用于自动预处理糖链的仪器转让专利
申请号 : CN200880119359.3
文献号 : CN101889202B
文献日 : 2013-02-06
发明人 : 西村绅一郎 , 篠原康郎 , 三浦嘉晃 , 山崎博司 , 堀内道雄 , 本木宏昭 , 黑田寿晴 , 喜多阳子 , 中野美佳
申请人 : 国立大学法人北海道大学 , 盐野义制药株式会社
摘要 :
本发明提供用于分析生物样品特别是血清中含有的糖链的自动分析仪器。即，旨在提供分析样品中的糖链的方法，所述方法包括下列步骤：A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤；B)制备用于检测的释放的糖链的检测样品制备步骤；和在利用板子进行质谱测试的情况下，C)形成具有点样于其上的捕获的糖链的用于质谱测试的板子的步骤，该步骤包括在收集板子上提供步骤B)中得到的标记的糖链样品溶液的步骤；和，如果需要，在附着有固相支持体的板子中进行操作以形成用于质谱测试的板子的步骤；和D)分析待测试的糖链的步骤。
权利要求 :
1.用于分析样品中的糖链的方法，该方法包括下列步骤：
A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤，该步骤包括下列步骤：A-1)将样品提供在用于反应的板子上的步骤；
A-2)添加增溶剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
A-3)添加还原剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
A-4)添加-SH保护剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
A-5)添加蛋白水解酶到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
A-6)灭活蛋白水解酶的步骤；和
A-7)添加糖链释放酶到样品中从而释放糖链的步骤；
B)制备在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备步骤，该步骤包括下列步骤：B-1)使步骤(A)中制备的样品与糖链捕获珠子接触，然后将样品置于使样品中释放的糖链结合至所述珠子的条件下，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；
B-2)添加蛋白变性剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；
B-3)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；
B-4)添加珠子上的糖链捕获剂的盐释放剂到捕获的糖链样品中，然后通过抽吸除去盐释放剂的步骤；
B-5)添加保护剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；
B-6)添加酸到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去酸的步骤；
B-7)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中的步骤；
B-8)除去珠子中的溶剂和水分的步骤；
B-9)添加烷基酯化剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，并将唾液酸的羧酸烷基化的步骤；
B-10)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去有机反应溶剂的步骤；
B-11)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；
B-12)从捕获的糖链样品中释放糖链样品的步骤，其中当进行分析所需要的标记时，将捕获的糖链样品中的糖链用标记试剂标记并将其从珠子释放；和B-13)溶解释放的糖链样品以产生糖链样品溶液的步骤；
C)当使用板子进行质谱法分析时，制备具有点样于其上的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子的步骤，该步骤包括：C-1)在用于回收的板子上处理步骤(B)中得到的标记的糖链样品溶液的步骤；并且该步骤还任选包括步骤(C-2)至(C-6)：C-2)在用于混合的板子上处理来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和有机溶剂以得到糖链吸附至固相的在有机溶剂中的浓度的步骤；
C-3)提供附着有固相载体的板子的步骤；
C-4)根据附着有固相载体的板子的相，活化附着有固相载体的板子并洗涤该附着有固相载体的板子的步骤；
C-5)添加标记的糖链样品溶液至附着有固相载体的板子，并使标记的糖链样品溶液顺应具有适合于附着有固相载体的板子的相的极性的溶剂的步骤；
C-6)通过抽吸从附着有固相载体的板子回收标记的糖链样品溶液至第二个用于回收的板子的步骤；和当将标记的糖链样品溶液进行MALDI-TOF MS时，包括下列步骤(C-7)：C-7)将标记的糖链样品溶液与用于质谱测试的基质混合，并将该混合物点样于用于测试的板子上的步骤；和D)对待测试的糖链进行分析的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中对于步骤A-1)，样品是体液、细胞提取物或组织提取物。
3.根据权利要求1-2任一项的方法，其中对于步骤A-2)，增溶剂是1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)、1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)、2-羟基-3-磺丙基月桂酸酯(HSD)或其等价物，且反应条件是在25℃-42℃下。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中对于步骤A-3)，还原剂是二硫苏糖醇(DTT)、
0.5M TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液)或其等价物，且反应条件是在室温至80℃下。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中对于步骤A-4)，-SH保护剂是碘乙酰胺(IAA)或其等价物，且反应条件是在黑暗中于20-37℃下。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中对于步骤A-5)，蛋白水解酶是胰蛋白酶、糜蛋白酶或其等价物，且反应条件是在25-42℃下。
7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中对于步骤A-6)，用于灭活的条件包括加热至
65℃或更高。
8.根据权利要求1-7任一项的方法，其中对于步骤A-7)，糖链释放酶是肽-N-糖苷酶F、肽-N4-(乙酰基-β-葡糖胺基)-天冬酰胺酰胺酶(PNGaseF)、Endo H或其等价物，且用于糖链释放酶的反应条件是在25℃-42℃下。
9.根据权利要求1-8任一项的方法，其中对于步骤B-1)，珠子是具有糖链捕获基团的珠子或磁性珠子，所述糖链捕获基团包括氨基氧基基团、N-烷基氨基氧基基团、酰肼基团、叠氮基团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基或与其结合的衍生物，且样品中释放的糖链结合至珠子的条件是在25-80℃下。
10.根据权利要求1-9任一项的方法，其中对于步骤B-2)，变性剂是盐酸胍、脲、十二烷基硫酸钠或其等价物，且反应条件包括在室温添加、并保持该温度以使珠子充分膨胀10秒至5分钟。
11.根据权利要求1-10任一项的方法，其中对于步骤B-3)，洗涤用水进行。
12.根据权利要求1-11任一项的方法，其中对于步骤B-4)，珠子上的糖链捕获剂是氨基氧基基团、N-烷基氨基氧基基团、酰肼基团、叠氮基团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基或其衍生物，且在酰肼情况下，盐释放剂是三乙胺或其等价物，及在N-烷基氨基氧基基团情况下，盐释放剂是三乙胺或其等价物。
13.根据权利要求1-12任一项的方法，其中对于步骤B-5)，保护剂是乙酸酐、琥珀酸酐或其它酸酐或其等价物，且反应条件是在15-37℃使用溶于甲醇中的乙酸酐。
14.根据权利要求1-13任一项的方法，其中对于步骤B-6)，酸是盐酸或另外的无机酸或pH 2-3的等价酸。
15.根据权利要求1-14任一项的方法，其中对于步骤B-7)，所述步骤包括在用有机反应溶剂置换之前用亲水性有机溶剂置换的步骤，并且亲水性有机溶剂是低级醇、乙腈或丙酮，而有机反应溶剂是二氧六环、乙腈、四氢呋喃或其等价物。
16.根据权利要求1-15任一项的方法，其中对于步骤B-8)，除去珠子中的溶剂和水分的步骤包括用滤纸、吸墨纸、纱布、毛巾、手帕、薄纸或棉布擦拭底部。
17.根据权利要求1-16任一项的方法，其中对于步骤B-9)，烷基酯化剂是甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)、乙基-对-甲苯基-三氮烯(ETT)、丁基-对-甲苯基-三氮烯(BTT)或其等价物，且反应条件是在20-80℃使用100mM MTT在二氧六环中的溶液，持续30分钟至
5小时。
18.根据权利要求1-17任一项的方法，其中对于步骤B-10)，有机反应溶剂是二氧六环、乙腈、四氢呋喃或其等价物。
19.根据权利要求1-18任一项的方法，其中对于步骤B-11)，洗涤用甲醇、NaCl溶液和水中的至少一种进行。
20.根据权利要求1-19任一项的方法，其中对于步骤B-12)，进行标记，所述标记采用能吸收紫外线和可见光的生色团、具有发射荧光的结构的标记物、具有能与另一个分子相互作用的分子的亲和标记物、具有能与官能团特异性反应的官能团的标记物、具有在疏水结构中的官能团的标记物或者具有金属离子配体的标记物来进行，并且标记通过添加乙酸、乙腈或醋酸盐缓冲液来进行。
21.根据权利要求1-20任一项的方法，其中对于步骤B-13)，标记的捕获的糖链样品的溶解采用水、水溶液或其等价物来完成。
22.根据权利要求1-21任一项的方法，其中对于步骤C-1)，用于回收的板子上的处理在除去标记试剂的条件下进行。
23.根据权利要求1-22任一项的方法，其中对于步骤C-2)，糖链吸附至固相的浓度是
80-90％在有机溶剂中。
24.根据权利要求1-23任一项的方法，其中对于步骤C-3)，附着有固相载体的板子是多孔型的并包含适合于固相萃取的树脂或膜的表面。
25.根据权利要求1-24任一项的方法，其中对于步骤C-4)，当附着有固相载体的板子是正相模式时，洗涤依次用水和乙腈进行，并且当附着有固相载体的板子是反相模式时，洗涤依次用低级醇和水进行。
26.根据权利要求1-25任一项的方法，其中对于步骤C-5)，在正相模式情况下具有相反极性的溶剂是疏水有机溶剂，并且，在反相模式中具有相反极性的溶剂是亲水溶剂。
27.根据权利要求1-26任一项的方法，其中对于步骤C-6)，第二个用于回收的板子是多孔型的并包含适用于固相萃取的树脂或膜的表面。
28.根据权利要求1-27任一项的方法，其中对于步骤C-7)，用于质谱测试的基质是2，
5-二羟基苯甲酸或其等价物，并且在用于质谱测试的基质上的标记的糖链样品溶液的点样混合或依次进行，并将其任选地稀释。
29.根据权利要求1-28任一项的方法，其中对于步骤D)，通过高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-电喷雾电离质谱(LC-ESI MS)、基质辅助的激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)或其等价方法进行待测定糖链的分析，然而当在标记中使用着色剂或生物素时，根据需要进行除去任何过量的着色剂的步骤，且当所述珠子是磁性珠子时，该磁性珠子是具有可修饰的官能团酰肼基团或氨基氧基基团的珠子。
30.根据权利要求1的方法，其中步骤A-1)包含将作为样品的血清提供在过滤板上的步骤。
31.根据权利要求1和30任一项的方法，其中步骤A-2)包含添加1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)或者1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)溶在碳酸氢铵中的溶液，并使混合物在25-42℃反应5-60分钟的步骤。
32.根据权利要求1、30-31任一项的方法，其中步骤A-3)包含添加二硫苏糖醇(DTT)至样品中，使混合物在50-80℃反应10-60分钟，然后冷却反应混合物至室温的步骤。
33.根据权利要求1、30-32任一项的方法，其中步骤A-4)包含添加碘乙酰胺(IAA)，并使混合物在黑暗中于室温反应0.5-2小时的步骤。
34.根据权利要求1、30-33任一项的方法，其中步骤A-5)包含添加胰蛋白酶至样品中，并使混合物在25-42℃反应30-120分钟的步骤。
35.根据权利要求1、30-34任一项的方法，其中步骤A-6)包含加热样品至80-100℃，持续1-10分钟，然后冷却样品至室温的步骤。
36.根据权利要求1、30-35任一项的方法，其中步骤A-7)包含加入PNGaseF，并使混合物在25-42℃反应6-24小时的步骤。
37.根据权利要求1、30-36任一项的方法，其中步骤B-1)包含使步骤(A)中制备的捕获的糖链样品与用于捕获糖链的珠子接触，从而在40℃至80℃下结合，并由此产生捕获的糖链样品的步骤。
38.根据权利要求1、30-37任一项的方法，其中步骤B-2)包含添加盐酸胍到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，然后通过抽吸除去反应液体的步骤。
39.根据权利要求1、30-38任一项的方法，其中步骤B-3)包含用水洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去水的步骤。
40.根据权利要求1、30-39任一项的方法，其中步骤B-4)包含用三乙胺洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去三乙胺的步骤。
41.根据权利要求1、30-40任一项的方法，其中步骤B-5)包含添加乙酸酐到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，所述反应条件即使用10％乙酸酐的甲醇溶液在室温反应10分钟至2小时，然后通过抽吸除去乙酸酐的步骤。
42.根据权利要求1、30-41任一项的方法，其中步骤B-6)包含添加盐酸至捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去盐酸的步骤。
43.根据权利要求1、30-42任一项的方法，其中步骤B-7)包含添加甲醇到捕获的糖链样品中，通过抽吸除去甲醇，然后添加二氧六环到捕获的糖链样品中的步骤。
44.根据权利要求1、30-43任一项的方法，其中步骤B-8)包含用棉布擦拭底部的步骤。
45.根据权利要求1、30-44任一项的方法，其中步骤B-9)包含添加甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)到捕获的糖链样品中，并使混合物在60℃或更高的温度反应30-120分钟的步骤。
46.根据权利要求1、30-45任一项的方法，其中步骤B-10)包含添加二氧六环到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去二氧六环的步骤。
47.根据权利要求1、30-46任一项的方法，其中步骤B-11)包含依次用甲醇、NaCl溶液和水洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去水的步骤。
48.根据权利要求1、30-47任一项的方法，其中步骤B-12)包含添加乙酸和乙腈到捕获的糖链样品中，并利用氨基氧基色氨酰基精氨酸甲酯的水溶液、盐酸O-苄基羟胺的水溶液或邻氨基苯甲酰肼的水溶液标记捕获的糖链样品中的糖链的步骤。
49.根据权利要求1、30-48任一项的方法，其中步骤B-13)包含添加水到标记的捕获的糖链样品中以产生标记的糖链样品溶液的步骤。
50.根据权利要求1、30-49任一项的方法，其中步骤C-1)包含在用于回收的板子上处理步骤(B)中得到的标记的糖链样品溶液的步骤。
51.根据权利要求1、30-50任一项的方法，其中步骤C-2)包含在用于混合的板子上处理来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和乙腈，以达到80-90％的乙腈终浓度的步骤。
52.根据权利要求1、30-51任一项的方法，其中步骤C-3)包含提供正相模式的附着有固相载体的板子的步骤。
53.根据权利要求1、30-52任一项的方法，其中步骤C-4)包含依次用水和乙腈洗涤附着有固相载体的板子，并通过抽吸除去水和乙腈的步骤。
54.根据权利要求1、30-53任一项的方法，其中步骤C-5)包含添加标记的糖链样品溶液到附着有固相载体的板子中，除去液体，用乙腈洗涤板子，并向其中添加1-20％乙腈的步骤。
55.根据权利要求1、30-54任一项的方法，其中步骤C-6)包含通过抽吸从附着有固相载体的板子回收珠子至第二个用于回收的板子的步骤。
56.根据权利要求1、30-55任一项的方法，其中步骤C-7)包含添加在20-40％乙腈中的2，5-二羟基苯甲酸到标记的糖链样品溶液中，并混合和点样该混合物的步骤。
57.根据权利要求1、30-56任一项的方法，其中步骤D)包含通过MALDI-TOF MS完成质谱法的步骤。
58.根据权利要求30-57任一项的方法，其中糖链捕获珠子是磁性珠子，并且分离利用磁场进行而不是通过抽吸除去来进行。
59.制备用于分析样品中的糖链的预处理样品的方法，该方法包括下列步骤：A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤，该步骤包括下列步骤：A-1)将样品提供在用于反应的板子上的步骤；
A-2)添加增溶剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
A-3)添加还原剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
A-4)添加-SH保护剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
A-5)添加蛋白水解酶到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
A-6)灭活蛋白水解酶的步骤；和
A-7)添加糖链释放酶到样品中以释放糖链的步骤；和
B)制备在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备步骤，该步骤包括下列步骤：B-1)使步骤(A)中制备的样品与珠子接触，然后将样品置于使样品中释放的糖链结合到珠子的条件下，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；
B-2)添加蛋白变性剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；
B-3)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；
B-4)添加珠子上的糖链捕获剂的盐释放剂到捕获的糖链样品中，然后通过抽吸除去盐释放剂的步骤；
B-5)添加保护剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；
B-6)添加酸到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去酸的步骤；
B-7)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中的步骤；
B-8)除去珠子中的溶剂和水分的步骤；
B-9)添加烷基酯化剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，并将唾液酸的羧酸烷基化的步骤；
B-10)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去有机反应溶剂的步骤；
B-11)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；
B-12)从捕获的糖链样品中释放糖链样品的步骤，其中当进行分析所需要的标记时，用标记试剂标记捕获的糖链样品中的糖链，并将其从珠子上释放；和B-13)溶解释放的糖链样品以产生糖链样品溶液的步骤。
60.糖链分析仪器，其包括下列组件：
1)板子固定座，其是任选可加热和/或可移动的；
2)试剂贮存组件，其在对于贮存而言所需要的温度下贮存一种或多种制备的试剂，其中试剂贮存组件是与支架或阀连接的贮存器，并且试剂贮存组件贮存一种或几种选自以下的试剂：增溶剂、还原剂、-SH保护剂、蛋白水解酶、糖链释放酶、糖链捕获珠子、蛋白变性剂、洗涤液体、糖链捕获剂的盐释放剂、保护剂、酸、有机反应溶剂、烷基酯化剂、标记剂、用于标记的糖链样品的溶剂、用于吸附至固相的有机溶剂、用于顺应的溶剂和用于质谱测试的基质；
3)用于从试剂贮存组件分配各种试剂的管嘴和/或阀；
4)板子移动组件；
5)任选的抽吸除去组件或磁场产生组件；
6)任选的摇动和/或搅拌组件；
7)板子贮存组件；和
8)完成质谱法的组件。
61.自动糖链预处理仪器，其包括下列组件：
1)板子固定座，根据需要其是可加热和/或可移动的；
2)试剂贮存组件，其在对于贮存而言所需要的温度下贮存一种或多种制备的试剂，其中试剂贮存组件是与支架或阀连接的贮存器，并且试剂贮存组件贮存一种或几种选自以下的试剂：增溶剂、还原剂、-SH保护剂、蛋白水解酶、糖链释放酶、糖链捕获珠子、蛋白变性剂、洗涤液体、糖链捕获剂的盐释放剂、保护剂、酸、有机反应溶剂、烷基酯化剂、标记剂、用于标记的糖链样品的溶剂、用于吸附至固相的有机溶剂、用于顺应的溶剂和用于质谱测试的基质；
3)用于从试剂贮存组件分配各种试剂的管嘴和/或阀；
4)板子移动组件；
5)任选的抽吸除去组件或磁场产生组件；
6)任选的摇动和/或搅拌组件；和
7)板子贮存组件。
62.根据权利要求45的方法，其中使混合物反应60分钟。
63.根据权利要求25的方法，其中所述低级醇是甲醇。
64.根据权利要求15的方法，其中所述低级醇是甲醇或乙醇。
说明书 :
用于自动预处理糖链的仪器
技术领域
[0001] 本发明涉及用于糖链分析的仪器。本发明可应用于疾病的诊断等。更具体地讲，本发明涉及自动糖链预处理仪器。
背景技术
[0002] 用于定量分析糖链的预处理方法(专利文件1；非专利文件1)。已报道了一种高灵敏度地迅速检测糖链的方法以便快速分析糖链，该方法如下进行：选择性地仅捕获从糖蛋白释放的糖链，将糖链固定在珠子上，并洗涤该珠子(非专利文件2)。然而，使用大量样品例如血清样品自动完成糖链分析的仪器或预处理仪器仍是未知的。
[0003] 在常规技术中，体液例如血(清)和细胞/组织提取物的生物学衍生的混合物中含有的糖链的纯化是按照下列步骤完成的。
[0004] A.在可溶产物存在下将样品中的糖蛋白还原烷基化。
[0005] B.将蛋白水解酶加入其中以便用该酶消化蛋白质部分，然后将系统加热来灭活所述酶。
[0006] C.进行从肽释放糖链的酶处理或化学处理来释放糖链。
[0007] D.使具有能捕获糖链的官能团的聚合物珠子(polymer beads)与已经用C.项处理的样品接触，并由此通过聚合物珠子的官能团来捕获释放的糖链。
[0008] E.将样品洗涤并过滤以便除去那些未被聚合物珠子的官能团捕获的杂质。
[0009] F.通过甲基酯化官能团来保护被聚合物珠子的官能团捕获的糖链的唾液酸残基的羧酸。
[0010] G.将聚合物珠子的官能团捕获的糖链进行腙键还原，以稳定其与聚合物珠子的结合。
[0011] H.通过腙-肟交换反应、通过裂解珠子上的糖链捕获分子中包含的二硫键或者通过给予含氨基氧基的化合物，从聚合物珠子释放糖链。在后者情况中，不进行G.项处理。
[0012] I.在滤液中回收释放的糖链。
[0013] J.将MALDI基质加入含有糖链的滤液中，然后将混合物滴加在MALDI板上。
[0014] 专利文件1：WO 2004/058687
[0015] 非专利文件1：Mol.Cell.Proteomics.2007；6：1437-45。基于释放N-聚糖的标准化方法的人全血清糖蛋白的定量糖组学(Quantitativeglycomics of human whole serum glycoproteins based on the standardizedprotocol for liberating N-glycans).Kita Y，Miura Y，Furukawa J，NakanoM，Shinohara Y，Ohno M，Takimoto A，Nishimura S。
[0016] 非专利文件2：Chem.Euro.J.2007；13：4797-804。用于通过质谱法的定量糖组学的唾液酸残基快速而简单的固相酯化(Rapid and simplesolid-phase esterification of sialic acid residues for quantitative glycomicsby mass spectrometry).Miura Y，Shinohara Y，Furukawa J，Nagahori N，Nishimura S。
发明内容
[0017] 本发明要解决的问题
[0018] 然而，上述过程通常主要通过手动来完成，因此，这些过程需要大量的时间和劳动，而且实现高度准确的纯化是困难的。
[0019] 在这种情况下完成了本发明，且本发明旨在提供自动糖链预处理仪器，该仪器通过使处理过程自动化而使得纯化快速高准确度地完成。
[0020] 也就是说，本发明的目的是提供用于分析血清样品中含有的糖链的自动分析仪器。一个目的是使利用自动分析仪器同时自动分析大量的样品成为可能。为了从糖蛋白定量释放糖链，需要繁琐的预处理例如应用增溶剂、还原烷基化和经胰蛋白酶消化。另外，可以将已定量释放的糖链通过进行化学选择性捕获并藉此容易地除去不受欢迎的异物而实现糖链的快速分析。然而，一次处理多个测试样品是困难的。因此，意欲优化上述的各个过程并建立适合于自动分析的系统。
[0021] 解决问题的方法
[0022] 本发明的发明人进行了详细的研究，由此，他们发现了当应用血清样品时，能自动制备用于质谱法的样品的仪器。其后，通过进行质谱法分析，使糖链的自动分析成为可能。本发明人已能够研制可以完成包括从预处理到糖链的捕获、唾液酸的修饰以及至糖链释放的全部过程的仪器。
[0023] 本发明提供以下内容。
[0024] (1)用于分析样品中的糖链的方法，该方法包括下列步骤：
[0025] A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤，该步骤包括下列步骤：
[0026] A-1)将样品提供在用于反应的板子上的步骤；
[0027] A-2)添加增溶剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0028] A-3)添加还原剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0029] A-4)添加-SH保护剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0030] A-5)添加蛋白水解酶到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0031] A-6)灭活蛋白水解酶的步骤；和
[0032] A-7)添加糖链释放酶到样品中从而释放糖链的步骤；
[0033] B)制备用于在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备步骤，该步骤包括下列步骤：
[0034] B-1)使步骤(A)中制备的样品与糖链捕获珠子接触，然后将样品置于使样品中释放的糖链结合至所述珠子的条件下，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；
[0035] B-2)添加蛋白变性剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；
[0036] B-3)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸(suction)除去残留的洗涤液体的步骤；
[0037] B-4)添加珠子上的糖链捕获剂的盐释放剂到捕获的糖链样品中，然后通过抽吸除去盐释放剂的步骤；
[0038] B-5)添加保护剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链置于反应条件下的步骤；
[0039] B-6)添加酸到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去该酸的步骤；
[0040] B-7)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中的步骤；
[0041] B-8)除去珠子中的水分和溶剂的步骤；
[0042] B-9)添加烷基酯化剂到捕获的糖链样品中然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，并将唾液酸的羧酸烷基化的步骤；
[0043] B-10)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去有机反应溶剂的步骤；
[0044] B-11)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；
[0045] B-12)从捕获的糖链样品中释放糖链样品的步骤，其中当进行分析所需要的标记时，将捕获的糖链样品中的糖链用标记试剂标记并将其从珠子释放；和
[0046] B-13)溶解释放的糖链样品以产生糖链样品溶液的步骤；
[0047] C)当使用板子进行质谱法分析时，制备具有点样(dotted)于其上的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子的步骤，该步骤包括：
[0048] C-1)在用于回收的板子上处理步骤(B)中得到的标记的糖链样品溶液的步骤；并且该步骤还任选包括步骤(C-2)至(C-6)：
[0049] C-2)在用于混合的板子上处理来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和有机溶剂以得到糖链吸附至固相的在有机溶剂中的浓度的步骤；
[0050] C-3)提供附着有固相载体的板子的步骤；
[0051] C-4)根据附着有固相载体的板子的相，活化附着有固相载体的板子并洗涤该附着有固相载体的板子的步骤；
[0052] C-5)添加标记的糖链样品溶液至附着有固相载体的板子，并使标记的糖链样品溶液顺应具有适合于附着有固相载体的板子的相的极性的溶剂的步骤；
[0053] C-6)通过抽吸从附着有固相载体的板子回收标记的糖链样品溶液至第二个用于回收的板子的步骤；和
[0054] 当将标记的糖链样品溶液进行MALDI-TOF MS时，包括下列步骤(C-7)：
[0055] C-7)将标记的糖链样品溶液与用于质谱测试的基质混合，并将该混合物点样于用于测试的板子上的步骤；和
[0056] D)对待测试的糖链进行分析的步骤。
[0057] (2)根据第(1)项的方法，前述步骤进一步具有下述特征中的至少任何一个特征：
[0058] A)在释放样品中的糖链以制备用于分析的糖链样品的糖链释放步骤中：
[0059] A-1)样品是体液、细胞提取物或组织提取物；
[0060] A-2)增溶剂是1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)、1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)、2-羟基-3-磺丙基月桂酸酯(HSD)或其等价物，或者
[0061] 反应条件为在25℃-42℃下；
[0062] A-3)还原剂是二硫苏糖醇(DTT)、TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液，0.5M)或其等价物，或者
[0063] 反应条件为在室温至80℃下；
[0064] A-4)-SH保护剂是碘乙酰胺(IAA)或其等价物，或者
[0065] 反应条件是在黑暗中于20-37℃下；
[0066] A-5)蛋白水解酶是胰蛋白酶、糜蛋白酶或其等价物，或者反应条件为在25-42℃下；
[0067] A-6)用于灭活的条件包括加热至65℃或更高；
[0068] A-7)糖链释放酶是肽-N-糖苷酶F、肽-N4-(乙酰基-β-葡糖胺基)-天冬酰胺酰胺酶(PNGaseF)、Endo H或其等价物，或者
[0069] 用于糖链释放酶的反应条件为在25℃-42℃下；
[0070] 就步骤(B)而言，
[0071] B-1)所述珠子是具有糖链捕获基团的珠子或磁性珠子，所述糖链捕获基团包括氨基氧基基团、N-烷基氨基氧基基团、酰肼基团、叠氮基团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基或与其结合的衍生物，或者
[0072] 样品中释放的糖链结合至珠子的条件是在25-80℃下；
[0073] B-2)所述变性剂是盐酸胍、脲、十二烷基硫酸钠或其等价物，或者
[0074] 反应条件包括在室温下添加、并保持该温度以使珠子充分膨胀(10秒至5分钟)；
[0075] B-3)洗涤用水进行；
[0076] B-4)珠子上的糖链捕获剂是氨基氧基基团、N-烷基氨基氧基基团、酰肼基团、叠氮基团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基或其衍生物，且在酰肼情况下，盐释放剂是三乙胺或其等价物，且在N-烷基氨基氧基基团情况下，盐释放剂是三乙胺或其等价物；
[0077] B-5)保护剂是乙酸酐、琥珀酸酐或其它酸酐或其等价物，或者反应条件是在15-37℃使用乙酸酐/甲醇；
[0078] B-6)酸是盐酸或另外的无机酸或pH2-3的等价酸；
[0079] B-7)所述步骤包括在用有机反应溶剂置换之前用亲水性有机溶剂置换的步骤，并且亲水性有机溶剂是低级醇例如甲醇或乙醇、乙腈或丙酮，而有机反应溶剂是二氧六环、乙腈、四氢呋喃或其等价物。
[0080] B-8)除去珠子中的溶剂和水分的步骤包括用滤纸、吸墨纸、纱布、毛巾、手帕、薄纸(tissue paper)或棉布(cotton sheet)擦拭底部，
[0081] B-9)烷基酯化剂是甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)、乙基-对-甲苯基-三氮烯(ETT)、丁基-对-甲苯基-三氮烯(BTT)或其等价物，或者
[0082] 反应条件是在20-80℃使用100mM MTT/二氧六环，持续30分钟至5小时；
[0083] B-10)有机反应溶剂是二氧六环、乙腈、四氢呋喃或其等价物；
[0084] B-11)洗涤采用甲醇、NaCl溶液和水中的至少一种进行；
[0085] B-12)进行标记，所述标记采用能吸收紫外线和可见光的生色团、具有发射荧光的结构的标记物(tag)、具有能与另一个分子相互作用的分子的亲和标记物、具有能与官能团特异性反应的官能团的标记物、具有在疏水结构中的官能团的标记物或者具有金属离子配体的标记物来进行，并且所述标记通过加入乙酸、乙腈、醋酸盐缓冲液或其等价物来进行，和
[0086] B-13)标记的捕获的糖链样品的溶解采用水、水溶液或其等价物来完成；
[0087] C)在制备具有点样于其上的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子的步骤中；
[0088] C-1)用于回收的板子上的处理在除去标记试剂的条件下进行；
[0089] C-2)糖链吸附至固相的浓度是80-90％在有机溶剂中；
[0090] C-3)附着有固相载体的板子是多孔型的并包含适合于固相萃取的树脂或膜的表面；
[0091] C-4)当附着有固相载体的板子是正相模式时，洗涤依次用水和乙腈进行，并且当附着有固相载体的板子是反相模式时，洗涤依次用低级醇例如甲醇和水进行；
[0092] C-5)在正相模式情况下具有相反极性的溶剂是疏水有机溶剂，并且，在反相模式中具有相反极性的溶剂是亲水溶剂。
[0093] C-6)第二个用于回收的板子是多孔型的并包含适用于固相萃取的树脂或膜的表面；和
[0094] C-7)用于质谱测试的基质是2，5-二羟基苯甲酸或其等价物，并且在用于质谱测试的基质上的标记的糖链样品溶液的点样混合或依次进行，并将其任选地稀释；
[0095] D)通过高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-电喷雾电离质谱(LC-ESIMS)、基质辅助的激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)或其等价方法进行待测定糖链的分析，然而当在标记中使用着色剂或生物素时，根据需要除去任何过量的着色剂的步骤，和
[0096] 当所述珠子是磁性珠子时，该磁性珠子是具有可修饰的官能团酰肼基团或氨基氧基基团的珠子。
[0097] (3)根据第(1)项的方法，其特征还在于包括在下列步骤中的至少一个步骤：
[0098] A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤，该步骤包括下列步骤：
[0099] A-1)将作为样品的血清提供在过滤板上的步骤；
[0100] A-2)添加1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)或者1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)/碳酸氢铵，并使混合物在25-42℃(例如37℃)反应5-60分钟(例如10分钟)的步骤。
[0101] A-3)添加二硫苏糖醇(DTT)至样品，使混合物在50-80℃(例如60℃)反应10-60分钟(例如30分钟)，然后冷却反应混合物至室温的步骤；
[0102] A-4)添加碘乙酰胺(IAA)，并使混合物在黑暗中于室温反应0.5-2小时(例如1h)的步骤；
[0103] A-5)添加胰蛋白酶至样品，并使混合物在25-42℃(例如37℃)反应30-120分钟(例如60分钟)的步骤；
[0104] A-6)加热样品至80-100℃(例如90℃)，持续1-10分钟(例如5分钟)，然后冷却样品至室温的步骤；和
[0105] A-7)加入PNGaseF，并使混合物在25-42℃(例如37℃)反应6-24小时(例如12h)的步骤；
[0106] B)制备用于在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备步骤，所述步骤包括下列步骤：
[0107] B-1)使步骤(A)中制备的捕获的糖链样品与用于捕获糖链的珠子接触，从而在40或更高的温度(例如80℃)下结合，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；
[0108] B-2)添加盐酸胍到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，然后通过抽吸除去反应液体的步骤；
[0109] B-3)用水洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去水的步骤；
[0110] B-4)用三乙胺洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去三乙胺的步骤；
[0111] B-5)添加乙酸酐到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件(即采用10％乙酸酐/甲醇在室温反应10分钟至2小时(例如30分钟))下，然后通过抽吸除去乙酸酐的步骤；
[0112] B-6)添加盐酸至捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去盐酸的步骤；
[0113] B-7)添加甲醇到捕获的糖链样品中，通过抽吸除去甲醇，然后添加二氧六环到捕获的糖链样品中的步骤；
[0114] B-8)用棉布擦拭底部的步骤；
[0115] B-9)添加甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)到捕获的糖链样品中，并使混合物在60℃或更高的温度(例如80℃)反应30-120分钟(例如60分钟)；
[0116] B-10)添加二氧六环到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去二氧六环的步骤；
[0117] B-11)依次用甲醇、NaCl溶液和水洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去水的步骤；
[0118] B-12)添加乙酸和乙腈到捕获的糖链样品中，并利用氨基氧基色氨酰基精氨酸甲酯/水、盐酸O-苄基羟胺/水或邻氨基苯甲酰肼/水标记捕获的糖链样品中的糖链的步骤；和
[0119] B-13)添加水到标记的捕获的糖链样品中以产生标记的糖链样品溶液的步骤；
[0120] C)制备用于质谱测试的板子的步骤，所述板子具有点样于其上的标记的捕获的糖链样品，该步骤包括：
[0121] C-1)在用于回收的板子上处理步骤(B)中得到的标记的糖链样品溶液的步骤；
[0122] C-2)在用于混合的板子上处理来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和乙腈，以达到80-90％的乙腈终浓度的步骤；
[0123] C-3)提供正相模式的附着有固相载体的板子的步骤；
[0124] C-4)依次用水和乙腈洗涤附着有固相载体的板子，并通过抽吸除去水和乙腈的步骤；
[0125] C-5)添加标记的糖链样品溶液到附着有固相载体的板子中，除去液体，用乙腈洗涤板子，并向其中添加1-20％(例如5％)乙腈的步骤；
[0126] C-6)通过抽吸从附着有固相载体的板子回收珠子至第二个用于回收的板子的步骤；和
[0127] C-7)添加在20-40％(例如30％)乙腈中的2，5-二羟基苯甲酸到标记的糖链样品溶液中，并混合和点样该混合物的步骤；和
[0128] D)通过MALDI-TOF MS完成质谱法的步骤。
[0129] (4)根据第(3)项的方法，其中糖链捕获珠子是磁性珠子，并且分离利用磁场进行而不是通过抽吸除去来进行。
[0130] (5)制备用于分析样品中的糖链的预处理样品的方法，该方法包括下列步骤：
[0131] A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤，该步骤包括下列步骤：
[0132] A-1)将样品提供在用于反应的板子上的步骤；
[0133] A-2)添加增溶剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0134] A-3)添加还原剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0135] A-4)添加-SH保护剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0136] A-5)添加蛋白水解酶到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0137] A-6)灭活蛋白水解酶的步骤；和
[0138] A-7)添加糖链释放酶到样品中以释放糖链的步骤；和
[0139] B)制备在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备步骤，该步骤包括下列步骤：
[0140] B-1)使步骤(A)中制备的样品与珠子接触，然后将样品置于使样品中释放的糖链结合到珠子的条件下，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；
[0141] B-2)添加蛋白变性剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；
[0142] B-3)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；
[0143] B-4)添加珠子上的糖链捕获剂的盐释放剂到捕获的糖链样品中，然后通过抽吸除去盐释放剂的步骤；
[0144] B-5)添加保护剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；
[0145] B-6)添加酸到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去酸的步骤；
[0146] B-7)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中的步骤；
[0147] B-8)除去珠子中的溶剂和水分的步骤；
[0148] B-9)添加烷基酯化剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，并将唾液酸的羧酸烷基化的步骤；
[0149] B-10)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去有机反应溶剂的步骤；
[0150] B-11)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；
[0151] B-12)从捕获的糖链样品中释放糖链样品的步骤，其中当进行分析所需要的标记时，用标记试剂标记捕获的糖链样品中的糖链，并将其从珠子上释放；和
[0152] B-13)溶解释放的糖链样品以产生糖链样品溶液的步骤。
[0153] (6)根据第(5)项的方法，其特征还在于第(2)、(3)或(4)项的任何特征。
[0154] (7)糖链分析仪器，其包括下列组件：
[0155] 1)板子固定座，其是任选可加热和/或可移动的；
[0156] 2)试剂贮存组件，其在对于贮存而言所需要的温度下贮存一种或多种制备的试剂，其中试剂贮存组件是与支架(rack)或阀连接的贮存器，并且试剂贮存组件贮存一种或几种选自以下的试剂：增溶剂、还原剂、-SH保护剂、蛋白水解酶、糖链释放酶、糖链捕获珠子、蛋白变性剂、洗涤液体、糖链捕获剂的盐释放剂、保护剂、酸、有机反应溶剂、烷基酯化剂、标记剂、用于标记的糖链样品的溶剂、用于吸附至固相的有机溶剂、用于顺应的溶剂(a solvent for acclimation)和用于质谱测试的基质；
[0157] 3)用于从试剂贮存组件分配各种试剂的管嘴和/或阀；
[0158] 4)板子移动组件；
[0159] 5)任选的抽吸除去组件或磁场产生组件；
[0160] 6)任选的摇动/搅拌组件；
[0161] 7)板子贮存组件；和
[0162] 8)完成质谱法的组件。
[0163] (8)根据第(7)项的仪器，特征在于其具有第(2)至(4)项的任何一项的特征。
[0164] (9)自动糖链预处理仪器，其包括下列组件：
[0165] 1)板子固定座，根据需要其是可加热和/或可移动的；
[0166] 2)试剂贮存组件，其在对于贮存而言所需要的温度下贮存一种或多种制备的试剂，其中试剂贮存组件是与支架(rack)或阀连接的贮存器，并且试剂贮存组件贮存一种或几种选自以下的试剂：增溶剂、还原剂、-SH保护剂、蛋白水解酶、糖链释放酶、糖链捕获珠子、蛋白变性剂、洗涤液体、糖链捕获剂的盐释放剂、保护剂、酸、有机反应溶剂、烷基酯化剂、标记剂、用于标记的糖链样品的溶剂、用于吸附至固相的有机溶剂、用于顺应的溶剂和用于质谱测试的基质；
[0167] 3)用于从试剂贮存组件分配各种试剂的管嘴和/或阀；
[0168] 4)板子移动组件；
[0169] 5)任选的抽吸除去组件或磁场产生组件；
[0170] 6)任选的摇动/搅拌组件；和
[0171] 7)板子贮存组件。
[0172] (10)根据第(9)项的仪器，特征在于其具有第(2)至(4)项的任何一项的特征。
[0173] 或者，本发明提供与第(9)项的仪器有关的下列仪器。
[0174] (11)自动糖链预处理仪器，其包括：
[0175] 具有能自由打开和关闭的盖子的壳体；和安装于壳体内部并沿纵向和横向移动如下所述的分配头的分配头移动机构；
[0176] 与升降机构一起升起和降低多个成排排列的分配针头的分配头，
[0177] 安装在壳体安装空间上方的第一个恒温槽，其装配有对容纳微孔板的接受座进行加热和冷却的组件，并且其装配有用于盖住接受座的上部的具有内盖的盖子；
[0178] 试剂架和多个用于混合的微孔板，它们安装在壳体安装空间的上方；
[0179] 框架形式的第一个低压回收装置，当将过滤板装在上部开口时，其降低压力，并将穿过过滤板的过滤器的液体接收到安装在回收装置内部的微孔板里；框架形式的第一个抽吸除去装置，当将过滤板装在上部开口时，其降低压力并抽吸，从而除去穿过过滤器的液体；和第二个恒温槽，其装配有对容纳过滤板的接受座进行加热和冷却的组件，并且其装有用于盖住接受座的上部的能自动打开和关闭的盖子，所有这些装置是沿纵向成排配置和排列的，并且配置和排列在壳体安装空间的上方；
[0180] 过滤板移动机构，其载有过滤板并将过滤板依次移动到第一个低压回收装置、第一个抽吸除去装置和第二个恒温槽中的每一个，以及框架形式的第二个低压回收装置，当将SPE板装在上面开口时，其降低压力，并将穿过SPE板固相体的液体接收到安装在回收装置内部的微孔板里；框架形式的第二个抽吸除去装置，当将SPE板装在上面开口时，其降低压力并抽吸，从而除去穿过固相体的液体；和目标板接受座，其载有在表面上点有样品的目标板，所述样品已完成最终处理步骤，所有这些装置是沿纵向成排配置和排列的，并且配置和排列在壳体安装空间的上方；
[0181] SPE板移动机构，其载有SPE板并在第二个低压回收装置和第二个抽吸除去装置之间移动SPE板；
[0182] 控制装置，其安装在壳体中，并且已向其输入了操作协议(operationprotocol)；
[0183] 具有以矩阵阵列排列的多个孔的微孔板，当已将生物样品注入到各孔中时，将其用薄板盖住；具有以矩阵阵列排列的多个过滤器的过滤板；和用于微量样品的SPE板，其具有以矩阵阵列排列的多个固相体，
[0184] 其中，根据输入至控制装置的操作协议来使仪器操作每个装置。
[0185] (12)自动糖链预处理仪器，其包括：
[0186] 具有能自由打开和关闭的盖子的壳体；和安装于壳体内部并沿纵向和横向移动下面所述的分配头的分配头移动机构；
[0187] 与升降机构一起升起和降低多个成排排列的分配针头的分配头，
[0188] 安装在壳体安装空间上方的第一个恒温槽，其装配有对容纳微孔板的接受座进行加热和冷却的组件，并且其装配有用于盖住接受座的上部的具有内盖的盖子；
[0189] 试剂架和多个用于混合的微孔板，它们安装在壳体安装空间的上方；
[0190] 框架形式的第一个低压回收装置，当将过滤板装在上部开口时，其降低压力，并将穿过过滤板的过滤器的液体接收到安装在回收装置内部的微孔板里；框架形式的第一个抽吸除去装置，当将过滤板装在上部开口时，其降低压力并抽吸，从而除去穿过过滤器的液体；底部擦拭器，在其上表面具有平面擦拭材料，并旨在用于擦掉粘附在过滤板底部的下表面的液体；和第二个恒温槽，其装配有对容纳过滤板的接受座进行加热和冷却的组件，并且其装有用于盖住接受座的上部的能自动打开和关闭的盖子，所有这些装置是沿纵向成排配置和排列的，并且配置和排列在壳体安装空间的上方；
[0191] 过滤板移动机构，其载有过滤板并将过滤板依次移动到第一个低压回收装置、第一个抽吸除去装置、底部擦拭器和第二个恒温槽，以及框架形式的第二个低压回收装置，当将SPE板装在上面开口时，其降低压力，并将穿过SPE板固相体的液体接收到安装在回收装置内部的微孔板里；框架形式的第二个抽吸除去装置，当将SPE板装在上面开口时，其降低压力并抽吸，从而除去穿过固相体的液体；和目标板接受座，其载有在表面上点有样品的目标板，所述样品已完成最终处理步骤，所有这些装置是沿纵向成排配置和排列的，并且配置和排列在壳体安装空间的上方；
[0192] SPE板移动机构，其载有SPE板并在第二个低压回收装置和第二个抽吸除去装置之间移动SPE板；
[0193] 控制装置，其安装在壳体中，并且已向其输入了操作协议；
[0194] 具有以矩阵阵列排列的多个孔的微孔板，当已将生物样品注入到各孔中时，将其用薄板盖住；具有以矩阵阵列排列的多个过滤器的过滤板；和用于微量样品的SPE板，其具有以矩阵阵列排列的多个固相体，
[0195] 其中，根据输入至控制装置的操作协议来使仪器操作每个装置。
[0196] (13)根据第(1)或(2)项的自动糖链预处理仪器，其中分配头是如下的分配头，其包括支架；升降架，其沿着与分配针头平行的安装在支架上的导杆在垂直方向上滑动；固定在支架上的驱动马达；升降架移动机构，其具有连接到驱动马达旋转轴的滚珠螺杆(ball screw)，并沿垂直方向移动升降架；和固定在安装于升降架的分配针头固定器中的分配针头。
[0197] (14)根据第(13)项的自动糖链预处理仪器，其中将圆柱体垂直向下固定于分配头中的支架的较低部分，并且同时，将加压板附着在圆柱体的活塞杆的尖端。
[0198] (15)根据第(11)、(12)、(13)或(14)项的自动糖链预处理仪器，其中第一个恒温槽是具有主体部件的第一个恒温槽，所述主体部件如下构造：包括有构建于由铝块(block)形成的接受座的内部中心的筒式加热器，以及在接受座较低部分配置帕耳帖(Peltier)元件和散热器，其中用盖子盖住主体部件中接受座的上面部分，所述盖子具有附着在内侧的硅酮片(silicone sheet)，并且其具有带有在内部中心固定的筒式加热器的内盖，该内盖是经弹簧弹性支持的。
[0199] (16)根据第(11)、(12)、(13)、(14)或(15)项的自动糖链预处理仪器，其中过滤板移动机构和SPE板移动机构是如下的移动机构，其各自具有安装在沿支撑板的长度方向的两端的滑轮，所述支撑板沿壳体的纵向竖立安装，所述滑轮之一由步进马达旋转驱动，其中水平移动板连接至悬挂于两个滑轮之间并且旋转的带子上，垂直移动组件安装于水平移动板上，并且垂直移动组件通过垂直移动杆和滚珠螺杆来上升或下降，所述垂直移动杆支持位于上部末端的用于容纳内部框架的接受架，并且其沿垂直安装于支架内部的导向装置在垂直方向上滑动，并且所述滚珠螺杆连接至固定于支架内部的马达的旋转轴，并且其中所述机构各自具有与垂直移动杆连接的升降杆。
[0200] (17)根据第(11)、(12)、(13)、(14)、(15)或(16)项的自动糖链预处理仪器，其中第二个恒温槽是具有主体部件的第二个恒温槽，所述主体部件如下构造：包括有构建于铝块形成的接受座的内部中心的筒式加热器，以及安装的从内部中心穿至表面的空气循环通道，并且在接受座的较低部分配置帕耳帖元件和散热器，其中在主体部件的接受座的上面部分和位于其上的过滤板之间提供与上述空气循环通道连通的空气循环通道，并且还提供管道和排风机以便让排出过滤板的空气再次流进接受座以藉此循环起来，同时主体部件中的接受座的上面部分是用盖子盖住的。
[0201] (A1)
[0202] 用于释放样品中的糖链的糖链释放方法，该方法包括下列步骤：
[0203] A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤，该步骤包括下列步骤：
[0204] A-1)将样品提供在用于反应的板子上的步骤；
[0205] A-2)添加增溶剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0206] A-3)添加还原剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0207] A-4)添加-SH保护剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0208] A-5)添加蛋白水解酶到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0209] A-6)灭活蛋白水解酶的步骤；和
[0210] A-7)添加糖链释放酶到样品中以释放糖链的步骤。
[0211] (A2)
[0212] 根据(A1)项的方法，其中前述步骤进一步具有至少任何一个下述特征：
[0213] A)在释放样品中的糖链以制备用于分析的糖链样品的糖链释放步骤中：
[0214] A-1)样品是体液、细胞提取物或组织提取物；
[0215] A-2)增溶剂是1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)、1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)、2-羟基-3-磺丙基月桂酸酯(HSD)或其等价物，且
[0216] 反应条件是在25℃-42℃下；
[0217] A-3)还原剂是二硫苏糖醇(DTT)、TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液，0.5M)或其等价物，或其等价物，且
[0218] 反应条件是在室温至80℃下；
[0219] A-4)-SH保护剂是碘乙酰胺(IAA)或其等价物，且
[0220] 反应条件是在黑暗中于20-37℃下；
[0221] A-5)蛋白水解酶是胰蛋白酶、糜蛋白酶或其等价物，且
[0222] 反应条件是在25-42℃下；
[0223] A-6)用于灭活的条件包括加热至65℃或更高；
[0224] A-7)糖链释放酶是肽-N-糖苷酶F、肽-N4-(乙酰基-β-葡糖胺基)-天冬酰胺酰胺酶(PNGaseF)、Endo H或其等价物，且
[0225] 用于糖链释放酶的反应条件是在25℃-42℃下；
[0226] (A3)
[0227] 根据第(A1)或(A2)项的方法，其还包括至少一个下面的步骤：
[0228] A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤，该步骤包括下列步骤：
[0229] A-1)将作为样品的血清提供在过滤板上的步骤；
[0230] A-2)添加1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)或1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)/碳酸氢铵，并使混合物在25-42℃反应5-60分钟的步骤。
[0231] A-3)添加二硫苏糖醇(DTT)到样品中，使混合物在50-80℃反应10-60分钟，然后冷却反应混合物至室温的步骤；
[0232] A-4)添加碘乙酰胺(IAA)，并使混合物在黑暗中于室温反应0.5-2小时的步骤；
[0233] A-5)添加胰蛋白酶到样品中，并使混合物在25-42℃反应30-120分钟的步骤；
[0234] A-6)加热样品至80-100℃，持续1-10分钟，然后冷却样品至室温的步骤；和[0235] A-7)添加PNGaseF，并使混合物在25-42℃反应6-24小时的步骤；
[0236] (A4)
[0237] 根据(A1)至(A3)项中任何一项的方法，将其用于制备用于分析样品中的糖链的预处理样品。
[0238] (B1)
[0239] 制备在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备方法，该方法包括下列步骤：
[0240] B-1)使样品与糖链捕获珠子接触然后将样品置于使样品中释放的糖链结合至珠子的反应条件下，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；
[0241] B-2)添加蛋白变性剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；
[0242] B-3)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；
[0243] B-4)添加珠子上的糖链捕获剂的盐释放剂到捕获的糖链样品中，然后通过抽吸除去盐释放剂的步骤；
[0244] B-5)添加保护剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；
[0245] B-6)添加酸到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去酸的步骤；
[0246] B-7)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中的步骤；
[0247] B-8)除去珠子中的溶剂和水分的步骤；
[0248] B-9)添加烷基酯化剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，并将唾液酸的羧酸烷基化的步骤；
[0249] B-10)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去有机反应溶剂的步骤；
[0250] B-11)洗涤捕获的糖链样品，随后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；
[0251] B-12)从捕获的糖链样品中释放糖链样品的步骤，其中当进行分析所需要的标记时，用标记试剂标记捕获的糖链样品中的糖链，并将其从珠子上释放；和
[0252] B-13)溶解释放的糖链样品以产生糖链样品溶液的步骤。
[0253] (B2)
[0254] 根据(B1)项的方法，其中前述步骤进一步具有至少下述任何一个特征：
[0255] B-1)珠子是具有糖链捕获基团的珠子或磁性珠子，所述糖链捕获基团包括氨基氧基基团、N-烷基氨基氧基基团、酰肼基团、叠氮基团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基或与其结合的衍生物，或者
[0256] 样品中释放的糖链结合至珠子的条件是在25-80℃下；
[0257] B-2)变性剂是盐酸胍、脲、十二烷基硫酸钠或其等价物，或者
[0258] 反应条件包括在室温添加，并保持该温度以使珠子充分膨胀(10秒至5分钟)；
[0259] B-3)洗涤用水进行；
[0260] B-4)珠子上的糖链捕获剂是氨基氧基基团、N-烷基氨基氧基基团、酰肼基团、叠氮基团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基或其衍生物，且在酰肼情况下，盐释放剂是三乙胺或其等价物，并且在N-烷基氨基氧基基团情况下，盐释放剂是三乙胺或其等价物；
[0261] B-5)保护剂是乙酸酐、琥珀酸酐或其它酸酐或其等价物，或者
[0262] 反应条件包括在15-37℃下应用乙酸酐/甲醇；
[0263] B-6)酸是盐酸或另外的无机酸或pH2-3的等价酸；
[0264] B-7)所述步骤包括在用有机反应溶剂置换之前用亲水性有机溶剂置换的步骤，并且亲水性有机溶剂是低级醇例如甲醇或乙醇、乙腈或丙酮，而有机反应溶剂是二氧六环、乙腈、四氢呋喃或其等价物；
[0265] B-8)除去珠子中的溶剂和水分的步骤包括用滤纸、吸墨纸、纱布、毛巾、手帕、薄纸或棉布擦拭底部；
[0266] B-9)烷基酯化剂是甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)、乙基-对-甲苯基-三氮烯(ETT)、丁基-对-甲苯基-三氮烯(BTT)或其等价物，或者
[0267] 反应条件是在20-80℃使用100mM MTT/二氧六环，持续30分钟至5小时；
[0268] B-10)有机反应溶剂是二氧六环、乙腈、四氢呋喃或其等价物；
[0269] B-11)洗涤用甲醇、NaCl溶液和水中的至少一种进行；
[0270] B-12)进行标记，所述标记采用能吸收紫外线和可见光的生色团、具有发射荧光的结构的标记物、具有能与另一个分子相互作用的分子的亲和标记物、具有能与官能团特异性反应的官能团的标记物、具有在疏水结构中的官能团的标记物或者具有金属离子配体的标记物来进行，并且所述标记通过加入乙酸、乙腈、醋酸盐缓冲液或其等价物来进行，和[0271] B-13)标记的捕获的糖链样品的溶解采用水、水溶液或其等价物来完成。
[0272] (B3)
[0273] 根据(B1)或(B2)项的方法，其还包括至少一个下面的步骤：
[0274] B-1)使步骤(A)中制备的捕获的糖链样品与用于捕获糖链的珠子接触，从而在40-80℃进行结合，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；
[0275] B-2)添加盐酸胍到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，然后通过抽吸除去反应液体的步骤；
[0276] B-3)用水洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去水的步骤；
[0277] B-4)用三乙胺洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去三乙胺的步骤；
[0278] B-5)添加乙酸酐到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，所述反应条件为在室温利用10％乙酸酐/甲醇持续10分钟至2小时，然后通过抽吸除去乙酸酐的步骤；
[0279] B-6)添加盐酸至捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去盐酸的步骤；
[0280] B-7)添加甲醇到捕获的糖链样品中，通过抽吸除去甲醇，然后添加二氧六环到捕获的糖链样品中的步骤；
[0281] B-8)用棉布擦拭底部的步骤；
[0282] B-9)添加甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)到捕获的糖链样品中，并使混合物在60℃或更高温度反应30-120分钟(例如60分钟)；
[0283] B-10)添加二氧六环到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去二氧六环的步骤；
[0284] B-11)依次用甲醇、NaCl溶液和水洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去水的步骤；
[0285] B-12)添加乙酸和乙腈到捕获的糖链样品中，并利用氨基氧基色氨酰基精氨酸甲酯/水、盐酸O-苄基羟胺/水或邻氨基苯甲酰肼/水标记捕获的糖链样品中的糖链的步骤；和
[0286] B-13)添加水到标记的捕获的糖链样品中以生成标记的糖链样品溶液的步骤；
[0287] (B4)
[0288] 根据(B3)项的方法，其中糖链捕获珠子是磁性珠子，并且分离利用磁场进行而不是通过抽吸除去来进行。
[0289] (B5)
[0290] 根据(B1)至(B4)项的任何一项的方法，其用于制备预处理样品，该预处理样品用于分析样品中的糖链。
[0291] (C1)
[0292] 制备具有点样于其上的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子以便使用板子进行质谱测试的方法，该方法包括下列步骤：
[0293] C-1)在用于回收的板子上处理标记的糖链样品溶液的步骤；并且其任选地包括步骤(C-2)至(C-6)：
[0294] C-2)在用于混合的板子上处理来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和有机溶剂，以便得到糖链吸附至固相的浓度的步骤；
[0295] C-3)提供附着有固相载体的板子的步骤；
[0296] C-4)根据附着有固相载体的板子的相，活化附着有固相载体的板子，并洗涤附着有固相载体的板子的步骤；
[0297] C-5)添加标记的糖链样品溶液至附着有固相载体的板子，并使标记的糖链样品溶液顺应具有适合于附着有固相载体的板子的相的极性的溶剂的步骤；
[0298] C-6)通过抽吸从附着有固相载体的板子回收标记的糖链样品溶液至第二个用于回收的板子的步骤；且
[0299] 当将标记的糖链样品溶液进行MALDI-TOF MS时，其包括以下步骤(C-7)：
[0300] C-7)将标记的糖链样品溶液与用于质谱测试的基质混合，并将混合物点样于用于测试的板子上的步骤。
[0301] (C2)
[0302] 根据(C1)项的方法，其中前述的步骤与至少下列情况中的任何一个相关：
[0303] C-1)用于回收的板子上的处理在除去标记试剂的条件下进行；
[0304] C-2)糖链吸附至固相的浓度是80-90％在有机溶剂中；
[0305] C-3)附着有固相载体的板子是多孔型的并包含适合于固相萃取的树脂或膜的表面；
[0306] C-4)当附着有固相载体的板子是正相模式时，洗涤依次用水和乙腈进行，并且当附着有固相载体的板子是反相模式时，洗涤依次用低级醇例如甲醇和水进行；
[0307] C-5)在正相模式情况下具有相反极性的溶剂是疏水有机溶剂，并且，在反相模式中具有相反极性的溶剂是亲水溶剂。
[0308] C-6)第二个用于回收的板子是多孔型的并包含适合于固相萃取的树脂或膜的表面；和
[0309] C-7)用于质谱测试的基质是2，5-二羟基苯甲酸或其等价物，并且在用于质谱测试的基质上的标记的糖链样品溶液的点样混合或依次进行，并其根据需要进行稀释。
[0310] (C3)
[0311] 根据(C1)或(C2)项的方法，其包括下列步骤中的至少一个步骤：
[0312] C)制备在其上点样有标记的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子的步骤，该步骤包括：
[0313] C-1)在用于回收的板子上处理步骤(B)中得到的标记的糖链样品溶液的步骤；
[0314] C-2)在用于混合的板子上处理来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和乙腈，以便达到80-90％的乙腈终浓度的步骤；
[0315] C-3)提供正相模式的附着有固相载体的板子的步骤；
[0316] C-4)依次用水和乙腈洗涤附着有固相载体的板子，并通过抽吸除去水和乙腈的步骤；
[0317] C-5)添加标记的糖链样品溶液到附着有固相载体的板子中，除去液体，用乙腈洗涤板子，并向其中添加1-20％乙腈的步骤；
[0318] C-6)通过抽吸从附着有固相载体的板子回收珠子至第二个用于回收的板子的步骤；和
[0319] C-7)添加在20-40％乙腈中的2，5-二羟基苯甲酸到标记的糖链样品溶液中，并混合和点样该混合物的步骤。
[0320] (C4)
[0321] 根据(C3)项的方法，其中糖链捕获珠子是磁性珠子，并且分离利用磁场进行而不是通过抽吸除去来进行。
[0322] (C5)
[0323] 根据(C1)至(C4)项的任何一项的方法，其用于制备用于分析样品中的糖链的预处理样品。
[0324] (18)包含得自样品的糖链和糖链捕获珠子的用于制备用于反应的板子的套盒(kit)，该套盒包含：
[0325] A-1)样品；
[0326] A-2)1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)或者1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)/碳酸氢铵；
[0327] A-3)二硫苏糖醇(DTT)；
[0328] A-4)碘乙酰胺(IAA)；
[0329] A-5)胰蛋白酶；
[0330] A-6)加热组件；
[0331] A-7)PNGaseF；
[0332] B-1)糖链捕获珠子；
[0333] B-2)盐酸胍；
[0334] B-3)水；
[0335] B-4)三乙胺；
[0336] B-5)10％乙酸酐/甲醇；
[0337] B-6)盐酸；
[0338] B-7)甲醇；
[0339] B-8)棉布；
[0340] B-9)甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)；
[0341] B-10)二氧六环；
[0342] B-11)甲醇、NaCl溶液和水；
[0343] B-12)乙酸和乙腈，以及氨基氧基色氨酰基-精氨酸甲酯/水、盐酸O-苄基羟胺/水或邻氨基苯甲酰肼/水；
[0344] B-13)水；
[0345] C-1)用于回收的板子；
[0346] C-2)乙腈和用于混合的板子；
[0347] C-3)附着有固相载体的板子；
[0348] C-4)水和乙腈；
[0349] C-5)乙腈和1-20％的乙腈；
[0350] C-6)第二个用于回收的板子，和
[0351] C-7)在20-40％乙腈中的2，5-二羟基苯甲酸。
[0352] (18A)包含得自样品的糖链和糖链捕获珠子的用于制备用于反应的板子的套盒，该套盒包含用于实现(1)至(5)项的任何操作的装置。
[0353] (19)包含得自样品的糖链和糖链捕获珠子的用于分析的板子，
[0354] 其中，将被从样品释放的糖链结合的糖链捕获珠子点样于板子的至少一个孔中，并将糖链用氨基氧基色氨酰基-精氨酸甲酯/水、盐酸O-苄基羟胺/水或邻氨基苯甲酰肼/水标记。
[0355] (20)用于分析样品中的糖链的板子，其中该板子具有至少一个用于分析的室和预先分配于所述至少一个室的糖链捕获珠子。
[0356] 因此，当读者参照附图阅读下面的详述时，本发明上述的和其它的优点将清晰地呈现给读者。
[0357] 本发明的作用
[0358] 本发明成功地提供了用于分析样品例如血清样品中含有的糖链的自动分析仪器。如此，使同时自动分析大量的样品成为可能。将从糖蛋白定量释放糖链所需要的烦琐的预处理(例如增溶剂的使用、还原烷基化和胰蛋白酶消化)自动化。此外，可以通过化学选择性捕获并藉此容易地除去不受欢迎的异物，对定量释放的糖链进行快速糖链分析，并使一次处理多个测试样品成为可能。优化了上述的各个过程，并建立了适合于自动分析的系统。
[0359] 由于本发明能使糖链纯化的处理过程自动化，与常规手工完成的过程相比，能明显更有效地完成所述过程，并可以准确快速地进行纯化。
[0360] 因为本发明的仪器使完成多个样品的分析成为可能，预期其能够用于寻找糖链生物标记物，并认为可以将本发明的仪器用于诊断等，并可以用于疾病的早期诊断等。
[0361] 用于实施本发明的最佳模式
[0362] 在下文中，将描述本发明。理所当然应当理解在整个说明书中，除非另外特别地说明，单数的表述还包括复数的概念。因此，理所当然应当理解，除非另外特别地说明，单数冠词或形容词(例如英语中的“a”、“an”、“the”等)还包括复数的概念。此外，理所当然应当理解，除非另外特别地说明，本说明书中所用的术语以相关领域中通常所用的含义使用。因此，除非另外地定义，本说明书中所用的所有术语和技术术语具有与本发明相关的领域的技术人员通常所理解的相同的含义。如果存在矛盾，本说明书(包括定义)优先。
[0363] (术语的定义和基本技术解释)
[0364] (糖链)
[0365] 文中所用的术语“糖链”指由连接在一起的一个或多个单元糖(unitsugars)(单糖和/或其衍生物)形成的化合物。当两个或多个单元糖连接时，各个单元糖通过脱水缩合基于糖苷键来连接。所述糖链的实例包括生物体中存在的多糖(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、唾液酸和其复合物和衍生物)，以及大量的降解自或衍生自复杂生物分子的糖链例如降解的多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、葡糖胺聚糖和糖脂，但是实例不限于所述的那些。如文中所用，可以将术语糖链与“多糖”、“糖”或“碳水化合物”互换使用。除非另外特别地说明，文中所用的“糖链”可以包括糖链和含有糖链的物质。
[0366] 文中所用的术语“含有糖链的物质”指含有糖链和糖链之外的物质的物质。所述含有糖链的物质大量存在于生物体中，并且其实例包括存在于生物体中的多糖，以及各种物质例如降解自或衍生自复杂生物分子的糖链如降解的多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖和糖脂，但不限于所述的这些。
[0367] 文中所用的术语“单糖”指多羟基醛或多羟基酮和其衍生物，其不能被水解成比所述这些更简单的分子，且其包含至少一个羟基基团和至少一个醛基团或酮基团。单糖通常通过式：CnH2nOn来表示，但不限于此，并且单糖还包括岩藻糖(脱氧己糖)、N-乙酰基葡糖胺等。在此，将其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9和10的上式化合物分别称为二碳糖、三碳糖、四碳糖、戊糖、己糖、庚糖、辛糖、壬糖和癸糖。通常来讲，所述化合物对应于链型多元醇的醛或酮，并将前者称作醛糖，而将后者称作酮糖。
[0368] 当在文中特别提到时，术语“单糖的衍生物”指未取代的单糖上的一个或多个羟基被另一个取代基取代产生的物质。所述单糖的衍生物包括但不限于具有羧基的糖(例如其中C-1位已氧化成羧酸的醛糖酸(例如，从氧化的D-葡萄糖得到的D-葡糖酸)，其中末端C原子已转化成羧酸的糖醛酸(从氧化的D-葡萄糖得到的D-葡糖醛酸)；具有氨基或氨基的衍生物(例如乙酰化的氨基)的糖(例如N-乙酰基-D-葡糖胺、N-乙酰基-D-半乳糖胺等)；具有氨基和羧基的糖(例如N-乙酰基神经氨酸(唾液酸)、N-乙酰基胞壁酸(muraminic acid)等)；去氧糖(例如2-去氧-D-核糖)；含有硫酸基团的硫酸化糖；含有磷酸基团的磷酸化糖；等等。如文中所用，当化合物被称作单糖时，还包括上面提到的衍生物。或者，对于形成半缩醛结构的糖，通过与醇反应形成缩醛结构的糖苷类也落入单糖的范围。
[0369] 文中所用的术语“相互作用”指当提到两个客体时，所述两个客体就互相施加力。上述相互作用的实例包括但不限于共价键、氢键、范德华力、离子相互作用、非离子相互作用、疏水作用、静电作用等。优选地，相互作用是氢键、疏水作用等。如文中所用，术语“共价键”以相关领域通常使用的含义使用，并且其指由两个原子共享的一对电子形成的化学键。
如文中所用，术语“氢键”以相关领域通常使用的含义使用，并且其指当氢原子的唯一的核外电子被吸引至具有高电负性的原子，以至于氢原子的核暴露，并且接着该核吸引具有高电负性的另一个原子时产生的键。例如，氢键在氢原子和具有高电负性的原子(例如氟、氧或氮)之间产生。
如文中所用，术语“氢键”以相关领域通常使用的含义使用，并且其指当氢原子的唯一的核外电子被吸引至具有高电负性的原子，以至于氢原子的核暴露，并且接着该核吸引具有高电负性的另一个原子时产生的键。例如，氢键在氢原子和具有高电负性的原子(例如氟、氧或氮)之间产生。
[0370] 如文中所用，术语“捕获糖链或含有糖链的物质”指使用本发明中所用的糖链捕获珠子来捕获糖链或含有糖链的物质。根据本发明的珠子的糖链捕获位点或糖链捕获基团优选包括氨基氧基基团、N-烷基氨基氧基基团、酰肼基团、叠氮基团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基和其衍生物。
[0371] 如文中所用，术语“糖链捕获载体”指用于捕获糖链的载体。如文中所用，术语“糖链捕获珠子”指用于捕获糖链的珠子。所述载体或珠子包括捕获糖链的部分和作为载体或珠子的部分。可以使用与本发明的糖链特异性相互作用的物质来形成捕获糖链的部分。对于载体来讲，可以使用支持体(support)，并且与本发明的糖链特异性相互作用的物质本身可以起载体的作用。所述载体包括具有上述式(I)中的“X”的载体。对于珠子来讲，可以使用任何产品，但磁性珠子是优选的。磁性珠子的实例包括由Dynabead市售的那些，但不限于此。
[0372] 如文中所用，术语“捕获的糖链样品”指被例如上述的糖链捕获载体或糖链捕获珠子捕获的糖链样品(例如与糖链结合的珠子)。
[0373] 具体地讲，所述载体包括具有结合至支持体的“X”、“X-Y”和“X-Y-Z”的载体，和由式(I)和式(II)所表示的化合物聚合产生的载体。通常来讲，所述载体包括例如具有下面所示基团的载体。
[0374] (糖链捕获官能团)-(间隔物)-(可聚合官能团)
[0375] 此处，糖链捕获官能团还可以描述为例如能与液体中糖链的醛基团反应的官能团，且其具有图2中所示的结构。图2中的R指上面所定义的取代基，但优选地，不会对聚合反应和与糖链的相互作用带来不利影响的取代基是优选的。更具体地讲，能特异性地与本发明的糖链相互作用的物质是可以通过下式表示的化合物：
[0376] 式(I)：X-Y-Z
[0377] 其中，X是由下式表示的基团：
[0378] [化学结构1]
[0379]1 2
[0380] (其中X 是可以被取代的亚烷基或可以被取代的亚烯基；X 是氧原子或硫原3 4 1 2 3
子；X 是氧原子或硫原子；X 是亚甲基或亚乙基；R 是氢原子或烷基；R 和R 各自独立地是氢原子或烷基)；Y(Y的长度相当于C0-C25)是单键；可以被取代并且可以被至少一个a b
选自-O-、-S-、-S-S-、-N(R)-C(＝O)-、-C(＝O)-N(R)-和可以被取代的亚苯基的基a
团间隔的亚烷基；或可以被取代并且可以被至少一个选自-O-、-S-、-S-S-、-N(R)-C(＝b a b
O)-、-C(＝O)-N(R)-和可以被取代的亚苯基的基团间隔的亚烯基(其中R 和R 各自独立地是氢原子或烷基)；且Z是下式所表示的基团：
子；X 是氧原子或硫原子；X 是亚甲基或亚乙基；R 是氢原子或烷基；R 和R 各自独立地是氢原子或烷基)；Y(Y的长度相当于C0-C25)是单键；可以被取代并且可以被至少一个a b
选自-O-、-S-、-S-S-、-N(R)-C(＝O)-、-C(＝O)-N(R)-和可以被取代的亚苯基的基a
团间隔的亚烷基；或可以被取代并且可以被至少一个选自-O-、-S-、-S-S-、-N(R)-C(＝b a b
O)-、-C(＝O)-N(R)-和可以被取代的亚苯基的基团间隔的亚烯基(其中R 和R 各自独立地是氢原子或烷基)；且Z是下式所表示的基团：
[0381] [化学结构2]
[0382]
[0383] (其中，Z1是氧原子或硫原子；Z2和Z3各自独立地是可以被取代并且可以被亚苯4
基间隔的亚烷基，或者可以被取代并且可以被亚苯基间隔的亚烯基；Z 是氧原子或硫原子；
4 5 1
R 和R 各自独立地是氢原子或烷基)。在本发明的式(I)化合物中，X 优选是C1-C10亚烷基或C2-C10亚烯基，并且Y的链长度优选是相当于C1-C25烷基的链长度。Y的优选实例
2
包括-(CH2CH2-O)n-CH2CH2-(其中，n＝1-8是优选的，并且n＝1-6是特别优选的)，并且Z
3
和Z 各自独立地优选是C1-C10亚烷基或C2-C10亚烯基。此外，可以被取代的亚苯基的具体实例包括：
基间隔的亚烷基，或者可以被取代并且可以被亚苯基间隔的亚烯基；Z 是氧原子或硫原子；
4 5 1
R 和R 各自独立地是氢原子或烷基)。在本发明的式(I)化合物中，X 优选是C1-C10亚烷基或C2-C10亚烯基，并且Y的链长度优选是相当于C1-C25烷基的链长度。Y的优选实例
2
包括-(CH2CH2-O)n-CH2CH2-(其中，n＝1-8是优选的，并且n＝1-6是特别优选的)，并且Z
3
和Z 各自独立地优选是C1-C10亚烷基或C2-C10亚烯基。此外，可以被取代的亚苯基的具体实例包括：
[0384] [化学结构3]
[0385]
[0386] 根据一个优选的实施方案，使用通过聚合式(I)化合物得到的聚合物。因此，当由能与本发明的糖链特异性相互作用的物质形成各种薄膜时，膜自身的强度和稳定性得以提高，并且此外，获得了可以将薄膜固定到支持体例如基板的效果。当将薄膜固定至支持体时，优选使用聚合单层膜的技术，其可通过物理吸附式(I)表示的化合物的Z部分到支持体上实现。如此，可以将具有固定在其上的薄膜的支持体直接用作本发明的糖链捕获载体。此外，聚合可以是热聚合或者可以是光聚合；然而，优选考虑Z部分中的丁二炔基之间或乙烯基之间的自由基聚合可以平顺地进行，并且通过相对简单的操作可以实现聚合的优点，并且应用通过用接近254nm(丁二炔基或乙烯基的特征吸收波长)的紫外线(UV)照射的光聚合。此外，还应用其中式(I)的“X”和支持体直接结合的物质，和其中“X-Y”和支持体直
1
接结合的物质。就X 中“可以被取代的亚烷基”和“可以被取代的亚烯基”的取代基而言，无取代基是优选的。就Y中“可以被取代的亚烷基”和“可以被取代的亚烯基”的取代基而
2 3
言，无取代基是优选的。就Z 和Z 中“可以被取代的亚烷基”和“可以被取代的亚烯基”的取代基而言，无取代基是优选的。
1
接结合的物质。就X 中“可以被取代的亚烷基”和“可以被取代的亚烯基”的取代基而言，无取代基是优选的。就Y中“可以被取代的亚烷基”和“可以被取代的亚烯基”的取代基而
2 3
言，无取代基是优选的。就Z 和Z 中“可以被取代的亚烷基”和“可以被取代的亚烯基”的取代基而言，无取代基是优选的。
[0387] 根据另一个优选的实施方案，能与本发明的糖链特异性相互作用的物质是通过共聚式(I)表示的化合物和式(II)表示的化合物得到的共聚物：
[0388] 式(I)：X-Y-Z(I)：
[0389] [其中，X是下式所表示的基团：
[0390] [化学结构4]
[0391]
[0392] (其中，X1是可以被取代的亚烷基或可以被取代的亚烯基；X2是氧原子或硫原3 4 1 2 3
子；X 是氧原子或硫原子；X 是亚甲基或亚乙基；R 是氢原子或烷基；R 和R 各自独立地是氢原子或烷基)；Y(Y的长度相当于C0-C25)是单键；可以被取代并且可以被至少一个a b
选自-O-、-S-、-S-S-、-N(R)-C(＝O)-、-C(＝O)-N(R)-和可以被取代的亚苯基的基a
团间隔的亚烷基；或可以被取代并且可以被至少一个选自-O-、-S-、-S-S-、-N(R)-C(＝b a b
O)-、-C(＝O)-N(R)-和可以被取代的亚苯基的基团间隔的亚烯基(其中R 和R 各自独立地是氢原子或烷基)；且Z是下式所表示的基团：
子；X 是氧原子或硫原子；X 是亚甲基或亚乙基；R 是氢原子或烷基；R 和R 各自独立地是氢原子或烷基)；Y(Y的长度相当于C0-C25)是单键；可以被取代并且可以被至少一个a b
选自-O-、-S-、-S-S-、-N(R)-C(＝O)-、-C(＝O)-N(R)-和可以被取代的亚苯基的基a
团间隔的亚烷基；或可以被取代并且可以被至少一个选自-O-、-S-、-S-S-、-N(R)-C(＝b a b
O)-、-C(＝O)-N(R)-和可以被取代的亚苯基的基团间隔的亚烯基(其中R 和R 各自独立地是氢原子或烷基)；且Z是下式所表示的基团：
[0393] [化学结构5]
[0394]1 2 3
[0395] (其中，Z 是氧原子或硫原子；Z 和Z 各自独立地是可以被取代并且可以被亚苯4
基间隔的亚烷基，或者可以被取代并且可以被亚苯基间隔的亚烯基；Z 是氧原子或硫原子；
4 5
R 和R 各自独立地是氢原子或烷基)]；
1 2
基间隔的亚烷基，或者可以被取代并且可以被亚苯基间隔的亚烯基；Z 是氧原子或硫原子；
4 5
R 和R 各自独立地是氢原子或烷基)]；
1 2
[0396] 式(II)：A-A(II)：1
[0397] [其中，A 是H(OCH2CH2)nO-表示的基团(其中，n是从1到5的整数)或者下式所示的基团：
[0398] [化学结构6]
[0399]
[0400] (其中A3是亚烷基；并且R6均是烷基)；并且
[0401] A2是下式所表示的基团：
[0402] [化学结构7]
[0403]
[0404] (其中A4均是亚烷基；并且A5均是下式所表示的基团：
[0405] [化学结构8]
[0406]6 7 7
[0407] (A 是亚烷基；A 是氧原子或硫原子；R 是氢原子或烷基)]。对于本发明的式(I)1
和(II)化合物的共聚物，X 优选是C1-C10亚烷基或C2-C10亚烯基，并且Y的链长优选是相当于C1-25烷基的链长。Y的优选实例包括-(CH2CH2-O)n-CH2CH2-(其中，n＝1-8是优选
2 3
的，并且n＝1-6是特别优选的)，Z 和Z 各自独立地优选是C1-C10亚烷基或C2-C10亚烯
3 4 6
基，A 优选是C1-C5亚烷基，并特别优选C2亚烷基，并且A 和A 各自独立地是C1-C10亚烷基。此外，可以被取代的亚苯基的具体实例包括：
和(II)化合物的共聚物，X 优选是C1-C10亚烷基或C2-C10亚烯基，并且Y的链长优选是相当于C1-25烷基的链长。Y的优选实例包括-(CH2CH2-O)n-CH2CH2-(其中，n＝1-8是优选
2 3
的，并且n＝1-6是特别优选的)，Z 和Z 各自独立地优选是C1-C10亚烷基或C2-C10亚烯
3 4 6
基，A 优选是C1-C5亚烷基，并特别优选C2亚烷基，并且A 和A 各自独立地是C1-C10亚烷基。此外，可以被取代的亚苯基的具体实例包括：
[0408] [化学结构9]
[0409]
[0410] 聚合可以是热聚合或者可以是光聚合；然而，因为如上所述的相同原因，通过用接近254nm(丁二炔基或乙烯基的特征吸收波长)的紫外线(UV)照射的光聚合是优选的。
[0411] (用于糖链分析的预处理技术)
[0412] 如文中所用，术语糖链的“释放”指将糖链从含有糖链的复合物中释放，所述复合物可见于生物材料等中。
[0413] 如文中所用，“样品”指旨在用于分析糖链的任何样品。优选地，样品是得自生物材料(例如体液、细胞提取物或组织提取物)的样品，更优选体液、细胞提取物、组织提取物等，甚至更优选含有血液组分的体液(例如血清和血浆)。样品甚至更优选是血液，并最优选血清。
[0414] 如文中所用，“用于反应的板子”指含有糖链的样品在其上进行化学反应的任何板子。板子是由不与生物材料反应或很难与生物材料反应的材料例如塑料构成的。板子可以是被涂覆的或者可以是未被涂覆的。对于板子来讲，可以使用通常所用的试验用板子例如多孔板。
[0415] 如文中所用，术语“增溶剂”指能增加蛋白质的溶解的物质。可以使用的增溶剂的实例包括1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)、1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)、2-羟基-3-磺丙基月桂酸酯(HSD)或其等价物。优选地，可以使用1-丙磺酸、2-羟基3-月桂酰胺(PHL)/碳酸氢铵。
[0416] 如文中所用，用于增溶剂的“反应条件”指能引起增溶剂的增溶反应的任何反应条件，包括例如在25℃-42℃，并优选在37℃，持续10分钟的条件。
[0417] 如文中所用，术语“还原剂”指将氢加至元素或化合物的任何物质。如文中所用，还原剂用于裂解蛋白质中的-S-S-键。还原剂可以是二硫苏糖醇(DTT)、TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液，0.5M)或其等价物。优选地，使用二硫苏糖醇(DTT)。
[0418] 如文中所用，用于还原剂的术语“反应条件”指还原剂的还原反应在其下能够进行的任何反应条件。如文中所用，例如可以使用在50℃至80℃的条件，并优选地，反应可以在60℃持续30分钟来完成。因为温度高，可以将温度恢复至室温以便进行随后的反应。
[0419] 如文中所用，术语“-SH保护剂”指保护蛋白质中的-S-S-键断裂后的-SH基团的任何物质。如文中所用，例如能进行乙酰化的试剂可以是示例性的，并且-SH保护剂可以例如是碘乙酰胺(IAA)或其等价物。
[0420] 如文中所用，用于-SH保护剂的术语“反应条件”指-SH保护剂的保护反应能在其下进行的任何条件，包括例如如下条件：反应在黑暗中于20-37℃进行，并优选在黑暗中于室温进行，持续1小时。
[0421] 如文中所用，术语“蛋白水解酶”指能降解通过肽键连接的氨基酸的任何聚合物例如蛋白质、多肽或肽的任何酶。如文中所用，可以使用例如胰蛋白酶、糜蛋白酶或其等价物，并优选使用胰蛋白酶。
[0422] 如文中所用，用于蛋白水解酶的术语“反应条件”指通过蛋白水解酶在其下进行蛋白降解反应的任何条件，包括例如用于在25-42℃、并优选在37℃反应60分钟的条件。
[0423] 如文中所用，术语蛋白水解酶的“灭活”指蛋白水解酶的酶活性丧失。通常来讲，因为蛋白水解酶也是蛋白质，“灭活”可以通过在高温下使蛋白质自身变性来实现，但不限于此。
[0424] 如文中所用，术语“糖链释放酶”指能从糖链复合物中释放糖链的任何酶。如文中所用，可以使用例如PNGaseF、Endo H或等价物，并优选PNGaseF。
[0425] 如文中所用，用于糖链释放酶的术语“反应条件”指通过糖链释放酶在其下释放糖链的任何条件。如文中所用，所述条件包括例如在25℃-42℃、并优选在37℃反应60分钟至12小时的条件。
[0426] 如文中所用，术语“糖链捕获珠子”指如本说明书中所述的具有用于糖链捕获的化学反应官能团的任何珠子。所述珠子在例如专利文件1中进行了举例。在市售的产品中，可以使用BlotGlyco(Sumitomo Bakelite)、AffiGel Hz(BioRad)、CarboLink Coupling Resin(PIERCE)、Surface-activated Dynabeads(注册商标)(Invitrogen)等。
[0427] 如文中所用，短语“用于结合至糖链捕获珠子的条件”指如下的任何条件：在所述条件下糖链捕获珠子(例如珠子或磁性珠子)上存在的糖链捕获基团(包括例如氨基氧基基团、N-烷基氨基氧基基团、酰肼基团、叠氮基团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基和其衍生物)与糖结合。例如所述条件包括如在25-80℃、并优选在80℃反应。
[0428] 如文中所用，术语“蛋白变性剂”指通过改变蛋白质和肽的分子结构来改变性质例如溶解性。例如，通过加热、碱处理、酸处理等来使蛋白质变性。因此，可以将任何产生上述因素的那些物质作为蛋白变性剂的示例。如文中所用，所述变性剂包括例如盐酸胍、脲、十二烷基磺酸钠或等价物。优选地，可以使用盐酸胍。
[0429] 如文中所用，用于蛋白变性剂的术语“反应条件”指在其下可使蛋白质和肽变性的任何条件。如文中所用，例如所述条件可以是在室温持续10秒至10分钟，但时间可以比所述时间更长。
[0430] 如文中所用，“残留的洗涤液体”指用洗涤液体例如水洗涤后产生的残留液体。因为残留的洗涤液体能对后续反应产生妨碍，通常优选除去残留的洗涤液体。
[0431] 如文中所用，术语珠子上的糖链捕获基团的“盐释放剂”指释放与糖链捕获珠子(例如珠子或磁性珠子)上的糖链捕获基团(包括例如氨基氧基基团、N-烷基氨基氧基基团、酰肼基团、叠氮基团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基或其衍生物)形成的盐(例如在酰肼情况下，与酰肼轭合的盐)的任何物质。在酰肼情况下，盐释放剂是三乙胺或等价物，并且在氨基氧基基团情况下，盐释放剂是三乙胺或等价物。在其它情况下，可以使用相关领域公知的技术通过保护所述基团来分离(detach)盐释放剂。
[0432] 如文中所用，术语“通过抽吸除去(......)”指在减压或负压条件下利用膜通过抽吸将液体除去(液体被吸引到所述膜)(例如市售的多孔过滤板)。
[0433] 如文中所用，术语“保护剂”指保护珠子的过量官能团的物质。根据本发明，可以使用例如乙酸酐、琥珀酸酐、其它酸酐或等价物，并可以优选使用乙酸酐。在该情况下，使用乙酰基进行保护(乙酰化)。
[0434] 如文中所用，用于保护剂的术语“反应条件”指在其下可以保护珠子的过量官能团的任何条件。如文中所用，可以应用如下条件：在室温下使用10％乙酸酐/甲醇，持续30分钟，优选在37℃。
[0435] 如文中所用，“酸”用于从捕获的糖链中的唾液酸的羧基基团除去并游离盐。由于预期在没有酸处理的情况下甲基酯化反应的产率将降低，所以优选进行酸处理。在此，除了盐酸外，可以使用pH 2-3的无机酸例如稀硫酸。
[0436] 如文中所用，术语“有机反应溶剂”指在反应例如烷基酯化反应中使用的任何有机溶剂。例如，可以使用二氧六环、以及乙腈和四氢呋喃。根据珠子可以优选二氧六环或乙腈。
[0437] 如文中所用，术语“亲水有机溶剂”指当疏水有机溶剂与水替换时，中间使用的任何有机溶剂(也就是说，居于水基(water-based)系统和有机溶剂之间)。例如，可以使用低级醇例如甲醇或乙醇、乙腈、丙酮等。
[0438] 如文中所用，术语“水分和溶剂”的“除去”指能除去水分和溶剂的任何方法。或者，所述除去还包括使用水基溶剂后通过用有机溶剂冲洗珠子的周围溶剂来去除水基溶剂。例如，可以将用滤纸、吸墨纸、纱布、毛巾、手帕、薄纸、棉布等擦拭底部用来举例。在“水分和溶剂”的“除去”中所用的工具(在本说明书中还称为“溶剂吸收片”)是在板子已被减压抽吸后用于吸收吸附到板子下面的溶剂例如水、乙腈(ACN)或甲醇的材料。所述工具不限于特定的材料例如棉布，只要它是由能吸收水分和溶剂的材料制成的即可。如果不擦除溶剂，溶剂将返回到过滤器上，并且过滤器上的珠子会含有更多的水分和溶剂。因此，优选的是预防这种情况发生。
[0439] 如文中所用，术语“在...底部擦拭”指将用于吸收水分和溶剂的工具(例如溶剂吸收片如棉布)在底部展开，并且将已经通过抽吸过滤的板子放于其上并从顶部施压，以便通过将过滤溶剂吸附到吸收片来除去附着在板子底部的过滤溶剂。
[0440] 如文中所用，术语“烷基酯化剂”指能实现烷基酯化的任何物质。例如，在甲基化情况下，将该反应称作甲基酯化。当将唾液酸的羧酸甲基化时，取得了使糖链检测更加容易的效果。该技术描述于WO 2007/099856中，根据需要，将其公开内容引入本说明书中作为参考。如文中所用，可以使用例如甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)、乙基-对-甲苯基-三氮烯(ETT)、丁基-对-甲苯基-三氮烯(BTT)或等价物。
[0441] 如文中所用，用于烷基酯化剂的术语“反应条件”指在其下利用烷基酯化剂进行烷基酯化反应的任何条件。如文中所用，例如可以应用如下条件：在60℃使用100mM MTT/二氧六环，持续60分钟。
[0442] 如文中所用，术语“标记”指将用于质谱测试的物质例如糖链结合至其它的分子例如标签，从而为检测作准备。所述标记利用能吸收紫外线和可见光的生色团、具有发射荧光的结构的标记物、具有能与其它分子(His标记物、生物素等)相互作用的分子的亲和标记物、具有能与官能团(光敏分子(用于交联)、叠氮基团、SH基团、氨基、羧酸)特异性反应的官能团的标记物、具有在疏水结构中的官能团的标记物或者具有金属离子配体的标记物进行。标记还可以在乙酸、乙腈、醋酸盐缓冲液或其等价物存在下进行。
[0443] 如文中所用，对于标记而言的术语“试剂”指能够进行标记的任何试剂，包括例如能吸收紫外线和可见光的生色团、具有发射荧光的结构的标记物、具有能与其它分子(His标记物、生物素等)相互作用的分子的亲和标记物、具有能与官能团(光敏分子(用于交联)、叠氮基团、SH基团、氨基、羧酸)特异性反应的官能团的标记物、具有在疏水结构中的官能团的标记物或者具有金属离子配体的标记物。
[0444] 如文中所用，术语“能吸收紫外线和可见光的生色团”指吸收紫外线和可见光的任何生色团，包括例如芳香族化合物如对-硝基苄氧基胺。
[0445] 如文中所用，术语“具有发射荧光的结构的标记物”指具有发射荧光的结构的任何标记物，包括例如邻氨基苯甲酰肼。
[0446] 如文中所用，术语“具有能与另一个分子相互作用的分子的亲和标记物”指具有能与另一个分子相互作用的分子的任何标记物，包括例如His标记物、生物素、生物素酰肼等。
[0447] 如文中所用，术语“具有能与官能团特异性反应的官能团的标记物”指具有能与官能团(例如光敏分子(用于交联)、叠氮基团、SH基团、氨基、羧酸、N-氨基氧基甘氨酸)特异性反应的官能团的任何标记物，包括例如分子中具有所述化合物结构的化合物。
[0448] 如文中所用，术语“具有在疏水结构中的官能团的标记物”指具有在疏水结构中的官能团的任何标记物，并例如具有疏水的芳香链或疏水的脂肪链的酰肼化合物；包括如吉拉德试剂P(Girard Reagent P)。
[0449] 如文中所用，术语“具有金属离子配体的标记物”指具有金属离子配体的任何标记物，包括例如组胺酸标记物或能吸附至载有金属离子的树脂的标记物。
[0450] 如文中所用，术语“标记的糖链样品溶液”指已制备的含有标记的糖链的任何样品。该溶液可以直接用HPLC或液相色谱-质谱(LC-MS)等进行分析，但是也可以固定在用于MALDI-TOF质谱法的板子上，并进行MALDI-TOF质谱分析。
[0451] 如文中所用，术语“检测样品”指用于在质谱法等中检测的样品。
[0452] 如文中所用，术语“用于质谱测试的板子”指用于质谱测试的任何板子。所述板子由不与生物材料反应或难于与生物材料反应的材料例如塑料或金属构成。所述板子可以是涂覆的，或者可以是未被涂覆的。例如，可以使用根据MALDI仪器的点有样品的板子。
[0453] 如文中所用，术语“用于回收的板子”指用于回收样品的任何板子。所述板子由不与生物材料反应或难于与生物材料反应的材料例如塑料构成。所述板子可以是涂覆的，或者可以是未被涂覆的。对于板子而言，可以使用通常所用的试验用板子例如多孔板。
[0454] 如文中所用，术语“多孔”指很多个孔，并且多孔板指具有很多个孔的板子。例如，具有96个孔的多孔板、具有384个孔的多孔板、具有1536个孔的多孔板等可以作为示例提及。
[0455] 如文中所用，术语“适合于固相萃取的树脂或膜”指用于固相萃取的任何树脂或膜。在本说明书中，所述树脂或膜包括例如C18硅胶、用于正相的固相载体、氨基官能化的硅树脂(silica resin)等。
[0456] 如文中所用，术语“固相”指固体状态。
[0457] 如文中所用，术语“糖链吸附至固相的浓度”指任何这样的浓度，在该浓度样品(例如糖链)吸附至固态的基板等被加速。
[0458] 如文中所用，术语“用于混合的板子”指用于混合两种或更多种试剂或样品的任何板子。所述板子由不与生物材料反应或难于与生物材料反应的材料例如塑料构成。所述板子可以是涂覆的，或者可以是未被涂覆的。对于板子而言，可以使用通常所用的试验用板子例如多孔板。
[0459] 如文中所用，术语“附着有固相载体的板子”或“SPE板子”指用于多个样品处理的柱型板子，所述板子附着有用于固相萃取的载体。所述板子由以下构成：不与生物材料反应或难于与生物材料反应的板材例如塑料；由具有官能团例如氨基丙基或十八烷基的二氧化硅或苯乙烯制成的的小珠子，将其作为用于固相萃取的载体被附着；和用于挡住用于固相萃取的载体的过滤器。所述板子可以是涂覆的，或者可以是未被涂覆的。对于板子而言，可以使用通常所用的试验用板子例如多孔板。示例产品之一包括Waters公司生产的“MassPREP HILIC μElution Plate”。
[0460] 如文中所用，短语“使......顺应具有适合于相的极性的溶剂”指使某种物质(material)与具有相反极性的溶剂共存(compatible)(如果水，疏水物质；如果疏水有机溶剂，亲水物质)。对于顺应而言，优选的是长时间地将物质浸没于溶剂中，或者优选数次调换溶剂。
[0461] 如文中所用，术语“第二个用于回收的板子”指在使用用于回收的板子的操作后旨在用于进行再次回收的板子，然后用附着有固相载体的板子进行纯化操作。
[0462] 如文中所用，术语“用于质谱测试的基质”指用于制备用于质谱测试的样品的任何基质。所述基质将在本说明书的其它部分详细地描述。
[0463] 如文中所用，术语“糖链的质量分析”指用于分析糖链的质量的任何技术。可以使用本说明书中描述的方法例如高效液相色谱法(HPLC)、LC-ESI-TOFMS方法或MALDI-TOF方法和相关领域公知的任何技术。
[0464] 如文中所用，术语“除去过量试剂的方法”指除去反应中所用的试剂的任何方法。例如，为了去除的目的，所述方法包括例如仅用溶剂洗涤几次等。
[0465] 如文中所用，术语“用于分析样品中的糖链的预处理样品”指用于分析样品中的糖链的样品。通常来讲，在质谱法等中，用收到的新鲜样品进行分析是不可能的。因此，进行例如除去杂质或标记的预处理是必需的，并且已进行所述预处理的样品在本说明书中称作用于分析样品中的糖链的预处理样品。
[0466] (质谱方法)
[0467] 如文中所用，术语“质谱法”指将粒子例如原子、分子或簇转化成气态离子(也就是说，电离)并让其在真空中移动，并且根据质荷比(m/z)利用电磁力分离和检测所述离子。基于根据m/z分离和检测的离子得到的谱图(横轴表示m/z且纵轴表示离子相对强度)是质谱。通常将提供有关于分子量信息的离子称作分子量相关的离子(可用的有：中性分+ - +子M失去一个电子得到的M ；增加一个电子得到的M ；增加质子得到的[M+H] ；失去质子得- + +
到的[M-H] ；失去氢负离子得到的[M-H] ；增加碱金属(例如Na)得到的[M+Na] ；等)。根据样品或电离方法(尤其是在EI方法中)，分子量相关的离子可能从不出现；然而，在所述情况下，可以通过使用温和电离方法来确认分子量相关的离子。与分子离子相比，将那些在较低质量一侧出现的离子称作碎片离子，并且这些碎片离子是分子离子的降解产物且提供样品分子的结构信息。将谱中具有最高离子强度的离子称作基峰，并且通过将该相对强度作为100％，用该峰将谱图标准化。
到的[M-H] ；失去氢负离子得到的[M-H] ；增加碱金属(例如Na)得到的[M+Na] ；等)。根据样品或电离方法(尤其是在EI方法中)，分子量相关的离子可能从不出现；然而，在所述情况下，可以通过使用温和电离方法来确认分子量相关的离子。与分子离子相比，将那些在较低质量一侧出现的离子称作碎片离子，并且这些碎片离子是分子离子的降解产物且提供样品分子的结构信息。将谱中具有最高离子强度的离子称作基峰，并且通过将该相对强度作为100％，用该峰将谱图标准化。
[0468] 根据本发明，通过适当选择下列7种方法中的一种来进行“电离”。
[0469] 1)电子电离方法(EI方法)
[0470] 电子电离方法是通过使热电子与气化样品接触的电离方法，并且其是最普及的电离方法。因为电离在气化样品后进行，所以必需预先气化液体或固体样品。因为将加热用于气化过程，所以测试热不稳定物质或难挥发物质是不可能的。然而，如果物质能通过衍生化例如甲基化、硅烷化或酰化来获得挥发性和热稳定性，那么可以进行测试。因为通常用70eV的能量进行电离，所以伴随分子离子的产生(通常有机化合物的电离能量是大约12eV)，通过过量的能量产生碎片离子。这些碎片离子的信息使化合物的结构分析成为可能。然而，因为难于得到分子离子，所以分子量信息通常是不能得到的。在这种情况下，必须降低电离能量至大约20eV，或者选择较温和的电离方法(CI、DEI、DCI、FAB或ESI)。
[0471] 2)化学电离方法(CI方法)
[0472] 化学电离方法是通过将样品送入预先电离的反应气体(试剂气体)中电离气化样品的方法。因为该方法利用离子-分子反应来实现电离，所以电离能量接近有机化合物的+ +电离能量，因此碎片离子的数量是非常少的，而具有分子量信息的离子((M+H)、(M+NH4)、-
(M-H) 等)作为基准离子出现。对于反应气体来讲，通常使用甲烷、异丁烷或氨。
(M-H) 等)作为基准离子出现。对于反应气体来讲，通常使用甲烷、异丁烷或氨。
[0473] 3)解吸电子电离方法(DEI方法)
[0474] DEI方法是在电子束附近进行瞬间加热从而在样品进行热降解之前气化和电离样品的方法。使热不稳定物质或难挥发性物质的测试成为可能。此外，因为与作为直接引入的常规方法EI方法相比，分子离子以较强强度出现，所以较容易得到分子量信息。测试方法涉及将样品溶液置于尖灯丝(具有100μm直径的铂线)的尖端，将尖灯丝插入到离子源中，然后快速加热灯丝来气化样品。
[0475] 4)解吸化学电离方法(DCI方法)
[0476] 当用处于CI状态的电子源进行DEI操作时，所述操作是DCI。
[0477] 5)快原子轰击方法(FAB方法)
[0478] FAB方法是将样品与基质分子充分混合，将混合物置于靶上，并使快速的中性原子例如Xe在其上轰击来电离样品的方法。不像EI和CI，它不需要气化样品，因此，该方法适合于测试热不稳定或难挥发性物质。然而，因为有很强的基质产生的背景峰出现在较低的质量区，所以在一些情况下，测试低分子量样品可能是困难的。在该种情况下用FRIT-FAB测试是有效的。
[0479] 6)FRIT-快原子轰击方法(FRIT-FAB方法)
[0480] FRIT-FAB方法也称作连续流FAB，并且该方法是使溶解于基质溶液中的样品连续流动，并用快速中性原子轰击流出口来电离样品的方法。
[0481] 7)电喷雾电离方法(ESI方法)
[0482] ESI方法是大气压电离方法，该方法利用当将高的电压施加在毛细管上时，样品溶液自发地进行喷雾和电离的现象。正如FAB，其不需要气化样品，因此，该方法适合于测试热不稳定物质或难挥发性物质。这使测试具有大的分子量的肽和蛋白质成为可能，即使对于具有小的质量范围的四极杆型。在常规ESI测试中，因为不能得到具有结构信息的碎片离子，而施加比通常所用略高的电压至毛细管/分离器-1(Capillary/Skimmer-1)时，源内CID发生，因此，其使具有结构信息的碎片离子的测试成为可能。
[0483] 如文中所用，术语“MALDI-TOF MS”是基质辅助激光解吸电离-飞行时间(质谱仪)的简称。MALDI是Tanaka等人发现的技术，并被Hillenkamp等人发展(Karas M.，-2Hillenkamp，F.，Anal.Chem.1988，60，2299-2301)。在该方法中，将样品和基质溶液以(10-4
至5×10 )∶1的摩尔比混合，然后将混合溶液在靶上干燥成固体，以使其成为晶体状态。
+
可以通过脉冲式激光照射将大量能量施加在基质上，并使样品产生的离子例如(M+H) 和+
(M+Na) 及基质产生的离子解吸。即使样品被微量的磷酸盐缓冲溶液、Tris缓冲溶液、胍等污染，分析仍可以进行。MALDI-TOF(MS)根据飞行时间利用MALDI进行质量测定。当将离子以恒定加速电压V进行加速时，并且当将离子质量指定为m、离子速度指定为v、离子电荷数指定为z、元素电荷为e、且离子的飞行时间为t时，离子的m/z可以用下式表示：
至5×10 )∶1的摩尔比混合，然后将混合溶液在靶上干燥成固体，以使其成为晶体状态。
+
可以通过脉冲式激光照射将大量能量施加在基质上，并使样品产生的离子例如(M+H) 和+
(M+Na) 及基质产生的离子解吸。即使样品被微量的磷酸盐缓冲溶液、Tris缓冲溶液、胍等污染，分析仍可以进行。MALDI-TOF(MS)根据飞行时间利用MALDI进行质量测定。当将离子以恒定加速电压V进行加速时，并且当将离子质量指定为m、离子速度指定为v、离子电荷数指定为z、元素电荷为e、且离子的飞行时间为t时，离子的m/z可以用下式表示：
[0484] m/z＝2eVt2/L2
[0485] 在所述的MALDI-TOF测试中，可以使用Shimadzu/Kratos的KOMPACT MALDI II/III。在测试时，可以参照生产商制作的说明书。在本说明书中，将MALDI-TOF测试中所用的激光照射的照射能量称作为“解离能”。
[0486] 如文中所用，术语“LDI-TOF MS”指：与“MALDI-TOF MS”相比，在没有利用小分子量基质试剂的情况下，通过激光照射解吸和电离指定分子的方法。
[0487] 如文中所用，术语“相同实体”指在本说明书中为了方便以复数表示的实体本身是相同的个体。
[0488] 如文中所用，术语“金属”指含有能(至少部分)结合至含有硫原子的物质(例如巯基、二硫化物等)的金属的金属元素或金属复合物。能结合至含有硫原子的物质的金属的代表类型包括金、银、镉、硒等。金属还可以是磁性物质。
[0489] 如文中所用，术语“金属微粒”指具有10nm-1μm平均粒径大小的金属微粒，并且微粒可以是单分散型或多分散型的。珠子可以由所述金属微粒构成。当金属微粒由金属复合物构成时，作为复合物的核心的微粒表面采取被金属层覆盖的结构，含有硫原子的物质可以结合至所述金属层。在本发明中所用的代表性金属微粒包括元素金或银金属的微粒，或者由具有金或银覆盖的表面的铁、镍、钴、氧化铁(Fe3O4)等的磁性颗粒形成的金属复合物的微粒。本发明的“金属微粒”在溶液中形成胶体。除了上面列出的金属微粒的示例外，还可以使用Quantum Dots(商品名称)(QuantumDot Corporation，Hayward，CA，USA；下文中，称为“QDs”)。在QDs中所用的金属类型的实例包括ZnSe、CdS、CdSe、CdTe等。典型的实例是具有在核心的CdSe和环绕核心的ZnS的纳米粒。可以通过出现在表面的Zn和-SH之间的键(该键与Au-S是相同类型的)将-SH化合物提供在QDs表面。关于金微粒的制备和其应用，描述可见于JACS 125，7790-7791(2003)；Angew Chem Int Ed 40(12)，
2257-2261(2001)；和Chem Eur J 9，1909-1921(2003)中。
2257-2261(2001)；和Chem Eur J 9，1909-1921(2003)中。
[0490] (本发明仪器的应用)
[0491] 蛋白质组分析联合糖链分析方法(其基于本发明实现的质谱方法)和双向电泳方法，还使得瞄准疾病中存在的蛋白标记的快速鉴定的研究或者用于靶蛋白(其作为基因组药物发现的靶点)的高通量搜索将被积极地进行。
[0492] 糖链修饰以及磷酸化、酰化、异戊烯化反应等是蛋白质动态结构/功能控制机制中非常重要和基础的生物合成过程。将所述各种用于蛋白质的修饰反应广泛地称作“遗传信息的翻译后修饰”，其是与包括癌症和免疫的许多疾病极其相关的现象。因此，糖链修饰可用于新诊断支持技术的开发或者药物的研究和开发中，并且甚至用于临床实践领域中。
[0493] 当应用本发明时，其使下述成为可能：进行高通量定量糖组学，和分析那些糖链的载体蛋白的肽序列信息，以及进行新疾病生物标记的搜寻研究，其采用进一步追溯至基因组数据的识别的“基于糖形的反向基因组学(glycoform-focused reverse genomics)”作为基本策略。
[0494] 利用本发明，可以进行基于糖形的反向基因组学(GFRG)，GFRG是如下方法：将糖链作为标记物，捕获糖肽片段，藉此同时进行蛋白质组学分析并获得基因组数据，并由此实现糖蛋白的鉴定、糖链异质性的剖析等。“高通量定量糖组学(High throughput quantitative glycomics)”是可行的，其中将通过N-聚糖酶消化等从包含在血清、细胞、组织和器官生物样品中的各种类型糖蛋白得到的糖链选择性或广泛地捕获和标记，并且通过高效液相色谱(HPLC)、LC-ESI-TOFMS方法等分析所有的糖链结构和其定量分布状态。将通过肽酶处理从同样样品得到的部分消化的糖肽片段捕获，用于各个指定的糖链结构组，通过MALDI-TOFMS和MALDI-TOF/TOFMS分析等来测试各个肽序列，并将结果与上述的高通量定量糖组学分析的结果结合起来。因此，可以进行确定个体糖肽结构的“基于糖形的蛋白组学(Glycoform-focused proteomics)”。在这种情况下，例如，如果可以利用MASCOT算法(Matrix Science，Ltd.)将含有所述肽结构的蛋白质挑选出来，则可以同时分析和识别含有遗传信息的糖蛋白的总图象。由糖链标记物反向追溯并分析载体蛋白质(甚至基因)的结构的GFRG方法是用于新疾病标记物的高通量搜寻法之一，并预期其是有前景的方法。
[0495] 在GFRG方法中，使用两种类型的微量糖链结构分析技术例如(1)糖链的高通量定量结构分析和(2)糖肽的结构分析。
[0496] 此处，可以使用糖印迹(glycoblotting)方法。
[0497] 从复杂的糖缀合物例如糖蛋白、蛋白聚糖或糖脂释放的糖链必定在分子中还原端的具有相当于醛基的半缩醛基团。因此，与其它生物分子例如构成蛋白质的氨基酸和肽、构成DNA/RNA的核苷酸和脂质的很好的化学区分是通过对所述半缩醛基团的特异性和选择性亲核加成反应来实现的。将含有广泛与所有糖链的还原端反应的官能团(氨基氧基基团、酰肼基等)的各种物质(不论高分子量或低分子量)用于连续高速地完成糖链捕获、利用高灵敏试剂等进行的探针标记和根据质谱方法的物质结构分析(专利文件1；图3)。
[0498] 利用本技术，可以将从包含于血清样品(大约50微升)中的各种糖蛋白释放的天冬酰胺结合型糖链的定量结构分析过程在很大程度上简化并缩短。在仅联合各种色谱操作的常规方法中，即使仅那些从含有大量异物的测试样品中纯化糖链或荧光标记的预处理的过程就需要烦琐操作，花费大约2-3周(N.Tomiya等人.Anal.Biochem.171，73(1988))，但是根据所述新方法，从糖链捕获至按照各种质谱方法例如MALDI-LIFT-TOF/TOF或nanoLC/ESI-TOFMS的全面结构分析可以在半天时间内完成。此外，当在具有非还原末端的半乳糖或唾液酸残基中进行选择性氧化反应(官能团转化)，接着在该位置进行肟形成反应时，可以将糖肽片段印迹。因此，图3中所示的流程可以用于糖肽的结构分析。
[0499] 糖链的碎片离子可以在其被破坏之前被检测。
[0500] 作为用于蛋白组研究非常有效的分析方法，质谱测定方法已经在各个方面得到广泛应用。这是因为该方法是非常有利的，不依赖其结构，所有通过酶消化等产生的肽片段可以容易地电离，并且从其稳定的主要离子峰进行选择性碎裂也是简单的，以至于当将MS/MS谱模式采用上述的MASCOT算法分析等进行校勘时，可以容易地推测包含那些肽序列的侯选蛋白质。
[0501] 此外，MALDI-TOF MS(例如Bruker Daltonics，Ltd.生产的REFLEXIII和BIFLEX III等)可以用作检测肽或蛋白质上进行的酶或化学糖链修饰反应的简单和通用的方法。利用这些仪器，可以通过简单识别反应产物的分子量(仅主要来自一价分子离子峰的信息)来完成反应条件的优化、反应产率的评估等。比上述两个仪器更高端的Ultraflex可以通过LIFT-TOF/TOF方法高灵敏度快速地检测和分析不稳定碎片离子。认为还可以用其它公司的MALDI型质量分析仪器进行TOF/TOF模式的类似测试，但是基本原理如在图4中所示，在TOF-1中，将加速电压选择性施加于前体离子，接着激光照射，藉此产生碎片离子。
然后，在碎片离子到达称作TOF-2区域时的阶段，使所述碎片离子中的每一个再次快速经受瞬间加速电压，通过反射器在特定电压下碎片离子直接移向检测器，从而使各个质量得到识别。此处，最重要的一点是所有已在TOF-2区域加速并分别以不同速度移动的碎片离子在几微秒后开始被检测到，并在此后最多至几百微秒的期间内连续地被检测到。用于比较，在PSD模式的测试被呈现在相同时间轴上，但是在这种情况下，因为所有的碎片离子通过相同的线性运动同时朝检测器移动，通过适当改变中间的反射器的电压分选和随后检测每个碎片离子的过程是必需的。因此，电离后，所有碎片离子花费大约1毫秒以到达检测器。当快速高灵敏度地检测和结构分析在糖链中观察到的那些不稳定碎片离子时，所述几百微秒的“时间差别攻击”是重要的。如此，当尝试使用各种方法时，本发明的自动分析方法是可应用的。
然后，在碎片离子到达称作TOF-2区域时的阶段，使所述碎片离子中的每一个再次快速经受瞬间加速电压，通过反射器在特定电压下碎片离子直接移向检测器，从而使各个质量得到识别。此处，最重要的一点是所有已在TOF-2区域加速并分别以不同速度移动的碎片离子在几微秒后开始被检测到，并在此后最多至几百微秒的期间内连续地被检测到。用于比较，在PSD模式的测试被呈现在相同时间轴上，但是在这种情况下，因为所有的碎片离子通过相同的线性运动同时朝检测器移动，通过适当改变中间的反射器的电压分选和随后检测每个碎片离子的过程是必需的。因此，电离后，所有碎片离子花费大约1毫秒以到达检测器。当快速高灵敏度地检测和结构分析在糖链中观察到的那些不稳定碎片离子时，所述几百微秒的“时间差别攻击”是重要的。如此，当尝试使用各种方法时，本发明的自动分析方法是可应用的。
[0502] 通过利用LIFT-TOF/TOF方法，使得能够良好重现性地观察各种粘蛋白型糖肽包括不裂解与丝氨酸或苏氨酸的O-糖苷键的那些结构(比裂解的要快)的分子离子峰或碎片离子峰。因为经简单操作还可以良好重现性地获得相对大的糖链(包含唾液酸或岩藻糖)的TOF/TOF质谱，现在通过与所谓已知化合物的TOF/TOFMS谱相结合(谱匹配方法)，在未知样品中鉴定结构异构体或分析异构体的组成比率是可能的。对于糖链的谱匹配而TM TM言，例如已报道了通过GlycosidiQ 的用于预测独特MS/MS图案的方法，GlycosidiQ 装载于Proteome Systems，Inc.研发的GlycoSuite DB中。在该方法中，将实际观察到的碎片离子的谱图图案和基于糖链裂解行为的特性通过理论模拟得到的碎片离子的计算数据库自动校勘，并且根据同源性推测侯选结构。通过利用更多种类和复杂的糖链相关化合物的MS/MS数据库，可以实现高度精确的谱匹配。
[0503] 超声喷雾电离(SSI)方法在天然物质、代谢中间体等的不稳定分子的电离方面是优秀的，SSI可以说是用于糖链非破坏性直接电离的最佳方法之一。在装载有SSI方法的Hitachi M-80003DQ型质量分析仪(HitachiHigh-Technologies Corp.生产的)中，即使对于各种包含中性糖链以及唾液酸的寡糖样品，当在负离子模式进行测试时，也可以高灵敏度地检测到稳定的分子离子峰，并且即使由于成键模式不同产生的唾液酸的四种结构异n构体，也可以通过氦气CID(碰撞诱导解离)得到的MS 谱匹配来进行完全鉴别。因为所述
2 3 2 3
异构体的MS、MS 和MS 谱是可以得到的，并且已在MS 中鉴定了分支的位置，当比较MS 谱时，可以简单地区别α2，6键和α2，3键，其连接唾液酸与半乳糖残基。然而，当进行在分子量和结构方面非常相似的糖肽的分析时，与优秀分离方法例如nanoLC技术相结合的通量增加被预期。
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异构体的MS、MS 和MS 谱是可以得到的，并且已在MS 中鉴定了分支的位置，当比较MS 谱时，可以简单地区别α2，6键和α2，3键，其连接唾液酸与半乳糖残基。然而，当进行在分子量和结构方面非常相似的糖肽的分析时，与优秀分离方法例如nanoLC技术相结合的通量增加被预期。
[0504] 基质相关的选择性碎裂(MDSF)方法
[0505] 2，5-二羟基苯甲酸(DHB)和α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)是两种经常在MALDI方法中使用的典型基质。当在各自独立地利用所述2种基质产生的分子离子上进行TOF/TOFMS测试时，尽管对具有相同质量的分子离子而言，将完全相同的加速电压施用至TOF-2，却观察到完全不同的碎片离子模式。这可以设想是归因于在活化的分子离子中电荷分布模式不同。在用DHB产生的分子离子的断裂中，大多数断裂方式是外(exo)型的，其中单糖一个接一个从末端断裂，与之相反，在用CHCA产生的情况中，内(endo)型断裂是占主导地位的，其中明显观察到相对大的糖链碎片离子。当用DHB产生分子离子时，选择具+
有m/z 1862.79(M+H)的值，并进行碎裂，除了从末端开始的外型糖链断裂外，在肽区域发生令人满意的碎裂。另一方面，将具有相同结构的糖链并在苷元部分不同的三种类型化合物(糖肽、糖基氨基酸和荧光标记的糖链)电离，这次采用CHCA作为基质。当由此产生的+
分子离子(M+Na)(其分别具有明确不同的质量数的)碎裂时，通过谱匹配完成糖链部分的结构分析也是可行的。这种基质相关的选择性碎裂(MDSF)方法是选择性碎裂其中糖苷键和酰胺键共存于同一分子中的糖肽的有效方法。
有m/z 1862.79(M+H)的值，并进行碎裂，除了从末端开始的外型糖链断裂外，在肽区域发生令人满意的碎裂。另一方面，将具有相同结构的糖链并在苷元部分不同的三种类型化合物(糖肽、糖基氨基酸和荧光标记的糖链)电离，这次采用CHCA作为基质。当由此产生的+
分子离子(M+Na)(其分别具有明确不同的质量数的)碎裂时，通过谱匹配完成糖链部分的结构分析也是可行的。这种基质相关的选择性碎裂(MDSF)方法是选择性碎裂其中糖苷键和酰胺键共存于同一分子中的糖肽的有效方法。
[0506] 对于GFRG方法，需要收到高通量定量糖组学的结果并需要对每个目标糖链结构包括根肽结构(基于糖形的蛋白组学)进行系统分析。因此，与MALDI-TOFMS结合，优选采3
用MDSF方法中或ESI(SSI)离子阱MS方法中的选择性MS 谱，并优选使用旨在用于更加选择性和准确碎裂的技术例如电子俘获解离(ECD)方法。
用MDSF方法中或ESI(SSI)离子阱MS方法中的选择性MS 谱，并优选使用旨在用于更加选择性和准确碎裂的技术例如电子俘获解离(ECD)方法。
[0507] (分析仪器的构成)
[0508] 作为本发明仪器的实例，可以使用图9中所提出的构造。
[0509] 下列过程可以在图9中的各个位置编号处进行。
[0510] 位置编号
[0511] 在下列位置进行的反应、处理
[0512] -------------------------------------------------------------------[0513] (1)●用蛋白水解酶和糖链释放酶处理糖蛋白，从而释放糖链。
[0514] -------------------------------------------------------------------[0515] (2)-(5)●用BlotGlycoABC珠子捕获糖链，并将糖链的还原末端进行标记。
[0516] ●将不能被珠子捕获的杂质通过过滤除去。
[0517] ●通过甲基酯化来保护唾液酸残基的羧酸。
[0518] ●将腙键还原以稳定与珠子的键。
[0519] ●将S-S键断裂以从珠子释放糖链。
[0520] ●将糖链过滤。
[0521] --------------------------------------------------------------------[0522] (6)-(7)●将MALDI基质添加到含有糖链的滤液/糖链流出液中，然后将混合物滴加在MALDI板上。
[0523] --------------------------------------------------------------------[0524] (8)-(10)当含有小的糖含量时，或者当进行HPLC分析时，进行该操作。
[0525] ●使通过混合ACN与含有糖链的滤液制备的液体流经已用ACN洗涤过的SPE板，并将糖链吸附至SPE板。
[0526] ●将SPE板用95％ACN洗涤，并除去过量的试剂。
[0527] ●使10％ACN流动以使糖链从SPE板流出。
[0528] --------------------------------------------------------------------[0529] 将另一个示例性实施方案显示于图5至图6中。在所述图中，将图1所示的仪器的位置用数字表示。图7显示分配的示例。图8显示本实施方案的鸟瞰图。
[0530] 图8中的洗涤阀A-H如下所示。
[0531] 图1中显示了更优选的实施方案。
[0532] 在所述图1中，进行了下列方法。
[0533] 用于分析样品中的糖链的方法，该方法包括下列步骤：
[0534] A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤，该步骤包括下列步骤：
[0535] A-1)将作为样品的血清提供在过滤板上的步骤；
[0536] A-2)添加1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)或1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)/碳酸氢铵，并使混合物在37℃反应10分钟的步骤；
[0537] A-3)添加二硫苏糖醇(DTT)到样品中，使混合物在60℃反应30分钟，然后冷却反应混合物至室温的步骤；
[0538] A-4)添加碘乙酰胺(IAA)，并使混合物在黑暗中于室温反应1小时的步骤；
[0539] A-5)添加胰蛋白酶到样品中，并使混合物在37℃反应60分钟的步骤；
[0540] A-6)加热样品至90℃，持续5分钟，然后冷却样品至室温的步骤；和
[0541] A-7)添加PNGaseF，并使混合物在37℃反应12小时的步骤；
[0542] B)制备在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备步骤，该步骤包括下列步骤：
[0543] B-1)使步骤(A)中制备的捕获的糖链样品与用于捕获糖链的珠子接触，从而在37℃进行结合，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；
[0544] B-2)添加盐酸胍到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，然后通过抽吸除去反应液体的步骤；
[0545] B-3)用水洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去水的步骤；
[0546] B-4)用三乙胺洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去三乙胺的步骤；
[0547] B-5)添加乙酸酐到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，然后通过抽吸除去乙酸酐的步骤；
[0548] B-6)添加盐酸到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去盐酸的步骤；
[0549] B-7)添加甲醇到捕获的糖链样品中，通过抽吸除去甲醇，然后添加二氧六环到捕获的糖链样品中的步骤；
[0550] B-8)用棉布擦拭底部的步骤；
[0551] B-9)添加甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)到捕获的糖链样品中，并使混合物在80℃反应60分钟的步骤；
[0552] B-10)添加二氧六环到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去二氧六环的步骤；
[0553] B-11)用甲醇洗涤捕获的糖链样品，通过抽吸除去甲醇，用NaCl溶液洗涤样品，通过抽吸除去NaCl溶液，接着用水洗涤样品，然后通过抽吸除去水的步骤；
[0554] B-12)添加乙酸和乙腈到捕获的糖链样品中，并用氨基氧基色氨酰基精氨酸甲酯/水、盐酸苄基羟胺/水或邻氨基苯甲酰肼/水标记捕获的糖链样品中的糖链的步骤；和[0555] B-13)添加水到标记的捕获的糖链样品中，以产生标记的糖链样品溶液的步骤；
[0556] C)制备具有点样于其上的标记的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子的步骤，该步骤包括：
[0557] C-1)在用于回收的板子上处理在步骤(B)中得到的标记的糖链样品溶液的步骤；
[0558] C-2)在用于混合的板子上处理来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和乙腈以便得到80-90％的乙腈终浓度的步骤；
[0559] C-3)提供正相模式的附着有固相载体的板子的步骤；
[0560] C-4)依次用水和乙腈洗涤附着有固相载体的板子，并通过抽吸除去水和乙腈的步骤；
[0561] C-5)添加标记的糖链样品溶液至附着有固相载体的板子，除去液体，并向其添加5％乙腈的步骤；
[0562] C-6)通过抽吸从附着有固相载体的板子回收珠子至第二个用于回收的板子的步骤；和
[0563] C-7)添加在30％乙腈中的2，5-二羟基苯甲酸至标记的糖链样品溶液，并混合和点样所述混合物的步骤；和
[0564] D)通过MALDI-TOF MS完成质谱法的步骤。
[0565] 图1中的数字如在字母和数字解释部分中所描述。
[0566] 下面所述用于4℃的试剂架、试剂架和洗涤阀。
[0567] [表1]
[0568]4℃的试剂架 mL 洗涤阀 mL
胰蛋白酶 0.48 2％AcO H的ACN溶液 34.56
PNGaseF 0.48 2M盐酸胍 38.4
水 86.4
试剂架 mL 1％TEA 38.4
PHL 1.92 10mM HCl 38.4
DTT 0.48 MeOH 38.4
IAA 0.96 二氧六环 57.6
10％Ac2O 9.6 95％ACN 72.96
MTT 9.6
20mM试剂 1.92
5％ACN 9.6
胰蛋白酶 0.48 2％AcO H的ACN溶液 34.56
PNGaseF 0.48 2M盐酸胍 38.4
水 86.4
试剂架 mL 1％TEA 38.4
PHL 1.92 10mM HCl 38.4
DTT 0.48 MeOH 38.4
IAA 0.96 二氧六环 57.6
10％Ac2O 9.6 95％ACN 72.96
MTT 9.6
20mM试剂 1.92
5％ACN 9.6
[0569] 应该理解可将上面所述的过程根据需要进行修改。
[0570] (详述)
[0571] 在下文中，将描述本发明优选的实施方案。下面提供的实施方案用于更好地理解本发明的目的，并且应该理解本发明的范围不限于下面的描述中。因此，显而易见，本领域的普通技术人员能参照本说明书中的描述，并在本发明范围内适当地修改本发明。
[0572] (糖链分析方法)
[0573] 根据一个方面，本发明提供用于分析样品中的糖链的方法。该方法包括A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤；B)制备在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备步骤；当使用板子进行质谱测试时，接着的步骤C)制备具有点样于其上的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子的步骤；和对待测试的糖链进行分析的步骤。
[0574] 在A)释放样品中的糖链的糖链释放步骤中，可以进行下列过程。
[0575] 糖链释放步骤，包括
[0576] A-1)将样品提供在用于反应的板子上的步骤；
[0577] A-2)添加增溶剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0578] A-3)添加还原剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0579] A-4)添加-SH保护剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0580] A-5)添加蛋白水解酶到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0581] A-6)灭活蛋白水解酶的步骤；和
[0582] A-7)添加糖链释放酶到样品中从而释放糖链的步骤。
[0583] 在步骤(A)的次级过程中，优选使用下面所示的条件，但本发明并不意欲限制于此。对于下面的条件，可以应用任何一个，或者可以应用多个所述的条件。
[0584] A-1)将样品提供在用于反应的板子上的步骤可以手动完成，或者该步骤可以是自动化的。样品的代表性实例包括体液、细胞提取物和组织提取物，并且更具代表性的实例是血清。通常，将样品提供在过滤板上。
[0585] 对于A-2)，增溶剂是1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)、1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)、2-羟基-3-磺丙基月桂酸酯(HSD)或其等价物，并且这些可以用下式表示：R-OCOO-CH2CH(OH)CH2-SO2-ONa(其中，R表示烷基)。例如，优选使用1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)，或1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)/碳酸氢铵。对于增溶剂而言，可以使用WO 2008/001888(PCT/JP2007/063100)中列举的那些。
[0586] 上述的反应条件通常是25℃-42℃，并优选37℃，且反应时间通常是5-60分钟，并优选大约10分钟。
[0587] A-3)还原剂是二硫苏糖醇(DTT)、TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液0.5M)或等价物，
[0588] 反应条件通常是室温至80℃，优选50℃-80℃，并且通常是60℃，并且反应时间通常是30分钟至2小时，并优选大约1小时。
[0589] A-4)-SH保护剂是碘乙酰胺(IAA)或等价物，并且
[0590] 反应条件是在黑暗中于20-37℃下(通常是室温)。反应时间通常是0.5-2小时，并且例如1小时。
[0591] A-5)蛋白水解酶通常是胰蛋白酶、糜蛋白酶或等价物，并优选胰蛋白酶，并且[0592] 反应条件是在25-42℃下，并且通常是37℃。反应时间通常是30-120分钟，并且例如大约60分钟。
[0593] A-6)用于灭活的条件包括通常加热至65℃或更高的温度，并优选80-100℃(例如90℃)。在此，加热时间通常是1-10分钟(例如5分钟)，并任选将系统冷却至室温。
[0594] A-7)糖链释放酶是肽-N-糖苷酶F、肽-N4-(乙酰基-β-葡糖胺基)-天冬酰胺酰胺酶(PNGaseF)、Endo H或等价物，并且优选的是在该步骤中没有溶剂挥发。可以采取在顶部加热处理的对抗措施。
[0595] 用于糖链释放酶的反应条件是25℃-42℃(例如37℃)，并且反应时间通常是2-24小时，并且例如12小时。
[0596] 在B)制备在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备步骤，可以进行下列过程：
[0597] B-1)使在步骤(A)中制备的样品与糖链捕获珠子接触然后将样品置于反应条件下，使样品中的释放的糖链结合到珠子，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；
[0598] B-2)添加蛋白变性剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；
[0599] B-3)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；
[0600] B-4)添加珠子上的糖链捕获剂的盐释放剂到捕获的糖链样品中，然后通过抽吸除去盐释放剂的步骤；
[0601] B-5)添加保护剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；
[0602] B-6)添加酸到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去酸的步骤；
[0603] B-7)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中的步骤；
[0604] B-8)除去珠子中的溶剂和水分的步骤；
[0605] B-9)添加烷基酯化剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，并将唾液酸的羧酸烷基化的步骤；
[0606] B-10)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去有机反应溶剂的步骤；
[0607] B-11)洗涤捕获的糖链样品，并接着通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；
[0608] B-12)从捕获的糖链样品中释放糖链样品的步骤，其中当进行分析所需要的标记时，用标记试剂标记捕获的糖链样品中的糖链，并将其从珠子上释放；和
[0609] B-13)溶解释放的糖链样品以产生糖链样品溶液的步骤。
[0610] 在步骤(B)的次级过程中，优选使用以下面所示的一个或多个情况为特征的过程，但是本发明并不意欲被限制于此。
[0611] 对于B-1)，珠子是具有糖链捕获基团的珠子或磁性珠子，所述糖链捕获基团包括氨基氧基基团、N-烷基氨基氧基基团、酰肼基团、叠氮基团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基或其衍生物，且
[0612] 样品中的糖链结合至珠子的条件通常是25-80℃，并更通常是40-80℃，并例如使用80℃。
[0613] B-2)变性剂是盐酸胍、脲、十二烷基硫酸钠或等价物，且
[0614] 反应条件包括在室温添加，并保持该温度以使珠子充分膨胀(10秒至5分钟)。
[0615] B-3)洗涤用水进行，然后通过抽吸除去水。
[0616] B-4)珠子上的糖链捕获剂是氨基氧基基团、N-烷基氨基氧基基团、酰肼基团、叠氮基团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基或其衍生物，且在酰肼情况下，盐释放剂是三乙胺或其等价物，并且在N-烷基氨基氧基基团情况下，盐释放剂是三乙胺。其后，任选通过抽吸除去三乙胺。
[0617] B-5)保护剂是乙酸酐、琥珀酸酐、其它酸酐或等价物，且
[0618] 反应条件包括(例如10％)乙酸酐/甲醇在15-37℃(例如室温)持续10分钟至2小时(例如30分钟)。其后，任选通过抽吸除去乙酸酐。
[0619] B-6)酸是盐酸或另外的无机酸或pH2-3的等价酸，并任选通过抽吸除去酸。
[0620] B-7)包括在用有机反应溶剂清洗(purging)前用亲水性有机溶剂清洗的步骤。所述亲水性有机溶剂通常是低级醇例如甲醇或乙醇、乙腈或丙酮，且有机反应溶剂是二氧六环、乙腈、四氢呋喃或等价物。任选通过抽吸除去甲醇等，然后将二氧六环添加到捕获的糖链样品中。
[0621] B-8)除去珠子中的溶剂和水分的步骤通常包括用棉布、纸、吸墨纸、纱布、毛巾、手帕、薄纸等擦拭底部，
[0622] B-9)烷基酯化剂通常是甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)、乙基-对-甲苯基-三氮烯(ETT)、丁基-对-甲苯基-三氮烯(BTT)或其等价物，且甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)是优选的。
[0623] 反应条件包括100mM MTT/二氧六环在60-80℃，持续30分钟至120分钟(例如60分钟)。
[0624] B-10)有机反应溶剂通常是二氧六环、乙腈、四氢呋喃或等价物，且二氧六环是优选的。任选通过抽吸除去二氧六环等。
[0625] B-11)洗涤用甲醇、NaCl溶液和水中的至少一种进行；并且此后，任选通过抽吸除去甲醇、NaCl溶液和水。可以使用足够用以洗涤的量，并且可以使用例如100μl-1ml的量例如200μl，但不限于此。NaCl溶液可以以任何浓度使用，但是例如可以使用10-100mM的溶液，且可以使用例如20mM的溶液。
[0626] B-12)进行标记。通常，标记利用能吸收紫外线和可见光的生色团、具有发射荧光的结构的标记物、具有能与另一个分子(His标记物、生物素等)相互作用的分子的标记物、具有能与官能团(光敏分子(用于交联)、叠氮基团、SH基团、氨基、羧酸等)特异性反应的官能团的标记物、具有在疏水结构中的官能团的标记物或者具有金属离子配体的标记物来完成，并且通过添加乙酸、乙腈、醋酸盐缓冲液或等价物来进行标记。优选的是将样品进行MALDI-TOF MS。对于质谱测试而言，可以使用另一种电离方法。例如，可以通过ESI-MS(电喷雾电离质谱)和各质谱方法来完成多级质谱测定法如MS/MS(LC-MS/MS等)。除此之外，考虑利用荧光染色标记回收糖链并完成LC-ESI-MS(/MS)。例如，添加乙酸和乙腈到捕获的糖链样品中，并可以将捕获的糖链样品中的糖链利用氨基氧基色氨酰基-精氨酸甲酯/水、盐酸O-苄基羟胺/水或邻氨基苯甲酰肼/水进行标记。还可以利用生物素标记来回收糖链并将糖链进行基于SPR例如BIACORE的相互作用分析，或者微点阵板的制备。当利用荧光染色标记回收糖链时，不是不可以进行MALDI-TOF分析，所述分析可以通过选择适当的条件来完成。
[0627] B-13)标记的捕获的糖链样品的溶解通常利用水、水溶液或等价物来完成。
[0628] 当利用板子进行质谱测试时，可以采用下面的过程C，且C)制备具有点样于其上的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子的步骤可以具有至少一个下面所述的特征：
[0629] C-1)在用于回收的板子上处理步骤(B)中得到的标记的糖链样品溶液的步骤；且[0630] 该步骤任选地包括步骤(C-2)至(C-6)：
[0631] C-2)在用于混合的板子上处理来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和有机溶剂以得到糖链吸附至固相的浓度的步骤；
[0632] C-3)提供附着有固相载体的板子的步骤；
[0633] C-4)根据附着有固相载体的板子的相，活化附着有固相载体的板子，并洗涤附着有固相载体的板子的步骤；
[0634] C-5)添加标记的糖链样品溶液至附着有固相载体的板子，并使标记的糖链样品溶液顺应具有适合于附着有固相载体的板子的相的极性的溶剂的步骤；
[0635] C-6)通过抽吸从附着有固相载体的板子回收标记的糖链样品溶液至第二个用于回收的板子的步骤；和
[0636] 当将标记的糖链样品溶液进行MALDI-TOF MS时，进行下面步骤(C-7)：
[0637] C-7)将标记的糖链样品溶液点样在用于质谱测试的基质上的步骤。
[0638] 在步骤(C)的次级过程中，优选采用具有如下面所示的一个或多个情况的特征的过程，但是本发明并不限于此。
[0639] C-1)用于回收的板子上的处理在除去标记试剂的条件下进行；
[0640] C-2)糖链吸附至固相的浓度通常是80-90％在有机溶剂中，并且优选地，将来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和乙腈在用于混合的板子上进行处理，以便得到80-90％的乙腈终浓度；
[0641] C-3)附着有固相载体的板子通常是多孔型的并包含适合于固相萃取的树脂或膜的表面；
[0642] C-4)当附着有固相载体的板子是正相模式时，洗涤依次用水和乙腈进行，并且当附着有固相载体的板子是反相模式时，洗涤依次用低级醇例如甲醇和水进行；
[0643] C-5)在正相模式情况下具有相反极性的溶剂是疏水有机溶剂，并且，在反相模式情况下具有相反极性的溶剂是亲水溶剂。此处，例如将标记的糖链样品溶液添加到附着有固相载体的板子，除去液体，并且通常用乙腈洗涤板子。此外，可以将1-20％(例如5％)的乙腈添加在其上。
[0644] C-6)第二个用于回收的板子是多孔型的并包含适合于固相萃取的树脂或膜的表面。
[0645] C-7)用于质谱测试的基质通常是2，5-二羟基苯甲酸或等价物，并且在用于质谱测试的基质上的标记的糖链样品溶液的点样混合或依次进行，并根据需要将其稀释。此外，优选地，可以将在20-40％(例如30％)乙腈中的2，5-二羟基苯甲酸添加到标记的糖链样品溶液中，并可以将混合物进行点样。
[0646] 在进行待测试糖链的分析的D)步骤中，可以使用任何质谱测试方法，通常是MADLI-TOF。一旦进行步骤(D)中MALDI-TOF，优选的是完成整个步骤(C)。通过高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-电喷雾电离质谱(LC-ESIMS)、基质辅助激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)或等价方法来进行待测试的糖链的质谱测试。当在标记中使用着色剂或生物素时，优选进行除去任何过量的着色剂的步骤。当珠子是磁性珠子时，磁性珠子优选是具有可修饰的官能团的珠子(例如羧基、氨基、环氧基、甲苯磺酰基或抗生蛋白链菌素结合的磁性珠子)。
[0647] 如果样品已回收至用于第1次回收的板子，且在接下来的分析例如MALDI-TOF MS中没有问题，可以省去使用SPE板子的过程。当在所述情形下进行MALDI-TOF MS时，将样品从用于第1次回收的板子转移至用于混合的MP2板子，并将其与基质混合，然后将混合物点样于MALDI板子上。当直接用HPLC、LC-ESI MS等处理样品时，可以省略所述步骤。
[0648] 当使用着色剂时，如果必须除去过量的着色剂，优选进行反相或正相萃取或者固相萃取例如离子交换。因此，尽管SPE板子的类型和用于活化的溶剂和洗涤依赖于试剂的性质，但优选进行类似的步骤。如果过量的试剂不会引起任何问题(例如，如果试剂通过结合至糖链第一次发射荧光)，可以对样品进行分析，而其保持在接收的自动采样器中。在生物素标记情况下，优选除去任何游离(未结合至糖链)的试剂。优选进行SPE板操作。
[0649] 上面优选的实施方案的各个特征可以被包括一个，或者两个或多个特征可以被组合。
[0650] (用于释放样品中的糖链的糖链释放方法)
[0651] 本发明提供用于释放样品中的糖链的糖链释放方法。该方法包括下列步骤：
[0652] A-1)将样品提供在用于反应的板子上的步骤；
[0653] A-2)添加增溶剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0654] A-3)添加还原剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0655] A-4)添加-SH保护剂到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0656] A-5)添加蛋白水解酶到样品中然后将样品置于反应条件下的步骤；
[0657] A-6)灭活蛋白水解酶的步骤；和
[0658] A-7)添加糖链释放酶到样品中从而释放糖链的步骤。
[0659] 根据优选的实施方案，提供了还具有用于上述步骤的至少任何一个下述特征的方法：
[0660] A)在释放样品中的糖链以制备用于分析的糖链样品的糖链释放步骤中：
[0661] A-1)样品是体液、细胞提取物或组织提取物；
[0662] A-2)增溶剂是1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)、1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)、2-羟基-3-磺丙基月桂酸酯(HSD)或其等价物，或者
[0663] 反应条件是在25℃-42℃下；
[0664] A-3)还原剂是二硫苏糖醇(DTT)、TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐溶液，0.5M)或其等价物，或者
[0665] 反应条件是在室温至80℃下；
[0666] A-4)一SH保护剂是碘乙酰胺(IAA)或其等价物，或者
[0667] 反应条件是在黑暗中于20-37℃下；
[0668] A-5)蛋白水解酶是胰蛋白酶、糜蛋白酶或其等价物，或者
[0669] 反应条件是在25-42℃下；
[0670] A-6)用于灭活的条件包括加热至65℃或更高；
[0671] A-7)糖链释放酶是肽-N-糖苷酶F、肽-N4-(乙酰基-β-葡糖胺基)-天冬酰胺酰胺酶(PNGaseF)、Endo H或其等价物，或者
[0672] 用于糖链释放酶的反应条件是在25℃-42℃下。
[0673] 根据更优选的实施方案，提供了进一步具有下列步骤中的至少一个步骤的方法：
[0674] A-1)将作为样品的血清提供在过滤板上的步骤；
[0675] A-2)添加1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)或1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)/碳酸氢铵，并使混合物在25-42℃反应5-60分钟的步骤；
[0676] A-3)添加二硫苏糖醇(DTT)到样品中，使混合物在50-80℃反应10-60分钟，然后冷却反应混合物至室温的步骤；
[0677] A-4)添加碘乙酰胺(IAA)，并使混合物在黑暗中于室温反应0.5-2小时的步骤；
[0678] A-5)添加胰蛋白酶到样品中，并使混合物在25-42℃反应30-120分钟的步骤；
[0679] A-6)加热样品至80-100℃，持续1-10分钟，然后冷却样品至室温的步骤；和[0680] A-7)添加PNGaseF，并使混合物在25-42℃反应6-24小时的步骤。
[0681] 根据某一实施方案，将该方法用于制备用于分析样品中的糖链的预处理样品。
[0682] 在上述优选的实施方案中，可以单个或组合地包括各个特征，或包括两个或更多个特征。
[0683] (用于制备在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备方法)
[0684] 本发明还提供用于制备在检测中使用的释放的糖链的检测样品制备方法。该方法包括下列步骤：
[0685] B-1)使样品与糖链捕获珠子接触然后将样品置于使样品中释放的糖链结合至珠子的条件下，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；
[0686] B-2)添加蛋白变性剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；
[0687] B-3)洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；
[0688] B-4)添加珠子上的糖链捕获剂的盐释放剂到捕获的糖链样品中，然后通过抽吸除去盐释放剂的步骤；
[0689] B-5)添加保护剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下的步骤；
[0690] B-6)添加酸到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去酸的步骤；
[0691] B-7)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中的步骤；
[0692] B-8)除去珠子中的溶剂和水分的步骤；
[0693] B-9)添加烷基酯化剂到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，并将唾液酸的羧酸烷基化的步骤；
[0694] B-10)添加有机反应溶剂到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去有机反应溶剂的步骤；
[0695] B-11)洗涤捕获的糖链样品，并接着通过抽吸除去残留的洗涤液体的步骤；
[0696] B-12)从捕获的糖链样品中释放糖链样品的步骤，其中当进行分析所需要的标记时，用标记试剂标记捕获的糖链样品中的糖链，将其从珠子上释放；和
[0697] B-13)溶解释放的糖链样品以产生糖链样品溶液的步骤。
[0698] 根据优选的实施方案，提供了进一步具有用于上述步骤的至少任何一个下列特征的方法：
[0699] 对于B-1)，珠子是具有结合在其上的糖链捕获基团的珠子或磁性珠子，所述糖链捕获基团包括氨基氧基基团、N-烷基氨基氧基基团、酰肼基团、叠氮基团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基或其衍生物，或者
[0700] 样品中的释放的糖链结合至珠子的条件是在25-80℃下；
[0701] B-2)变性剂是盐酸胍、脲、十二烷基硫酸钠或等价物，或者
[0702] 反应条件包括在室温添加，并保持该温度以使珠子充分膨胀(10秒至5分钟)；
[0703] B-3)洗涤用水进行；
[0704] B-4)珠子上的糖链捕获剂是氨基氧基基团、N-烷基氨基氧基基团、酰肼基团、叠氮基团、氨基硫脲基团、半胱氨酸残基或其衍生物，且在酰肼情况下，盐释放剂是三乙胺或等价物，且在N-烷基氨基氧基基团情况下，盐释放剂是三乙胺或等价物；
[0705] B-5)保护剂是乙酸酐、琥珀酸酐或其它酸酐或等价物，或者
[0706] 反应条件是在15-37℃使用乙酸酐/甲醇；
[0707] B-6)酸是盐酸或另外的无机酸或pH 2-3的等价酸；
[0708] B-7)所述步骤包括在用有机反应溶剂置换之前用亲水性有机溶剂置换的步骤，并且亲水性有机溶剂是低级醇例如甲醇或乙醇、乙腈或丙酮，而有机反应溶剂是二氧六环、乙腈、四氢呋喃或其等价物；
[0709] B-8)除去珠子中的溶剂和水分的步骤包括用滤纸、吸墨纸、纱布、毛巾、手帕、薄纸或棉布擦拭底部；
[0710] B-9)烷基酯化剂是甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)、乙基-对-甲苯基-三氮烯(ETT)、丁基-对-甲苯基-三氮烯(BTT)或其等价物，或者
[0711] 反应条件是在20-80℃使用100mM MTT/二氧六环，持续30分钟至5小时；
[0712] B-10)有机反应溶剂是二氧六环、乙腈、四氢呋喃或其等价物；
[0713] B-11)洗涤用甲醇、NaCl溶液和水中的至少一种进行；
[0714] B-12)进行标记，标记采用能吸收紫外线和可见光的生色团、具有发射荧光的结构的标记物、具有能与另一个分子相互作用的分子的亲和标记物、具有能与官能团特异性反应的官能团的标记物、具有在疏水结构中的官能团的标记物或者具有金属离子配体的标记物来完成，并且标记通过添加乙酸、乙腈、醋酸盐缓冲液或等价物来进行；或
[0715] B-13)标记的捕获的糖链样品的溶解利用水、水溶液或等价物来完成。
[0716] 根据更优选的实施方案，提供进一步具有下列步骤中至少一个步骤的方法：
[0717] B-1)使捕获糖链的样品与用于捕获糖链的珠子接触从而在40-80℃进行结合，并由此产生捕获的糖链样品的步骤；
[0718] B-2)添加盐酸胍到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，然后通过抽吸除去反应液体的步骤；
[0719] B-3)用水洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去水的步骤；
[0720] B-4)用三乙胺洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去三乙胺的步骤；
[0721] B-5)添加乙酸酐到捕获的糖链样品中，然后将捕获的糖链样品置于反应条件下，所述反应条件为在室温使用10％乙酸酐/甲醇持续10分钟至2小时，然后通过抽吸除去乙酸酐的步骤；
[0722] B-6)添加盐酸至捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去盐酸的步骤；
[0723] B-7)添加甲醇到捕获的糖链样品中，通过抽吸除去甲醇，然后添加二氧六环到捕获的糖链样品中的步骤；
[0724] B-8)用棉布擦拭底部的步骤；
[0725] B-9)添加甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)到捕获的糖链样品中，并使混合物在60℃反应30-120(60)分钟；
[0726] B-10)添加二氧六环到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去二氧六环的步骤；
[0727] B-11)依次用甲醇、NaCl溶液和水洗涤捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去水的步骤；
[0728] B-12)添加乙酸和乙腈到捕获的糖链样品中，并采用氨基氧基色氨酰基-精氨酸甲酯/水、盐酸O-苄基羟胺/水或邻氨基苯甲酰肼/水标记捕获的糖链样品中的糖链的步骤；和
[0729] B-13)添加水到标记的捕获的糖链样品中以生成标记的糖链样品溶液的步骤。
[0730] 根据另一个优选的实施方案，糖链捕获珠子是磁性珠子，并且分离利用磁场进行而不是利用如上所述的通过抽吸除去来进行。
[0731] 根据某一实施方案，该方法用于制备用于分析样品中的糖链的预处理样品。
[0732] 在上述的优选实施方案中，可以单个或组合或两个或更多个地包括各个特征。
[0733] (制备具有点样于其上的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子的方法，其用于使用板子的质谱测试)
[0734] 根据另一方面，本发明提供了制备具有点样于其上的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子的方法，其用于使用板子的质谱测试。该方法包括下列步骤：
[0735] C-1)在用于回收的板子上处理标记的糖链样品溶液的步骤；并且该步骤还任选地包括步骤(C-2)至(C-6)：
[0736] C-2)在用于混合的板子上处理来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和有机溶剂，以得到糖链吸附至固相的在有机溶剂中的浓度的步骤；
[0737] C-3)提供附着有固相载体的板子的步骤；
[0738] C-4)根据附着有固相载体的板子的相，活化附着有固相载体的板子，并洗涤附着有固相载体的板子的步骤；
[0739] C-5)添加标记的糖链样品溶液至附着有固相载体的板子，并使标记的糖链样品溶液顺应具有适合于附着有固相载体的板子的相的极性的溶剂的步骤；
[0740] C-6)通过抽吸从附着有固相载体的板子回收标记的糖链样品溶液至第二个用于回收的板子的步骤；和
[0741] 当将标记的糖链样品溶液进行MALDI-TOF MS时，该方法包括下面步骤(C-7)：
[0742] C-7)将标记的糖链样品溶液与用于质谱测试的基质混合，并将混合物点样于用于测试的板子上的步骤。
[0743] 根据优选的实施方案，提供进一步具有用于上述步骤的至少任何一个下列特征的方法：
[0744] C-1)用于回收的板子上的处理在除去标记试剂的条件下进行；
[0745] C-2)糖链吸附至固相的浓度是80-90％在有机溶剂中；
[0746] C-3)附着有固相载体的板子是多孔型的并包含适合于固相萃取的树脂或膜的表面；
[0747] C-4)当附着有固相载体的板子是正相模式时，洗涤依次用水和乙腈进行，并且当附着有固相载体的板子是反相模式时，洗涤依次用低级醇例如甲醇和水进行；
[0748] C-5)在正相模式情况下具有相反极性的溶剂是疏水有机溶剂，并且，在反相模式中具有相反极性的溶剂是亲水溶剂；
[0749] C-6)第二个用于回收的板子是多孔型的并包含适合于固相萃取的树脂或膜的表面；和
[0750] C-7)用于质谱测试的基质是2，5-二羟基苯甲酸或等价物，并且在用于质谱测试的基质上的标记的糖链样品溶液的点样混合或依次进行，并根据需要将其稀释。
[0751] 根据更优选的实施方案，提供了制备用于质谱测试的板子的方法，其进一步具有下列步骤中的至少一个步骤：
[0752] C-1)在用于回收的板子上处理标记的糖链样品溶液的步骤；
[0753] C-2)在用于混合的板子上处理来自用于回收的板子上的标记的糖链样品溶液和乙腈，以便达到80-90％的乙腈终浓度的步骤；
[0754] C-3)提供正相模式的附着有固相载体的板子的步骤；
[0755] C-4)依次用水和乙腈洗涤附着有固相载体的板子，并通过抽吸除去水和乙腈的步骤；
[0756] C-5)添加标记的糖链样品溶液到附着有固相载体的板子中，除去液体，用乙腈洗涤板子，并向其中添加1-20％乙腈的步骤；
[0757] C-6)通过抽吸从附着有固相载体的板子回收珠子至第二个用于回收的板子的步骤；和
[0758] C-7)添加在20-40％乙腈中的2，5-二羟基苯甲酸到标记的糖链样品溶液中，并混合和点样混合物的步骤。
[0759] 根据另一个优选的实施方案，糖链捕获珠子是磁性珠子，并且分离利用磁场进行而不是如上所述通过抽吸除去来进行。
[0760] 根据某一实施方案，该方法用于制备用于分析样品中的糖链的预处理样品。
[0761] 在上述的优选实施方案中，可以单个或组合或两个或更多个地包括各个特征。
[0762] (包含得自样品的糖链和糖链捕获珠子的用于制备用于反应的板子的套盒)[0763] 本发明提供包含得自样品的糖链和糖链捕获珠子的用于制备用于反应的板子的套盒，将该套盒具有用于实现用于分析样品中的糖链的本发明方法的任何操作的装置。所述套盒的实例包括含有下述的套盒：
[0764] A-1)样品；
[0765] A-2)1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)或1-丙磺酸、2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)/碳酸氢铵；
[0766] A-3)二硫苏糖醇(DTT)；
[0767] A-4)碘乙酰胺(IAA)；
[0768] A-5)胰蛋白酶；
[0769] A-6)加热组件；
[0770] A-7)PNGaseF；
[0771] B-1)糖链捕获珠子；
[0772] B-2)盐酸胍；
[0773] B-3)水；
[0774] B-4)三乙胺；
[0775] B-5)10％乙酸酐/甲醇；
[0776] B-6)盐酸；
[0777] B-7)甲醇；
[0778] B-8)棉布；
[0779] B-9)甲基-对-甲苯基三氮烯(MTT)；
[0780] B-10)二氧六环；
[0781] B-11)甲醇、NaCl溶液和水；
[0782] B-12)乙酸和乙腈，以及氨基氧基色氨酰基-精氨酸甲酯/水、盐酸O-苄基羟胺/水或邻氨基苯甲酰肼/水；
[0783] B-13)水；
[0784] C-1)用于回收的板子；
[0785] C-2)乙腈和用于混合的板子；
[0786] C-3)附着有固相载体的板子；
[0787] C-4)水和乙腈；
[0788] C-5)乙腈和1-20％乙腈；
[0789] C-6)第二个用于回收的板子；和
[0790] C-7)在20-40％乙腈中的2，5-二羟基苯甲酸。
[0791] 对于上面所示的各个特征，可以单独地包括本说明书中所述的上面优选实施方案的各个特征，或者两个或更多个所述特征可以组合。
[0792] (包含得自样品的糖链和糖链捕获珠子的用于分析的板子)
[0793] 本发明还提供与本发明的分析样品中的糖链的方法有关的制备的板子。所述板子还可以称为包含得自样品的糖链和糖链捕获珠子的用于分析的板子，其中与样品中释放的糖链结合的糖链捕获珠子被点样于板子的至少一个孔中，并且糖链已采用标记试剂例如氨基氧基色氨酰基-精氨酸甲酯/水、盐酸O-苄基羟胺/水或邻氨基苯甲酰肼/水标记。
[0794] 对于上面所示的各个特征，可以单独地包括本说明书中所述的上面优选实施方案的各个特征，或者两个或更多个所述特征可以组合。
[0795] (用于分析样品中的糖链的板子)
[0796] 本发明还提供用于分析样品中的糖链的板子，所述板子具有至少一个用于分析的室，并且至少一个室含有预先分配于其中的糖链捕获珠子。就板子而言，例如使用多孔板子例如96-孔板或过滤板。对于图1中的121(BlotGlyco H)和图8中的开始2(BlotGlyco ABC)，不是用手来手动分配糖链捕获珠子，而可以使用具有预先分配的所述糖链捕获珠子的板子。通过将板子与糖链自动分析仪器联合，可以更方便地用所述板子进行分析。
[0797] 对于上面所示的各个特征，可以单独地包括本说明书中所述的上面优选实施方案的各个特征，或者两个或更多个所述特征可以组合。
[0798] (自动糖链预处理仪器的示例性具体实施方案)
[0799] 下文中，将参照附图描述用于实现根据本发明的自动糖链预处理仪器的最佳实施方案。
[0800] 图15是显示根据本发明实施方案的自动糖链预处理仪器的平面视图，将一些部件从图中省略去了；图16是分配头的正面视图；图17是图2的横切面视图，其是沿着A-A线切开的；图18是第一个恒温槽的中央垂直横切面视图；图19是显示第一个低压回收装置和过滤板移动机构的分解透视图；图20是显示过滤板移动机构的平面视图，将一些部件从图中省略了；图21是显示过滤板移动机构中的垂直移动组件的垂直横切面视图，将一些部件从图中省略了；图22是过滤板移动机构和第二个恒温槽的透视图；图23是第二个恒温槽的中央垂直横切面视图；图24和图25是处理操作的流程图。
[0801] 通过使处理自动化，本发明使得糖链纯化处理快速高准确度地完成，并提供了在壳体1里面的分配头2，分配头2借助移动机构11沿纵向和横向移动。将分配针头10，10，10，...固定于分配头2中以便向上和向下移动。提供第一个和第二个恒温槽12和29，其装配有实现接受座的加热和冷却的装置，将接受座的上面部分用盖子盖住。提供试剂架22和用于混合的微孔板23和24。在第二个恒温槽29的前面，第一个低压回收装置26、第一个抽吸除去装置27和底部擦拭器28成排排列。在目标板接受座59的前面，配置第二个低压回收装置56和第二个抽吸除去装置57。输入到安排在壳体1里面的控制装置60的操作方法操作上述的各个组件。
[0802] 根据本发明实施方案的自动糖链预处理仪器装配有：壳体1，壳体1装配有能自由打开和关闭的盖子(没有描绘)；安装在壳体1内部并沿纵向和横向移动下述分配头的分配头移动机构11；利用升降机构同时升起和降低成排排列的多个分配针头的分配头2；装配在壳体1安装空间1a上方的第一个恒温槽12，其装配有加热和冷却容纳微孔板的接受座13的组件，并提供有用于盖住接受座13的上面部分的具有内盖19的盖子21；试剂架22和多个用于混合的微孔板23和24，将其安装于壳体1的安装空间上方；框架形式的第一个低压回收装置26，当将过滤板装在上部开口时其降低压力，并接收穿过过滤板的过滤器的液体到安装于回收装置内部的微孔板25中；框架形式的第一个抽吸除去装置27，当将过滤板装在上部开口时其降低压力并抽吸，并且除去穿过过滤器的液体；第二个恒温槽29，其装配有加热和冷却容纳过滤板的接受座30的组件，并提供有自动打开和关闭的盖子38，盖子
38用于盖住接受座30的上面部分，所有这些装置是沿纵向成排配置和排列的，并且配置和排列在壳体1安装空间1a的上方；过滤板移动机构39，其固定过滤板并将过滤板依次移动到第一个低压回收装置26、第一个抽吸除去装置27和第二个恒温槽29中的每一个；框架形式的第二个低压回收装置56，当将SPE板装在上面开口时其降低压力，并接收穿过SPE板的固相体的液体到安装在回收装置内部的微孔板55；框架形式的第二个抽吸除去装置57，当将SPE板装在上面开口时其降低压力并抽吸，并且除去穿过固相体的液体；目标板子接受座59，其容纳将已完成最终处理步骤的样品点样在表面上的目标板子58，上述装置56、
57和59沿纵向成排配置和排列，并配置和排列于壳体1的安装空间1a的上方；载有SPE板并在第二个低压回收装置和第二个抽吸除去装置之间移动SPE板的SPE板移动机构39；
安装于壳体1内部并已输入操作协议的控制装置60；具有以矩阵阵列排列的多个孔的微孔板61，当已将生物样品注射进每个孔中时将其用薄板盖住；具有多个以矩阵阵列排列的过滤器的过滤板62；和用于微量样品的SPE板(没有描绘)，其具有多个以矩阵阵列形式排列的固相体，其中根据输入控制装置60的操作协议来使仪器操作每个装置。
38用于盖住接受座30的上面部分，所有这些装置是沿纵向成排配置和排列的，并且配置和排列在壳体1安装空间1a的上方；过滤板移动机构39，其固定过滤板并将过滤板依次移动到第一个低压回收装置26、第一个抽吸除去装置27和第二个恒温槽29中的每一个；框架形式的第二个低压回收装置56，当将SPE板装在上面开口时其降低压力，并接收穿过SPE板的固相体的液体到安装在回收装置内部的微孔板55；框架形式的第二个抽吸除去装置57，当将SPE板装在上面开口时其降低压力并抽吸，并且除去穿过固相体的液体；目标板子接受座59，其容纳将已完成最终处理步骤的样品点样在表面上的目标板子58，上述装置56、
57和59沿纵向成排配置和排列，并配置和排列于壳体1的安装空间1a的上方；载有SPE板并在第二个低压回收装置和第二个抽吸除去装置之间移动SPE板的SPE板移动机构39；
安装于壳体1内部并已输入操作协议的控制装置60；具有以矩阵阵列排列的多个孔的微孔板61，当已将生物样品注射进每个孔中时将其用薄板盖住；具有多个以矩阵阵列排列的过滤器的过滤板62；和用于微量样品的SPE板(没有描绘)，其具有多个以矩阵阵列形式排列的固相体，其中根据输入控制装置60的操作协议来使仪器操作每个装置。
[0803] 此外，对于上述的构造，根据需要，可以将底部擦拭器28(其装配有在表面的平面擦拭材料并旨在用于擦除附着于过滤板底部的下表面的液体)安装在第一个抽吸除去装置27和第二个恒温槽29之间。
[0804] 此外，上述构造中的分配头移动机构11可以采用众所周知的利用马达或轨道的移动机构。
[0805] 分配头2是含有下述部件的分配头：支架3；升降架5，其沿着与分配针头平行的安装在支架3上的导杆在垂直方向上滑动；固定在支架3上的驱动马达6；升降架移动机构8，其具有连接到驱动马达6的旋转轴的滚珠螺杆7，并沿垂直方向移动升降架5；和固定在安装于升降架5的分配针头固定器9的分配针头10，10，10，...。
[0806] 根据本实施方案，将圆柱体2A垂直向下固定于分配针头2中的支架的较低部分，并且同时，将加压板2B附着在圆柱体2A的活塞杆的尖端。如果按照所述构建，当对第一个和第二个低压回收装置26和56及第一个和第二个抽吸除去装置27和57进行减压抽吸时，可以通过从上面压过滤板或SPE板来提高气密性，并因此提高效率。
[0807] 第一个恒温槽12是具有主体部件12A的第一个恒温槽，所述主体部件12A如下构造：包括有构建于由铝块形成的接受座13的内部中心的筒式加热器14，以及还在接受座13的较低部分配置帕耳帖元件15和散热器16，其中主体部件12A中的接受座13的上面部分被盖子21盖住，盖子21具有附着在内侧的硅酮片，并且具有在内部中心固定的筒式加热器18的内盖19，内盖是经弹簧20弹性支持的。此外，对于第一个恒温槽12来讲，虽然在本实施方案中盖子17的打开和关闭是手动操作的，但是所述打开和关闭还可以自动操作。此外，当微孔板61的铝板61a被分配头10，10，10，...穿破时，硅酮片17用于阻止内部样品的排出。
[0808] 过滤板移动机构39是如下移动机构，其在沿支撑板40的长度方向的两端安装有滑轮41和42，所述支撑板40沿壳体1的纵向竖立安装，所述滑轮41和42之一由步进马达43旋转驱动，其中水平移动板45连接至悬挂于两个滑轮41和42之间并且旋转的带子44上，垂直移动组件46安装于水平移动板45上，并垂直移动组件46通过垂直移动杆51和滚珠螺杆53来上升或下降，所述垂直移动杆51支持位于上部末端的用于容纳内部框架47的接受架48，并且其沿垂直安装于支架49内部的导向装置50在垂直方向上滑动，并且所述滚珠螺杆53连接至固定于支架49内部的马达52的旋转轴52a，并且其中所述机构具有连接至垂直移动杆54的升降杆51。此外，将用于保持密封的垫圈47a和48a安装于内部框架
47和接受架48之间。
47和接受架48之间。
[0809] SPE板移动机构39具有与过滤板移动机构相同的构造，并因此，将其解释略去了。
[0810] 第二个恒温槽29是具有主体部件29A的第二个恒温槽，主体部件29A如下构建：包括有构建于由铝块形成的接受座30的内部中心的筒式加热器31，以及安装的从内部中心穿至表面的空气循环通道32，并且在接受座30的较低部分配置帕耳帖元件33和散热器
34，其中在主体部件29A中的接受座30的上面部分和位于其上的过滤板之间提供与上述空气循环通道32连通的空气循环通道35，并且还提供管道36和排风机37以便使排出过滤板的空气再次流进接受座30以藉此循环起来，并且主体部件29A中的接受座30的上面部分是用盖子38盖住的。此外，在第二个恒温槽29中，盖子38是可以自动打和开关闭的。
34，其中在主体部件29A中的接受座30的上面部分和位于其上的过滤板之间提供与上述空气循环通道32连通的空气循环通道35，并且还提供管道36和排风机37以便使排出过滤板的空气再次流进接受座30以藉此循环起来，并且主体部件29A中的接受座30的上面部分是用盖子38盖住的。此外，在第二个恒温槽29中，盖子38是可以自动打和开关闭的。
[0811] 接下来，将与上述实施方案相关的自动糖链预处理仪器的处理操作根据图24和图25中所示的流程图进行解释。
[0812] <下文中，相应的步骤编号还将被描述。>
[0813] 1.将壳体1的盖子打开，将第一个恒温槽12打开，并将生物样品注射进每个孔时，将用铝板盖住的微孔板61放置在接受座13上。
[0814] (到此处的过程大约对应于步骤(A-1)。)
[0815] 2.将分配头2移动以从试剂架22的容器中抽吸15μl 0.33M碳酸氢铵，并将其移动以便实现分配至微孔板61的每个孔。
[0816] 3.按照2中的相同方式，分配30μl 0.4％的增溶剂。
[0817] 4.将第一个恒温槽12关闭并于37℃加热10分钟。
[0818] (到此处的过程大约对应于步骤(A-2)。)
[0819] 5.打开盖子，并分配5μl(CV(变异系数)5％)120mM的二硫苏糖醇(DTT)。
[0820] 6.将盖子关闭，并将第一个恒温槽在60℃加热30分钟。
[0821] 7.将盖子打开，并将第一个恒温槽在室温冷却。
[0822] (到此处的过程大约对应于步骤(A-3)。)
[0823] 8.将123mM碘乙酰胺(IAA)以10μl(CV 5％)的量进行分配。
[0824] 9.将第一个恒温槽在室温于黑暗中冷却60分钟。
[0825] (到此处的过程大约对应于步骤(A-4)。)
[0826] 10.将胰蛋白酶(400U)以5μl的量分配至微孔板61的各孔，所述微孔板61再次被置于盖子打开的第一个恒温槽12中。
[0827] 11.将盖子关闭，并将第一个恒温槽在37℃加热60分钟。
[0828] 12.再将第一个恒温槽在90℃加热5分钟。
[0829] 13.将盖子打开，并将该恒温槽在室温冷却。
[0830] (到此处的过程大约对应于步骤(A-5)。)
[0831] 14.将肽-N-糖苷酶F和肽-N4-(乙酰基-β-葡糖胺基)-天冬酰胺酰胺酶(PNGaseF)(2U)以5μl的量分配至微孔板61的各孔。
[0832] 15.将盖子关闭，并将第一个恒温槽在37℃加热12小时。
[0833] (到此处的过程大约对应于步骤(A-6)。)
[0834] 16.将1M乙酸(AcOH)以200μl的量分配至含有聚合物珠子的过滤板62的各孔，过滤板62安置在抽吸除去装置27中。
[0835] 17.通过抽吸除去乙酸。
[0836] (到此处的过程大约对应于步骤(B-1)。)
[0837] 18.将50％的ACN以300μl的量进行分配。
[0838] 19.通过抽吸除去乙腈。
[0839] 20.将ACN以300μl的量进行分配。
[0840] 21.通过抽吸除去ACN。
[0841] (到此处的过程大约对应于步骤(B-2，3)。)
[0842] 22.将含有聚合物珠子的过滤板62移至底部擦拭器38的位置，并完成底部擦拭。将过滤板移至第二个恒温槽29(恒温槽自动打开)。
[0843] 23.将第二个恒温槽29打开，并将经酶处理的样品以20μl的量分配至含有聚合物珠子的过滤板62，过滤板62置于接受座30上。
[0844] (到此处的过程大约对应于步骤(B-4)。)
[0845] 24.将2％AcOH/ACN以200μl的量进行分配。
[0846] 25.将盖子关闭，并将第二个恒温槽在80℃加热60分钟。
[0847] 26.将6M盐酸胍以300μl的量进行分配。
[0848] 27.在盖子打开情况下，将第二个恒温槽在室温冷却10分钟。
[0849] 28.将过滤板62移至抽吸除去装置27。
[0850] 29.通过抽吸除去盐酸胍。
[0851] (到此处的过程大约对应于步骤(B-5)。)
[0852] 30.将6M盐酸胍以300μl的量进行分配。
[0853] 31.通过抽吸除去盐酸胍。
[0854] 32.将水以300μl的量进行分配。
[0855] 33.通过抽吸除去水。
[0856] 34.将10M盐酸以300μl的量进行分配。
[0857] 35.通过抽吸除去盐酸。
[0858] (到此处的过程大约对应于步骤(B-6)。)
[0859] 36.将MeOH以300μl的量进行分配。
[0860] 37.通过抽吸除去MeOH。
[0861] (到此处的过程大约对应于步骤(B-7)。)
[0862] 38.将过滤板62移至底部擦拭器28的位置，并完成底部擦拭。
[0863] 39.将过滤板62移至第二个恒温槽29。
[0864] (到此处的过程大约对应于步骤(B-8)。)
[0865] 40.将还原剂以200μl的量进行分配。
[0866] 41.避光，并将第二个恒温槽在室温冷却30分钟。
[0867] 42.将过滤板62移至抽吸除去装置27。
[0868] 43.通过抽吸除去还原剂。
[0869] 44.将MeOH以300μl的量进行分配。
[0870] 45.通过抽吸除去MeOH。
[0871] 46.将过滤板62移至底部擦拭器28的位置，并完成底部擦拭。
[0872] 47.将水以300μl的量进行分配。
[0873] 48.通过抽吸除去水。
[0874] 49.将ACN以300μl的量进行分配。
[0875] 50.通过抽吸除去ACN。
[0876] 51.进行底部擦拭。
[0877] 52.将过滤板62移至第二个恒温槽29。
[0878] 53.将在DMSO/ACN中的100mM MTT以100μl的量进行分配。
[0879] 54.将盖子关闭，并将第二个恒温槽在60℃加热60分钟。
[0880] (到此处的过程大约对应于步骤(B-9)。)
[0881] 55.将过滤板62移至抽吸除去装置27。
[0882] 56.通过抽吸除去MTT。
[0883] 57.将ACN以300μl的量进行分配。
[0884] 50.通过抽吸除去ACN。
[0885] (到此处的过程大约对应于步骤(B-10)。)
[0886] 59.将过滤板62移至底部擦拭器28的位置，并完成底部擦拭。
[0887] 60.将过滤板62移至抽吸除去装置27。
[0888] 61.将水以300μl的量进行分配。
[0889] (到此处的过程大约对应于步骤(B-11)。)
[0890] 62.通过抽吸除去水。
[0891] 63.将50mM DTT以50μl的量进行分配。
[0892] 64.将过滤板62移至第二个恒温槽29。
[0893] 65.将盖子关闭，并第二个恒温槽在60℃加热5分钟。
[0894] 66.将盖子打开，并将第二个恒温槽在室温冷却15分钟。
[0895] 67.将过滤板62移至低压回收装置26。
[0896] 68.降低压力，并将样品抽至微孔板25中并回收。
[0897] (到此处的过程大约对应于步骤(B-12)的前半部分。)
[0898] 69.将样品冷却至10℃，并完成处理。
[0899] 此后，根据样品的量将处理方法分开。
[0900] [当样品是充足的时]
[0901] 70.将微孔板25中的样品分配至用于混合的微孔板24。
[0902] 71.将MALDI基质以2μl的量分配至用于混合的微孔板24。
[0903] 72.将用于混合的微孔板24中的样品以2μl的量点样于目标板接受座59上的目标板58。
[0904] (到此处的过程大约对应于步骤(B-12)的后半部分。)
[0905] 73.结束。
[0906] (到此处的过程大约对应于步骤(B-13)。)
[0907] [当样品是微量的时]
[0908] 74.将微孔板25中的样品以20μl的量分配至用于混合的微孔板23。
[0909] 75.将ACN以400μl的量分配至用于混合的微孔板23。
[0910] 76.将水以200μl的量分配至位于抽吸除去装置57的SPE板。
[0911] 77.通过抽吸除去水。
[0912] 78.将ACN以200μl的量分配至SPE板。
[0913] 79.通过抽吸除去ACN。
[0914] 80.将用于混合的微孔板23中的样品以420μl的量分配至SPE板。
[0915] 81.通过抽吸除去样品。
[0916] 82.将95％ACN以200μl的量分配至SPE板。
[0917] 83.通过抽吸除去ACN。
[0918] 84.将10％ACN以20μl的量分配至SPE板。
[0919] 85.将SPE板移至低压回收装置56。
[0920] 86.降低压力，并将样品抽至微孔板55中并回收。
[0921] 87.将微孔板55中的样品以2μl的量分配至用于混合的微孔板24。
[0922] 88.将MALDI基质以2μl的量分配至用于混合的微孔板24。
[0923] 89.将用于混合的微孔板24中的样品以2μl的量点样于目标板接受座59上的目标板58。
[0924] 90.结束。
[0925] C)当利用板子进行质谱测试时，进行制备具有点样于其上的捕获的糖链样品的用于质谱测试的板子的过程。
[0926] 91.在用于回收的板子上处理通过直到73.的过程获得的标记的糖链样品溶液的过程；并任选地进行92.-93.。
[0927] 92.将从用于回收的板子得到的标记的糖链样品溶液和有机溶剂在用于混合的板子上进行处理，以得到糖链吸附至固相的有机溶剂的浓度。
[0928] 93.提供附着有固相载体的板子。
[0929] 94.根据附着有固相载体的板子的相，将附着有固相载体的板子活化，并洗涤板子。
[0930] 95.将标记的糖链样品溶液添加到附着有固相载体的板子，并使样品溶液顺应具有适合于附着有固相载体的板子的相的极性的溶剂。
[0931] 96.通过抽吸将标记的糖链样品溶液从附着有固相载体的板子回收至第二个用于回收的板子。
[0932] 当将标记的糖链样品溶液进行MALDI-TOF MS时，进行下述过程。
[0933] 97.将标记的糖链样品溶液与用于质谱测试的基质混合，并将混合物点样在用于测试的板子上。
[0934] 98.进行待测试糖链的分析。所述分析可以如本说明书中所述采用任何已知的方法完成。
[0935] 将本发明中引用的参考文献例如科学论文、专利和专利申请以其全部内容引入作为参考，就如同它们各自被在本文中详述。
[0936] 如上面所讨论，已用本发明的优选实施方案解释说明本发明，但是并不意欲将本发明解释为限制于所述实施方案。应该理解，仅根据权利要求书的范围来明确解释本发明的范围。从本发明优选实施方案的具体描述，本领域技术人员将理解根据本发明的详述和普通技术知识可以得到本发明的等价范围。应该理解已将在本说明书中引用的专利、专利申请和文献的公开内容明确引入本说明书中作为参考，就如同将所述公开内容本身在本说明书中进行具体描述。实施例
[0937] 下文中，将通过实施例更详细地描述本发明，但是并不意欲将本发明限制于下面的实施例中。
[0938] (实施例1：BlotGlycoABCTM：用于快速大规模临床糖组学的整合型糖印迹技术)[0939] 将根据需要使用下面的简称。
[0940] CDG：先天性糖基化病
[0941] DTT：二硫苏糖醇
[0942] HCC：肝细胞癌
[0943] HPLC：高效液相色谱
[0944] MALDI-TOF：基质辅助激光解析电离-飞行时间
[0945] (试验程序)
[0946] (材料)
[0947] 本实施例的临床研究被北海岛大学医院的伦理委员会(EthicsCommittee of Hokkaido University Hospital)批准。已对所有血清供者进行了解释并得到了所有血清供者的同意。肽-N-糖苷酶F(PNGase F)购买自罗氏(Roche)(曼海姆，德国)。3-甲基-1-对-甲苯基三氮烯(MTT)、8M硼烷-吡啶络合物和二硫苏糖醇(DTT)购买自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，Inc.)(圣路易斯，MO)。如另外如描述的那样制备TMBlotGlycoABC 。其现在已可商业购自Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.(东京，日本)。除非另外说明，其他试剂和溶剂获自Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.(东京，日本)。CDG患者的血清由Burnham医学研究所(Burnham Institute for Medical Research)(La Jolla，CA)的H.H.Freeze教授友好提供。
[0948] (从人血清释放N-聚糖)
[0949] 根据本发明人的团队以前报道的条件(Kita，Y.，Miura，Y.，Furukawa，J.I.，Nakano，M.，Shinohara，Y.，Ohno，M.，Takimoto，A.，和Nishimura，S.I.(2007)Mol.Cell.Proteomics 6，1437-1445)来处理人全血血清以释放还原型N-聚糖。简单地讲，将10μl血清等分试样在含有表面活性剂和10mM
[0950] DTT的83mM碳酸氢铵中6倍稀释。在60℃孵育混合物30分钟后，将1体积(10μl)的123mM碘乙酰胺加入其中，并将混合物在黑暗中于室温孵育1小时。将400单位的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)添加到所述溶液中，并将混合物在37℃孵育1小时。将胰蛋白酶加热灭活，然后将2单位PNGaseF添加到混合物中。将得到的混合物在37℃孵育过夜。利TM用下述的BlotGlycoABC 子将消化混合物中释放的N-聚糖(中性聚糖和唾液酸聚聚糖(sialylglycans))全部直接用于糖印迹。
[0951] (通过BlotGlycoABCTM的糖印迹的常规方法)
[0952] 将40μl的BlotGlycoABCTM珠子(50％混悬液)分配在过滤板MultiScreen Solvinert(Millipore)的孔中。利用减压歧管依次用1M乙酸(AcOH)水溶液、50％乙腈水溶液和乙腈(ACN)冲洗所述珠子。将20μl用胰蛋白酶和PNGase F消化的全血清(相当于2.5μl血清)转移至孔中，然后将200μl 2％AcOH的乙腈溶液添加到其中。在没有使用氮气流情况下将板子在TurboVap 96浓缩器(Caliper Life Sciences Inc，Hopkinton，MA)中于80℃孵育并干燥。这通常需要30min。用300μl 6M的盐酸胍(在50mM碳酸氢铵中)冲洗板子3次，然后，用300μl水冲洗3次。在珠子上甲酯化后(Miura，Y.，Shinohara，Y.，Furukawa，J.I.，Nagahori，N.和Nishimura，S.I.(2007)Chem.Eur.J.13，4797-4804)，将珠子依次用300μl的10mM HCl、50％乙腈水溶液和乙腈冲洗。将孔与100μl 100mM 3-甲基-1-对-甲苯基三氮烯的二甲基亚砜-ACN(1∶1)溶液一起在60℃孵育60min。利用减压除去溶液，然后，将珠子依次用ACN、水和MeOH冲洗(3×300μl)。根据先前报道的方法(Lohse，A.，Martins，R.，Jorgensen，M.R.和Hindsgaul，O.(2006)固相寡糖标记(SPOT)：
对糖脂衍生结构的确认(Solid-phase oligosaccharide tagging(SPOT)：Validation onglycolipid-derived structures)。Angew.Chem.Int.Ed.Engl.45，4167-4172)通过与还原剂(0.8M硼烷-吡啶)一起孵育来稳定珠子上的寡糖和荧光探针之间的腙键。在黑暗中于室温将所述还原进行30分钟。除去混合物后，将珠子依次用MeOH、ACN和水(3×300μl)冲洗。在孔中，添加50μl 50mMDTT(在5mM碳酸氢铵中)，将板子在60℃孵育5min，并在室温进一步孵育15min。从DTT溶液中的珠子收集如上述处理的浓缩的N-聚糖。
对糖脂衍生结构的确认(Solid-phase oligosaccharide tagging(SPOT)：Validation onglycolipid-derived structures)。Angew.Chem.Int.Ed.Engl.45，4167-4172)通过与还原剂(0.8M硼烷-吡啶)一起孵育来稳定珠子上的寡糖和荧光探针之间的腙键。在黑暗中于室温将所述还原进行30分钟。除去混合物后，将珠子依次用MeOH、ACN和水(3×300μl)冲洗。在孔中，添加50μl 50mMDTT(在5mM碳酸氢铵中)，将板子在60℃孵育5min，并在室温进一步孵育15min。从DTT溶液中的珠子收集如上述处理的浓缩的N-聚糖。
[0953] (质谱测定)
[0954] 将在DTT溶液中的收集的N-聚糖(0.5μl)直接置于AnchorChip400/384(Bruker Daltonics，德国)上，与等体积的基质溶液(DHB和DHB钠盐(分别是10mg/ml的30％ACN溶液)的9∶1混合物)混合在一起，并减压干燥以得到被分析物晶体。利用UltraFlex II TOF/TOF(BrukerDaltonics)在反射器正离子模式中代表性地总结100×5轰击(shots)来获得质谱。
[0955] (统计学分析)
[0956] 在本研究中，利用称作FlexAnalysis的第3版软件(Bruker Daltonics，德国)来选择MALDI-TOF MS谱中最大的44个N-聚糖峰。除非另外指出，利用那些最初用MATLAB(第7.4版)(The Mathworks，Inc.)语言开发的统计学工具包来进行所有统计学分析。
[0957] (CDG情况)
[0958] 将各亚型进行重复测试(n＝6)。原因在于对于各个样品来讲，仅一个是可用于所述亚型的。将各个聚糖的同位素面积用已知量的内标进行标准化。为了鉴别可用于区别CDG-I亚型和正常对照的N-聚糖，本发明人利用期望值最大化的算法进行分类。所述算法分离最大值评价(maximumevaluation)方法的重复步骤中的各种数据分布的混合(Redner，R.A.，和Walker，H.F.(1984)Soc.Indust.Appl.Math.Rev.26，195-239)。利用Spotfire DecisionSite(第9.0版Somerville，MA)进行临床前组分分析(PCA)。本发明人标绘了(plotted)最初的两个主要组分。
[0959] (HCC情况)
[0960] 将用于计算的截止线调整为总面积的0.3％。利用student t校准来计算疾病情况与正常情况的统计学差异。如果P＜0.001，认为差异是统计学显著的。为了识别用于最佳地将血清在疾病情况和正常情况两种情况之间进行分类的基本特征，本发明人采用连续渐变选择算法(successivelyprogressive selection algorism)。根据k-近侧鉴别器(k-proximaldiscriminator)(k＝3)的one extract方法(LOO)的误差率，该算法依次选择N-聚糖峰的更好组合。
[0961] (结果)
[0962] (基于BlotGlycoABCTM的临床糖组学的主要说明)
[0963] 本说明书中描述的新方法能提供不需要特殊训练的非常简单和方便的用于复合物glyco-adelphus浓缩分析的方法(图10a)。本发明人设计N-(2-氨基苯甲酰基)半胱氨酸酰肼(ABCh)以便建立“一体化(all in one)”方法，将adelphus与硫丙基琼脂糖6BTM结合，并用它来得到稳定的酰肼-官能化的聚合物支持体(即，BlotGlycoABC 珠子)(图TM
10b，参照对BlotGlycoABC 珠子的合成和鉴定后的说明以及下面的流程1)。
10b，参照对BlotGlycoABC 珠子的合成和鉴定后的说明以及下面的流程1)。
[0964] (表2)ABCh(N-(2-氨基苯甲酰基)半胱氨酸酰肼)的合成途径和BlotGlycoABCTM珠子的制备。
[0965] [表2]
[0966] 补充的流程1
[0967]
[0968] ABCh(N-(2-氨基苯甲酰基)半胱氨酸酰肼)的合成途径和BlotGlycoABCTM珠子的制备。
[0969] 使酰肼基团与一般生物样品(除具有还原半缩醛末端的聚糖外)中非常少见的醛TM基或酮基反应。BlotGlycoABC 珠子和聚糖之间的腙键形成是可逆的，并且其能够放出部分还原糖。此外，可以将其还原以转化成稳定的C-N键(Lohse，A.，Martins，R.，Jorgensen，M.R.和Hindsgaul，O.(2006)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.45，4167-4172)。该化学性质涉及各种试剂(例如二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺、表面活性剂等)。即使在制备蛋白组学样品中使用的各种的胺和试剂存在下，其也适合于从复杂生物材料中富集聚糖。通过本发明人的方法发生一般N键型寡糖的定量结合，而一点也不损失唾液酸。结合硫丙基琼脂糖6B和ABCh探针的二硫键使得通过洗脱缓冲液中的DTT处理能够实现富集的N-聚糖的定量收集。
收集的样品含有中性和酸性的聚糖，并可以将其立即用于下面的定量分析，所述定量分析利用一些HPLC和MS方法。
收集的样品含有中性和酸性的聚糖，并可以将其立即用于下面的定量分析，所述定量分析利用一些HPLC和MS方法。
[0970] 尽管可通过上述的方法收集完整的中性聚糖和唾液酸化的聚糖，但是在普通MS分析中由于其负电荷，唾液酸化的寡糖发生分解是已知的。因为唾液酸的稳定性对于唾液酸寡糖的定量MS分析是必需的，所以将唾液酸残基被3-甲基-1-对-甲苯基三氮烯(MTT)TM简单O-甲基酯化引入本方法中。在通过BlotGlycoABC 珠子的稳定腙键的介入的完整N-聚糖的捕获中，进行唾液酸的珠子上甲基酯化和珠子上腙键的还原，以便在MALDI-TOF的正反射器模式中使中性糖形和酸性糖形高可信性和高重性地进行质量测试。
[0971] 为了举例说明新方法，本发明人提供人血清(2.5μl)用于使用BlotGlycoABCTM珠子的最佳方法中。将相当于25nl“能直接分析的”血清的样品溶液部分直接置于用于MALDI-TOF分析(正反射器模式)的目标板上。本发明人定量了44种N-聚糖(图11A和表3)。将44种衍生自人血清的N-聚糖设定为本研究的目标。峰33是添加的用于定量的内标。
在简写栏中显示的组分注解和推论的结构是通过GlycoSuite在线数据库的蛋白质组系统(roteome Systems)(http://glycosuite.proteomesystems.com/glycosuite/glycodb)得到的。
在简写栏中显示的组分注解和推论的结构是通过GlycoSuite在线数据库的蛋白质组系统(roteome Systems)(http://glycosuite.proteomesystems.com/glycosuite/glycodb)得到的。
[0972] [表3]
[0973]
[0974] 这些聚糖可以在所有的样品中检测到，并且将它们的量用作为内标的第33号峰(尖峰信号，也就是说，A2酰胺突然升高)标准化。一旦N-聚糖可应用全血清糖基蛋白质的PNGase F处理(Kita，Y.，Miura，Y.，Furukawa，J.I.，Nakano，M.，Shinohara，Y.，Ohno，M.，Takimoto，A.和Nishimura，S.-I.(2007)Mol.Cell.Proteomics 6，1437-1445。)，通过TMBlotGlycoABC 珠子和MALDI-TOF MS的惯用操作来鉴别全部N-聚糖的分布图(profile)仅需要不到4小时。应该注意该固相方案是单纯自动化工作流程中“一体化”糖印迹技术TM
的第一个实例。本发明人现在正研究和开发适合于使用BlotGlycoABC 的自动化糖印迹的样品处理机器。事实上，通过与为人血清应用的优化的流程图下的标准多孔过滤板形式组TM
合应用，可以将基于BlotGlycoABC 的“一体化”糖印迹方法初步转化成为自动化平台(图
8)。通过同时完成相同的人血清消化物来评价自动化方法的效率(图14)。此外，通过良好的重现性来确证其精确的可信度(图4)。
的第一个实例。本发明人现在正研究和开发适合于使用BlotGlycoABC 的自动化糖印迹的样品处理机器。事实上，通过与为人血清应用的优化的流程图下的标准多孔过滤板形式组TM
合应用，可以将基于BlotGlycoABC 的“一体化”糖印迹方法初步转化成为自动化平台(图
8)。通过同时完成相同的人血清消化物来评价自动化方法的效率(图14)。此外，通过良好的重现性来确证其精确的可信度(图4)。
[0975] (表4)CV；波动计数
[0976] 应该指出在自动化糖印迹中腙键没有被还原，这是因为通过酸处理收集还原糖模式的寡糖，并且比较表3和4的质量，产生-2Da的质量差。
[0977] [表4]
[0978]
[0979] (检测先天性糖基化缺乏(CDG)的变化)
[0980] 对于先天性变化和获得性变化引起的异常蛋白糖基化的快速鉴定来说，全血清蛋白中的N-聚糖的检测和N-聚糖分布图的确定是非常有用的。本发明人测试本发明人用于从患有先天性糖基化缺乏(CDG)的个体得到的血清的技术，CDG是遗传性人类疾病中的少见病(Mandato，C.，Brive，L.，Miura，Y.，Davis，J.A.，Di Cosmo，N.，Lucariello，S.，Pagliardini，S.，Seo，N.S.，Parenti，G.，Vecchione，R.，Freeze，H.H.和Vajro，P.(2006)PediatricRes.59，293-298)。迄今为止已鉴定了超过19种的CDG亚型(Freeze，H.H.和Aebi，M.(2005)Curr.Opin.Struc.Biol.15，490-498)。所述CDG是由N-聚糖前体的生物合成或特定型N-聚糖集合(assembly)或由排斥引起的所述两者任一者的缺乏(1型CDG)或与蛋白质结合的糖链的非成熟加工(2型CDG)引起的。本发明人的糖印迹技术基于TMBlotGlycoABC 和MALDI-TOF MS，但是本发明人能检测全血清糖蛋白中的异常糖基化模式。
将各个分析重复6次(n＝6)，并用固定量的为内标的A2酰胺来标准化MALDI-TOF MS谱中的峰面积。如所预期，对于2型CDG(CDG-II)个体，本发明人观察到异常N-聚糖分布图(例如一些未成熟的小尺寸的N-聚糖链)，略去糖基化缺乏的具体步骤(图11B，iv-vii的升高)[CDG-I和CDG-II的未分类的亚类]。另一方面，从1型CDG(CDG-I)个体的血清富集的N-聚糖显示与正常分析物非常类似的N-聚糖分布图(图11B ii和iii)。然而，结果还显示与正常供体(1011±69μM)相比，总N-聚糖显著减少(对于CDG-Ia个体和CDG 1b个体分别是575±46μM和692±41μM；并参照表4)。上述清晰地表明CDG-I的缺乏丢失整个聚糖链，达到前体的生物合成是不可能的程度。
将各个分析重复6次(n＝6)，并用固定量的为内标的A2酰胺来标准化MALDI-TOF MS谱中的峰面积。如所预期，对于2型CDG(CDG-II)个体，本发明人观察到异常N-聚糖分布图(例如一些未成熟的小尺寸的N-聚糖链)，略去糖基化缺乏的具体步骤(图11B，iv-vii的升高)[CDG-I和CDG-II的未分类的亚类]。另一方面，从1型CDG(CDG-I)个体的血清富集的N-聚糖显示与正常分析物非常类似的N-聚糖分布图(图11B ii和iii)。然而，结果还显示与正常供体(1011±69μM)相比，总N-聚糖显著减少(对于CDG-Ia个体和CDG 1b个体分别是575±46μM和692±41μM；并参照表4)。上述清晰地表明CDG-I的缺乏丢失整个聚糖链，达到前体的生物合成是不可能的程度。
[0981] 在CDG 1个体的诊断标记中的定量糖组学的优点是很明显的。原因是由检测到的42种N-聚糖的量形成的数据分布可以用于与正常血清个体进行简单区分(图11C，在左侧的组和在中心的组)。结果表明N-聚糖的量的配对组合证实CDG-I个体、CDG-Ia个体和CDG-Ib个体之间的诊断区别(图11C，在右侧的组)。此外，本发明人使用获得的全N-聚糖分布图的所有CDG子系统的主要组分分析(PCA)，以解释复杂的多谱图数据组。最初的两个主要组分清晰地区分含有正常供体的CDG子系统。从所述结果已证实，通过全血清的N-聚糖组的分布图其能够与健康对照区分，并且CDG的特定子系统能够与CDG的其它子系统进行区别。
[0982] (肝细胞癌的诊断区别)
[0983] 为了证实本方法在大规模临床糖组学中的弹性，本发明人将本发明人的技术用于TM多个患有肝细胞癌(HCC)的个体的血清。如所证实的，基于BlotGlycoABC 和MALDI-TOF
3
分析的糖印迹方法的应用能够迅速和定量地测定10 个人血清样品的N-聚糖分布图(83位个体和20位正常对照)。为了通过鉴定基本特征来最恰当地将血清归类于两个相对类别(疾病类别和正常类别)，本发明人采用连续递进选择的算法，其根据k近侧鉴别器的one extract方法(LOO)的误差率(k＝3)，来选择更好的N-聚糖峰组合(图12a和12b)。当本发明人选择显示疾病和对照之间显著差异(双侧t校准且P＜0.001)的获得峰之间的全部两个峰的比率时，所述算法选择以100％准确度区分HCC样品和正常对照(图12a)的TM
N-聚糖的量的比率(图12c)。因此，已证实基于BlotGlycoABC 的全血清N-聚糖分布图的区别为先前难于早期诊断或辨别的疾病提供了简单的非侵袭性诊断工具。
3
分析的糖印迹方法的应用能够迅速和定量地测定10 个人血清样品的N-聚糖分布图(83位个体和20位正常对照)。为了通过鉴定基本特征来最恰当地将血清归类于两个相对类别(疾病类别和正常类别)，本发明人采用连续递进选择的算法，其根据k近侧鉴别器的one extract方法(LOO)的误差率(k＝3)，来选择更好的N-聚糖峰组合(图12a和12b)。当本发明人选择显示疾病和对照之间显著差异(双侧t校准且P＜0.001)的获得峰之间的全部两个峰的比率时，所述算法选择以100％准确度区分HCC样品和正常对照(图12a)的TM
N-聚糖的量的比率(图12c)。因此，已证实基于BlotGlycoABC 的全血清N-聚糖分布图的区别为先前难于早期诊断或辨别的疾病提供了简单的非侵袭性诊断工具。
[0984] (应用于细胞糖组学)
[0985] 除血清之外，细胞和组织是临床糖组学中重要的生物材料。本发明人将上述建立的纯化策略用于培养细胞，以研究全细胞的N-聚糖形式。培养人前列腺癌的PC-3细胞和TM正常人前列腺上皮PrEC细胞，并将它们的全蛋白提取物用于BlotGlycoABC 珠子处理。用
6
与血清N-聚糖分布图类似的方式，利用少量的原料(5-8×10 个细胞)将全细胞聚糖形式进行阐明。根据结果成功检测各个细胞种类独特的N-聚糖分布图，并且已表明上述所显示的本发明人用于血清糖组学的方法同样适合于细胞糖组学(图13)。细胞糖组学/组织糖组学的优化能使通用策略适用于其它高通量的特征。
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与血清N-聚糖分布图类似的方式，利用少量的原料(5-8×10 个细胞)将全细胞聚糖形式进行阐明。根据结果成功检测各个细胞种类独特的N-聚糖分布图，并且已表明上述所显示的本发明人用于血清糖组学的方法同样适合于细胞糖组学(图13)。细胞糖组学/组织糖组学的优化能使通用策略适用于其它高通量的特征。
[0986] (BlotGlycoABCTM珠子的合成和鉴定)
[0987] 常规方法和材料：所有市售的原料和溶剂是试剂级的，并将它们按购买来的状况使用。2-氨基苯甲酸盐、1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)和二盐酸L-胱氨酸二甲酯购自Sigma-Aldrich Chemical。N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺单盐酸盐(WSC)购自TCI(日本)。硫丙基琼脂糖6B购自GE医疗保健生物科学公司(GE HealthcareBiosciences)。所有其它化学物质是超高纯度级别的并购自Wako Pure Chemicals Co.，
1
Ltd.(Japan)。采用DMSO作为溶剂，用Bruker DPX-600波谱仪在600MHz测试 H NMR谱和
13
C NMR谱。除非另外地说明，所有其它的化学反应在氮气气氛下无水溶剂中避光条件下进行。TLC在Merck预涂板(20×20cm，0.25mm的薄层厚度和硅胶60F254)上进行；通过喷
90∶5∶5(v/v/v)的甲醇：对-茴香醛：浓硫酸溶液并将其在180℃加热大约30秒来显现斑点，或者当紫外线适用时，在紫外线线下(256nm或365nm)显现斑点。将有机提取物经无水MgSO4干燥并在低于50℃下减压浓缩溶液。
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Ltd.(Japan)。采用DMSO作为溶剂，用Bruker DPX-600波谱仪在600MHz测试 H NMR谱和
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C NMR谱。除非另外地说明，所有其它的化学反应在氮气气氛下无水溶剂中避光条件下进行。TLC在Merck预涂板(20×20cm，0.25mm的薄层厚度和硅胶60F254)上进行；通过喷
90∶5∶5(v/v/v)的甲醇：对-茴香醛：浓硫酸溶液并将其在180℃加热大约30秒来显现斑点，或者当紫外线适用时，在紫外线线下(256nm或365nm)显现斑点。将有机提取物经无水MgSO4干燥并在低于50℃下减压浓缩溶液。
[0988] N，N’-(2-氨基苯甲酰基)胱氨酸二甲酯3：将2-氨基苯甲酸(8.22g(60.0mmol))溶解于圆底烧瓶中的60ml四氢呋喃里，并将混合物在冰浴中冷却。将HOBt(9.18g，26.9mmol)、二盐酸L-胱氨酸二甲酯(10.23g，30.0mmol)和三乙胺(8.37mL)添加到溶液中。添加WSC(11.49g，60.0mmol)到溶液中，将溶液在冰浴上搅拌15分钟，并将混合物在室温搅拌过夜。反应完全后，经蒸发除去溶剂，并将残留物溶解于150ml氯仿中。将氯仿溶液依次用饱和NaHCO3水溶液和饱和NaCl水溶液洗涤，将有机相用Na2SO4脱水，并经蒸发除去溶剂，得到黄色粉末(16.4g，32.4mmol，108％)。
[0989] 1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：3.32(d，J＝5.3Hz，2H，CH2)，3.77(s，3H，CH3)，5.03(dd，J＝5.3，12.6Hz，1H，CH)，3.32(d，J＝5.3Hz，2H，CH2)，6.62(t，J＝7.3Hz，1H，Ph)，6.69(d，J＝8.1Hz，1H，Ph)，6.98(bd，J＝6.6Hz，1H，NH)，7.20(t，J＝7.2Hz，1H，Ph)，7.43(d，J＝8.0Hz，1H，Ph)。
[0990] N，N’-(2-氨基苯甲酰基)胱氨酸酰肼5：将肼一水合物(31.6g，631mmol)添加到320mL甲醇溶液中，并将混合物在室温搅拌过夜以得到沉淀物。经过滤收集沉淀物并用320mL甲醇冲洗。将残留物减压干燥以得到纯的化合物5(10.8g，21.3mmol，67.4％)。
[0991] N-(2-氨基苯甲酰基)胱氨酸酰肼6：将1M盐酸(14.22mL)添加到96mL乙腈-水溶液(50％，v/v)中，并将溶液搅拌。通过添加1M碳酸氢铵的水溶液(17.06mL)调节溶剂的pH至7.0，然后加入1M二硫苏糖醇(DTT)的水溶液(4.74mL)，并将混合物在室温搅拌2小时。经TLC检测反应完全后，用乙酸乙酯萃取溶液。将有机相用Na2SO4脱水，并经蒸发1
除去溶剂，得到白色粉末6(2.4g，9.44mmol，定量)。H NMR(500MHz，DMSO)δ：2.36(bs，1H，SH)，2.84(m，2H，CH2)，4.26(bs，2H，NHNH2)，4.45(dd，J＝2.1，8.0Hz，1H，CH)，6.36(bs，2H，PhNH2)，6.52(t，J＝7.5Hz，1H，Ph)，6.69(d，J＝8.2Hz，1H，Ph)，7.15(t，J＝8.2Hz，1H，Ph)，7.60(d，J＝7.9Hz，1H，Ph)，8.16(d，J＝7.9Hz，CHNH)和9.21(s，1H，NHNH2)。
除去溶剂，得到白色粉末6(2.4g，9.44mmol，定量)。H NMR(500MHz，DMSO)δ：2.36(bs，1H，SH)，2.84(m，2H，CH2)，4.26(bs，2H，NHNH2)，4.45(dd，J＝2.1，8.0Hz，1H，CH)，6.36(bs，2H，PhNH2)，6.52(t，J＝7.5Hz，1H，Ph)，6.69(d，J＝8.2Hz，1H，Ph)，7.15(t，J＝8.2Hz，1H，Ph)，7.60(d，J＝7.9Hz，1H，Ph)，8.16(d，J＝7.9Hz，CHNH)和9.21(s，1H，NHNH2)。
[0992] BlotGlycoABCTM珠子的制备：将10mL硫丙基琼脂糖6B树脂在非必需的柱子中用0.1M碳酸氢铵水溶液冲洗。将所述珠子浸没于6.7mL乙腈/水(50％，v/v)中，然后向其中添加0.1M ABCh的乙腈/水(50％，v/v)溶液(3.3mL)。将浆状物在室温混合30分钟。
反应后，将珠子用乙腈/水(50％，v/v)、0.1M乙酸和乙醇/水(20％，v/v)充分冲洗。将得到的物质在4℃贮存于10mL乙醇/水(20％，v/v)中直至使用。
反应后，将珠子用乙腈/水(50％，v/v)、0.1M乙酸和乙醇/水(20％，v/v)充分冲洗。将得到的物质在4℃贮存于10mL乙醇/水(20％，v/v)中直至使用。
[0993] (利用BlotGlycoABCTM的细胞糖组学)
[0994] 细胞培养：人前列腺癌PC-3细胞和正常人前列腺上皮细胞(PrEC)分别从Health Science Researches Bank和Cambrex Bio Science Walkersville，Inc.(Walkersville，MD)获得。将PC-3细胞保持于补充有10％牛胚胎血清、50U/ml青霉素和50μg/mL链霉素TM的Ham’s F-12中。根据生产商的说明利用Clonetics前列腺表皮生长孵育基(PrEGM )BulletKit(R)来维持PrEC细胞。将所述细胞在37℃和5％CO2的潮湿保温箱中进行培养。
[0995] 10YGM0109
[0996] 来自细胞的N-聚糖的制备：将在10cm平皿中繁殖的细胞用冰浴PBS洗涤，刮到含有10mM EDTA的PBS中，然后用PBS洗涤。将收集在1.5ml试管中的细胞悬浮于PBS(60μl)中，通过添加1/10体积的10％TritonX-100来溶解并在冰上静置1小时。将溶胞产物在15,000rpm于4℃离心10min。向上清液中添加4体积的冷丙酮以产生蛋白物质的沉淀物并置于-20℃过夜。通过在12,000rpm、4℃离心15分钟来收集沉淀物；将所述沉淀物用
200μl乙腈洗涤并如上所述进行离心。将所述沉淀物溶解于50μl80mM的碳酸氢铵(含有
0.02％1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL))中，并在60℃孵育10分钟。向溶液中添加
1μl 0.5M的二硫苏糖醇(DTT)水溶液，在60℃孵育30分钟，然后通过在室温避光条件下孵育30分钟用碘乙酰胺来烷基化。接着，将混合物在37℃用胰蛋白酶处理过夜并在90℃加热灭活10分钟。冷却到室温后，将混合物在37℃与2.5U的PNGase F(罗氏)一起孵育过夜。将相当于每1/2培养皿的细胞的制备的物质(20-40μl)用于如说明书中所述使用TM
BlotGlycoABC 的下面的糖印迹方法中。
200μl乙腈洗涤并如上所述进行离心。将所述沉淀物溶解于50μl80mM的碳酸氢铵(含有
0.02％1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL))中，并在60℃孵育10分钟。向溶液中添加
1μl 0.5M的二硫苏糖醇(DTT)水溶液，在60℃孵育30分钟，然后通过在室温避光条件下孵育30分钟用碘乙酰胺来烷基化。接着，将混合物在37℃用胰蛋白酶处理过夜并在90℃加热灭活10分钟。冷却到室温后，将混合物在37℃与2.5U的PNGase F(罗氏)一起孵育过夜。将相当于每1/2培养皿的细胞的制备的物质(20-40μl)用于如说明书中所述使用TM
BlotGlycoABC 的下面的糖印迹方法中。
[0997] (使用BlotGlycoABCTM的糖印迹方法的自动化)
[0998] 采用8孔过滤板，将等体积(20μl)PNGase F消化血清样品施用于BlotGlycoABC珠子，并根据图8中所示的流程图同时进行糖印迹方法。因此将收集的N-聚糖通过MALDI-TOFMS进行分析，并用统计学分析检测面积。
[0999] (讨论)
[1000] 质谱法的最近发展带来了糖组学中新的难题。对于所述难题，应提及快速聚糖富集技术的发展。用于与碳水化合物有关的生物标记的回收的容易的技术是重要的。这是因为蛋白组学研究靶向糖化(其是翻译后修饰)。在本说明书中，本发明人报道用于高TM通量临床糖组学的“一体化”策略。利用这一新技术，将基于BlotGlycoABC 珠子的糖印迹的聚糖浓缩、唾液酸珠子上的稳定和寡糖的荧光标记统一于多孔过滤板上的一个工作流(workflow)中。通过具有先天性糖化病症的样品的血清N-聚糖分布图、具有肝细胞癌的样品的血清N-聚糖分布图和健康供体的血清N-聚糖分布图的区别来证实所述策略和MALDI-TOF质量分析的优点。此外，上述的方法使得能够进行人前列腺癌细胞和正常人前列腺表皮细胞的全细胞糖组学。所述结果说明聚糖缩合/处理用于生物标记发现的可能性。
[1001] 大规模定量糖组学是重要的和鼓舞人心的方法。这是因为疾病状态和健康状态间聚糖表达的差异被预期是用于疾病诊断或预后判断的有用工具(Hakomori，S.(2001)Adv.Exp.Med.Biol.491，369-402)。目前，将质谱(MS)广泛用于碳水化合物的结构分析和序列测定研究(Zaia，J.(2004)MassSpectrom.Rev.23，161-227；Dell，A.和Morris，H.R.(2001)Science 291，2351-2356)。由于MS技术的显著改进(电离、碎裂和检测方法被引用)(Kurogochi，M.和Nishimura，S.(2004)Anal.Chem.76，6097-6101；Takegawa，Y.，Deguchi，K.，Ito，S.，Yoshioka，S.，Nakagawa，H.和Nishimura，S.(2005)Anal.Chem.77，2097-2106.；Takegawa，Y.，Deguchi，K.，Ito，S.，Yoshioka，S.，Nakagawa，H.和Nishimura，S.(2005)Anal.Chem.77，2097-2106)，在糖组学中，与其它分析方法(例如高效液相色谱(HPLC)和核磁共振分析(NMR))相比，MS是更优选的。尤其是，聚糖的适度电离和用于进行高通量分析的基质支持激光解析电离-飞行时间(MALDI-TOF)MS及电喷雾电离(ESI)MS是主要技术的潜在候选者。
[1002] 然而，对于糖组学来讲，PCR-样聚糖扩增技术是不可行的。因为聚糖生物合成过程不是模板驱使型的，而是多样的、连续过程且是酶过程。尽管在蛋白组学中检测到的部分肽片段是被全长蛋白质序列数据库/全长DNA序列数据库完全支持的，但是从高度复合的混合物(例如血清、细胞和组织)中的总聚糖的缩合对于糖组学是必需的。因此，在结构-功能糖组学中一个重要瓶颈是费力和费时的复杂聚糖纯化步骤。例如，一旦被从糖蛋白或糖脂分离后，通常将聚糖进行用于在HPLC分析中检测的荧光标记和纯化(Neville，D.C.，Coquard，V.，Priestman，D.A.，te Vruchte，D.J.，Sillence，D.J.，Dwek，R.A.，Platt，F.M.和Butters，T.D.(2004)Anal.Biochem.331，275-282；Tomiya，N.，Kurono，M.，Ishihara，H.，Tejima，S.，Endo，S.，Arata，Y.和Takahashi，N.(1987)Anal.Biochem.163，489-499)。此外，将含有唾液酸的寡糖进一步修饰以便稳定MS测试中阴离子聚糖和增大其敏感性(Powell，A.K.和Harvey，D.J.(1996)RapidCommun.Mass Spectrom.10，1027-1032；
Sekiya，S.，Wada，Y.和Tanaka，K.(2005)Anal.Chem.77，4962-4968；Mechref，Y.，Kang，P.和Novotny，M.V.(2006)Rapid Commun.Mass Spectrom.20，1381-1389)。在多个案例中，尽管丢失了重要信息，然而由于简化处理或检测限制唾液酸被除去。在最近几年中，还将DNA序列测试用于临床N-聚糖绘图(profiling)(Callewaert，N.，VanVlierberghe，H.，Van Hecke，A.，Laroy，W.，Delanghe，J.和Contreras，R.(2004)Nat.Med.10，429-434；Laroy，W.；Contreras，R.和Callewaert，N.(2006)Nat.Protoc.1，397-405)。在所述临床N-聚糖绘图中，适合于毛细管电泳的如上所提及的多个过程和衍生化步骤仍然是必需的。通常来讲，用于制备聚糖衍生物的方法根据分析方法而变化，并且对于每个过程中的处理而言其需要专业知识。由于在聚糖缩合中的这些技术上的但显著的问题，进行可靠的高通量糖组学是不可能的(Morelle，W.，Canis，K.，Chirat，F.，Faid，V.和Michalski，J.C.(2006)Proteomics 6，3993-401)。
Sekiya，S.，Wada，Y.和Tanaka，K.(2005)Anal.Chem.77，4962-4968；Mechref，Y.，Kang，P.和Novotny，M.V.(2006)Rapid Commun.Mass Spectrom.20，1381-1389)。在多个案例中，尽管丢失了重要信息，然而由于简化处理或检测限制唾液酸被除去。在最近几年中，还将DNA序列测试用于临床N-聚糖绘图(profiling)(Callewaert，N.，VanVlierberghe，H.，Van Hecke，A.，Laroy，W.，Delanghe，J.和Contreras，R.(2004)Nat.Med.10，429-434；Laroy，W.；Contreras，R.和Callewaert，N.(2006)Nat.Protoc.1，397-405)。在所述临床N-聚糖绘图中，适合于毛细管电泳的如上所提及的多个过程和衍生化步骤仍然是必需的。通常来讲，用于制备聚糖衍生物的方法根据分析方法而变化，并且对于每个过程中的处理而言其需要专业知识。由于在聚糖缩合中的这些技术上的但显著的问题，进行可靠的高通量糖组学是不可能的(Morelle，W.，Canis，K.，Chirat，F.，Faid，V.和Michalski，J.C.(2006)Proteomics 6，3993-401)。
[1003] 本发明人最近的努力朝向实用的聚糖缩合方法(即糖印迹)(Nishimura，S.，Niikura，K.，Kurogochi，M.，Matsushita，T.，Fumoto，M.，Hinou，H.，Kamitani，R.，Nakagawa，H.，Deguchi，K.，Miura，N.，Monde，K. 和 Kondo，H.(2005)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.44，91-96；Lohse，A.，Martins，R.，Jorgensen，M.R. 和 Hindsgaul，O.(2006)固相寡糖标记(SPOT)：糖脂衍生的结构的确认(Solid-phase oligosaccharidetagging(SPOT)：Validation onglycolipid-derived structures).Angew.Chem.Int.Ed.Engl.45，4167-4172.；Niikura，K.，Kamitani，R.，Kurogochi，M.，Uematsu，R.，Shinohara，Y.，Nakagawa，H.，Deguchi，K.，Monde，K.，Kondo，H.和Nishimura，S.(2005)Chem.Eur.J.11，3825-3834.；Shimaoka，H.，Kuramoto，H.，Furukawa，J.，Miura，Y.，Kurogochi，M.，Kita，Y.，Hinou，H.，Shinohara，Y. 和 Nishimura，S.(2007)Chem.Eur.J.13，1664-1673.；Miura，Y.，Shinohara，Y.，Furukawa，J.I.，Nagahori，N.和Nishimura，S.I.(2007)Chem.Eur.J.13，4797-4804；Kita，Y.，Miura，Y.，Furukawa，J.I.，Nakano，M.，Shinohara，Y.，Ohno，M.，Takimoto，A.和Nishimura，S.I.(2007)Mol.Cell.Proteomics6，
1437-1445)。对于5-8小时内对30-40种主要糖形定量绘图而言，用于上述的最佳方法仅需要5μl人血清(Miura，Y.，Shinohara，Y.，Furukawa，J.I.，Nagahori，N.和Nishimura，S.I.(2007)Chem.Eur.J.13，4797-4804)。这些尝试清楚显示如上优势：通过引入固相支持体(以简单和有效地操作缩合聚糖)来实现较高的回收和减少复杂操作。本发明人在本说明书中提供用于自动化高通量N-聚糖缩合处理的“一体化”解决方法。所述解决方法在“真实世界”的临床糖组学中是非常有益的。利用所述体系，基于酰肼官能化珠子和多路过滤板的处理的组合应用，可以将多个过程(例如全部聚糖的选择性捕获、唾液酸的甲酯化和荧光标记)统一在一个工作流中。本发明人认为用该事实上的标准技术，大规模临床糖组学/大规模临床糖蛋白组学将成为可能，并将加速新的与疾病相关的生物标记的发现。
1437-1445)。对于5-8小时内对30-40种主要糖形定量绘图而言，用于上述的最佳方法仅需要5μl人血清(Miura，Y.，Shinohara，Y.，Furukawa，J.I.，Nagahori，N.和Nishimura，S.I.(2007)Chem.Eur.J.13，4797-4804)。这些尝试清楚显示如上优势：通过引入固相支持体(以简单和有效地操作缩合聚糖)来实现较高的回收和减少复杂操作。本发明人在本说明书中提供用于自动化高通量N-聚糖缩合处理的“一体化”解决方法。所述解决方法在“真实世界”的临床糖组学中是非常有益的。利用所述体系，基于酰肼官能化珠子和多路过滤板的处理的组合应用，可以将多个过程(例如全部聚糖的选择性捕获、唾液酸的甲酯化和荧光标记)统一在一个工作流中。本发明人认为用该事实上的标准技术，大规模临床糖组学/大规模临床糖蛋白组学将成为可能，并将加速新的与疾病相关的生物标记的发现。
[1004] (结论)
[1005] 已报道了许多研究，其用于验证疾病状态相关的蛋白质糖基化的变化(Baldus，S.E.，Wienand，J.R.，Werner，J.P.，Landsberg，S.，Drebber，U.，Hanisch，F.G. 和Dienes，H.P.(2005)Int.J.Oncol.27，1289-1297；Comunale，M.A.，Lowman，M.，Long，R.E.，Krakover，J.，Philip，R.，Seeholzer，S.，Evans，A.A.，Hann，H.W.，Block，T.M.和Mehta，A.S.(2006)J.Proteome Res.5，308-315；Dwek，M.V.，Lacey，H.A.和Leathem，A.J.(1998)Clin.Chim.Acta 271，191-202.；J.Proteome Res.6，1822-1832.)。本发明人的结果显示通过MALDI-TOFMS获得的全血清N-聚糖分布图的定量分析的潜在临床价值。在最近几年，MALDI-TOFMS在血清中的N-聚糖绘图的可用性被预期用于促进临床相关的肿瘤检测的定量分析和定性分析中(Morelle，W.，Flahaut，C.，Michalski，J.C.，Louvet，A.，Mathurin，P.和Klein，A.(2006)Glycobiology 16，281-293.；Kranz，C.，Ng，B.G.，Sun，L.，Sharma，V.，Eklund，E.A.，Miura，Y.，Ungar，D.，Lupashin，V.，Winkel，D.R.，Cipollo，J.F.，Costello，C.E.，Loh，E.，Hong，W.和Freeze，H.H.(2007)Hum.Mol.Genet.16，731-741.)。本发明人的方法传达了用于临床评价中的定量和详尽的MS分析的聚糖缩合和衍生化的非TM
常高的可行性。通过引入整合型糖印迹珠子(此处引入BlotGlycoABC )和珠子上的甲基酯化，使真正的总N-糖组学分析成为可能。本方法仅需2.5μl分量的人全血清，并通过操作(包括MALDI-TOFMS)通过单次扫描完成用于后续在固相上顺利衍生化的多个过程(用4个小时)。这致使操作效率和时间的巨大提高。因为在血清聚糖制备和分析中证实了意义深远的改进，可以将本发明人提出的方法用于细胞样品的聚糖浓缩分析。对于正在单个10cm培养皿中增殖的人前列腺癌PC-3细胞和对于与其对应的正常细胞，本发明人通TM
过利用BlotGlycoABC 和MALDI-TOFMS分析的糖印迹已初步考证了它们的全细胞N-糖组(glycome)。除了样品预处理之前进行的小修改之外，该细胞糖组绘图方法基本与血清糖组绘图方法一致(图13)。本结果清楚表明在PC-3细胞和正常前列腺表皮细胞(PrEC)之间N-聚糖结构(N-聚糖的模式和体积)具有显著的差异。认为本发明人提出的方法的应用将在细胞水平和组织水平极大地促进糖组学。最近关于导致各种CDG的缺陷的发现表明聚糖分析不足以正确指出CDG-II的部分缺陷(Wu，X.，Steet，R.A.，Bohorov，O.，Bakker，J.，Newell，J.，Krieger，M.，Spaapen，L.，Kornfeld，S.和Freeze，H.H.(2004)Nat.Med.10，518-523.；Redner，R.A. 和 Walker，H.F.(1984)Soc.Indust.Appl.Math.Rev.26，
195-239.)。然而，尽管没能对各个亚型完成多个测试，但是本结果清楚证实关于各亚型患者中的N-聚糖丰度的数据组通过主要组分分析在表达方面被明确分开。因此，在常规筛选试验(例如新生儿的筛选程序)中，通过用于CDG的定量糖组学，稀有病例的发现可能成为必要的。这是因为CDG可以通过简单血液检测与其他疾病一起检测。而且，由于其重现性和容易性，所述糖印迹技术可能成为用于实现上述的方法。如果将本技术用于其它以运铁蛋白糖基化改变为特征的病症(例如先天性半乳糖血症和长期酒精摄入)以验证本研究中完成的分析的可用性，其将是令人感兴趣的。
常高的可行性。通过引入整合型糖印迹珠子(此处引入BlotGlycoABC )和珠子上的甲基酯化，使真正的总N-糖组学分析成为可能。本方法仅需2.5μl分量的人全血清，并通过操作(包括MALDI-TOFMS)通过单次扫描完成用于后续在固相上顺利衍生化的多个过程(用4个小时)。这致使操作效率和时间的巨大提高。因为在血清聚糖制备和分析中证实了意义深远的改进，可以将本发明人提出的方法用于细胞样品的聚糖浓缩分析。对于正在单个10cm培养皿中增殖的人前列腺癌PC-3细胞和对于与其对应的正常细胞，本发明人通TM
过利用BlotGlycoABC 和MALDI-TOFMS分析的糖印迹已初步考证了它们的全细胞N-糖组(glycome)。除了样品预处理之前进行的小修改之外，该细胞糖组绘图方法基本与血清糖组绘图方法一致(图13)。本结果清楚表明在PC-3细胞和正常前列腺表皮细胞(PrEC)之间N-聚糖结构(N-聚糖的模式和体积)具有显著的差异。认为本发明人提出的方法的应用将在细胞水平和组织水平极大地促进糖组学。最近关于导致各种CDG的缺陷的发现表明聚糖分析不足以正确指出CDG-II的部分缺陷(Wu，X.，Steet，R.A.，Bohorov，O.，Bakker，J.，Newell，J.，Krieger，M.，Spaapen，L.，Kornfeld，S.和Freeze，H.H.(2004)Nat.Med.10，518-523.；Redner，R.A. 和 Walker，H.F.(1984)Soc.Indust.Appl.Math.Rev.26，
195-239.)。然而，尽管没能对各个亚型完成多个测试，但是本结果清楚证实关于各亚型患者中的N-聚糖丰度的数据组通过主要组分分析在表达方面被明确分开。因此，在常规筛选试验(例如新生儿的筛选程序)中，通过用于CDG的定量糖组学，稀有病例的发现可能成为必要的。这是因为CDG可以通过简单血液检测与其他疾病一起检测。而且，由于其重现性和容易性，所述糖印迹技术可能成为用于实现上述的方法。如果将本技术用于其它以运铁蛋白糖基化改变为特征的病症(例如先天性半乳糖血症和长期酒精摄入)以验证本研究中完成的分析的可用性，其将是令人感兴趣的。
[1006] 通过基于HCC样品的大规模糖组学(83个患者和20个健康供体)的N-聚糖绘图的统计学方法，现在识别一套最适合于模式(pattern)分类的特异性N-聚糖表达比率是可行的。通过上述的特异N-聚糖分布图，本发明人以高达100％的准确度区分HCC样品和正常对照。因此，尽管仍然需要利用与其它临床变量和医学事实例如乙型肝炎病毒感染和/或丙型肝炎病毒感染相关联来证实，但本研究中获得的信息，即选择的糖形的定量绘图具有用于人HCC的新颖和有效的诊断生物标记的潜在临床信息。
[1007] 通过唾液酸残基的定量甲基酯化来实现整个MALDI-TOFMS分析中具有重现性的质谱测试。这使MALDI-TOFMS能经受对中性N-聚糖和酸性N-聚糖的同时和定量绘图。即使具有比其它方法更好的所述优点，但必须指出在对具有宽范围分子量的N-聚糖分析期间，质量信号强度通常取决于所用的个别MALDI装置。看起来这归因于装配到每个MALDI系统的激光源，并且其受具体分子(例如具有多个唾液酸残基的高分子量聚糖)的电离效率的影响。通过比较本结果(表4)和先前的数据(Kita，Y.，Miura，Y.，Furukawa，J.I.，Nakano，M.，Shinohara，Y.，Ohno，M.，Takimoto，A.和Nishimura，S.I.(2007)Mol.Cell.Proteomics 6，1437-1445)，设想完全添加到唾液酸的三天线型(triantennary)聚糖的量从先前数据中的量减少。
[1008] (表5)人血清N-聚糖缩合/处理的自动化试验的统计表(n＝8)
[1009] 根据2045m/z将峰面积标准化。
[1010] [表5]
[1011]
[1012] N.D.；没有在样品中检测到 NaN；非数值的
[1013] 这些结果可归因于肽的高灵敏度标记物(Kita，Y.，Miura，Y.，Furukawa，J.I.，Nakano，M.，Shinohara，Y.，Ohno，M.，Takimoto，A.和Nishimura，S.I.(2007)Mol.Cell.TMProteomics 6，1437-1445.)和由BlotGlycoABC 设计的探针之间化学结构的差别，及每个测试中所用的激光输出量和波长的差别。为了在基于MALDI质谱法的糖组学中进行更精确和更可信的定量分析，或许应该研发具有更高电离效率的新型分子探针，其提供所述高分TM
子量的聚糖。对于多个血清样品和细胞样品来讲，利用BlotGlycoABC 的整合型糖印迹技术极大地促进了用于各种疾病的新生物标记的发现。用于固相中富集的N-聚糖处理的化学特性是非常适合于在后续分析方法中所需要的衍生化，并因此，可以将用最佳化学探针标记的回收N-聚糖用于常规的HPLC、LC-MS和/或基于DNA测序仪的分析。
子量的聚糖。对于多个血清样品和细胞样品来讲，利用BlotGlycoABC 的整合型糖印迹技术极大地促进了用于各种疾病的新生物标记的发现。用于固相中富集的N-聚糖处理的化学特性是非常适合于在后续分析方法中所需要的衍生化，并因此，可以将用最佳化学探针标记的回收N-聚糖用于常规的HPLC、LC-MS和/或基于DNA测序仪的分析。
[1014] (实施例2：H型实施例)
[1015] 在本实施例中，将举例说明利用H型的分析实施例。基本上，将试验在实施例1中所述的条件下完成。图1用图表举例说明分析实施例。具体地讲，完成下面的步骤。根据TM实施例1(BlotGlycoABC 珠子的合成和鉴定)利用ABC和日本专利申请号2006-217165和TM
日本专利申请号2006-73170的描述完成BlotGlycoH 珠子的制备。
日本专利申请号2006-73170的描述完成BlotGlycoH 珠子的制备。
[1016] A)用于分离样品中的糖链的糖链分离步骤，其包括下列步骤：
[1017] A-1)提供10μl作为样品的血清到PCR板；
[1018] A-2-1)添加45μl 1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)或2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)0.26％/碳酸氢铵0.11M到样品(CV 5％)中，以在37℃反应10分钟；或者[1019] A-2-2)添加50μl 1-丙磺酸、2-羟基-3-月桂酰胺(PHL)或2-羟基-3-肉豆蔻酰胺(PHM)0.24％/碳酸氢铵105mM/二硫苏糖醇(DTT)12mM到样品(CV5％)中。
[1020] 当应用上面的A-2-1)时，
[1021] A-3-1)添加5μl 120mM的二硫苏糖醇(DTT)(CV 5％)到样品中。
[1022] 当应用上面的A-2-2)或一旦完成上面的A-3-1)时，
[1023] A-3-2)添加12μl作为内标的A2酰胺糖链(上面表3中的第33号峰)，以在60℃反应30分钟，然后冷却至室温。
[1024] A-4)添加10μl 123mM碘乙酰胺(IAA)(CV 5％)到样品中，以在室温下于黑暗地方反应1小时。
[1025] A-5)添加5μl胰蛋白酶400U到样品中，以在37℃反应60分钟。
[1026] A-6)将样品在90℃加热10分钟，然后冷却至室温，其中充分冷却以避免PNGaseF的灭活。
[1027] A-7)添加5μl PNGaseF 2U到样品中，以在37℃反应12小时，其中要小心以使操作过程中不会发生溶剂挥发，这对应于顶部加热处理。
[1028] B)用于检测分离的糖链的检测样品制备步骤：
[1029] B-1)使步骤A)中制备的捕获的糖链样品与用于糖链捕获的珠子接触，并使其在80℃结合以制备捕获的糖链样品，其中添加180μl 2％乙酸/乙腈，在80℃加热45分钟，并洗涤。
[1030] B-2)根据需要，两次添加200μl 2M盐酸胍到捕获的糖链中，将捕获的糖链样品置于反应条件下，然后通过抽吸除去反应液体。
[1031] B-3)根据需要，用水两次洗涤200μl捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去水。
[1032] B-4)用三乙胺/甲醇两次洗涤200μl捕获的糖链样品，然后通过抽吸除去三乙胺，其中在抽吸后，用一张棉布完成底部擦拭。
[1033] B-5)添加100μl 10％的乙酸酐/甲醇到捕获的糖链样品中，将捕获的糖链样品置于室温下持续30分钟的反应条件下，然后通过抽吸除去乙酸酐，其中将甲醇添加到乙酸酐中以制备10％乙酸酐/甲醇。
[1034] B-6)根据需要，两次添加200μl 10mM的盐酸到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去盐酸。
[1035] B-7)根据需要，两次添加200μl甲醇到捕获的糖链样品中，通过抽吸除去甲醇后，根据需要两次添加200μl二氧六环到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去。
[1036] B-8)用一张棉布完成底部擦拭。
[1037] B-9)添加100μl 100mM的甲基-对-甲苯基-三氮烯(MTT)/二氧六环到捕获的糖链样品中，以在80℃反应60分钟。
[1038] B-10)添加200μl二氧六环到捕获的糖链样品中，并通过抽吸除去二氧六环。
[1039] B-11)(1)添加200μl甲醇到捕获的糖链样品中，通过抽吸除去；(2)添加200μl20mM的NaCl溶液到捕获的糖链样品中，通过抽吸除去；(3)用200μl水洗涤捕获的糖链样品并通过抽吸除去水。
[1040] B-12)添加180μl 2％乙酸/乙腈到捕获的糖链样品中，用20μl 20-50mM氨基氧基色氨酰基精氨酸甲酯/水、盐酸O-苄基羟胺/水或邻氨基苯甲酰肼/水标记捕获的糖链样品中的糖链，并通过抽吸除去。
[1041] B-13)添加100μl水到被标记的捕获的糖链样品中，以产生标记的糖链溶液。
[1042] C)制备质谱测试板子(具有置于其上的标记的捕获的糖链样品)的步骤：
[1043] C-1)在收集板子上处理步骤B)中得到的标记的糖链样品溶液。
[1044] C-2)添加为液体基质的15μl 50％甲醇/1％甘油水溶液到用于混合的板子。
[1045] C-3)添加15μl从收集板子上得到的标记的糖链样品到用于混合的板子，用移液管混合。
[1046] 由此通过分配2μl并置于MALDI板子(#209512MTP AnchorChipTM400/384T F(384固定凹，400μm直径；#209520MTP 384目标板剖光的钢T F，Bruker Daltonik GmbH)上来产生质谱测试板子。
[1047] D)根据常规方法进行MALDI-TOF。
[1048] 已采用本发明的优选实施方案如上面所述举例说明本发明。然而，应该理解本发明的范围仅由权利要求书来诠释。应该理解将本说明书中引用的专利、专利申请和文献的内容引入文中作为本说明书的参考。
[1049] [工业适用性]
[1050] 本发明人成功提供用于分析样品例如血清样品中含有的糖链的自动分析装置。这使得能够同时且自动化地分析大量样品。对于从糖蛋白定量分离糖链来讲，复杂的预处理例如还原烷基化和胰蛋白酶消化及增溶剂是自动化的。对于要定量分离的糖链来讲，尽管糖链的立刻分析是可能的，然而通过进行化学选择性捕获使无用异物的除去变得容易，本发明使得能够一次处理许多种样品。上面的每一步是优化的，且构建了能进行自动化分析的系统。
[1051] 利用本发明的装置使得能够分析多个样品。糖链生物标记的搜寻被预期，且考虑了关于疾病诊断和早期诊断的应用。
[1052] 附图简述
[1053] 图1是BlotGlycoH的流程图，其是用于本发明的糖链自动分析的糖链自动分析仪器和预处理仪器的代表性实施方案。对于各个数字的描述在字母或数字解释部分或本说明书中进行了详述；
[1054] 图1A是图1的放大图(左上部分)；
[1055] 图1B是图1的放大图(左下部分)；
[1056] 图1C是图1的放大图(上面中间部分)；
[1057] 图1D是图1的放大图(下面中间部分)；
[1058] 图1E是图1的放大图(右上部分)；
[1059] 图1F是图1的放大图(右下部分)；
[1060] 图2是糖链捕获分子的示意图；
[1061] 图3是糖链印迹的示意图。因为从复合碳水化合物例如糖蛋白、蛋白聚糖或糖脂释放的糖链在分子的还原末端必定具有相当于的醛基的半缩醛基，与其它生物分子例如构成蛋白质的氨基酸/肽、构成DNA/RNA的核苷酸和脂类的完全化学区分通过对该半缩醛基特异性的选择性亲核加成反应来实现。将含有能广泛与所有种类的糖链的还原末端反应的官能团(氨基氧基基团、酰肼基等)的各种物质(不论是大分子或小分子)用于连续高速地进行糖链捕获、利用高灵敏试剂等的探针标记和根据那些质谱测试方法的结构分析。将在右下角显示的MADLI分析、MS分析和MS/MS分析结果作为示例给出；
[1062] 图4是显示MALDI-TOF MS的基本原理的图；
[1063] 图5是利用BlotGlycoABCTM的方法的示例性流程图；
[1064] 图6是利用BlotGlycoABCTM的方法的示例性流程图。图6是图5的延续；
[1065] 图7是利用BlotGlycoABCTM的方法中的分配的示例性流程图；
[1066] 图8是利用BlotGlycoABCTM的方法的示例性鸟瞰图。显示了自动糖印迹方法的流程图。显示应用于96-孔式自动仪。图8与图1的不同处在于：图8还包括了利用8M硼烷-吡啶复合物的腙键还原处理。所述处理可以参照Angew Chem Int Ed Engl.2006Jun19；45(25)：4167-72；Lohse A，Martins R，Jorgensen MR，Hindsgaul O等完成。将对各种数字的描述记载于字母或数字的解释部分或本说明书中；
[1067] 图8A是图8的放大图(左上部分)；
[1068] 图8B是图8的放大图(左下部分)；
[1069] 图8C是图8的放大图(上面中间部分)；
[1070] 图8D是图8的放大图(下面中间部分)；
[1071] 图8E是图8的放大图(右上部分)；
[1072] 图8F是图8的放大图(右下部分)；
[1073] 图9是作为本发明仪器的示例的配置图。虚线长方形表示放置用于试剂等的分配针头的位置。实线长方形表示不放置用于试剂等的分配针头的位置。虚线箭头表示液体和用于试剂等的分配针头的移动。实线箭头表示过滤板/SPE板的移动。双线箭头表示连接至真空泵。＊标记的位置表示冷却至10％发生的位置；
[1074] 图10是显示本发明的复杂类型糖共轭物浓缩分析的非常方便和可行方法的实例的图(图10a)。图10b是显示通过设计一种多功能分子探针N-(2-氨基苯甲酰基)半胱氨酸酰肼(ABCh)，并结合该探针到硫丙基-琼脂糖6B来制备的稳定的酰肼-官能化的聚合物TM载体(即BlotGlycoABC 珠子)的图。这是用于整合糖印迹技术的一般方法。(a)基于糖
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印迹的高通量临床糖组学的工作流程。该方法包括下列步骤：1)利用糖印迹技术 化学选择性地将还原的糖捕获到杂交的官能化的珠子上，2)完成洗涤以除去所有的杂质，3)将唾液酸残基进行珠子上的甲基酯化，然后还原腙键，4)通过还原二硫键回收修饰的N-聚糖。
TM
(b)基于BlotGlycoABC 的糖印迹。包括探针N-(2-氨基甲酰基)半胱氨酸酰肼(ABCh)的化学结构；关于合成，可以参考本说明书中的描述；
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印迹的高通量临床糖组学的工作流程。该方法包括下列步骤：1)利用糖印迹技术 化学选择性地将还原的糖捕获到杂交的官能化的珠子上，2)完成洗涤以除去所有的杂质，3)将唾液酸残基进行珠子上的甲基酯化，然后还原腙键，4)通过还原二硫键回收修饰的N-聚糖。
TM
(b)基于BlotGlycoABC 的糖印迹。包括探针N-(2-氨基甲酰基)半胱氨酸酰肼(ABCh)的化学结构；关于合成，可以参考本说明书中的描述；
[1075] 图11A是显示用作本发明的实例的44种N-聚糖的图。人血清糖形绘图。(a)代表性正常人血清N-聚糖的MALDI-TOF MS图谱。将已用胰蛋白酶和PNGase F消化的血清TM直接利用BlotGlycoABC 进行N-聚糖浓缩和衍生化的方法。通过在珠子上甲基酯化处理的唾液酸化N-聚糖对于脱唾液酸是稳定的，并由此，应该指出使总N-聚糖的定量糖组学分析成为可能；
[1076] 图11B是显示已经过糖基化缺乏的特定阶段的II型CDG(CDG-II)患者的结果的图。本发明的发明人观察异常的N-聚糖分布图(例如几个不成熟的小N-聚糖链)。(b)通过MALDI-TOF MS发现的DCG患者的血清N-聚糖分布图。i：健康供体，ii：CDG-Ia，iii：CDG-Ib，iv：CDG-IIh，v：CDG-IIx1，vi：CDG-IIx2和vii：CDG-IIx3。星号表示预定量的内标(A2酰胺)；
[1077] 图11C是显示N-聚糖的量的配对组合的图，其显示CDG-I患者、CDG-Ia患者和CDG-Ib患者之间的诊断区别。显示由检测的42种N-聚糖的量形成的数据分布可以用于患者与正常血清的简单区别。(c)利用期望值最大化算法来将CDG-I患者分类。将选择的N-聚糖浓度集合(set)用于区别健康患者和CDG-I患者(左栏和中间栏的组)。类似地，利用同样的N-聚糖集合可以成功区分CDG-Ia和CDG-Ib。
[1078] 图11D是显示关于CDG病例的研究中测试的总血清中的7种主要组分分析(PCA)的图。将第一个主要组分(PC1)和第二个主要组分(PC2)作图。所述两个主要组分分别占分布的41％和37％。
[1079] 图12A是显示基于从肝细胞癌和正常对照血清中得到的N-聚糖的分类的图。(a)特征子集选择的方法。在所述方法中，依次添加各个步骤中最显著的N-聚糖比率，并且总计测试了276个模型。结果，最小相对误差成为0％。(b)选作用于分类的特征的3种N-聚糖比率的Hit map图(较浅的颜色表示聚糖存在较高的比率)。(c)选择的特征的盒状图显示(N-聚糖存在的比率、寡糖的结构和峰的数显示在图中)。
[1080] 图12B是显示基于从肝细胞癌和正常对照血清中得到的N-聚糖的分类的图。(a)特征子集选择的方法。在所述方法中，依次添加各个步骤中最显著的N-聚糖比率，并且总计测试了276个模型。结果，最小相对误差成为0％。(b)选作用于分类的特征的3种N-聚糖比率的Hit map图(较浅的颜色表示聚糖存在较高的比率)。(c)选择的特征的盒状图显示(N-聚糖存在的比率、寡糖的结构和峰的数显示在图中)。
[1081] 图12C是显示基于从肝细胞癌和正常对照血清中得到的N-聚糖的分类的图。(a)特征子集选择的方法。在所述方法中，依次添加各个步骤中最显著的N-聚糖比率，并且总计测试了276个模型。结果，最小相对误差成为0％。(b)选作用于分类的特征的3种N-聚糖比率的Hit map图(较浅的颜色表示聚糖存在较高的比率)。(c)选择的特征的盒状图显示(N-聚糖存在的比率、寡糖的结构和峰的数显示在图中)。
[1082] 图13是人前列腺癌PC-3细胞和正常人前列腺上皮细胞(PrEC)的总细胞糖组。将TM已在10cm大小的培养皿中增殖的细胞进行利用BlotGlycoABC 的糖印迹和MS分析(还参见本说明书中的描述)。
[1083] 图14是通过利用BlotGlycoABCTM的自动化糖印迹方法制备的血清样品(n＝8)的MALDI-TOF MS谱。
[1084] 图15是显示根据本发明的实施方案的自动糖链预处理仪器的平面视图，将一些部件从图中省略了。
[1085] 图16是分配头的正面视图。
[1086] 图17是沿着A-A线切开的图16的横切面视图。
[1087] 图18是第一个恒温槽的中央垂直横切面视图。
[1088] 图19是显示第一个低压回收装置和过滤板移动机构的分解透视图。
[1089] 图20是显示过滤板移动机构的平面视图，将一些部件从图中省略了。
[1090] 图21是显示过滤板移动机构中的垂直移动组件的垂直横切面视图，将一些部件从图中省略了。
[1091] 图22是过滤板移动机构和第二个恒温槽的透视图。
[1092] 图23是第二个恒温槽的中央垂直横切面视图。
[1093] 图24是处理操作的流程图。
[1094] 图25是图24的处理操作后面的处理操作的流程图。
[1095] 数字的解释
[1096] 1 壳体
[1097] 1a 壳体的安装空间
[1098] 2 分配头
[1099] 2A 圆柱体
[1100] 2B 加压板
[1101] 3 支架
[1102] 4 导杆
[1103] 5 升降架
[1104] 6 驱动马达
[1105] 7 滚珠螺杆
[1106] 8 升降架移动机构
[1107] 9 分配针头固定器
[1108] 10 分配针头
[1109] 11 分配头移动机构
[1110] 12 第一个恒温槽
[1111] 12A 主体部件
[1112] 13 接受座
[1113] 14 筒式加热器
[1114] 15 帕耳帖元件
[1115] 16 散热器
[1116] 17 硅酮片
[1117] 18 筒式加热器
[1118] 19 内盖
[1119] 21 盖子
[1120] 22 试剂架
[1121] 23，24 用于混合的微孔板
[1122] 25 微孔板
[1123] 26 第一个低压回收装置
[1124] 27 第一个抽吸除去装置
[1125] 28 底部擦拭器
[1126] 29 第二个恒温槽
[1127] 29A 主体部件
[1128] 30 接受座
[1129] 31 筒式加热器
[1130] 32 空气循环通道
[1131] 33 帕耳帖元件
[1132] 34 散热器
[1133] 35 空气循环通道
[1134] 36 管道
[1135] 37 排风机
[1136] 38 盖子
[1137] 39 过滤板移动机构
[1138] 40 支撑板
[1139] 41，42 滑轮
[1140] 43 马达
[1141] 44 带子
[1142] 45 水平移动板
[1143] 46 垂直移动组件
[1144] 47 内部框架
[1145] 48 接受架
[1146] 49 支架
[1147] 50 导向装置
[1148] 51 垂直移动杆
[1149] 52 马达
[1150] 53 滚珠螺杆
[1151] 54 升降杆
[1152] 55 微孔板
[1153] 56 第二个低压回收装置
[1154] 58 目标板
[1155] 59 目标板接受座
[1156] 60 控制装置
[1157] 61 微孔板
[1158] 62 过滤板
[1159] 101 10μl 血清
[1160] 102 含有血清的过滤板
[1161] 103 在37℃保温，持续10分钟
[1162] 104 含有血清的过滤板
[1163] 105 在60℃保温，持续30分钟
[1164] 106 含有血清的过滤板
[1165] 107 冷却至室温
[1166] 108 含有血清的过滤板
[1167] 109 在室温保温，于黑暗中持续1小时
[1168] 110 含有血清的过滤板
[1169] 111 在37℃保温，持续60分钟
[1170] 112 含有血清的过滤板
[1171] 113 在90℃保温，持续5分钟
[1172] 114 含有血清的过滤板
[1173] 115 冷却至室温
[1174] 116 含有血清的过滤板
[1175] 117 在37℃保温，持续12小时
[1176] 118 含有血清的过滤板
[1177] 119 试剂架，在4℃，1.5ml
[1178] 120 试剂架，室温，避光
[1179] 121 含有血清的过滤板
[1180] 122 在80℃保温，持续45分钟
[1181] 123 含有血清的过滤板
[1182] 124 通过抽吸除去
[1183] 125 含有血清的过滤板
[1184] 126 通过抽吸除去
[1185] 127 含有血清的过滤板
[1186] 128 通过抽吸除去
[1187] 129 含有血清的过滤板
[1188] 130 在室温保温，持续30分钟
[1189] 131 含有血清的过滤板
[1190] 132 通过抽吸除去
[1191] 133 通过抽吸除去
[1192] 134 含有血清的过滤板
[1193] 135 通过抽吸除去
[1194] 136 含有血清的过滤板
[1195] 137 通过抽吸除去
[1196] 138 底部擦拭器
[1197] 139 含有血清的过滤板
[1198] 140 在80℃保温，持续60分钟
[1199] 141 含有血清的过滤板
[1200] 142 通过抽吸除去
[1201] 143 含有血清的过滤板
[1202] 144 通过抽吸除去
[1203] 145 含有血清的过滤板
[1204] 146 在80℃保温，持续45分钟
[1205] 147 含有血清的过滤板
[1206] 148 通过抽吸提取
[1207] 149 洗涤阀
[1208] 150 用于回收的板子1
[1209] 151 分配20μl
[1210] 152 用于混合的MP1
[1211] 153 分配380μl
[1212] 154 SPE板子
[1213] 155 通过抽吸除去
[1214] 156 SPE板子
[1215] 157 通过抽吸除去
[1216] 158 SPE板子
[1217] 159 除去
[1218] 160 SPE板子
[1219] 161 通过抽吸除去
[1220] 162 SPE板子
[1221] 163 通过抽吸回收
[1222] 164 用于回收的板子2
[1223] 165 分配2μl
[1224] 166 用于混合的MP2
[1225] 167 分配2μl
[1226] 168 MALDI板子
[1227] 169 结束
[1228] 201 胰蛋白酶400U，5μl
[1229] 202 PNGase F，2U，5μl
[1230] 203 0.26％PHL(增溶剂)/0.11M碳酸氢铵，45μl(CV5％)
[1231] 204 120mM DTT，5μl(CV5％)
[1232] 205 123mM IAA，10μl(CV5％)
[1233] 206 10％Ac2O/MeOH，100μl
[1234] 207 150mM MTT/二氧六环，100μl
[1235] 208 20mM试剂，20μl
[1236] 209 2％AcOH/ACN，180μl
[1237] 210 2M盐酸胍，200μl×2
[1238] 211 水，200μl×2
[1239] 212 1％TEA/MeOH，200μl×2
[1240] 213 10mM HCl，200μl×2
[1241] 214 MeOH，200μl×2
[1242] 215 二氧六环，200μl×2
[1243] 216 二氧六环，200μl×2
[1244] 217 水，200μl×1
[1245] 218 2％AcOH/ACN，180μl
[1246] 219 水，100μl×1
[1247] 220 95％，ACN，360μl
[1248] 221 水，200μl
[1249] 222 95％，ACN，200μl
[1250] 223 95％，ACN，200μl
[1251] 224 5％，ACN，100μl
[1252] 225 DHB/30％ACN，18μl
[1253] 在149中，
[1254] A 2％乙酸(AcOH)/乙腈(ACN)
[1255] B 水
[1256] C 2M盐酸胍
[1257] D 95％乙腈(ACN)
[1258] E 二氧六环
[1259] F 甲醇(MeOH)
[1260] G 10mM HCl
[1261] H 1％TEA/甲醇(MeOH)
[1262] 301 10μl血清
[1263] 302 PCR板子
[1264] 303 含有血清的PCR板子
[1265] 304 在37℃保温，持续10分钟
[1266] 305 含有血清的PCR板子
[1267] 306 在60℃保温，持续30分钟
[1268] 307 含有血清的PCR板子
[1269] 308 冷却至室温
[1270] 309 含有血清的PCR板子
[1271] 310 在室温保温，于黑暗中持续1小时
[1272] 311 含有血清的PCR板子
[1273] 312 在37℃保温，持续60分钟
[1274] 313 含有血清的PCR板子
[1275] 314 在90℃保温，持续5分钟
[1276] 315 含有血清的PCR板子
[1277] 316 冷却至室温
[1278] 317 含有血清的PCR板子
[1279] 318 在37℃保温，持续12小时
[1280] 319 含有血清的PCR板子
[1281] 320 试剂架，4℃，1.5ml
[1282] 321 试剂架，室温
[1283] 322 分配20μl
[1284] 323 通过抽吸除去
[1285] 324 通过抽吸除去
[1286] 325 通过抽吸除去
[1287] 326 底部擦拭器
[1288] 327 含有珠子的过滤板
[1289] 328 含有珠子的过滤板
[1290] 329 含有珠子的过滤板
[1291] 330 含有珠子的过滤板
[1292] 331 在80℃保温，持续60分钟
[1293] 332 含有珠子的过滤板
[1294] 333 在室温保温，持续10分钟
[1295] 334 通过抽吸除去
[1296] 335 含有珠子的过滤板
[1297] 336 通过抽吸除去
[1298] 337 含有珠子的过滤板
[1299] 338 通过抽吸除去
[1300] 339 含有珠子的过滤板
[1301] 340 通过抽吸除去
[1302] 341 含有珠子的过滤板
[1303] 342 通过抽吸除去
[1304] 343 底部擦拭器
[1305] 344 含有珠子的过滤板
[1306] 345 保温，避光，室温，持续30分钟
[1307] 346 含有珠子的过滤板
[1308] 347 通过抽吸除去
[1309] 348 含有珠子的过滤板
[1310] 349 通过抽吸除去
[1311] 350 底部擦拭器
[1312] 351 含有珠子的过滤板
[1313] 352 通过抽吸除去
[1314] 353 含有珠子的过滤板
[1315] 354 通过抽吸除去
[1316] 355 底部擦拭器
[1317] 356 含有珠子的过滤板
[1318] 357 在60℃保温，持续60分钟
[1319] 358 含有珠子的过滤板
[1320] 359 通过抽吸除去
[1321] 360 含有珠子的过滤板
[1322] 361 通过抽吸除去
[1323] 362 底部擦拭器
[1324] 363 含有珠子的过滤板
[1325] 364 通过抽吸除去
[1326] 365 含有珠子的过滤板
[1327] 366 在50mM碳酸氢铵中的50mM DTT，50μl
[1328] 367 在60℃保温，持续5分钟
[1329] 368 在室温保温，持续15分钟
[1330] 369 含有珠子的过滤板
[1331] 370 通过抽吸回收
[1332] 371 用于回收的板子1
[1333] 372 在10℃保温至完成
[1334] 373 SPE起动(INITIATION)
[1335] 374 分配20μl
[1336] 375 用于混合的MP 1
[1337] 376 分配420μl
[1338] 377 SPE板子
[1339] 378 通过抽吸除去
[1340] 379 SPE板子
[1341] 380 通过抽吸除去
[1342] 381 SPE板子
[1343] 382 通过抽吸除去
[1344] 383 SPE板子
[1345] 384 通过抽吸除去
[1346] 385 SPE板子
[1347] 386 通过抽吸回收
[1348] 387 用于回收的板子2
[1349] 388 在10℃保温至完成
[1350] 389 分配2μl
[1351] 390 MALDI分配起动
[1352] 391 用于混合的MP 2
[1353] 392 分配2μl
[1354] 393 MALDI板子
[1355] 394 洗涤阀
[1356] 395 含有珠子的过滤板
[1357] 396 通过抽吸除去
[1358] 397 底部擦拭器
[1359] 在394中，
[1360] A 2％乙酸(AcOH)/乙腈(ACN)，20ml
[1361] B 95％乙腈(ACN)的水溶液，20ml
[1362] C 甲醇(MeOH)，200ml
[1363] D 水
[1364] E 95％乙腈(ACN)，330ml
[1365] F 50％乙腈(ACN)
[1366] G 10mM盐酸，100ml
[1367] H 6M盐酸胍，100ml
[1368] 401 还原剂任务的调整
[1369] 402 还原剂
[1370] 403 试剂架，室温/避光
[1371] 404 分配20μl
[1372] 405 分配40μl
[1373] 406 R9(2ml)
[1374] 407 8M硼烷吡啶
[1375] 408 排空架
[1376] 409 R11(20ml)
[1377] 410 R10(4ml)
[1378] 411 MeOH，140μl
[1379] 412 50％的三氟乙酸水溶液
[1380] 501 0.33M碳酸氢铵，15μl，CV5％
[1381] 502 0.4％的增溶剂，30μl，CV5％
[1382] 503 120mM DTT，5μl，CV5％
[1383] 504 123mM IAA，10μl，CV5％
[1384] 505 胰蛋白酶，400U，5μl
[1385] 506 PNGase F，2U，5μl
[1386] 508 R1(1.5ml)
[1387] 509 R2(3ml)
[1388] 510 R12(20ml)
[1389] 511 R3(0.5ml)
[1390] 512 R4(1ml)
[1391] 513 R5(2ml)
[1392] 514 R6(0.2ml)
[1393] 515 R7(10ml)
[1394] 516 R8(5ml)
[1395] 517A ACN，300μl×3
[1396] 517B 50％ACN，300μl×3
[1397] 518 1M AcOH，200μl
[1398] 519 10％ACN，20μl
[1399] 520 MALDI基质，2μl
[1400] 521 200μl
[1401] 522 100mM MTT的DMSO/ACN溶液，100μl
[1402] 523 2％AcOH/ACN，200μl
[1403] 524 6M盐酸胍，300μl
[1404] 525 6M盐酸胍，300μl×2
[1405] 526 水，300μl
[1406] 527 10mM盐酸，300μl×3
[1407] 528 MeOH，300μl×3
[1408] 529 MeOH，300μl×3
[1409] 530 WATER，300μl×3
[1410] 531 ACN，300μl×3
[1411] 532 ACN，300μl×3
[1412] 533 水，300μl×3
[1413] 534 水，200μl
[1414] 535 ACN，400μl
[1415] 536 ACN，200μl
[1416] 537 95％ACN，200μl
[1417] 538 仅MALDI分配
[1418] 539 SPE处理后的MALDI分配