[0023] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中H1亚型引物探针混合液由(a)与双链靶多核苷酸的第一条链结合的H1亚型正向引物，(b)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的H1亚型反向引物，(c)和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团和荧光淬灭基团的H1亚型寡核苷酸探针组成，以上引物探针浓度均为5～15pmol/反应，优选引物浓度为5pmol/反应、探针浓度为5pmol/反应。

[0024] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中H1亚型引物探针混合液中H1亚型正向引物的序列为：5’-TGGCACCAAGATATGCTTTTG -3’(SEQ ID NO：1)，H1亚型反向引物的序列为：5’-CAAGTCGCATTGCAGTCATG-3’(SEQID NO：2)，正、反向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基。

[0025] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中H1亚型引物探针混合液中H1亚型寡核苷酸探针的序列为：5’-CGGGTATCATAACATCGGATGCACCA-3’(SEQ ID NO：3)。

[0026] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中H3亚型引物探针混合液由(a)与双链靶多核苷酸的第一条链结合的H3亚型正向引物，(b)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的H3亚型反向引物，(c)和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团和荧光淬灭基团的H3亚型寡核苷酸探针组成，以上引物探针浓度均为5～15pmol/反应，优选引物浓度为5pmol/反应、探针浓度为5pmol/反应。

[0027] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中H3亚型引物探针混合液中H3亚型正向引物的序列为：5’-CGTCGTGAAAGCGTGAACAG-3’(SEQ ID NO：4)，H3亚型反向引物的序列为：5’-CGGCATGGTCACGTTCAG-3’(SEQ ID NO：5)，正、反向引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基。

[0028] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中H3亚型引物探针混合液中H3亚型寡核苷酸探针的序列为：5’-CCGTCTGAACTGGCTGCATAACCTGG-3’(SEQ ID NO：6)。

[0029] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中N1亚型引物探针混合液由(a)与双链靶多核苷酸的第一条链结合的N1亚型正向引物，(b)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的N1亚型反向引物，(c)和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团和荧光淬灭基团的N1亚型寡核苷酸探针组成，以上引物探针浓度均为5～15pmol/反应，优选引物浓度为5pmol/反应、探针浓度为5pmol/反应。

[0030] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中N1亚型引物探针混合液中N1亚型正向引物的序列为：5’-GACCTTGCTTTTGGGTTGAACT-3’(SEQ ID NO：7)，N1亚型反向引物的序列为：5’-AAGGATATGCTGCTCCCACTAGTC-3’(SEQ ID NO：8)，正、反向引物引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基。

[0031] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中N1亚型引物探针混合液中N1亚型寡核苷酸探针的序列为：5’-CAGAGGGCGACCCAAAGAGAACACAATC-3’(SEQ ID NO：9)。

[0032] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中N2亚型引物探针混合液由(a)与双链靶多核苷酸的第一条链结合的N2亚型正向引物，(b)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的N2亚型反向引物，(c)和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团和荧光淬灭基团的N2亚型寡核苷酸探针组成，以上引物探针浓度均为5～15pmol/反应，优选引物浓度为5pmol/反应、探针浓度为5pmol/反应。

[0033] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中N2亚型引物探针混合液中N2亚型正向引物的序列为：5’-GGGCACCACCCTGAACAA-3’(SEQ ID NO：10)，N2亚型反向引物的序列为：5’-CGTTCATCAGCAGGGTACGA-3’(SEQ ID NO：11)，正、反向引物引物可向5’和3’端方向各延伸10个碱基。

[0034] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中N2亚型引物探针混合液中N2亚型寡核苷酸探针的序列为：5’-CCATAGCAACGATACCGTGCATGATCG-3’(SEQ ID NO：12)。

[0035] 根据本发明的另一个优选实施方案，RT-PCR反应液包括一步法RT-PCR反应缓冲液和DEPC水，其中一步法RT-PCR反应缓冲液包含10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、150mmol/L KCl、2.0mmol/L MgCl2。

[0036] 根据本发明的另一个优选实施方案，RT-PCR酶系由逆转录酶(RT酶)、热启动Taq酶、RNasin、dNTPs、酶系稀释液组成，其中RT酶用量为1.5～3.5U/反应、热启动Taq酶用量为3～7U/反应、RNasin用量为15～25U/反应、dNTPs浓度为0.20mmol/L，酶系稀释液为一般市售的酶系稀释液。

[0037] 根据本发明的一个优选实施方案，其中阴性质控品为去离子水，H1亚型阳性质控品为含有H1亚型HA基因序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，H3亚型阳性质控品为含有H3亚型HA基因序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，N1亚型阳性质控品为含有N1亚型NA基因序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，N2亚型阳性质控品为含有N2亚型NA基因序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物序列SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，6
以上阳性质控品浓度均为1×10 拷贝/ml。

[0038] 根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为：50℃逆转录15min，1个循环；94℃ 15min，1个循环；最后95℃ 15s，55～60℃ 45s，45个循环(收集荧光信号)。

[0039] 根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待检样品是呼吸道样本、血清、肺组织等样品。

[0040] 本发明提供的一步法实时荧光RT-PCR试剂盒可以检测出猪流感病毒不同亚型的2
最低浓度为1.0×10copies/ml，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。

[0041] 本发明分别针对猪流感病毒H1亚型、H3亚型HA基因和N1亚型、N2亚型NA基因设计特异性引物和探针，可分别检测出猪流感病毒相应亚型，但不能检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒阳性样本，说明本试剂盒具有很好的特异性。

[0042] 本发明提供的一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒可以检测呼吸道样本、血清、肺组织等样品中的猪流感病毒不同亚型；可为灵敏、快速早期诊断猪流感病毒感染，监控其流行状况提供可靠的实验证据。

附图说明

[0043] 图1显示H1亚型阳性质控品、H3亚型阳性质控品、N1亚型阳性质控品、N2亚型阳性质控品和阴性质控品的检测结果。H1亚型阳性质控品、H3亚型阳性质控品、N1亚型阳性质控品、N2亚型阳性质控品扩增曲线有明显指数增长期，成S型，可明确判定为阳性。阴性质控品扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。

[0044] 图2显示特异性参考品的检测结果。9份特异性参考品的扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。9份特异性参考品分别为禽流感病毒H5/H7/H9各亚型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒。

[0045] 图3显示H1N1型猪流感病毒样本检测结果。H1亚型、N1亚型的扩增曲线有明显指数增长期成S型，可明确判定为阳性，其余亚型的扩增曲线扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性，因此可明确判定为H1N1型猪流感病毒。

[0046] 图4显示H3N2型猪流感病毒样本检测结果。H3亚型、N2亚型的扩增曲线有明显指数增长期成S型，可明确判定为阳性，其余亚型的扩增曲线扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性，因此可明确判定为H3N2型猪流感病毒。

[0047] 图5显示H1N2型猪流感病毒样本检测结果。H1亚型、N2亚型的扩增曲线有明显指数增长期成S型，可明确判定为阳性，其余亚型的扩增曲线扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性，因此可明确判定为H1N2型猪流感病毒。

[0048] 图6显示灵敏度参考品的检测结果。16份灵敏度参考品中除了浓度为1
1.0×10copies/ml的4份质粒样本扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。其余样本均可明确判定为阳性。

具体实施方式

[0049] 下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

[0050] 实施例1：猪流感病毒分型检测试剂的研制

[0051] 1、引物和探针的设计：通过对已报导猪流感病毒的核酸序列进行序列比对分析，分别以猪流感病毒H1型、H3型HA基因和N1型、N2型NA基因为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用软件和人工设计多对引物和探针。

[0052] 2、临床样本的选择：根据国内外相关文献报道表明，可以使用呼吸道样本、血清、肺组织等样品。

[0053] 3、反应体系的建立与优化

[0054] 样品的准备：以构建的含有各目的扩增片断的质粒作为阳性质控品，以禽流感病毒H5/H7/H9各亚型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒阳性样本作为阴性参考品；以去离子水作为阴性质控品，分别用TRIZOL提取上述阳性质控品与特异性参考品的RNA，阴性质控品待用。

[0055] 引物探针的筛选：以上述1中设计的多组引物探针分别检测上述的阳性质控品与阴性参考品的RNA，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合。(如序列表中SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：12)。

[0056] 引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从2pmol/反应至15pmol/反应梯度的引物和从2pmol/反应至15pmol/反应浓度梯度的探针进行PCR反应，经多次重复试验发现引物和探针浓度在5～15pmol/反应之间均可，其中最佳的引物浓度为5pmol/反应、探针浓度为5pmol/反应。

[0057] 镁离子浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1mol/L至2.5mmol/L浓度梯度的镁离子进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓度为2.0mmol/L。

[0058] 热启动Taq酶用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1U(酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的热启动Taq酶用量为3～7U/反应。

[0059] RT酶用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1U(酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RT酶用量为1.5～3.5U/反应。

[0060] RNasin用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从5U(酶单位)至40U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RNasin用量为15～25U/反应。

[0061] dNTPs浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/L至0.25mmol/L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为0.20mmol/L。

[0062] 反应温度的优化：根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：50℃逆转录15min，1个循环；94℃ 15min，1个循环；最后95℃ 15s，55～60℃ 45s，45个循环(收集荧光信号)。

[0063] 实施例2：猪流感病毒分型检测试剂盒及其使用

[0064] 1、制备包括下列组成成分的试剂盒：RNA提取液(50ml/管)1管、H1业型引物探针混合液(50μl/管)1管、H3亚型引物探针混合液(50μl/管)1管、、N1亚型引物探针混合液(50μl/管)1管、N2亚型引物探针混合液(50μl/管)1管、RT-PCR反应液(1440μl/管)1管、RT-PCR酶系(300μl/管)1管，阴性质控品(200μl/管)1管、H1亚型阳性质控品(100μl/管)1管、H3亚型阳性质控品(100μl/管)1管、N1亚型阳性质控品(100μl/管)1管、N2亚型阳性质控品(100μl/管)1管。

[0065] 2、标本采集、运送和保存

[0066] 根据实际情况进行标本采集，可检测的标本包括：呼吸道样本、血清、肺组织等样品。采集方法如下：①呼吸道样本：拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子浸入4-5ml采样液中，密封送检；②血清：无菌采集静脉血约1ml，分别于室温和4℃静置2小时和1小时后，离心(8,000rpm，5分钟)分离并收集血清标本；③肺组织：利用支气管镜对肺部可疑病灶进行活组织取样，并用组织匀浆器对组织样本进行匀浆待用。

[0067] 标本可立即用于测试，也可以保存于-70℃待测，保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶

[0068] 3、检测步骤

[0069] (1)RNA提取

[0070] 取上述类型的样本各100μl(样品不足100μl时请补加适量生理盐水重悬)，放置于1.5ml灭菌离心管，加入200μl Trizol试剂及100μl氯仿，用振荡器强力振荡20秒后静置3分钟；

[0071] 2～8℃下12,000rpm离心10min，吸取上清至另一干净的1.5ml离心管；

[0072] 加入0.2ml氯仿，盖紧盖子，手动用力颠倒摇动15s(不可用振荡器)，室温孵育2～3min；

[0073] 2～8℃下12000rpm离心15min后，取最上层的上清液至另一干净的1.5ml离心管；

[0074] 加入0.5ml预冷的异丙醇，缓慢颠倒充分混匀后，-20℃静置15min，2～8℃，12000rpm离心10min，小心弃尽上清液；

[0075] 加入1ml预冷的70％的冰冷乙醇，手动颠倒数次洗涤沉淀，2～8℃，8000rpm离心5min，小心弃尽上清液；

[0076] 空气或真空干燥5～10min，加入50μl DEPC H2O，55～60℃下孵育10min，手指轻轻弹打管底，使其充分溶解，直接用于实验或-70℃保存备用。

[0077] (2)PCR反应与结果分析

[0078] 分别取H1亚型引物探针混合液2μl、RT-PCR反应液15μl、RT-PCR酶系3μl配制成H1业型反应体系；取H3亚型引物探针混合液2μl、RT-PCR反应液15μl、RT-PCR酶系3μl配制成H3亚型反应体系；取N1亚型引物探针混合液2μl、RT-PCR反应液15μl、RT-PCR酶系3μl配制成N1亚型反应体系；取N2亚型引物探针混合液2μl、RT-PCR反应液15μl、RT-PCR酶系3μl配制成N2亚型反应体系。

[0079] 取阴性质控品、标本各5μl，分别加入H1亚型反应体系、H3亚型反应体系、N1亚型反应体系、N2亚型反应体系中，另外取H1亚型阳性质控品5μl加入H1亚型反应体系、H3亚型阳性质控品5μl加入H3亚型反应体系、N1亚型阳性质控品5μl加入N1亚型反应体系、N2亚型阳性质控品5μl加入N2亚型反应体系使用市售的荧光定量PCR仪(如ABI7500)进行PCR扩增。PCR循环条件是：50℃逆转录15min，1个循环；94℃ 15min，1个循环；最后95℃ 15s，55～60℃ 45s，45个循环(收集荧光信号)。

[0080] 反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线，分析实验结果。如扩增曲线有明显指数增长期，则判定为相应亚型阳性，否则为阴性。

[0081] 如H1亚型阳性、N1亚型阳性，其余亚型为阴性，则为H1N1型猪流感病毒；

[0082] 如H3亚型阳性、N2亚型阳性，其余亚型为阴性，则为H3N2型猪流感病毒；

[0083] 如H1亚型阳性、N2亚型阳性，其余亚型为阴性，则为H1N2型猪流感病毒；

[0084] 如H3亚型阳性、N1亚型阳性，其余亚型为阴性，则为H3N1型猪流感病毒。

[0085] 实施例3：应用猪流感病毒分型检测试剂盒检测样品

[0086] 以实施例1中的阳性质控品、阴性质控品、特异性参考品作为待检样本，按照实施例2的方法分别检测这些样本，阳性质控品检测结果为阳性，阴性质控品和特异性参考品检测结果均为阴性(参见附图1，2)。

[0087] 分别以H1N1型猪流感病毒、H3N2型猪流感病毒、H1N2型猪流感病毒样本作为待检样本，按照实施例2的方法分别检测这些样本，H1N1型猪流感病毒、H3N2型猪流感病毒、H1N2型猪流感病毒均准确分型(参见附图3，4，5)。

[0088] 实施例4：猪流感病毒分型检测试剂盒灵敏度实验

[0089] 分别以猪流感病毒H1亚型HA基因的质粒、H3亚型HA基因的质粒、N1亚型NA基4
因的质粒、N2亚型NA基因的质粒作为待测样本，各质粒浓度均稀释为1.0×10copies/ml、
3 2 1
1.0×10copies/ml、1.0×10copies/ml、1.0×10copies/ml组成灵敏度参考品，按照实施
2
例2的方法分别检测这16份样本，检测结果表明，本试剂盒的灵敏度为1.0×10copies/ml(见附图6)。

[0090] 序列表

[0091] <110>中山大学达安基因股份有限公司

[0092] <120>一种猪流感病毒实时荧光RT-PCR分型试剂盒

[0093] <140>

[0094] <141>

[0095] <160>12

[0096] <210>1

[0097] <211>21

[0098] <212>DNA

[0099] <213>人工序列

[0100] <220>

[0101] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

[0102] <400>1

[0103] tggcaccaagatatgcttttg

[0104] <210>2

[0105] <211>20

[0106] <212>DNA

[0107] <213>人工序列

[0108] <220>

[0109] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

[0110] <400>2

[0111] caagtcgcattgcagtcatg

[0112] <210>3

[0113] <211>26

[0114] <212>DNA

[0115] <213>人工序列

[0116] <220>

[0117] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。

[0118] <400>3

[0119] cgggtatcataacatcggatgcacca

[0120] <210>4

[0121] <211>20

[0122] <212>DNA

[0123] <213>人工序列

[0124] <220>

[0125] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

[0126] <400>4

[0127] cgtcgtgaaagcgtgaacag

[0128] <210>5

[0129] <211>18

[0130] <212>DNA

[0131] <213>人工序列

[0132] <220>

[0133] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

[0134] <400>5

[0135] cggcatggtcacgttcag

[0136] <210>6

[0137] <211>26

[0138] <212>DNA

[0139] <213>人工序列

[0140] <220>

[0141] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。

[0142] <400>6

[0143] ccgtctgaactggctgcataacctgg

[0144] <210>7

[0145] <211>22

[0146] <212>DNA

[0147] <213>人工序列

[0148] <220>

[0149] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

[0150] <400>7

[0151] gaccttgcttttgggttgaact

[0152] <210>8

[0153] <211>24

[0154] <212>DNA

[0155] <213>人工序列

[0156] <220>

[0157] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

[0158] <400>8

[0159] aaggatatgctgctcccactagtc

[0160] <210>9

[0161] <211>28

[0162] <212>DNA

[0163] <213>人工序列

[0164] <220>

[0165] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。

[0166] <400>9

[0167] cagagggcgacccaaagagaacacaatc

[0168] <210>10

[0169] <211>18

[0170] <212>DNA

[0171] <213>人工序列

[0172] <220>

[0173] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

[0174] <400>10

[0175] gggcaccaccctgaacaa

[0176] <210>11

[0177] <211>20

[0178] <212>DNA

[0179] <213>人工序列

[0180] <220>

[0181] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

[0182] <400>11

[0183] cgttcatcagcagggtacga

[0184] <210>12

[0185] <211>27

[0186] <212>DNA

[0187] <213>人工序列

[0188] <220>

[0189] <223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。

[0190] <400>12

[0191] ccatagcaacgataccgtgcatgatcg